고화질 푸리에 병리학 개선으로 인체 조직 섹션의 적외선 (FT-IR) 분광 이미징 변환

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Sreedhar, H., Varma, V. K., Nguyen, P. L., Davidson, B., Akkina, S., Guzman, G., Setty, S., Kajdacsy-Balla, A., Walsh, M. J. High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology. J. Vis. Exp. (95), e52332, doi:10.3791/52332 (2015).

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Abstract

고화질 퓨리에 변환 적외선 (FT-IR) 분광 이미징 생화학 적 정보를 연관 상세한 이미지를 얻기 위해 새로운 접근 방식 변환. 조직의 FT-IR 촬상은 중 적외선의 상이한 영역이어서 존재 및 조성물에 관련 될 수있다 (예를 들면, C = O, CH, NH) 세포 또는 조직 내의 다른 화학적 결합에 의해 흡수되는 원리에 기초 생체 분자 (예를 들어, 지질, DNA, 글리코겐, 단백질, 콜라겐). FT-IR 이미지에서, 이미지 내의 모든 픽셀은 세포 유형 또는 질병 유형 분류를 위해 이용 될 수있다 세포의 생화학 적 상태에 대한 정보를 제공 할 수있는 전체 적외선 (IR​​) 스펙트럼을 포함한다. 본 논문에서는, 우리가 보여 FT-IR 시스템을 사용하여 인체 조직에서 IR 이미지를 얻는 방법, 고화질 이미징 기능을 허용하는 방법과 FT-IR 이미지를 시각화하는 기존 장비를 수정하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 FT-IR의 일부 응용 프로그램을 제시병리학 예로서 간과 신장을 사용. FT-IR 촬상 질병 과정의 일부로서 새로운 생체​​ 분자의 변화에​​ 대한 통찰력을 제공쪽으로 완전히 라벨없는 비 섭동 경로에서 세포 및 조직으로부터 생화학 적 정보를 획득하기 위해 신규 한 경로를 제공하는 흥미로운 애플리케이션을 보유하고있다. 또한,이 정보는 잠재적 생화학 질병 진단의 특정 양태의 목적은 자동화 된 분석을 허용 할 수있다.

Introduction

IR 분광법은 1930 년대 이후 어떤 형태로 사용할 수있는 분석 도구를하고있다; 그러나, 단지 FT-IR과 조직의 촬상 영역이 분해되었음을 지난 십년 내에되어있다. 때문에 큰 초점면 배열의 가용성 (FPA) 일반적으로 IR 민감한 감지기 1의 수천 탐지기에 데이터 수집의 1) 증가 속도 : 조직 이미징을위한 FT-IR의 발전은 세 가지 주요 개발에 의해 많은 부분에서 구동되었습니다 고급 처리 알고리즘 및 대형 하이퍼 스펙트 럴 데이터를 처리하는 연산 능력의 2, 2) 개발은 3으로 설정되고, FT-IR 촬상 시스템 3) 모델링은 공간 해상도를 극대화하기 위해 4,5-. 조직에서 17 점 스펙트럼 또는지도를받을 수있는 단계를 자세히 자연 프로토콜 용지 외에 다수의 높은 품질과 최근 6-16 FT-IR 분광법의 분야를 검토 매우 광범위한 기사가 있었다. 본 논문에서 우리는 제자에 초점을 맞출 것이다ocol 고화질 기능 변성 FT-IR 시스템에서 128 X 128 FPA 검출기를 이용하여 조직의 영상을 얻었다.

FT-IR 촬상 긴 의한 화소마다 생화학 풍부한 정보를 갖고있는 이미지를 획득 할 수있는 능력에 세포 및 조직 이미징 도구 잠재적 바람직한 것으로 제안되어왔다. FT-IR 촬상은 샘플의 다른 생체 분자가 정량적 중 적외선의 상이한 영역을 흡수된다는 원리를 기반으로한다; 이 '생화학 지문'의 유도 수 있습니다. 이 지문은 서로 다른 세포 유형 및 질환 상태 사이에서 변경하기 위해 많은 연구에 도시되었다. 얼룩 및 면역 마커 시각화하고 진단 및 치료 방법을 안내하는 데 사용되는 종류의 세포 및 조직 구조를 식별하기 위해 사용될 필요가 종래 병리 실제로는 달리, FT-IR에서 이미지는 조직의 본질적인 생화학에 기초하여 형성된다. 현재 techniq진단 염색 조직 UE는 시간 소모적 힘들고, 파괴, 및 FT-IR이 프로세스는, 급속 비파괴, 고도로 자동화 된,보다 객관적인 만들 가능성을 제공하는 반면, 병리학 주관적 전문 지식을 필요로한다. 또한, FT-IR은 기존의 염색 기술을 사용하여 쉽게 액세스 할 수 없습니다 추​​가 생화학 적 정보를 획득하는 새로운 경로를 제공합니다.

