ヒトとマウスにおける脳室周囲の組織の側脳室および組織学的特性の3次元モデリング

Neuroscience

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Acabchuk, R. L., Sun, Y., Wolferz, Jr., R., Eastman, M. B., Lennington, J. B., Shook, B. A., Wu, Q., Conover, J. C. 3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse. J. Vis. Exp. (99), e52328, doi:10.3791/52328 (2015).

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Abstract

Introduction

上衣細胞単層系脳脊髄液(CSF)と間質液(ISF)1-3との間で双方向のバリア及び輸送機能を提供する脳の脳室系。これらの機能は、脳が毒物を含まない、生理バランス2,3で維持するのに役立ちます。ヒトでは怪我や病気を通してこのライニングの部分の損失は他の上皮ライニングに見られるような、再生、交換をもたらすように表示されません。むしろ上衣細胞カバレッジの損失は、心室表面における上衣細胞の無欠陥領域を覆う星状細胞の網目構造と脳室周囲アストログリオーシスをもたらすと思われます。重要CSF / ISF交換やクリアランス機構に深刻な影響は、この上皮層1,2,4-7の喪失に起因すると予測されます。

人間の老化の共通の特徴は、側脳室(脳室)とobservなどの関連する脳室周囲の浮腫を拡大していますMRIおよび流体弱毒化反転回復MRI(MRI / FLAIR)8-14により編。脳室と心室ライニングの細胞組織との関係を調べるために、死後の人間のMRIシーケンスは、側脳室の脳室周囲組織の組織学的調製物と一致しました。脳室拡大例では、神経膠症の実質的な領域は、側脳室の壁に沿って上衣細胞カバレッジを交換していました。心室拡張がMRIベースのボリューム分析によって検出されなかった場合には、上衣細胞のライニングは無傷であったとグリオーシスは心室ライニング6に沿って検出されませんでした。このコンビナトリアルアプローチは、部分のホールマウントの準備や全体の側脳室の壁と心室容積6の3Dモデリングを使用して、側脳室のライニングの細胞の完全性の変化を詳細に最初の包括的なドキュメントを表します。いくつかの疾患(アルツハイマー病、統合失調症)、および外傷(外傷性脳損傷)初期の神経病理学的特徴として脳室拡大を示します。上衣細胞ライニングの領域の裸出は、それによって、通常の上衣細胞機能を妨害し、CSF / ISF流体と溶質交換機との間の恒常性バランスを損なうことが予測されるであろう。したがって、脳室系への変更の、より精密検査、その細胞組成、およびその下または隣接する脳構造の結果は、最終的に心室肥大に関連した神経病理の詳細を明らかにするために開始されます。

一緒に組織学的組織サンプルを対応へのアクセスが制限されたマルチモーダルイメージングデータの不足、特に縦方向のデータ列には、人間の脳の病理の解析を困難にします。ヒトの老化や病気に見られるモデリングの表現型は、多くの場合、マウスモデルを用いて達成することができ、動物モデルは、ヒト疾患の開始および進行についての質問を探検するために最善の手段の一つになります。でいくつかの研究健康な若いマウスは、側脳室の壁の細胞構築とその下の幹細胞ニッチ4,7-15を記載しています。これらの研究は、高齢化6,15を介して3Dモデリングおよび心室壁の細胞分析を含むように拡張されています。マウスは比較的堅牢subventicularゾーン(SVZ)は、無傷の上衣細胞ライニング6,15に細胞ニッチの下にある幹表示むしろ脳室周囲グリオーシスも脳室のいずれもが、老齢マウスで観察されます。このように、印象的な種特異的な違いは、6,15の老化過程における側脳室のライニングの一般的なメンテナンスと整合性の両方に存在します。したがって、ヒトで見られる条件を調べるための最良の使用マウスに、2種間の違いは、任意のモデリングパラダイムを特徴とし、適切に考慮される必要があります。ここでは、人間とMの両方で側脳室および関連する脳室周囲組織に長手方向の変化を評価するための手順を提示しますウーズ。私たちの手順は、細胞、組織と構造の両方を特徴づけるために、3Dレンダリングとマウスおよびヒトの心室の両方の容積測定、および脳室周囲組織の全載標本の免疫組織化学的分析の使用を含みます。一緒にこれらの手順は、脳室系の変化と関連する脳室周囲の組織を特徴付けるための手段を提供します。

