HD-Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spektroskopiske Imaging of Human vevssnitt mot Forbedre Pathology

* These authors contributed equally
Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sreedhar, H., Varma, V. K., Nguyen, P. L., Davidson, B., Akkina, S., Guzman, G., Setty, S., Kajdacsy-Balla, A., Walsh, M. J. High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology. J. Vis. Exp. (95), e52332, doi:10.3791/52332 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

HD-Fourier Transform Infrared (FT-IR) spektroskopiske imaging er en voksende tilnærming for å få detaljerte bilder som har knyttet biokjemiske informasjonen. FT-IR avbildning av vev er basert på prinsippet om at ulike regioner av mid-infrarøde absorberes av ulike kjemiske bindinger (f.eks, C = O, CH, NH) innenfor celler eller vev som kan deretter bli knyttet til tilstedeværelse og sammensetning av biomolekyler (f.eks, lipider, DNA, glykogen, protein, kollagen). I et FT-IR-bildet, omfatter hver piksel i bildet en hel infrarød (IR) spektrum som kan gi informasjon om den biokjemiske status for de celler som deretter kan utnyttes for celle-type eller sykdomstypen klassifisering. I denne artikkelen viser vi: hvordan du får tak IR-bilder fra menneskelige vev ved hjelp av en FT-IR-systemet, for å tillate HD-imaging evner, og hvordan å visualisere FT-IR-bilder hvordan du kan endre eksisterende instrumentering. Vi deretter presentere noen anvendelser av FT-IRfor patologi ved hjelp av lever og nyre som eksempler. FT-IR bildebehandling holder spennende applikasjoner i å gi en ny rute for å få biokjemiske informasjon fra celler og vev i en helt etikett-fri ikke-perturbing rute mot å gi ny innsikt i biomolekylære endringer som en del av sykdomsprosesser. I tillegg kan denne biokjemiske informasjonen potensielt tillate for objektiv og automatisk analyse av visse aspekter av sykdomsdiagnose.

Introduction

IR-spektroskopi har vært et analytisk verktøy tilgjengelig i noen form siden 1930-tallet; er det imidlertid bare vært i løpet av det siste tiåret at arealet av vev avbildning med FT-IR har eksplodert. Fremskrittene i FT-IR for vev avbildning har vært drevet i en stor del av tre sentrale utviklingstrekk: 1) økt hastighet av datainnsamling på grunn av tilgjengeligheten av stor Focal Plane Array (FPA) detektorer som typisk har tusenvis av IR-følsomme detektorer 1 , 2, 2) utvikling av avanserte prosesseringsalgoritmer og regnekraft til å håndtere store hyperspektral datasett 3, og 3) modellering av FT-IR imaging-systemer for å maksimere spatial oppløsning 4,5. Det har vært mange høy kvalitet og svært omfattende artikler gjenn feltet av FT-IR spektroskopi nylig 6-16, i tillegg til Nature Protokoller papir med detaljer om trinn for å få poeng spektra eller kart fra vev 17. I denne artikkelen vil vi fokusere på protocol å få bilder av vev ved hjelp av en 128 x 128 FPA detektor i en modifisert FT-IR system med HD-evner.

FT-IR-avbildning har lenge vært foreslått å være et potensielt ønskelige verktøy for celler og vev avbildning på grunn av evnen til å oppnå bilder hvor hvert piksel har et mangfold av biokjemisk informasjon. FT-IR-avbildning er basert på det prinsipp at forskjellige biomolekyler i en prøve vil kvantitativt absorbere forskjellige regioner av mid-IR; Dette gjør det mulig for avledning av en biokjemisk fingeravtrykk ". Denne fingeravtrykk hadde blitt vist i mange studier for å endre mellom ulike celletyper og sykdomstilstander. I motsetning til konvensjonell praksis patologi hvor flekker og immunhistokjemiske markører trenger å bli brukt til å visualisere og identifisere celletyper og vev strukturer som brukes for å lede diagnose og behandling, blir bildene fra FT-IR dannet basert på den iboende biokjemi av vevet. Den nåværende technique av farging vev for diagnostisering er tidkrevende, destruktive, arbeidskrevende, og krever subjektive ekspertise av patologen, mens FT-IR gir mulighet for å gjøre denne prosessen rask, ikke-destruktiv, svært automatisert, og mer objektiv. I tillegg gir FT-IR en ny vei til å skaffe ytterligere biokjemisk informasjon som kanskje ikke er lett tilgjengelige ved hjelp av konvensjonelle fargeteknikker.

En av de mest spennende fremskritt de siste årene har vært tilgjengeligheten av høyoppløste bilde tilnærminger som nå kan tillate for visualisering og karakterisering av celletyper og vev strukturer som er kritiske for omfattende sykdomsdiagnose. En av disse teknikker er attenuert total refleksjon (ATR) FT-IR som inkorporerer en fast nedsenking linse (SIL) av en høy brytningsindeks, som gjør det mulig for oppløsningen avbildning 18 høy, med mange meget spennende studier som viser dens anvendelser 19-25. I tillegg, det wsom nylig vist at økt romlig oppløsning forbundet med ATR bildebehandling kan tillate for visualisering og klassifisering av endothelial og korg cellene i brystvevet som danner en viktig del av brystkreftdiagnose 26. Mens ATR avbildning er meget nyttig, krever denne teknikk SIL å komme i kontakt med vevet til å danne FT-IR-bilder; Derfor er bruken noe begrenset til vev patologi der store områder av vev må raskt avbildes.