최근 가장 흥미로운 발전 중 하나는 현재 세포 유형 및 광범위한 질병 진단에 중요한 조직 구조의 시각화 및 특성화 할 수 있도록 고해상도 영상화 방법의 가용성이었다. 이러한 기술 중 하나는 많은 연구가 매우 흥미로운 19-25응용을 보여주는, 고해상도 영상 (18)을 허용하는 고 굴절율의 고체 침지 렌즈 (SIL)을 갖추고있어 약독 총 반사율 (ATR) FT-IR이다. 또한, w최근 인 ATR 촬상과 연관된 증가 된 공간 해상도는 내피 유방암 진단 (26)의 주요 구성 요소를 형성 유방 조직의 근 상피 세포의 시각화 및 분류를 위해 허용 할 수 있음을 입증 하였다. ATR 촬상 매우 유용하지만,이 기술은 FT-IR 이미지를 형성하기 위해 조직과 접촉하도록 SIL을 요구; 따라서, 그것의 사용은 어느 정도 조직의 큰 영역이 빠르게 군데해야 조직 병리에 대한 제한됩니다.

두 번째 방법은 IR의 밝은 소스로 싱크로트론을 사용하는 기존 FT-IR 시스템에 고배율 대물 결합에 의해 증명되었으며, 그것은 완전히 0.54 X 0.54 ㎛, 유효 화소 크기 FPA 화상을 조명 할 수있다. 우리가 기존의 FT-IR 시스템 (4)를 사용하여 분해되지 않은 유방암과 전립선 조직의 주요 구조를 시각화하는이있었습니다. IR 이미지 공간 resolutio 이러한 극적인 증가하는 동안n은 그것의 사용으로 인해 싱크로트론을 필요로 제한 남아, 흥분했다. 이어서, 최적의 시스템은 고화질 촬상 싱크로트론 광원의 요구없이 1.1 X 1.1 ㎛의 화소 크기를 갖는 기능 아니라 전통적인 globar의 IR 소스 (5)를 사용하기 위해 허용 할 수 있도록 설계되었다. 이 글에서, 우리는 여러 IR 목표 (15 배, 36 배, 그리고 74X)를 사용하여 노이즈 비율 허용 신호와 조직의 회절 제한 IR 이미징이 가능하도록 기존의 상업 FT-IR 이미징 시스템을 수정하는 방법을 보여줍니다. 세 가지 목표와 유효 화소 크기는 5.5 X 5.5 μm의 (15 배), 2.2 X 2.2 μm의 (36 배) 및 1.1 X 1.1 μm의 (74X). 우리는 간과 신장 조직 검사 (27)에 질병 검출을위한 공간 해상도의 이익의 중요성의 몇 가지 예를 제공합니다.