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Protocol

注:動物の手順はIACUCコネチカット大学によって承認され、NIHガイドラインに準拠しました。ヒト組織およびデータ分析や手順が遵守していたし、コネチカット大学IRBによって承認され、NIHガイドラインに準拠しています。

1.マウス:側脳室の脳室周囲細胞の完全性と3Dモデリングの分析

マウス側脳室の壁のホールマウントの1.1)準備

  1. 免疫組織化学(IHC)のために、マウス側脳室全体のマウントの準備は前に16,17を説明しました。

側脳室の分析のための1.2)免疫組織化学

  1. 以前に18,19に記載されているように、マウスの脳組織を修正してください。
    1. 室温、4%パラホルムアルデヒド、続いて経通常、室温の生理食塩水で簡単に説明すると、フラッシュマウス、臓器がクリアするまで(淡い着色で示されています)、組織までの0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水で(PFA)(PBS)が硬直しています。
    2. 頭蓋骨から脳を削除します。矢状縫合に沿って頭蓋底からカットするアイリス解剖ハサミを使用してください。
    3. 頭蓋骨を露出させ、ピンセットで脳を削除します。一晩4℃で、4%PFA固定液で脳を浸し。そしてPBSで20分間3回洗浄します。
  2. 免疫組織化学およびボリューム分析のための連続切片を準備します。
    1. 顕微メスを用いて、浮遊切片を免疫染色する際に右半球から左半球の同定を可能にするために、左半球の皮質に沿って縦方向に小さな切開を行います。
    2. ビブラトーム切片中に添加し、構造的支持のために、3%アガロースで固定脳を包みます。蒸留水でウォーム3%アガロース(w / vで)完全になるまで電子レンジやホットプレートのいずれかを使用して溶解しました。
    3. かみそりの刃で、と小脳で脳の尾部を除去冠状カットでも、平坦な表面を残します。組織ステージに瞬間接着剤を適用し、上向きに嗅球で新たに切断面に脳を置きます。
    4. 液体アガロース溶液が触れないようにちょうど暖かい温度に冷却したとき、完全に脳全体を包むために、脳の上に均等に適用されます。アガロースが固化することができます。
    5. セクションでは、アガロース順序を維持するためにPBSを含む24ウェルプレートにシリアルに置かセクションで、50μmの切片にビブラトームに冠脳を包ま。
      注:一般的に12ウェルは、ウェルA1から始まる側脳室の出現を見B6に通って数値的に移動するとバックA1にサイクリングの前に5つのセクションを開始する組織の集まりで、1脳のために使用されています。これは、同じ脳から複数の識別可能なセクションでは、同一ウェル内で処理することができます。側脳室の容積の分析のために、組織採取時には、側脳室停止しましたSと第3脳室は、ウェルまたは36のセクションの総当たり約3つのセクションで、その結果、マージします。
    6. フローティングのセクションでは、誤って吸引されていないことを確認するために、20〜200μlのマイクロピペットチップを貼付トランスファーピペットを用いてPBSを吸引します。ブロックし、室温で1時間、PBS(PBS-TX)10%血清、0.1%トリトンX-100(TX)中に浮遊切片を透過します。 24ウェルプレート中で自由に浮遊組織切片をカバーし、揺動板上のセクションの全てのインキュベーションを行うために、ウェルあたりの溶液300μLを使用してください。
    7. 4℃でブロッキング溶液を吸引し、PBS-TXで一晩(少なくとも12時間)で一次抗体と共に切片をインキュベートします。冠状切片を用いて、心室容積のトレースについては、上衣細胞を標識するために、抗S100β抗体を使用しています。
    8. 吸引一次抗体溶液、およびPBS-TXで切片を10分間3回ずつ洗浄します。
    9. 部屋のテンペラで1時間、暗所でのセクションをインキュベート1の濃度で蛍光二次抗体とトゥーレ、10%血清、PBS-TX 1,000。残りのすべてのインキュベーションステップ、暗所でのセクションを保持。
    10. 吸引二次抗体溶液を、5分間、細胞核を対比染色するためにPBS中に4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、を10μg/ ml)で切片をインキュベートします。 DAPI溶液を吸引除去し、PBSで10分間3回ずつのセクションをすすぎます。
    11. 右半球の向きに対して左を維持するために皮質のマークを使用して、スライド上に直列マウントセクション。次いで空気乾燥し、暗所でのセクションとスライドに取り付けメディアの薄い層を適用することにより、カバースリップし、穏やかに上にカバーガラスを配置します。カバースリップスライドを室温で一晩乾燥することができます。