En annen tilnærming ble demonstrert ved kobling av en høy forstørrelse objektiv til en eksisterende FT-IR-system som bruker en synkrotron som en lysende kilde til IR, er det mulig å fullt belyse en FPA og bilde med en effektiv pikselstørrelse på 0,54 x 0,54 um. Dette er mulig for oss å visualisere viktige strukturer i bryst og prostata vev som ikke ble løses ved hjelp av konvensjonelle FT-IR-systemer fire. Mens disse dramatiske økninger i IR bilde romlig resolution var spennende, bruken forble begrenset på grunn krever en synkrotron. Deretter ble et optimalt system designet som kunne også gi rom for HD-imaging evner med en 1,1 x 1,1 mikrometer pikselstørrelse uten kravet om en synkrotron kilde, men heller bruke en tradisjonell globar IR kilde 5. I denne artikkelen viser vi hvordan du kan endre en eksisterende kommersielle FT-IR imaging system for å tillate diffraksjon begrenset IR avbildning av vev med et akseptabelt signal til støyforhold ved hjelp av flere IR mål (15X, 36X og 74X). Den effektive pikselstørrelse med de tre målene er 5,5 x 5,5 mikrometer (15X), 2,2 x 2,2 mikrometer (36X) og 1,1 x 1,1 mikrometer (74X). Vi da gi noen eksempler på viktigheten av gevinstene i romlig oppløsning for sykdom deteksjon i lever og nyre biopsier 27.

Protocol

1. Sette opp en FT-IR mikroskop og Innhente Tissue Images

  1. Seksjon en formalinfiksert parafin-embedded vevsblokk på 4 mikrometer tykkelse på til en IR-kompatibel lysbilde ved hjelp av en mikrotom. Vekselvis, seksjon en flytende nitrogen frosset vev ved 4 mikrometer tykkelse på en IR-kompatibel lysbilde ved hjelp av en kryostat.
    MERK: Vanligvis vil en serie delen også bli kjøpt på en glassplate og farget med en spesiell (for eksempel haematoxylin og eosin (H & E)) eller immunhistokjemisk flekken. I tillegg kan dyrkede cellelinjer dyrkes på IR kompatible lysbilder. IR kompatible lysbilder kan være IR reflekterende lysbilder for refleksjonsmodus imaging (f.eks mirrir lysbilde, gull) eller IR transparente lysbilder for overføringsmodus imaging (f.eks BaF 2, CaF 2).
  2. Purge FT-IR-mikroskop og spektrometer ved anvendelse av enten tørr luft eller tørr nitrogengass for å fjerne atmosfærisk vann fra systemet. Vent minst 45 minutter før bildebehandling for å sikre en grundig purge.
  3. Avkjøl både FPA detektor (79 K), og den indre MCT detektor i FT-IR-mikroskop ved hjelp av flytende nitrogen. Kjøle detektorene omtrent hver 6. time.
    FORSIKTIG! Flytende nitrogen er en kryogen væske og kan forårsake frostskader, frostskader og i lukkede rom kvelning.
  4. Montere prøven lysbilde på mikroskopet scenen for FT-IR-avbildning.
  5. Sørg for synlig lys er "ON" og deretter enten ved hjelp av kikkert eller prøven fange program (som gir en real-time synlig bilde av vevet), fokus på prøven.
  6. Åpner bunten programvarepakke som resolusjoner pro og klikk "Collect", og klikk deretter Diagnostics "og velg deretter" Align Spectrometer '. Sørg for at strålebanen til spektrometeret interne detektoren ikke er blokkert.
  7. Klikk på "Imaging Setup '.
  8. I "Electronics 'fanen, velg riktig' Speed ​​',' Under Sampling Ratio (UDR) 'og' Filtre 'innstillinger avhengig av systemet.
    MERK: I dette eksemplet er innstillingen Speed ​​= 2,5 KHz, UDR = 4 og Filters = Ingen.
  9. I "Optics 'kategorien sikre at" Mid-IR kilde "," Åpne blenderåpning "og" 100% stråledemper' er valgt.
  10. Å kalibrere systemet, i "Optics-fanen, velger du" Detektor "som" Ground "," Microscope Detector "som" Venstre ", og velg deretter enten 'Transmittance' eller 'Refleksjon' under 'Optics mode' avhengig av type av skyv som brukes.
  11. Klikk Setup, som vil åpne opp 'Lancer Control "vinduet.
    MERK: For refleksjonsmodus følg instruksjonene i 1.12 og 1.13 og for overføringsmodus følge instruksjonene i 01.14 til 01.16. Fortsett fra 1.17 for både refleksjon og transmisjon.
  12. For refleksjon modus, i &# 8216; Lancer Control "klikk på" Raw ". Bruke scenen kontroll joystick og se live view av FT-IR interferogram bilde (øverst til høyre bilde), flytte til et rent område på lysbildet.
  13. Juster integreringstiden til ca 8000 teller. Deretter flytter scenen for å finne et stykke vev med struktur, helst på kanten av en vev, og perfeksjonere fokus på bildet. Change "varmen" og "Contrast" alternativer for å hjelpe danne et bilde for å forbedre fokus, vil dette ha noen effekt på IR data. Fortsett fra 1.18.
  14. For sendemodus, i 'Lancer Control "klikk på" Raw ". Bruke scenen kontroll joystick og se live view av FT-IR interferogram bilde (øverst til høyre bilde), flytte til et rent område av lysbildet.
  15. Juster integreringstiden til ca 8000 teller.
  16. Juster bunnen fokusering / kjøleren mål å øke antall tellinger til sin maksimal hoppem. Se formen på høyre bilde i Lancer kontroll for å sikre at det er gaussisk i utseende og forholdsvis jevn. Juster integrering tid igjen til ca 8000 teller.
    MERK: Hvis noen av piksler i FT-IR interferogram bilde blir hvit, redusere integreringstiden.
  17. Flytt scenen for å finne et stykke vev med struktur, helst kanten av en vev og perfekt fokus i bildet. Eventuelt endre varme og kontrast alternativer for å hjelpe danne et bilde for å bedre fokus, men vil ikke ha noen effekt på IR data.
  18. Bruke scenen kontroll joystick, flytte til et rent område av lysbildet. Trykk 'Kalibrering' knappen. Sikre 'Out Of Range (OOR)' verdien er mindre enn 50, og forskjellen mellom "High Flux" og "Low Flux 'teller er minst 4000 teller.
  19. Velg "OK" to ganger. I optikk faner velge; 'Detektor' = 'MCT', 'Microstakle Detector '=' Høyre 'og deretter på' Setup '. På dette punkt vil det være et FT-IR interferogram på skjermen. Klikk på "Finn Centerburst '. Klikk "Ok".
  20. I "Optics-fanen, velg på nytt 'Detektor' = 'Ground', 'mikroskop Detector' = 'Venstre' og velger 'Setup'.
  21. I Lancer Control - sørger for at bildet er fortsatt på et rent sted og klikk 'Kalibrering' igjen. Klikk "Ok".
  22. Neste, samle en bakgrunn FT-IR bilde for å korrigere for absorbans fra atmosfæren, system og lysbilde. Gå til "Elektronikk" -fanen og velg en passende spektral oppløsning, typisk på 4 cm -1 eller 8 cm -1 for vev.
  23. Gå til "Bakgrunn" -fanen og skriv 128 i 'Skanner å co-add ". Velg 'Ny fil ...' og plassere bakgrunnen filen i riktig foldeh. Sjekk den "Imaging-fanen for å sikre mosaicing er en av 1. Klikk 'Bakgrunn', vent til skanningen å fullføre og bekrefte hvor du vil lagre filen. Klikk på en region på bakgrunn FT-IR bilde og sjekk spekteret.
  24. Å ta en stor mosaikk bilde av prøven, velg "Imaging-fanen og sett antall X- og Y-rammer for mosaikk størrelse du ønsker å kjøpe.
  25. Klikk 'Setup' og i Lancer Kontroll bruke live IR sikte på å finne arealet av interesse. Hvis du tar en mosaikk, sentrere live feed i midten av området av interesse. Klikk "Ok". Gå til "Elektronikk" -fanen og skriv antall skanninger å co-add (vanligvis en verdi mellom 2 og 16 skanninger for vev). Trykk på «Let '.
  26. Kontroller samlet FT-IR bilde på skjermen for å sikre det ser fokusert. Klikk på bildet for å få opp en IR spekteret fra det stedet og sjekk at det ser ut til å ha et akseptabelt signal til støy. Acquire et synlig bilde av prøven.
  27. Lagre bildet og eksportere den til ønsket format, for eksempel ENVI-IDL.