Protocol

1. 조직의 이미지를 FT-IR 현미경을 설정 및 취득

  1. 제 마이크로톰을 사용하여 IR 호환 슬라이드에 4 μm의 두께 포르말린 고정 파라핀 조직 블록. 또는, 섹션 저온 유지 장치를 사용하여 IR 호환 슬라이드에 4 μm의 두께로 액체 질소 냉동 조직.
    참고 : 일반적으로 시리얼 섹션은 또한 유리 슬라이드에 인수되고 또는 면역 조직 화학 염색 (예 : 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)와 같은) 특별한 염색. 또한, 배양 된 세포주 IR 호환 슬라이드 상에 성장 될 수있다. IR 호환 슬라이드는 전송 모드 이미징을위한 반사 모드 영상 (예를 들어, MirrIR 슬라이드, 금) 또는 IR 투명 슬라이드에 대한 IR 반사 슬라이드 될 수있다 (예를 들어, BAF 2, 카페 2).
  2. 시스템에서 대기 수분을 제거하는 건조 공기 또는 건조 질소 가스를 이용하여 FT-IR 현미경 및 분광계를 제거. 철저한 purg을 보장하기 위해 촬영 전에 최소한 45 분을 기다립니다전자.
  3. 쿨 FPA 탐지기 모두 (79 K에) 및 액체 질소를 사용하여 FT-IR 현미경의 내부 MCT 검출기. 감지기를마다 약 6 시간 쿨.
    주의! 액체 질소 극저온 유체 차가운 화상, 동상과 밀폐 된 공간 질식의 원인이 될 수 있습니다.
  4. FT-IR 이미징에 대한 현미경 무대에 샘플 슬라이드를 탑재합니다.
  5. 가시 광선을 확인하는 것은 다음 중 쌍안경 또는 (실시간 조직의 눈에 보이는 이미지를 제공) 샘플 캡처 프로그램을 사용하여 "ON"이며, 샘플에 초점을 맞 춥니 다.
  6. 이러한 프로 해상도로 번들 소프트웨어 패키지를 열고 '수집'을 클릭 한 후 '진단'을 선택한 다음 '정렬 분광계'을 클릭합니다. 분광계 내부 검출기 빔 경로가 차단되지 않았는지 확인합니다.
  7. '이미지 설정'을 클릭합니다.
  8. '전자'탭에서 사에서 '적절한'속도 '를 선택mpling 비율 (UDR) '와'체제에 따라 필터 '설정.
    주 :이 예에서, 설정은, UDR = 4 및 필터 = 없음 = 2.5 KHz의 속도이다.
  9. '광학'탭에서 '중간 IR 소스', '열기 구멍'과 '100 % 광 감쇠기'가 선택되어 있는지 확인합니다.
  10. '광학'탭 '지상'으로 선택 '감지기'의 시스템을 교정하려면, '왼쪽'으로 '현미경 탐지기'는 다음 유형에 따라 '투과율'또는 '광학 모드'에서 '반사율'을 선택 의 사용 밀어 넣습니다.
  11. '랜서 컨트롤'창을 열 것이다, 설정을 클릭합니다.
    참고 : 반사 모드는 1.12과 1.13 및 전송 모드는 1.14-1.16의 지침에 따라 지침을 따라하십시오. 반사 및 전송 모두 1.17에서 계속합니다.
  12. 반사 모드를 들면, &# 8216; 원시 '랜서 컨트롤'을 클릭하십시오 '. 스테이지 제어 조이스틱을 사용하고 FT-IR의 간섭 무늬 이미지 (오른쪽 위 이미지)의 라이브 뷰를보고, 슬라이드에 깨끗한 지역으로 이동합니다.
  13. 약 8,000 카운트로 통합 시간을 조정합니다. 다음에, 구조 조직편, 조직 바람직 에지를 찾는 단계를 움직여 이미지의 초점을 완벽한. 변경 "따뜻함"포커싱 개선하는 화상을 형성하는 데 도움 '콘트라스트'옵션이 IR 데이터에 영향을 미치지 않을 것이다. 1.18에서 계속합니다.
  14. '원시'에 '랜서 컨트롤의 클릭으로 전송 모드,하십시오. 스테이지 제어 조이스틱을 사용하고 FT-IR의 간섭 무늬 이미지 (오른쪽 위 이미지)의 라이브 뷰를보고, 슬라이드의 깨끗한 지역으로 이동합니다.
  15. 약 8,000 카운트로 통합 시간을 조정합니다.
  16. 그 maximu까지 카운트들의 수를 증가시키는 포커싱 / 응축기 대물 바닥을 조정m. 이 모양 가우스 상대적으로 균일하도록 랜서 컨트롤의 오른쪽 하단 이미지의 모양을보세요. 약 8,000 카운트에 다시 통합 시간을 조정합니다.
    주 : FT-IR의 간섭 무늬의 화상의 임의의 픽셀이 하얗게 경우 통합 시간을 감소시킨다.
  17. 구조 조직편, 조직, 바람직하게 가장자리를 찾아 이미지의 초점을 완벽하게 스테이지를 이동. 선택적으로 향상시키는 집중 화상을 형성하는 데 도움 온기와 대비 옵션을 변경할 수 있지만, IR 데이터에 영향을 미치지 않을 것이다.
  18. 스테이지 제어 조이스틱을 사용하여, 상기 슬라이드의 깨끗한 영역으로 이동. '보정'버튼을 누릅니다. 확인 '범위 (OOR) 초과'값이 50 미만이고, '높은 플럭스'및 '로우 플럭스'카운트 사이의 차이가 적어도 4000 카운트이다.
  19. 두 번 'OK'를 선택합니다. 광학 탭에서 선택; '감지기'= 'MCT', '극소감지기 '='오른쪽 대처 '다음 클릭'설정 '. 이때 화면 FT-IR의 간섭 무늬가있을 것이다. 'Centerburst 찾기'를 클릭합니다. '좋아요'를 클릭합니다.
  20. '광학'탭에서 '감지기'= '그라운드', '현미경 감지기'= '설치'를 '왼쪽'선택을 다시 선택합니다.
  21. 랜서 제어 - 이미지가 깨끗한 지역에 여전히 확인하고 다시 '보정'을 클릭합니다. '좋아요'를 클릭합니다.
  22. 다음으로, 분위기, 시스템 및 슬라이드에서 흡광도를 수정하기 위해 배경 FT-IR 이미지를 수집합니다. '전자'탭으로 이동하여 4cm -1 8cm -1 조직에 대한의 일반적으로, 적절한 스펙트럼 해상도를 선택합니다.
  23. '배경'탭으로 이동하여 '공동 추가 검사'에 128을 입력합니다. '새 파일 ...'버튼을 선택하고 적절한 배에서 배경 파일을 배치어. mosaicing은 1. '배경'에 의해 1 보장하는 '이미지'탭을 확인, 완료하고 파일을 저장할 확인하기 위해 검사를 기다립니다. 배경 FT-IR 이미지 영역을 클릭하고 스펙트럼을 확인합니다.
  24. 샘플의 대형 모자이크 이미지를 촬영하기 위해, '이미지'탭을 선택하고 취득하고자하는 모자이크 크기 X와 Y 프레임 수를 삽입합니다.
  25. '설정'을 클릭하고 랜서 제어에 대한 관심의 영역을 찾기 위해 라이브 IR 뷰를 사용합니다. 모자이크를 복용하는 경우, 관심 영역의 중앙에 중심을 생중계. '좋아요'를 클릭합니다. '전자'탭으로 이동 (조직에 대한 2 16 스캔 사이에 일반적으로 값)를 공동으로 추가 스캔의 번호를 입력합니다. '검색'을 클릭합니다.
  26. 그것은 초점을 보이​​는 보장하기 위해 화면에 수집 된 FT-IR 이미지를 확인합니다. 해당 위치에서 IR 스펙트럼을 제기하고 소음 허용 신호를 보이는 것을 확인하기 위해 이미지를 클릭하십시오. 아퀴샘플의 가시적으로 이미지.
  27. 이미지를 저장 및 ENVI-IDL로 필요한 형식으로 내보낼 수 있습니다.