3D再建のための1.3)側脳室のセグメンテーション

注:直立エピ蛍光microscoにマッピングソフトウェアを使用して、側脳室のトレースを実行します蛍光検出のための自動化されたステージとデジタルCCDカメラでPE。

  1. 蛍光顕微鏡装置の電源をオンにし、蛍光モードでマッピングソフトウェアを起動します。開く」表示オプションは、「トレースのために必要な適切なツールバーとドッキングツールパネルをロードします。オプション>表示オプション>アクセサリ、および「メイン​​」と「マーカー」ツールバーを選択します。同じメニューでは、下にある「カメラヒストグラム」、「マルチチャンネル·コントロール」、「カメラ設定」、および「画像取得」を選択して「ドッキングツールパネル」。
  2. 側脳室を裏打ちする上衣細胞を標識する強力なS-100βの蛍光に基づいて、心室の始まりを確認します。側脳室を含む組織の最初の部分を特定します。
  3. 新しいデータファイルを作成し、左側脳室上記の画像ウィンドウ内をクリックしてステージ移動の基準点を指定します。小さな探し切開は右半球から左配向します。シリアル再構成のための輪郭をインポートするときに役立つように、ファイルをトレース全体の側脳室への相対的な一貫性のある場所に基準点にしてください。
  4. 例えば 、ドロップダウンメニューから適切なプリセット輪郭輪郭の種類を選択し「左側脳室を」。左右の側脳室の追跡のそれぞれについて、固有の色を使用してください。輪郭名と色の変更が必要な場合は、「輪郭タイプを追加 '次に、輪郭の色の名前を変更するか選択し、[オプション]> [表示設定]> [輪郭に移動します。
  5. 「左側脳室」輪郭が選択した状態で、トレース輪郭を開始し上衣ライニングの頂端面に沿ってクリックします。頂端面に沿って連続してクリックし続けることで心室をトレースします。
    1. より多くの技巧を必要とする不規則な分野については、クリックして、フリーハンドを追跡するために、マウスの左ボタンを押したままにします。 Ctrlキーを押しながらZ、または行くTOオプション>は、前の輪郭点を元に戻す元に戻します。画面の輪郭点をオフにすることと、ウィンドウが自動的にセンタリングすることを可能にすることによって、矢印キーを使用するか、トレースウィンドウを移動します。右クリックを追跡する心室を終了し、[閉じる輪郭」を選択します。
  6. ドロップダウンメニューを使用して、右側脳室のための新たな輪郭の色(輪郭タイプ)を選択します。左のためのステップ1.3.4のように右心室をトレースします。
  7. 輪郭名と色の変更が必要な場合は、右の輪郭をクリックして、適切な色を選択するために、変更輪郭タイプを選択します。
  8. 3D再構成用のシリアル輪郭を整列させるのを助けるために正中線に沿ってマーカーを追加します。マーカーを追加するには、左側のマーカーツールバーから適切なマーカーを( 'X'を使用)を選択し、トレース画面にドロップする]をクリックします。各組織切片トレースの輪郭と一緒にインポートマーカー。
  9. 組織トレース、[ファイル]> [保存]を保存するにはデータファイルとして、新しいフォルダとファイル名を作成します。番号追跡[スライド#] - [組織#]連続切片からのトレースを簡単に識別するため。例えば、第2のスライド上に第3の組織切片は、各脳のディレクトリ内のファイル名 '2-3'を有します。
  10. 繰り返して、心室壁の付着の領域を除いて、脳全体を通して心室をトレースする脳組織の各シリアルセクションの1.3.9に1.3.4をステップ実行します。
  11. 心室は、接着部位にそれらの背側と腹側から接着、サブセグメント前方領域の領域を持っている場合。各心室のための2つの新しい輪郭型を作成します( 例えば 、「背左心室」と「腹左心室')。接着性を有する第一の組織切片上で、完全な心室再構築を作成することができることを確認するために、元の側脳室の輪郭と新しい背と腹の輪郭の両方で側脳室をトレースします。
  12. セクションでventriclに後方Eの壁面付着、各心室( 例えば 、「後部左心室')の後部のための新たな輪郭の色のセットを作成します。現在の密着性と新しい後部の輪郭タイプの両方で、この第1の再接合部をダブルトレースします。