2. Tilpasning en FT-IR mikroskop for HD-Capabilities

MERK: De fleste FT-IR-systemer er utstyrt med en objektiv ca 15X forstørrelse og 0,5 numerisk apertur (NA). Til bilde i HD-modus, kan en IR-kompatibel 36X eller 74X objektiv brukes til å gi diffraksjon begrensede imaging evner.

  1. Fjern systemets 15X objektiv ved å skru mot klokken.
  2. Skru på 36X eller 74X objektiv i stedet. Justere målsettingen før bruk. Bruk linse forlengelsesrør å bringe målet nær nok til prøven.
  3. Plasser vev under den nye objektiv og fokusere med synlig lys ved hjelp av enten kikkert eller Sample Capture program.
    MERK: HD-bilde må gjøres i sendemodus. Den svært nær arbeidsavstand påSE mål (1-2 mm) og svært grunt dybdeskarphet krever fokus sakte og forsiktig, ta deg tid til å senke målet uten å berøre prøven.
  4. Følg instruksjonene 1,6 til 1,11.
    MERK: På grunn til å være betydelig vanskeligere å fokusere og mye mindre lys som når detektoren, er følgende protokoll justert basert på 1.14.
  5. I sendemodus, klikk på "Raw". Bruke scenen kontroll joystick og se live view av FT-IR interferogram bilde (øverst til høyre bilde), flytter til vevet og fokus (helst på en kant).
    MERK: Det kan være vanskelig, derfor justere "varmen" og "Contrast" alternativer for å hjelpe danne et bilde for å bedre fokusering (disse alternativene har ingen innvirkning på IR data).
  6. Når fokusert, bruker scenen kontroll joystick og live IR utsikt flytte til et rent område av lysbildet. Juster integreringstiden til ca 8000 teller. Juster bunnen fokus mål åøke antallet av tellinger til sitt maksimum. Juster integrering tid igjen til ca 8000 teller.
  7. Flytt scenen for å finne et stykke vev med struktur, helst på kanten av en vev, og perfeksjonere fokus på bildet.
  8. Hvis mosaicking et bilde med høy oppløsning, justere scenen for å tillate riktig bevegelse kreves over avstander for nøyaktig mosaicing. Å endre trinnavstands innstillinger, gå til "Setup scenen" i Lancer kontrollere og justere horisontal og vertikal justering innstillinger for å tillate riktig mosaicking.
  9. Bruke scenen kontroll joystick flytte til et rent område av lysbildet. Trykk 'Kalibrering' knappen. Sikre Out Of Range (OOR) verdien er mindre enn 50 for både 36X og 74X mål. Sikre forskjellen mellom High Flux og lav Flux verdier er minst 1000 teller for 74X objektiv og 2000 teller for 36X objektiv.
  10. Fortsett 1,19 til 1,27. Antallet skanninger i 1,23 og1.25 må justeres på grunn av redusert signal til ca 256 skanninger for bakgrunnsbildet og 16-128 skanner for vevet bilde.