2. 고화질 기능에 대한 FT-IR 현미경을 적응

주 : 대부분의 FT-IR 시스템은 약 목적 15 배 배율 0.5 개구 수 (NA)가 장착되어 있습니다. 고해상도 모드에서 이미지를, IR 호환 74X 대물 36 배 또는 회절 제한된 촬상에게 능력을 제공하는데 사용될 수있다.

  1. 시계 반대 방향으로 풀어 시스템의 15 배 목표를 제거합니다.
  2. 그 자리에 36 배 또는 74X 목적 중 하나에 나사. 사용하기 전에 목표를 맞 춥니 다. 샘플 충분히 목적 가까이 가져 렌즈 확장 튜브를 사용합니다.
  3. 새로운 목표에 따라 조직을 배치하고 쌍안경 또는 샘플 캡처 프로그램을 사용하여 가시 광선을 사용하여 초점을 맞 춥니 다.
    주 : 고화질 영상을 전송 모드에서 수행해야합니다. 의 매우 가까운 작동 거리자체 목표 (1-2 ㎜)과 초점의 매우 얕은 깊이는 샘플을 건드리지 않고 목적을 낮추기 위해 시간을내어, 차분히 집중이 필요합니다.
  4. 1.6-1.11 지침을 따르십시오.
    참고 : 크게 초점을 더 어렵게하고 검출기에 도달하기 훨씬 덜되는 빛으로 인해, 다음과 같은 프로토콜이 1.14에 따라 조정됩니다.
  5. 전송 모드에서, '원시'를 클릭하십시오. 스테이지 제어 조이스틱을 사용하고 FT-IR의 간섭 무늬 이미지 (오른쪽 위 이미지)의 라이브 뷰를보고, 조직으로 이동 (가장자리에 이상적으로) 초점을 맞추고있다.
    참고 :이 때문에 (이러한 옵션이 더 IR 데이터에 영향을주지 않은 경우) 초점을 개선하기 위해 이미지를 형성하기 위해 '따뜻함'과 '대비'옵션을 조정, 어려울 수 있습니다.
  6. 일단 스테이지 제어 조이스틱 및 슬라이드의 깨끗한 지역에 라이브 IR보기 이동을 사용하여 초점을 맞추었다. 약 8,000 카운트로 통합 시간을 조정합니다. 에 목표를 중심으로 아래쪽을 조정최대 카운트로의 수를 증가시킨다. 약 8,000 카운트에 다시 통합 시간을 조정합니다.
  7. 구조 조직편, 조직, 바람직하게 가장자리를 찾는 단계를 이동 및 이미지의 초점을 완벽한.
  8. 고해상도의 화상을 모자이 경우 정확한 mosaicing 위해 필요한 정확한 거리에 걸쳐 이동 가능하도록 스테이지를 조절. 무대의 거리 설정을 변경하려면, 랜서 컨트롤의 '설정 단계'에 가서 정확한 모자이 수 있도록 수평 및 수직 정렬 설정을 조정합니다.
  9. 슬라이드의 깨끗한 영역으로 스테이지 제어 조이스틱 이동 사용. '보정'버튼을 누릅니다. 범위 (OOR) 값의 출력을 확인하는 것은 모두 36 배와 74X 목표 미만 50입니다. 하이 및 로우 플럭스 플럭스 값 사이의 차이가 74X 대물 렌즈에 대해 적어도 1,000 카운트 및 36 배의 대물 2,000 건의 확인.
  10. 1.19-1.27 계속합니다. 1.23에서 검사의 수와1.25 배경 이미지를위한 약 256 스캔 및 조직 이미지를위한 16-128 검사로 인해 감소 된 신호를 조정해야한다.