1.4)側脳室3D再構成

  1. 3D再構成し、ボリュームデータを生成するために、マウス側脳室のシリアル輪郭追跡を合わせて、コンパイルします。
  2. 3D再構成プログラムを開きます。 [ファイル]> [開く]をクリックし、最初のトレースのシリアルセクションの輪郭ファイルを選択します。左と右心室の輪郭追跡ならびに任意の追加のマーカーをインポートします。
  3. 輪郭を選択するには、「オブジェクトの選択」ボタン(カーソルのアイコン)をクリックして、「Ctrlキー」を保持することにより、2つの心室とのマーカーを選択します。右クリックして選択し、輪郭のZ位置を確立するために、「Z位置を変更します」。 0μmの最初の組織切片を設定します。
  4. <李は>復興として、[ファイル]> [保存データファイルを保存します。間違いが行われた場合、回復は、再ロードする前のファイルを同じように簡単になるように、すべてのファイルをインポートした後に保存します。
  5. 復興に次の組織切片を追加するには、表示する追加> [ファイル]をクリックします。付加する.DATファイルを選択し、「マージ」チェックボックスをオンにします。
  6. 再び新しくインポートしたトレースファイルのZ位置を調整するステップ1.4.3に従ってください。他のトレースの移動を回避するには、メインウィンドウで新しく追加された左右の輪郭だけを選択します。 50μmのセクションの前輪郭線のZ位置から50μmの連続する各トレースファイルを設定します。 (1番目の輪郭、Z = 0、第2等高線:Z = 50、第三の輪郭:などのz = 100)
  7. 選択した輪郭とマーカーのX、Y位置を調整するには、以前の組織の輪郭に合わせてボタン "マウスで翻訳を有効にする」と輪郭をドラッグをクリックします。選択した現在のトレースの左右輪郭の両方を保ちます同期移動を可能にします。
  8. トレースは正中線マーカーをラインアップするために時計回りまたは反時計回りに回転するには、「Z軸回転」ボタンを選択します。 、右クリックして、インポートされた輪郭とマーカーの両方を選択し「設定された回転角度」を選択し、「Y回転」に「180」と入力します(左輪郭が右にある場合)、Y軸を横切る輪郭を反転します。
  9. 心室と中線マーカーは最高のステップ1.4.4のように、再構成ファイルを保存する前に整列していることを確認してください。
  10. 手順を繰り返し、後続の各組織切片のための1.4.9に1.4.5をすべてインポートし、適切に整列されるまで。
  11. シリアル復興のボリュームデータを表示するには、分析>「マーカーをし、地域分析」クリックして、「3D等高線の概要」を選択します。左側のパネルですべての輪郭を選択し、最終的な3次元再構成を表示する「3D可視化」ボタンをクリックします。

2.ヒト:側脳室の脳室周囲細胞の完全性の分析と3次元モデリング

2.1)ヒトMRIデータ解析

注:プロトコルは、3D画像再構成と側脳室の容積の定量化を作成し、縦方向のオーバーレイ解析を使用して、時間をかけて体積変化を評価するために記載されています。これは、データを含めると20を設定するための非常に重要な基準であるMRデータ収集( 例えば 、機械と磁石の強さ、切片厚、配向および解像度)とポスト取得処理でその整合性に留意することが重要です。