3. visualisere og klassifisere IR Spectral datasett

MERK: I denne delen vil vi diskutere hvordan å visualisere og hente ut data fra spektrale bilder ved hjelp av geografisk bildebehandling og analyse av programvare som ENVI + IDL, men prosessen er svært lik for alle alternativ programvare som Matlab, gratis programvare som CytoSpec eller instrument utvikler egen programvare. Det finnes flere ulike spektrale behandlingsteknikker som kan utføres på IR data.

  1. Åpen geospatial bildebehandling og analyse programvare og laste IR datafil.
  2. Påfør en baseline korreksjon algoritme til IR-data ved å velge "Spectral verktøy" og bla ned og klikk "Absorbance spektra". Observere en pop-up meny og velg "Baseline tilsvarDette skjer "
    MERK: Baseline korreksjon vil fjerne en baseline offset skråning fra dataene på grunn av spredning
  3. Utføre Spectral normalisering ved ratioing dataene til en viss spektral topp (typisk amid I (1650 cm-1) eller amid II (1550 cm -1)) eller et område under et definert område av spekteret. Gjør dette ved å velge "Normal spektra" under "Absorbance Spectra" menyalternativer.
    MERK: Spectral normalisering utføres slik at eventuelle forskjeller i spektra er ekte biokjemiske forskjeller og ikke på grunn av tykkelse eller tetthetsforskjeller mellom prøver.
  4. Bruk en støyreduksjon algoritme for å fjerne støy fra spektra om nødvendig 28.
    MERK: Det er flere tilnærminger tilgjengelige der baseline korreksjon, spektral normalisering og støyreduksjon kan oppnås, med de fleste programvare ha automatiserte algoritmer bygget i I tillegg er det en voksende antall tilnærminger som vil korrigere for.spektrale avvik, som har vært diskutert i detalj 29-42; imidlertid ikke samfunnet ennå ikke enige om hvilke av disse er nødvendig.
  5. Observere en liste over alle IR-frekvensene som samles inn i bildet (typisk av en spektral varierer fra 900 til 4000 cm -1). Klikk på de frekvenser som tilsvarer spesifikke biomolekyler for å observere en avbildning av vev ved den valgte frekvens.
    1. Klikk for eksempel på 1650 cm -1 bandet å observere fordelingen av proteiner i prøven. Alternativt kan klikke på 1080 cm-1 båndet for å observere fordelingen av nukleinsyrene i prøven. Bruk bølgetallet 1650 cm -1.
  6. Opprett flere bilder ved å beregne spektrale topphøyde forholdstall, peak området forholdstall osv som vil tillate for visualisering av ulike biomolekylære komponenter. Klikk på 'Spectral Tools' og deretter velge enten 'topphøyde prosenter' eller 'Beregn Bildeområde'å lage bilder.
  7. Skanne tilsvarende tilstøtende vev delen som er farget ved hjelp av en egen hel lysbilde imager system som fanger lysfelt bilder. Sammen med IR bilde, ta opp det digitale bildet av farget vev med et synlig bilde program.
  8. Høyreklikk på bildet i en region av interesse og velg "Z-profil". Dette vil gi den spektrale informasjon på det valgte bildepunkt.
  9. Se på IR spektra av flere piksler fra flere klasser, slik som å sammenligne celletyper, sykdomstilstander. Marker bestemte piksler på bildet ved hjelp av "regioner av interesse" (ROI) verktøyet. For å utføre dette, høyreklikk på bildet og velg "ROI verktøy". Lag klassene som er å merkes, for eksempel normal, dysplasi, og kreft klasser. Deretter velger du «ROI type '-' Point '. Deretter velger klassen til å velge for piksler og trekke på de aktuelle piksler på IR bilde. Utlede gjennomsnittlig spektra feller hver av klassene ved hjelp av "Average ROI" verktøy.
  10. Sammenligne avledet spektra ved å plotte i grafisk programvare.

Representative Results

FT-IR-avbildning tillater avledning av IR-bilder av vev som kan gi forskjellige kontraster avhengig av IR frekvens av interesse. I tillegg, i en IR-bilde, omfatter hver piksel av hele IR-spekteret, med forskjellige topper tilsvarende forskjellige biomolekyler som kan gi informasjon om de biokjemiske egenskaper av celletyper eller sykdomstilstander (figur 1). Her har vi vist hvordan å sammenligne spektrale signaturer mellom klassene, men mer avanserte automatiserte klassifisering er mulig å bruke flere algoritmer 3,43-50, som bayesiansk klassifisering, Random Forests, Kunstige nevrale nettverk, og Hierarkisk Cluster Analysis kan utføres på data. Veiledet klassifisering tilnærminger vil tillate bygging av en klassifikator som kan trenes til å tillate for automatisert anerkjennelse av celletyper eller sykdomstilstander. Styrt klassifikasjon tilnærminger kan brukes til å lete etter naturlig forekommende difskjeller i vev eller celler på grunn av biokjemiske avvik.