3. 떠올리 급기 IR 스펙트럼 데이터 집합

참고 :이 섹션에서 우리는 시각화 및 ENVI + IDL과 같은 소프트웨어를 지리 공간 영상 처리를 이용하여 분석 스펙트럼 이미지에서 데이터를 추출하는 방법을 논의 할 것이다, 그러나 과정은 MATLAB, 같은 CytoSpec 자유 소프트웨어와 같은 다른 소프트웨어와 매우 유사하다 또는 기기 개발자의 자신의 소프트웨어. IR 데이터상에서 수행 될 수있는 몇 가지 상이한 스펙트럼 프로세싱 기술이있다.

  1. 오픈 지리 영상 처리 및 분석 소프트웨어는 IR 데이터 파일을로드.
  2. "스펙트럼 도구"를 선택하여 IR 데이터를 기준 보정 알고리즘을 적용하고 아래로 스크롤 "흡광도 스펙트럼"을 클릭합니다. 팝업 메뉴를 관찰하고 "기준 이리와! 빨리ction의 "
    참고 : 기준선 보정으로 인해 산란 데이터에서 기준 오프셋 기울기를 제거합니다
  3. 스펙트럼의 정의 된 영역에 따라 소정의 스펙트럼 피크 (전형적 아마이드 I (1,650cm-1) 또는 아미드 II (1,550cm-1)) 또는 데이터 영역 비로, 스펙트럼 정규화를 수행한다. "흡광도 스펙트럼"메뉴 옵션에서 "일반 스펙트럼"을 선택하여이 작업을 수행합니다.
    참고 : 스펙트럼의 차이가 실제 생화학 적 차이없는 두께로 인해 또는 샘플 사이의 밀도 차이가 있도록 스펙트럼 정규화가 수행된다.
  4. 필요하다면 (28) 스펙트럼에서 잡음을 제거하는 잡음 제거 알고리즘을 사용.
    .베이스 라인 보정, 스펙트럼 정규화 및 노이즈 감소 대부분의 소프트웨어가 내장 된 자동화 된 알고리즘을 갖는 달성 할 수있는 사용 가능한 여러 방법이 있습니다 또한, 보정 할 방법의 신흥 수 있습니다 : 주29-42에 상세히 논의되었다 스펙트럼 수차; 그러나 사회는 아직 필요한 이들 중 어느 동의하지 않습니다.
  5. (일반적으로 900 내지 4,000 ㎝ 내지 스펙트럼 범위 -1) 내에 수집 된 모든 화상 IR 주파수들의 목록을 관찰한다. 선택된 주파수에서 조직의 이미지를 관찰하기 위해 특정 생체 분자에 해당하는 주파수를 클릭합니다.
    1. 예를 들어, 시료 중의 단백질의 분포를 관찰 1,650cm -1 밴드 클릭. 또한 샘플에서 핵산의 분포를 관찰하는 1,080cm -1 밴드를 클릭합니다. 1,650cm을 파수 -1을 사용합니다.
  6. 다른 생체 분자 구성 요소의 시각화 수 등 스펙트럼 피크 높이 비율, 피크 면적 비율을 계산하여 추가 이미지를 만듭니다. '스펙트럼 도구'를 클릭 한 후 다음 중 하나를 선택합니다 '피크 높이 비율을'또는 '이미지 영역을 계산'이미지를 만들 수 있습니다.
  7. 시야 이미지를 캡처하는 별도의 전체 슬라이드 이미 저 시스템을 사용하여 스테인드 해당 인접 조직 섹션을 검색합니다. IR 이미지 외에도, 눈에 보이는 이미지 프로그램으로 스테인드 조직의 디지털 이미지를 불러옵니다.
  8. 마우스 오른쪽 단추로 관심의 영역에서 이미지를 클릭하고 'Z 프로파일'을 선택합니다. 이것은 선택된 픽셀에서 스펙트럼 정보를 줄 것이다.
  9. 이러한 세포 유형, 질병 상태를 비교하는 여러 클래스에서 여러 픽셀의 IR 스펙트럼 봐. '관심 지역'(ROI) 도구를 사용하여 이미지에 마크 특정 픽셀. 이 작업을 수행하려면, 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '투자 수익 (ROI) 도구'를 선택합니다. 일반 예, 발육, 암 클래스, 표시되어야하는 클래스를 만듭니다. '포인트'- 다음, '투자 수익 (ROI) 형'을 선택합니다. 그런 다음에 대한 픽셀을 선택하고 IR 이미지의 해당 픽셀에 그리는 클래스를 선택하십시오. 평균 스펙트럼 F를 유도또는 평균 ROI '도구를 사용하여 각 클래스.
  10. 그래프 소프트웨어에 플롯에 의해 유도 된 스펙트럼을 비교.