  1. 心室セグメンテーション
    注:ITK /スナップ高分解能T1加重MR画像からセグメントに心室に使用されています。あるいは、Freesurferのような他のフリーウェアを使用することができます。
    1. ITK /スナップ、[ファイル]> [開く]グレースケール画像を開きます。 .niiファイル(NITFIファイル)として所望のファイルとオープンを選択します。
    2. 各アナトをスクロールomical面、注目に心室の異常(狭窄領域、大きいか小さい一時的なホーン、 など )。メインツールボックスで「スネークROIツール」をクリックします。 「セグメント3D]をクリックします。 「強度領域」オプションを選択します。
    3. 「プリプロセスイメージ」をクリックします。白でROIを強調するために、特定の強度閾値以下の領域を含むように、「上」を選択します。スライドバーを使用して最大強度を記録します。最大強度(レコードこの値)の15%にしきい値を設定します。 10.「OK」をクリックし、次に「次へ」を平滑化パラメータを設定します。
    4. 前方正面の角に2つ、7は、側脳室体の上面に沿って等間隔で、後頭部ホーンの1との時間的なホーンの1:10〜12小(サイズ2)は、各心室に「バブル」を追加します側脳室。 「選択パラメータ 'と0.4に湾曲力を設定します。アクティブ輪郭進化を開始するプレイ記号をクリックします。
    5. 表面を可視化するために「更新メッシュ]をクリックします。 「自動アップデート」をご確認ください。側脳室のすべての領域を関心領域(ROI)に含まれている場合にセグメンテーションを停止します。第三脳室の混入を避けます。 「完了」をクリックします。
    6. 以下の方法で望ましくない領域を除去するために、必要に応じて手動で画像を編集する(典型的には、第三脳室の漏れを消去する必要があります)。手動で余分な領域を削除するか、または手動でROIを越える混入を消去するアクティブな図面のラベルとして「クリアラベル」と「ペイントブラシ」ツールを使用する「3Dメス」ツールを使用します。
    7. .nii画像( 'NIFTI'ファイル形式)として分割結果を保存します。
    8. 総心室容積を得るためには、「セグメンテーション>ボリューム 'と統計を選択します。セットカラーラベルを使用して、心室の総容積を得ます。
  2. MRIScansから側脳室の長手方向の表現
    注:使用しますマンゴーソフトウェアは、長手方向のROIを定性的および定量的に経時的に被験者内心室体積の変化を示すために重ねられます。
    1. マンゴーを開きます。 GREENのように[ファイル]> [最初のROI時点(ベースライン)のロードROIをクリックします。 [ファイル]> [REDとして第2のROI時点の負荷ROI。ファイルを選択することにより、長手方向のオーバーレイを保存>として保存します。 ' - [秒時点の年齢] .niiファイル名_ [第1の時点の年齢]」として各画像を割り当てます。
    2. ITK-SNAPを開きます。画像>組み合わせROIファイルからセグメンテーション>ロード]を選択して、「グレースケール画像」として組み合わせROIを再度開きます。縦ボリュームデータを取得するには、次のコマンドを実行します。セグメンテーション>ボリュームと統計情報]> [ラベル1(赤)は膨張容積を=。ラベル2(緑)=狭窄ボリューム。ラベル3(青)=ベースボリューム。