FT-IR instrumentering har utviklet seg over de siste tiårene, fra måling i et enkelt punkt / kartlegging modus ved hjelp av IR ugjennomsiktig åpninger til bildemodus med Cassegrain mål, enten ved hjelp av en opplysende objektiv kombinert med en oppsamlings mål i overføring-modus eller et enkelt mål at både tennes og samler i refleksjon-modus (figur 2). Det ble nylig vist at det å samle mål i sendemodus kan bli slått ut for en høyere forstørrelse og numerisk apertur mål å tillate for diffraksjon begrenset IR imaging, som fører til en betydelig økning i romlig oppløsning av innsamlet IR-bilder 4,5. Fremskritt innen romlig oppløsning for vev avbildning har vært av avgjørende betydning som vi nå kan identifisere celletyper og vev strukturer, for eksempel de funksjonelle enheter av nyre, glomeruli, ved hjelp tilpasset in-houseFT-IR (Figur 3).

HD-FT-IR bildebehandling sørger for detaljerte bilder av vev som skal undersøkes for å identifisere unormale regioner og å identifisere biokjemiske forskjeller mellom ulike celletyper. I en levervev kjerne, er det mulig å visualisere hepatocytter og regioner av infiltrerende fibrose som skiller to distinkte områder av dysplasi og ikke-dysplastisk cirrhose (figur 4). Vi jobber med å utnytte dette til å gjøre automatiserte diagnostiske verktøy for bruk i vanskelige tilfeller av leversykdom.

Viktigere, kan den økte romlig oppløsning nå tillate oss å isolere bestemte strukturelle trekk som kan kjemisk modifisert av sykdom før histologiske endringer er tydelige. For eksempel er vi fokusert på å identifisere biokjemiske forandringer i nyre glomerulær strukturer som Bowmans kapsel, mesangium, glomerulær basalmembran og rørformet basalmembran, før endringer identifisert av patologen kan observeres (Figur 5). Spesielt er vi interessert i å identifisere endringene i forbindelse med utvikling av diabetisk nefropati og kronisk avvisning hos transplantasjonspasienter, hvor dagens teknikker ikke klarer å identifisere endringer i en tidlig nok mote for vellykket intervensjon.

Figur 1
Figur 1. FT-IR-bilder og spekteret fra en lever kjerne. Bilde av (A) H & E farget kjernen fra leverbiopsi og bilder av IR-absorbansen serieseksjonen av den samme kjerne ved (B) 3286 cm-1, og (C) 2603 cm -1, som fremhevet ulike strukturelle trekk. (D) Typiske IR-spektrum av vev, med viktige topper merket. Skala bar = 100 mikrometer.fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Optikk skjematiske detaljering FT-IR mikroskop driftsmåte. (A) I sendemodus, blir prøven belyst gjennom bunnen objektiv, og lyset passerer gjennom prøven er samlet inn av topp objektiv. (B) I refleksjonsmodus, tjener den øverste mål både for å belyse prøven, og å samle det reflekterte lyset. Den nederste mål er ikke brukt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Sammenligning av different mikroskop mål på FT-IR-bilder av en nyre glomerulus på 2925 cm -1. (A) 15X samle objektiv med NA = 0,5 (5,5 x 5,5 mikrometer pikselstørrelse). (B) 36X samle objektiv med NA = 0,5 (2,2 x 2,2 mikrometer pikselstørrelse). (C) 74X samle objektiv med NA = 0,65 (1,1 x 1,1 mikrometer pikselstørrelse). Skala bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Spectral forskjeller mellom fibrose og hepatocytter i en lever kjerne. (A) H & E farget kjerne fra leverbiopsi. (B) Bilde av en serie seksjon kjerne skannet i FT-IR (36X objektiv setup). (C) Representative spektra av hepatocytter og fibrose, tatt fra områder av vev som er angitt ved piler i (A) og (B). Skala bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Differensiering av nyre vev biopsi funksjoner gjennom bruk av high-definition FT-IR bildebehandling. (A) Perjodsyre-Schiff farget seksjon med de funksjonene som skal trekkes merket. (B) HD-FT-IR-bilde av CH2 asymmetrisk strekker region (36X objektiv oppsett) av en serieseksjonen av det samme vev. (C) Egenskaper merket i (A) ekstraheres ved hjelp av FT-IR-bilde i (B) for å være i stand til kjemisk differentiate de fire funksjonene i vev. Skala bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

FT-IR er en ny modalitet for etikett-fri biokjemisk avbildning av vevssnitt, med potensial til å ha en viktig rolle i å forbedre dagens standard av diagnose i patologi. Dagens gullstandard for patologi krever vev som skal biopsied, fast i formalin, dyppet i parafin, seksjonert flere ganger, og farget med flere flekker. Et høyt utdannet patolog må subjektivt visuelt bedømme vevet struktur og cellulær morfologi for å bestemme en diagnose. Her viser vi hvordan du kan samle høyoppløselige IR-bilder fra samme type seksjoner og diskutere noen av de beregnings tilnærminger for å undersøke kjemiske forskjeller mellom celletyper og sykdomstilstander.

De kritiske trinn i denne protokollen, er å sikre at vevet er svært nøye fokusert, og at systemet er godt kalibrert for å sikre meget høy kvalitet spektroskopiske data. Omsorg når du setter opp systemet er spesielt Criti cal når du arbeider med høye forstørring. Til hjelp i feilsøking dekker følgende liste noen av de potensielle vanskelighetene;

Problem: Lav IR intensitet når bildebehandling i refleksjon. Løsning: Kontroller IR lysbilde orientering som den reflekterende belegg kan være på feil side av raset.