Representative Results

FT-IR 촬상 관심 IR 주파수에 따라 다른 대조를 줄 수있는 조직의 IR 이미지의 도출을 허용한다. 또한, IR 이미지의 모든 픽셀은 세포 유형 또는 질병 상태 (도 1)의 생화학 적 성질에 대한 정보를 제공 할 수있는 여러 다른 생체 분자에 대응하는 피크와, 전체 IR 스펙트럼을 포함한다. 여기서 우리는 그러나 더 진보 된 자동화 된 분류가 수행 될 수 베이지안 분류, 임의의 숲, 인공 신경망, 그리고 계층 적 클러스터 분석과 같은 추가 알고리즘 3,43-50을 사용 가능하며, 클래스 사이의 스펙트럼 서명을 비교하는 방법을 보여 주었다 데이터. 감독 분류 접근법은 세포 유형 또는 질병 상태를 자동으로 인식하도록 훈련 될 수있는 분류기의 구성을 허용한다. 감독 분류 방식은 자연적으로 DIF 발생을 찾을 수 있습니다조직에서 ferences 또는 생화학 적 변화로 인해 세포.

FT-IR 계측, 카세그레인 목표를 사용하여 촬영 모드로 IR 불투명 한 구멍을 사용하여 단일 포인트 / 매핑 모드에서 측정을 사용하여 하나의 전송 모드의 수집 목적 또는 단일 목적으로 결합 된 조명 목적에서, 지난 몇 년 동안 진화하고있다 켜지고 반사 모드에서 수집 (그림 2) 모두 그. 이는 최근에 송신 모드에서 수집 대물 수집 IR 이미지 4,5의 공간 해상도의 상당한 증가에 이르게 회절 제한된 IR 이미징을 허용하기 위해 더 높은 배율 및 개구 수 대물 바꿔도 될 수 있음을 입증 하였다. 우리는 이제 예를 들어 신장 사구체의 기능 부들을 유형의 세포 및 조직을 식별 할 수있는 구조로 조직 이미징을위한 공간 해상도의 진보는 사내 적응 이용하여 매우 중요왔다FT-IR 시스템 (그림 3).

고화질 FT-IR 영상 비정상적인 영역을 식별하고 다른 세포 유형 간의 생화학 적 차이를 확인하기 위해 조사하는 조직의 자세한 이미지 수 있습니다. 간 조직 코어에서, 이형성 및 비 이형성 간경변 (도 4)의 별개의 두 영역으로 분할 섬유증 함침 간세포 및 영역을 시각화 할 수있다. 우리는 간 질환의 어려운 경우에 사용하기 위해 자동화 된 진단 도구를 만드는 방향으로이 문제를 악용하기 위해 노력하고 있습니다.