2.2)ヒト脳室周囲の組織調製および分析

  1. ヒト組織を操作するための安全対策注意事項
    1. appropを取得riate安全教育( 例えば 、血液媒介病原体コース)。
    2. 標準(ユニバーサル)安全上の注意事項を守ってください。手袋を着用してください。使い捨てではない任意の一般的な機器や表面に触れる前に手袋を変更します。 「ヒト組織の使用」の名称でヒト組織での作業時に日常扱うすべての項目にラベルを付けます。
    3. ヒト組織と接触するすべてのアイテムの除染慣行に従ってください。 ( 例えば、鉗子)漂白剤に浸したタオル( 例えば 、ベンチトップ)または漂白剤で直接オブジェクトを配置することによって汚染された表面を処理、処分前に24時間の最小値のため、すべての汚染された液体を漂白。
    4. 漂白剤で紙タオルを浸し患部(5〜10分)に保持含むことができる皮膚に直接ヒト組織と接触するためのコンティンジェンシー·プランを準備します。
    5. ヒト組織に接触し、すべての項目のための適切な廃棄物処理を使用してください。
  2. 側脳室全体のマウントの準備
    1. B無傷の半球(10%ホルマリンで固定し、0.1 M PBSで十分に洗浄)でeginning、大きなナイフを使用して半球全体を通して1.5センチメートル厚の冠状切片をスライス。
      注:すべての固定プロトコルは、従来の抗体の確認が必要です。
    2. ラベルのセクションでは、フロント側脳室を含む最初のセクションで始まるバックアップします。番号(トップダウン)と文字(後部に前方)およびサブセク​​ションでスライスを標識、英数字ラベリングシステムを使用してください。上衣表面を破壊することは避けてください。
    3. 顕微メスを用いて、全体の横方向の壁のための1つの連続した​​部分を維持し、1センチメートル深い心室壁を分析。よく染色するために適切なサイズのセクションを作成するために、必要に応じて壁を分割。心室壁の反対側の切り欠き部は、上/下方向を特定します。
    4. ダブルboileを用い10~20分間、100℃で、10mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中で組織切片をインキュベートすることによって抗原回復を実行しますR(最適なインキュベーション時間は、経験的に決定されます)。 PBS / 0.1%トリトンX-100(PBS-TX)で3回洗浄します。
    5. 室温で1時間、PBS / PBS-TXを用いて、10%ウマ血清でブロック。
    6. 4℃で48時間、一次抗体でインキュベートします。マウス抗βカテニン(1:250)心室壁のライニングを可視化するために、免疫染色の全体は、以下の抗体の組み合わせを用いてマウントし、ヤギ抗GFAP(1:250)。ウサギ抗AQP4(1:400)。
    7. 暗闇の中で、後続のすべての手順を実行します。二次抗体(1:500)と共にインキュベートし、PBS中で組織を3回リンスし、4℃で24時間または室温で2時間インキュベートし、そしてPBSでさらに3回洗浄します。 PBSでさらに3回のすすぎに続いて室温で7分間DAPIで組織をインキュベートします。
    8. パラフィルムでワックスボトムディッシュを覆うことによって、最終的な解剖のために組織を準備します。 、微細な鉗子を使用して皿の中の組織を置く上衣壁に接触することを回避、PBSで皿を埋めます。
    9. 解剖顕微鏡下で、しっかりとSECUその側使ってピン上の組織再。 22.5°顕微刺すナイフで、側脳室の壁の均一な薄切片(約厚さ300μm)を作成します。難しい曲率を持つ大規模なセクションまたはセクションでは、場所を装着し、ノートの最終セクションに切断する前に、より小さな立方体にカット。
    10. 慎重に、微細な鉗子を使用して、スライド上に地域の位置と向きをメモを取るまでスライド上に解剖セクション上衣側に配置します。気泡を避けるように注意しながら、aquapolymountの薄い層で組織をカバーしています。組織の上にカバーガラスを置き、カバーガラスの下で任意のギャップを埋めるために、必要に応じて追加aquapolymountを追加します。
    11. 室温で2〜3日間暗所とドライに搭載されたセクションを配置します。 4℃でslideboxで保管してください。
  3. 免疫組織化学および組織学的分析
    1. 利用Oによって決定されるように、蛍光免疫組織化学を表示するために、共焦点顕微鏡を使用して、心室表面における撮像焦点面を設定しますFのβカテニン(上衣細胞の頂端接着結合タンパク質のマーカー)。上衣セルカバレッジ及び表面アストログリオーシス(心室表面におけるGFAP染色)の領域の輪郭を描きます。
    2. 全体心室表面文書にし、モンタージュ、全面を覆うように重なり合う画像を使用しています。連続画像のモンタージュを作成するには、Adobe Photoshopのを開きます。必要に応じて手動で調整をする、オーバーレイする画像を選択するには、ファイル>自動処理> Photomergeの>インタラクティブレイアウトを使用してください。
    3. 無傷の上衣細胞のカバレッジまたは心室面グリオーシスの漫画の表現を生成するモンタージュをトレースするために、新しいレイヤーを作成します。各スライドまたはROIについて、この手順を繰り返します。 MRI再構成上の領域を対応する心室壁やリンクのマップを再構築するためにすべてのセクションをコンパイルします。

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Representative Results

免疫染色50μmの冠状切片と3次元再構成( 図3)に基づいて、マウス側脳室の輪郭追跡は、ボリュームデータは、病気やけがのためのモデル系としてマウスを使用して、異なる実験パラダイムに収集することができるようになります。この手順に重要な側脳室の壁が互いに付着領域の除外です。心室の領域をsubsegmenting各領域( 図3C)のために別の色を指定することにより、隣接するセクションを遵守することができ、地域の全量は、コンパイルされたサブセグメントから計算することができます。

同様の研究は、3Dレンダリングのための側脳室の半自動セグメンテーション(ITK-SNAP)と共に脳のMRIスキャンを用いて行うことができます。心室容積の直接のペアリングと脳室周囲組織分析、前または死後のためにMRIスキャンは、セグメント化され、(3次元再構成を作成するために整列されています図5)の分析のために重ね合わせることができます。縦断的解析は、将来の免疫組織化学的分析のために、特定の関心領域についての情報を提供します。対応する組織は、脳室表面( 図6A)で無傷上衣細胞単層に対するアストログリオーシスの領域を明らかにするために免疫組織化学的に分析されます。組織の画像を捕捉した後、心室表面の大部分( 図6B)を覆うmontagedています。コンパイルされたモンタージュは、漫画の表現に変換され、脳室周囲細胞の完全性( 図6C)の地域の変化を示すために、MRIベースの2次元モデルにマッピングされます。心室壁のホールマウントの準備は、心室表面の広大のパノラマビューを可能にする、または私達は全体の側脳室面6を実証しているよう。増加L浮腫を示唆する表面グ ​​リオーシスの分野におけるアクアポリン4発現のevelsは心室ライニング6保全評価することができます。