Problem: Lav signal / Rød varselskilt i Lancer Control. Løsning: Cool detektorer med LN2. Flytende nitrogen er nødvendig for FPA detektorer for å fungere, og krever jevnlig blir toppet.

Problem: Velocity feil / bevegelses feil. Løsning: Tilbakestill spektrometer og redusere vibrasjoner. Vibrasjoner vil føre til det bevegelige speil i interferometeret til å bli forstyrret.

Problem: Vanndamp toppene i data. Løsning: Øk utrenskning på systemet og beskytte prøve fra luften.

Problem: Ugyldig centerburst. Løsning: Finn centerburst igjen.

e_content "> Problem:. lav fluks forskjell i transmisjonen, selv om konsentrert løsning. Juster bunnkjøler Dette vil skje som IR-lyset ikke blir fokusert til et punkt på prøven.

I denne artikkelen har vi fokusert på hvordan å skaffe seg HD-IR-bilder av vev i enten overføring eller transflektans modus. Naturen av FT-IR-avbildning, er at det er flere modifikasjoner som kan gjøres til datainnsamlings-, så som type-substrat, fikseringsteknikk, prøvetykkelse, spektral oppløsning, interferometer speilhastighet etc. Effekten av disse parametre har vært diskutert i omfattende detalj nylig 4,5,17,51.

Det finnes en rekke modifikasjoner som kan gjøres til avbildningssystem som innbefatter avbildning i ATR-modus 10,24,26, og ved hjelp av nanoskala termiske metoder 52,53 for å tillate høy oppløsning IR-avbildning. Den største begrensningen med høy oppløsning IR bildebehandling er at tissues må være nøye forberedt og tynn nok for IR kan passere (vanligvis fire mikrometer tykkelse). I tillegg krever transmisjon og refleksjon FT-IR-avbildning prøvene å være tørr på grunn av IR-absorbansen av vann. Imidlertid har FT-IR-avbildning betydelige fordeler i forhold til andre teknikker, ved at det kan meget hurtig bilde store områder av vevet, mens stammer rik og detaljert biokjemisk informasjon. Andre lignende teknikker som henter biokjemiske informasjonen i en etikett-free mote inkluderer Raman-spektroskopi, men tidspunktet for datainnsamling er mye tregere å hente bilder. New Raman bildebehandling tilnærminger dukker blant annet stimulert Raman spredning (SRS) og Coherent Antistokes Raman spredning (CARS); Men de har tilgang begrenset spektralområde eller enkel frekvens bildebehandling.