중요한 것은, 증가 된 공간 해상도는 지금 우리가 조직 학적 변화가 명백하기 전에 화학적으로 질병에 의해 변경 될 수있는 특정 구조 기능을 분리 할 수​​ 있습니다. 예를 들어, 우리는 전에 같은 보 먼의 캡슐, 메산 지움, 사구체 기저막과 관 기저막으로 신장 사구체 구조의 생화학 적 변화를 식별에 초점을 맞추고있다 병리학 자에 의해 확인 된 변화는 (그림 5)를 관찰 할 수있다. 특히, 우리는 현재의 기술이 성공적으로 개입 충분히 일찍 방식으로 변경 사항을 식별하는 데 실패 이식 환자, 당뇨병 성 신증, 만성 거부 반응의 진행과 관련된 변경 사항을 식별에 관심이 있습니다.

그림 1
(A) H & E는 (B)에서 간 생검과 동일한 코어의 직렬 섹션의 IR 흡광도의 화상으로부터 코어 염색 3,286cm -1 (C) 2603의 간 코어로부터도 1 FT-IR, 이미지와 스펙트럼. 이미지 다른 구조적 특징을 강조 cm -1. 레이블이 중요한 봉우리 (D) 조직의 일반적인 IR 스펙트럼. 스케일 바 = 100 μm의.fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 2 광학 개략적 디테일 FT-IR 현미경 동작 모드. (A)의 전송 모드는, 샘플은 저부 대물 통해 조명하고, 샘플을 통과하는 광은 대물 상부에서 수집된다. 반사 모드에서, (B)는, 상부 목적 모두 샘플을 조사하고 반사 된 광을 수집하는 역할을한다. 아래의 목표는 사용되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
differen의 그림 3. 비교2,925cm -1 NA와. (A) 15 배 수집 목적 = 0.5 (5.5 X 5.5 μm의 픽셀 크기)에서 신장 사구체의 FT-IR 이미지에 T 현미경 목표. NA와 (B) 36 배의 수집 목적 = 0.5 (2.2 X 2.2 μm의 픽셀 크기). NA 대물으로 수집 (C) 74X 0.65 (1.1 X 1.1 ㎛의 화소 크기) =. 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 간 핵심의 섬유화와 간세포 사이 4. 스펙트럼의 차이. 간 생검에서 (A) H & E 염색 핵심. (B) FT-IR 스캔 직렬 섹션 코어 (36 배 목표 설정)의 이미지. (C) 담당자resentative (A)에 화살표로 나타내는 영역의 조직에서 찍은 간세포 및 섬유증의 스펙트럼, 및 (B). 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
고화질 FT-IR 영상의 사용을 통해 신장 조직 생검 기능 그림 5. 차별화. 기능 (A) 정기 산 쉬프 염색 부분은 표시를 추출 할 수 있습니다. (B) 같은 조직의 직렬 섹션의 CH 2 비대칭 스트레칭 지역 (36 배 목표 설정)의 고화질 FT-IR 이미지. (C)는 (A)는 화학적 DIF 할 수 있도록 (B)의 FT-IR을 이용하여 이미지에서 추출 된 특징 표지조직의 기능을 네 ferentiate. 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

FT-IR은 병리 진단의 현재 표준을 개선하는데 중요한 역할을 할 수있는 가능성, 조직 절편의 라벨없는 생화학 이미징을위한 신흥 양상이다. 병리에 대한 현재 황금 표준은 조직이, 파라핀, 포르말린에 고정, 생검을 여러 번 절단, 여러 얼룩으로 염색하는 것이 필요합니다. 고도로 훈련 병리학 주관적 시각적 진단을 판별 조직 구조 및 세포 형태를 평가한다. 여기서 우리는 섹션들의 동일한 유형으로부터 고해상도 IR 이미지를 수집하고 세포 유형 및 질환 상태 사이의 화학적 차이를 조사하기 위해 어떤 계산 방법을 설명하는 방법을 보여준다.

이 프로토콜 내에서 중요한 단계는 조직은 매우 신중하게 집중되도록하고 있음은 물론 시스템은 매우 높은 품질의 분광 데이터를 보장하기 위해 교정된다. 시스템 설정 관리는 특히 criti입니다 CAL은 고배율 목표로 작업 할 때. 문제 해결을 돕기 위해, 다음은 발생 가능한 문제 중 일부는 커버;

문제 : 반영 이미징 낮은 IR 강도. 해결 방법 : 반사 코팅 슬라이드의 반대쪽에있을 수 있으므로 IR 슬라이드 방향을 확인합니다.

문제 : 랜서 컨트롤의 낮은 신호 / 적색 경고 기호입니다. 해결 방법 : LN2와 함께 멋진 탐지기. 액체 질소가 작동 할 수있는 FPA 탐지기 필요하며 주기적으로 얹어되고 필요합니다.