図1
図1:ITK /スナップスネークROIツール(A)を使用して、側脳室のセグメンテーションを実行するには、側脳室に追加された「泡」。 (B)「泡」は、動的輪郭進化の過程で展開します。全体側脳室が満たされている場合(C)セグメント化は完了です。 (ケアは3 番目の心室を避けるために注意されています。)

図2
図2:ヒト側脳室の壁の切開、(D)に示されています。 (E)心室壁の部分を切開し、IHCのために処理されます。組織の分割サイズと曲率に応じて必要とされ得ます。向きを維持するために、組織を心室表面(緑)の反対側の上部に切り欠かれています。ピン(黒丸)は、組織を固定し、最後の解剖(赤い点線)を案内するために使用されます。最終的な全体のマウントの準備が心室表面が(緑色)上向きにスライド上にマウントされています。

図3
図3:トレースおよび S100β免疫反応性上衣細胞によって概説マウス側脳室 (側脳室を含む冠状マウス脳切片の3次元再構成 (*、側脳室、ブラケット、のadhEの領域。シオン;スケールバー、500μmで)。 (B)マウスの側脳室を容量分析に干渉室内接着の領域を除いて、「輪郭」としてトレースサブセグメント化部として配置されています。 (C)側脳室輪郭の3D再構築。イエロー、側脳室を含む関心領域にわたる全脳容積の輪郭。

図4
図4:MRIベースの側脳室のセグメント(A)のMR画像が組み立てられます。 (B)側脳室は、ROI(赤)として定義されます。 (C)は、3D画像再構成は、体積定量および側脳室の定性的な可視化を可能にします。

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図5:複数のポイントから縦心室拡張縦MRIのの評価が整列し、経時的な被験者内の心室の体積膨張を可視化し、定量化するために重ね合わせることができます。

図6
図6:免疫組織化学的評価と βカテニン染色により概説無傷の上衣細胞のヒトの側脳室面(A)地域の地域マッピング 、敷石(アスタリスク)を示し、心室表面にアストログリオーシスの地域から点線で区画されています(GFAP +染色)。 (B)シリアル共焦点画像は、心室表面での細胞組織の漫画の表現のためのAdobe Photoshopのを使用して、地域のモンタージュを生成するように重ねてトレースされます。の(C)漫画画像モンタージュは、MRIベースの3D心室再構築に対応する上で心室表面にマッピングされます。 (スケールバー(A)、40ミクロ​​ン;スケールバー(B)は1mm)

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Discussion

我々は、マウスおよびヒトにおいて、脳の脳室系の完全性を評価するために使用できるツールおよびプロトコルを提示します。これらのツールは、しかし、また、14,21,22または老化プロセス中に損傷、疾患に起因する変化を受ける他の脳構造または器官系にも適用することができます。戦略は断面および縦MRI配列のアラインメントは、特定の領域または対象の構造の3次元体積表現を生成することができるソフトウェアのテイク利点を提示します。縦MRIシーケンスは、時間の経過とともに発生し、総脳容積比の側脳室のために、総脳容積を含むように拡張することができる3Dボリュームの変更、および/ ​​または他の脳構造の編集( 例えば 、視床下核23または脳梁白質路可能)拡散強調テンソル画像を用いました。同時に、脳の構造変化の包括的分析を行うことができます。最終的には、マルチモーダルイメージング技術の収集脳構造への加齢関連疾患と関連の変化を評価するために、脳の健康状態24の最も正確な画像を提供するために必要とされます。一緒対象被験者の変動と被験者全体の変動の範囲で重要な構造データの文書化とコンパイルは、理想的には健康または疾患における組織の最高のガイド臨床診断に超高磁場MRIアトラスを生成するために使用することができました。

いくつかの重要なステップは、間、および対象データセット内の取得および処理のばらつきを低減するために注意することが重要です。理想的にマッチしたデータ·シーケンスを得るために、同一のMRIスキャナおよび配列型は、研究全体にわたって使用されるべきです。死後脳組織は、多くの場合、品質を変化させるのです。このような固定剤で死因、死後間隔、灌流の品質、および時間の長さなどの重要な要因は、すべての染色有効性との必要性に影響を与える可能性があります抗原回復プロトコル。また、人間の脳の大きさは、関心領域を含む組織を得るために、さらなる操作を必要とする各スライスで複数のスライス断面を必要とします。したがって、各セクションの位置と方向が明確にマークされ、記録されていることが重要です。最終的には、死後組織分析と主要な問題は、正確にそのです - それは死後である - ので、人生の終わりに、組織の唯一のスナップショットビューを提供します。改善されたマルチモーダルイメージング技術は、細胞の分解能で、脳の構造およびモルフォ機能情報の変更をリアルタイムで分析するために必要とされます。