Fremskritt i hastigheten på datainnsamling, romlig oppløsning, og tilgjengeligheten av beregningsorientert tilnærminger har vært av enorm verdi i å gjøre FT-IR imaging et mer gjennomførbare tilnærming for oversettelse som en ny bilde verktøy i patologi. De siste fremskritt i romlig oppløsning har vært spesielt viktig for vev patologi grunn til viktige celletyper som ikke er løses ved hjelp av konvensjonelle FT-IR bildesystemer. Den nylige papir ved Reddy et al. viste hvordan å modellere et ideelt system for å oppnå optimal romlig oppløsning på en FT-IR imaging system 5. Nyrevevet eksempel presentert i denne avhandlingen viser viktigheten av høyere romlig oppløsning for å trekke biokjemiske informasjon fra glomerulær strukturer (Figur 3 og Figur 5). I fremtiden, nye fremskritt i Quantum Cascade Lasere som svært lyse IR lyskilder 54-57, 3D spektral avbildning 58, og gjennombrudd innen nanoskala IR teknologier 52,53,59,60 holde spennende nye muligheter for forskning som kan ha enorme implikasjoner i fremtiden av vev bildebehandling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cary 600 Series FT-IR system Agilent Multiple configurations  Alternate FT-IR imaging systems exist
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR Edmund Optics 66-592
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR Edmund Optics 66-586
MirrIR slide Kevley Technologies CFR For FT-IR reflection-mode measurements
Barium Fluoride slides International Crystal Laboratories Multiple sizes For FT-IR transmission-mode measurements
Calcium Fluoride slides International Crystal Laboratories Multiple sizes For FT-IR transmission-mode measurements
Dry Nitrogen/Dry Air gas Multiple gas suppliers Multiple sizes
Hexane Sigma Aldrich Multiple sizes For deparafinizing tissue
Liquid Nitrogen Multiple cryogenic liquid suppliers Multiple sizes
ENVI-IDL software Exelis-Vis Other software packages available
Whole slide Imager Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) To image stained slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, E. N., et al. Fourier transform spectroscopic imaging using an infrared focal-plane array detector. Anal Chem. 67, (19), 3377-3381 (1995).
  2. Dorling, K. M., Baker, M. J. Rapid FTIR chemical imaging: highlighting FPA detectors. Trends Biotechnol. 31, (8), 437-438 (2013).
  3. Fernandez, D. C., Bhargava, R., Hewitt, S. M., Levin, I. W. Infrared spectroscopic imaging for histopathologic recognition. Nat Biotechnol. 23, (4), 469-474 (2005).
  4. Nasse, M. J., et al. High-resolution Fourier-transform infrared chemical imaging with multiple synchrotron beams. Nat Methods. 8, (5), 413-416 (2011).
  5. Reddy, R. K., Walsh, M. J., Schulmerich, M. V., Carney, P. S., Bhargava, R. High-definition infrared spectroscopic imaging. Appl Spectrosc. 67, (1), 93-105 (2013).
  6. Walsh, M. J., Bhargava, R. Chapter 10; Infrared spectroscopic imaging: an integrative approach to pathology. Nanobiophotonics. McGraw Hill. (2010).
  7. Walsh, M. J., Reddy, R. K., Bhargava, R. Label-Free Biomedical Imaging With Mid-IR Spectroscopy. Ieee J Sel Top Quant. 18, (4), 1502-1513 (2012).
  8. Matthaus, C., et al. Chapter 10: Infrared and Raman microscopy in cell biology. Methods Cell Biol. 89, 275-308 (2008).
  9. Walsh, M. J., et al. IR microspectroscopy: potential applications in cervical cancer screening. Cancer Lett. 246, (1-2), 1-11 (2007).
  10. Kazarian, S. G., Chan, K. L. ATR-FTIR spectroscopic imaging: recent advances and applications to biological systems. Analyst. 138, (7), 1940-1951 (2013).
  11. Sahu, R. K., Mordechai, S. Spectral signatures of colonic malignancies in the mid-infrared region: from basic research to clinical applicability. Future Oncol. 6, (10), 1653-1667 (2010).
  12. Kendall, C., et al. Vibrational spectroscopy: a clinical tool for cancer diagnostics. Analyst. 134, (6), 1029-1045 (2009).
  13. Steiner, G., Koch, E. Trends in Fourier transform infrared spectroscopic imaging. Anal Bioanal Chem. 394, (3), 671-678 (2009).
  14. Biswas, S., Walsh, M. J., Bhargava, R. Ch. 16. Challenges and Advances in Computational Chemistry and Physics. 14, 475-504 (2014).
  15. Bhargava, R. Infrared Spectroscopic Imaging: The Next Generation. Appl Spectrosc. 66, (10), 1091-1120 (2012).
  16. Malek, K., Wood, B. R., Bambery, K. R. Ch. 15. Challenges and Advances in Computational Chemistry and Physics. 14, 419-473 (2014).
  17. Martin, F. L., et al. Distinguishing cell types or populations based on the computational analysis of their infrared spectra. Nat Protoc. 5, (11), 1748-1760 (2010).
  18. Sommer, A. J., Tisinger, L. G., Marcott, C., Story, G. M. Attenuated Total Internal Reflection Infrared Mapping Microspectroscopy Using an Imaging Microscope. Appl Spectrosc. 55, (3), 252-256 (2001).
  19. Glassford, S. E., Byrne, B., Kazarian, S. G. Recent applications of ATR FTIR spectroscopy and imaging to proteins. Biochim Biophys Acta. 1834, (12), 2849-2858 (2013).
  20. Andanson, J. M., Chan, K. L., Kazarian, S. G. High-throughput spectroscopic imaging applied to permeation through the skin. Appl Spectrosc. 63, (5), 512-517 (2009).
  21. Kuimova, M. K., Chan, K. L., Kazarian, S. G. Chemical imaging of live cancer cells in the natural aqueous environment. Appl Spectrosc. 63, (2), 164-171 (2009).
  22. Chan, K. L., Kazarian, S. G. Attenuated total reflection-Fourier transform infrared imaging of large areas using inverted prism crystals and combining imaging and mapping. Appl Spectrosc. 62, (10), 1095-1101 (2008).
  23. Gajjar, K., et al. Diagnostic segregation of human brain tumours using Fourier-transform infrared and/or Raman spectroscopy coupled with discriminant analysis. Anal Methods. 5, 89-102 (2012).
  24. Holton, S. E., Walsh, M. J., Bhargava, R. Subcellular localization of early biochemical transformations in cancer-activated fibroblasts using infrared spectroscopic imaging. Analyst. 136, (14), 2953-2958 (2011).
  25. Gulley-Stahl, H. J., Bledsoe, S. B., Evan, A. P., Sommer, A. J. The advantages of an attenuated total internal reflection infrared microspectroscopic imaging approach for kidney biopsy analysis. Appl Spectrosc. 64, (1), 15-22 (2010).
  26. Walsh, M. J., Kajdacsy-Balla, A., Holton, S. E., Bhargava, R. Attenuated total reflectance Fourier-transform infrared spectroscopic imaging for breast histopathology. Vib Spectrosc. 60, 23-28 (1016).