문제 : 속도 오류 / 이동 오류. 해결 방법 : 분광계를 재설정하고 진동을 줄일 수 있습니다. 진동은 간섭계의 이동 미러 방해하게됩니다.

문제 : 데이터의 수증기 스파이크. 해결 방법 : 시스템에 퍼지을 높이고 공기 샘플을 보호합니다.

문제 : 잘못된 centerburst. 해결 방법 : 다시 centerburst 찾기.

e_content "> 문제 :. 전송에 낮은 플럭스 차이, 집중에도 불구하고 해결 방법 :. 적외선 빛이 시료의 한 지점에 집중되지 않는로 바닥 콘덴서 조정이 발생합니다.

본 논문은 전송 또는 transflectance의 모드에서 조직의 고화질 적외선 이미지를 수집하는 방법에 초점을 맞추고있다. FT-IR 촬상의 특성상, 이러한 기판의 종류, 고정술, 샘플 두께 스펙트럼 해상도, 간섭계 거울 속도 등 이들 파라미터의 영향 등 데이터 수집에 제조 될 수있는 다수의 변형들이 존재한다는 것이다 갖는다 최근 4,5,17,51 광범위한 자세히 설명되어.

ATR 모드 10,24,26 이미징 포함하고 고해상도 IR 촬상을 허용하도록 나노 스케일 열 (52, 53) 접근법을 사용하여 촬상 시스템으로 이루어질 수 변형들이있다. 고해상도 IR 영상의 가장 큰 한계는 TI 것입니다ssues은 (일반적으로 4 μm의 두께)를 통과하기 위해 조심스럽게 준비하고 IR 충분히 얇은해야합니다. 또한, 전송 및 반사율 FT-IR 영상 인해 물에 의해 IR의 흡광도를 건조하기 위해 샘플을 필요로한다. 그러나, FT-IR 영상이 점에서, 다른 기술에 비해 상당한 장점을 가지고 그것을 할 수있는 조직의 매우 빠른 속도로 이미지 넓은 지역에 풍부하고 상세한 생화학 적 정보를 도출한다. 라벨이없는 방식으로 생화학 적 정보를 도출 기타 유사한 기술은 라만 분광법 그러나 데이터 수집의 시간은 이미지를 수집하는 것이 훨씬 느리다을 포함한다. 라만 새로운 촬상 방식 자극 된 라만 산란 (SRS)과 일관된 Antistokes 라만 산란 (CARS)을 포함하여 등장하고; 그러나 이러한 접근 제한 스펙트럼 범위 또는 단일 주파수 촬상있다.

데이터 수집, 공간 해상도 및 계산 방법의 가용성의 속도 발전은 FT-IR의 IMAG을 만드는 엄청난 가치왔다병리의 새로운 이미징 도구로 번역에 대한 더 실현 가능한 방법을 보내고. 공간 해상도의 최근 발전으로 인해, 종래의 FT-IR 촬상 시스템을 사용하여 분해없는 키 세포 유형에 조직 병리에 특히 중요왔다. 레디 등의 알에 의해 최근 종이. FT-IR 촬상 시스템 (5)의 최적 공간 해상도를 얻기위한 이상적인 시스템을 모델링하는 방법을 설명했다. 본 논문에서 제시 한 신장 조직의 예는 사구체 구조 (그림 3과 그림 5)에서 생화학 적 정보를 추출하기 위해 높은 공간 해상도의 중요성을 보여줍니다. 향후, 양자 폭포 레이저와 같은 매우 밝은 IR 광원의 새로운 발전은 54-57, 3D 분광 영상 (58), 및 나노 IR 기술 분야의 혁신은 52,53,59,60가있을 수 있습니다 연구의 흥미로운 새로운 길을 잡아 조직 이미징의 미래에 큰 영향.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cary 600 Series FT-IR system Agilent Multiple configurations  Alternate FT-IR imaging systems exist
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR Edmund Optics 66-592
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR Edmund Optics 66-586
MirrIR slide Kevley Technologies CFR For FT-IR reflection-mode measurements
Barium Fluoride slides International Crystal Laboratories Multiple sizes For FT-IR transmission-mode measurements
Calcium Fluoride slides International Crystal Laboratories Multiple sizes For FT-IR transmission-mode measurements
Dry Nitrogen/Dry Air gas Multiple gas suppliers Multiple sizes
Hexane Sigma Aldrich Multiple sizes For deparafinizing tissue
Liquid Nitrogen Multiple cryogenic liquid suppliers Multiple sizes
ENVI-IDL software Exelis-Vis Other software packages available
Whole slide Imager Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) To image stained slides

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