マウスの研究では、変数によって人間の条件変数の尋問を可能にし、ヒト組織で作業する際に見つかった問題点の多くを提示しません。因果構造力学の解析により、ヒトの疾患または障害をモデル化するために使用されるマウスの研究は、疾患モデルvalのための改善を提供することができますidation。しかし、種特異的な違いに注意する必要があります。側脳室の我々の分析では、マウスのように、側脳室の側壁に沿って積極的な幹細胞のニッチを保持し、裏地は控えめな上衣細胞喪失の場合に発生し、心室の細胞媒介再生修復を食い止めることに注意することが重要です老齢マウスで見られるか、制限され上衣細胞裸出は、上衣の露光により発生したときに19ノイラミニダーゼします。いずれの場合これとは対照的に、人間は、側脳室の壁に沿って25〜27を強固な幹細胞ニッチを維持し、少ししない、再生は可能性があります。老齢マウスとは対照的に、高齢の人間は、心室の拡張6に関連付けられた心室表面に広範なアストログリオーシスを示します。裸出と心室の裏地の「瘢痕」のこのレベルは、上衣細胞6,28の心室の裏地をはぎ取るするノイラミニダーゼを使用して、マウスでモデル化することができます。また、目を認識することが重要ですビバリウム-維持マウスでほとんどのヒト対象から大きく異なる病歴を提示し、感染症、疾患または外傷を経験しません。さらに、マウスは、通常、加齢に伴う神経変性疾患、脳室または脳室周囲グリオーシスを示さありません。したがって、それらはモデル化されなければならないこれらの表現型を観察しました。最後に、何の動物モデルは完全に個体発生、病態生理、およびヒト疾患の症状の複雑さを再現することはできませんし、これらの制限が確認され、適切に通信する必要があります。

要約すると、我々は、マウスとヒトで側脳室の容積を評価するために、技術およびプロトコルを提示します。心室は、3Dでレンダリングすることができ、縦方向の分析が時空間体積変化のコンパイルを可能にします。また、一対の脳組織を使用して、我々は、心室容積の変化にリンクすることができますどのように細胞の特徴を示しています。最近の結果はperiventricuの分野におけるアクアポリン4の発現レベルの増加を実証しますLARグリオーシスは、心室の表面に沿って浮腫を示唆しています。組織組織学とFLAIR-MRIをペアリングこのため、将来の研究は、CSFと間質液の交換の我々の理解を向上させ、心室システムの健全性とどのようにその劣化は様々な脳機能に影響を与えるに関する重要な情報を提供します。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline (PBS) Life Technologies 21600-069
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 19210 Use at 4% in PBS, 4 °C
Normal Horse Serum Life Technologies 16050 10% in PBS-TX (v/v)
Normal Goat Serum Life Technologies 16210 10% in PBS-TX (v/v)
Triton X-100 (TX) Sigma-Aldrich T8787 0.1% in PBS (v/v)
Vibratome Leica VT1000S
Fluorescence Microscope Zeiss Imager.M2
Camera Hamamatsu ORCA R2
Microscope Stage Controller Ludl Electronic Products MAC 6000
Stereology software MBF Bioscience Stereo Investigator 11
Stereology software ImageJ/NIH NIH freeware
3D Reconstruction software MBF Bioscience Neurolucida Explorer
Confocal Microscope Leica TCS SP2
MRI Software
Freesurfer https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall Segmentation and Volume
ITK-Snap http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php Segmentation and Volume
Multi-image Analysis GUI (Mango) http://ric.uthscsa.edu/mango/ Longitudinal overlay
Whole Mount Equipment
22.5° microsurgical straight stab knife Fisher Scientific NC9854830
parafilm
wax bottom dissecting dish 
pins
fine forceps
aquapolymount
Dissecting Microscope Leica MZ95
Whole Mount Antibodies
mouse anti-b-catenin BD Bioschiences, San Jose, CA, USA 1:250
goat anti-GFAP Santa Cruz Biotechnology 1:250
rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4)  Sigma-Aldrich 1:400
Coronal Antibodies
Anti-S100β antibody Sigma-Aldrich 1:500
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Life Technologies D-1306 10 µg/ml in PBS

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References

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