  27. Investigating the Biochemical Progression of Liver Disease Through Fibrosis, Cirrhosis, Dysplasia and Hepatocellular Carcinoma using Fourier Transform Infrared Spectroscopic Imaging. Sreedhar, H., et al. Biomedical Vibrational Spectroscopy VI: Advances in Research and Industry, 89390J (2014).
  28. Reddy, R. K., Bhargava, R. Accurate histopathology from low signal-to-noise ratio spectroscopic imaging data. Analyst. 135, (11), 2818-2825 (2010).
  29. Bassan, P., et al. The inherent problem of transflection-mode infrared spectroscopic microscopy and the ramifications for biomedical single point and imaging applications. Analyst. 138, (1), 144-157 (2013).
  30. Bassan, P., et al. FTIR microscopy of biological cells and tissue: data analysis using resonant Mie scattering (RMieS) EMSC algorithm. Analyst. 137, (6), 1370-1377 (2012).
  31. Bassan, P., et al. Resonant Mie scattering in infrared spectroscopy of biological materials--understanding the 'dispersion artefact'. Analyst. 134, (8), 1586-1593 (2009).
  32. Bassan, P., et al. RMieS-EMSC correction for infrared spectra of biological cells: extension using full Mie theory and GPU computing. J Biophotonics. 3, (8-9), 609-620 (2010).
  33. Bassan, P., et al. Resonant Mie scattering (RMieS) correction of infrared spectra from highly scattering biological samples. Analyst. 135, (2), 268-277 (2010).
  34. Bassan, P., et al. Reflection contributions to the dispersion artefact in FTIR spectra of single biological cells. Analyst. 134, (6), 1171-1175 (2009).
  35. Davis, B. J., Carney, P. S., Bhargava, R. Theory of mid-infrared absorption microspectroscopy: II. Heterogeneous samples. Anal Chem. 82, (9), 3487-3499 (2010).
  36. Davis, B. J., Carney, P. S., Bhargava, R. Theory of midinfrared absorption microspectroscopy: I. Homogeneous samples. Anal Chem. 82, (9), 3474-3486 (2010).
  37. Kohler, A., et al. Estimating and correcting mie scattering in synchrotron-based microscopic fourier transform infrared spectra by extended multiplicative signal correction. Appl Spectrosc. 62, (3), 259-266 (2008).
  38. Miljkovic, M., Bird, B., Lenau, K., Mazur, A. I., Diem, M. Spectral cytopathology: new aspects of data collection, manipulation and confounding effects. Analyst. 138, (14), 3975-3982 (2013).
  39. Miljkovic, M., Bird, B., Diem, M. Line shape distortion effects in infrared spectroscopy. Analyst. 137, (17), 3954-3964 (2012).
  40. Bird, B., Miljkovic, M., Diem, M. Two step resonant Mie scattering correction of infrared micro-spectral data: human lymph node tissue. J Biophotonics. 3, (8-9), 597-608 (2010).
  41. Mohlenhoff, B., Romeo, M., Diem, M., Wood, B. R. Mie-type scattering and non-Beer-Lambert absorption behavior of human cells in infrared microspectroscopy. Biophys J. 88, (5), 3635-3640 (2005).
  42. Bambery, K. R., Wood, B. R., McNaughton, D. Resonant Mie scattering (RMieS) correction applied to FTIR images of biological tissue samples. Analyst. 137, (1), 126-132 (2012).
  43. Kwak, J. T., Reddy, R., Sinha, S., Bhargava, R. Analysis of variance in spectroscopic imaging data from human tissues. Anal Chem. 84, (2), 1063-1069 (2012).
  44. Trevisan, J., Angelov, P. P., Carmichael, P. L., Scott, A. D., Martin, F. L. Extracting biological information with computational analysis of Fourier-transform infrared (FTIR) biospectroscopy datasets: current practices to future perspectives. Analyst. 137, (14), 3202-3215 (2012).
  45. Trevisan, J., et al. Measuring similarity and improving stability in biomarker identification methods applied to Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy. J Biophotonics. 7, (3-4), 254-265 (2014).
  46. Bhargava, R., Fernandez, D. C., Hewitt, S. M., Levin, I. W. High throughput assessment of cells and tissues: Bayesian classification of spectral metrics from infrared vibrational spectroscopic imaging data. Biochim Biophys Acta. 1758, (7), 830-845 (2006).
  47. Menze, B. H., et al. A comparison of random forest and its Gini importance with standard chemometric methods for the feature selection and classification of spectral data. BMC bioinformatics. 10, 213 (2009).
  48. Kelly, J. G., et al. Biospectroscopy to metabolically profile biomolecular structure: a multistage approach linking computational analysis with biomarkers. J Proteome Res. 10, (4), 1437-1448 (2011).
  49. Bird, B., et al. Infrared micro-spectral imaging: distinction of tissue types in axillary lymph node histology. BMC Clin Pathol. 8, 8 (2008).
  50. Baker, M. J., et al. Investigating FTIR based histopathology for the diagnosis of prostate cancer. J Biophotonics. 2, (1-2), 104-113 (2009).
  51. Baker, M. J., et al. Using Fourier transform IR spectroscopy to analyze biological materials. Nat Protoc. 9, (8), 1771-1791 (2014).
  52. Katzenmeyer, A. M., Aksyuk, V., Centrone, A. Nanoscale Infrared Spectroscopy: Improving the Spectral Range of the Photothermal Induced Resonance Technique. Anal Chem. 85, (4), 1972-1979 (2013).
  53. Dazzi, A., et al. AFM-IR: combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Appl Spectrosc. 66, (12), 1365-1384 (2012).
  54. Kole, M. R., Reddy, R. K., Schulmerich, M. V., Gelber, M. K., Bhargava, R. Discrete frequency infrared microspectroscopy and imaging with a tunable quantum cascade laser. Anal Chem. 84, (23), 10366-10372 (2012).
  55. Vrancic, C., et al. Continuous glucose monitoring by means of mid-infrared transmission laser spectroscopy in vitro. Analyst. 136, (6), 1192-1198 (2011).
  56. Mid-infrared microspectroscopic imaging with a quantum cascade laser. Yeh, K., Schulmerich, M., Bhargava, R. Next-Generation Spectroscopic Technologies VI, 8726, 87260E (2013).
  57. Brandstetter, M., Volgger, L., Genner, A., Jungbauer, C., Lendl, B. Direct determination of glucose, lactate and triglycerides in blood serum by a tunable quantum cascade laser-based mid-IR sensor. Appl. Phys. B. 110, (2), 233-239 (2013).
  58. Martin, M. C., et al. 3D spectral imaging with synchrotron Fourier transform infrared spectro-microtomography. Nat Meth. 10, (9), 861-864 (2013).
  59. Kwon, B., et al. Infrared microspectroscopy combined with conventional atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 116, 56-61 (2012).
  60. Marcott, C., et al. Nanoscale infrared (IR) spectroscopy and imaging of structural lipids in human stratum corneum using an atomic force microscope to directly detect absorbed light from a tunable IR laser source. Exp Dermatol. 22, (6), 419-421 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics