Transformée de Fourier à haute définition infrarouge (FT-IR) imagerie spectroscopique des sections de tissus humains à l'amélioration de Pathologie

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Sreedhar, H., Varma, V. K., Nguyen, P. L., Davidson, B., Akkina, S., Guzman, G., Setty, S., Kajdacsy-Balla, A., Walsh, M. J. High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology. J. Vis. Exp. (95), e52332, doi:10.3791/52332 (2015).

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Abstract

Transformée de Fourier à haute définition infrarouge (FT-IR) imagerie spectroscopique est une approche émergente d'obtenir des images détaillées qui ont associés informations biochimiques. Imagerie FT-IR de tissu est basé sur le principe selon lequel les différentes régions de l'infrarouge moyen sont absorbés par différentes liaisons chimiques (par exemple, C = O, CH, NH) à l'intérieur des cellules ou des tissus qui peuvent ensuite être liées à la présence et de la composition des biomolécules (par exemple, les lipides, l'ADN, le glycogène, la protéine, le collagène). Dans une image FT-IR, chaque pixel dans l'image comprend l'ensemble d'un spectre infrarouge (IR) qui peuvent donner des informations sur l'état biochimique des cellules qui peuvent ensuite être exploités pour cellule de type ou de type maladie classification. Dans cet article, nous montrons: comment obtenir des images infrarouges de tissus humains en utilisant un système FT-IR, comment modifier l'instrumentation existante pour permettre haute définition des capacités d'imagerie, et la façon de visualiser les images FT-IR. Nous présentons ensuite certaines applications de FT-IRpour la pathologie en utilisant le foie et les reins à titre d'exemples. Imagerie FT-IR détient applications passionnantes en fournissant une nouvelle voie pour obtenir des informations biochimiques à partir de cellules et de tissus dans un non-perturbant itinéraire entièrement sans étiquette en vue de donner un nouvel éclairage sur les changements biomoléculaires dans le cadre du processus de la maladie. En outre, cette information biochimique peut potentiellement permettre une analyse objective et automatisée de certains aspects du diagnostic de la maladie.

Introduction

spectroscopie IR a été un outil d'analyse disponibles dans une certaine forme depuis les années 1930; cependant, il ne est fait à l'intérieur de la dernière décennie que le domaine de l'imagerie des tissus avec FT-IR a explosé. Les progrès de la FT-IR pour l'imagerie des tissus ont été entraînée en grande partie par trois développements clés: 1) augmentation de la vitesse d'acquisition de données en raison de la disponibilité de grande matrice de plan focal (FPA) détecteurs qui ont généralement des milliers de détecteurs IR sensibles 1 , 2, 2) le développement d'algorithmes de traitement avancés et puissance de calcul pour gérer de grandes données hyperspectrales fixe 3, et 3) la modélisation de systèmes d'imagerie FT-IR pour maximiser résolution spatiale 4,5. Il ya eu de nombreux haute qualité et très étendues des articles examinant le domaine de la spectroscopie FT-IR récemment 6-16, en plus d'un article de Nature protocoles qui détaille les étapes pour obtenir les spectres de points ou des cartes à partir de tissus 17. Dans cet article, nous allons nous concentrer sur la protocol d'obtenir des images de tissus à l'aide d'un détecteur 128 x 128 FPA dans un système FT-IR modifiée avec des capacités haute définition.

Imagerie FT-IR a longtemps été suggéré d'être un outil potentiellement souhaitable pour l'imagerie cellulaire et tissulaire due à la capacité d'obtenir des images où chaque pixel possède une mine d'informations biochimique. Imagerie FT-IR est basé sur le principe selon lequel les différentes biomolécules dans un échantillon vont absorber quantitativement différentes régions de l'infrarouge moyen; ce qui permet pour la dérivation d'une «empreinte biochimique». Cette empreinte a été démontré dans de nombreuses études pour changer entre différents types de cellules et des états pathologiques. Contrairement à la pratique de la médecine conventionnelle où les taches et les marqueurs immunohistochimiques ont besoin d'être utilisé pour visualiser et identifier des types de cellules et des structures de tissus qui sont utilisés pour guider le diagnostic et les options de traitement, les images de FT-IR sont formés sur la base de la biochimie inhérente du tissu. La techniq actuelleue coloration de tissu pour le diagnostic prend du temps, destructeur, laborieux et nécessite une expertise subjective du pathologiste, alors que FT-IR offre la possibilité de rendre ce processus rapide, non destructive, hautement automatisée et plus objective. En outre, FT-IR fournit une nouvelle voie d'obtenir des informations supplémentaires biochimique qui peuvent ne pas être facilement accessibles en utilisant des techniques classiques de coloration.

L'un des progrès les plus passionnants de ces dernières années a été la disponibilité de méthodes d'imagerie à haute résolution qui peut maintenant permettre pour la visualisation et la caractérisation de types de cellules et des structures tissulaires qui sont essentiels pour le diagnostic de la maladie complète. Une de ces techniques est réflectance totale atténuée (ATR) FT-IR qui comprend une lentille à immersion solide (SIL) d'un indice de réfraction élevé qui permet une imagerie à haute résolution 18, avec de nombreuses études très intéressantes montrant ses applications 19-25. En outre, il wcomme démontré récemment que la résolution spatiale accrue associée à l'imagerie ATR peut permettre la visualisation et la classification des cellules endothéliales et les cellules myoépithéliales dans le tissu du sein qui forment un élément clé de diagnostic du cancer du sein 26. Alors que l'imagerie ATR est très utile, cette technique nécessite l'SIL de prendre contact avec le tissu pour former des images FT-IR; par conséquent, son utilisation est quelque peu limitée pour la pathologie des tissus où de grandes régions de tissus doivent être rapidement imagés.

Une deuxième approche a été démontrée par le couplage d'un objectif à fort grossissement à un système FT-IR existant qui utilise un rayonnement synchrotron en tant que source lumineuse de IR, il est possible d'illuminer complètement un FPA et image avec une taille de pixel effective de 0,54 x 0,54 um. Cela a permis de visualiser les structures clés dans les tissus du sein et de la prostate qui ne ont pas été résolu en utilisant des systèmes FT-IR conventionnels 4. Bien que ces augmentations spectaculaires en image IR resolutio spatialen était excitant, son utilisation reste limitée en raison d'exiger un synchrotron. Par la suite, un système optimal a été conçu qui pourrait également permettre haute définition des capacités d'imagerie avec une taille de pixel de 1,1 x 1,1 um sans l'exigence d'une source de rayonnement synchrotron, mais plutôt en utilisant une source infrarouge de 5 Globar traditionnel. Dans cet article, nous montrons comment modifier un système d'imagerie existante commerciale FT-IR pour permettre la diffraction IR limitée imagerie des tissus avec un signal acceptable pour bruit utilisant objectifs multiples (IR 15X, 36X, 74X) et. La taille de pixels effectifs avec les trois objectifs est de 5,5 x 5,5 um (15X), 2,2 x 2,2 um (36X) et 1,1 x 1,1 um (74X). Nous donnons ensuite quelques exemples de l'importance des gains de la résolution spatiale pour la détection de la maladie dans le foie et les reins des biopsies 27.

Protocol

1. Mise en place d'un microscope à FT-IR et acquisition tissus Images

  1. Section un bloc de tissu fixé au formol et inclus en paraffine à 4 um d'épaisseur sur une diapositive compatible IR en utilisant un microtome. Alternativement, la section a de tissu congelé de l'azote liquide à 4 um d'épaisseur sur une diapositive compatible IR en utilisant un cryostat.
    NOTE: En règle générale, une section de série sera également acquis sur une lame de verre et colorées avec une spéciale (comme l'hématoxyline et de l'éosine (H & E)) ou de teinture immunohistochimique. En outre, les lignées de cellules cultivées peuvent être cultivées sur des lames compatibles IR. Diapositives compatibles IR peuvent être IR diapositives réfléchissantes pour le mode imagerie de réflexion (par exemple, mirrir diapositive, or) ou IR diapositives transparentes pour le mode transmission imagerie (par exemple, BaF 2, CaF 2).
  2. Purger le microscope FT-IR et le spectromètre utilisant l'air sec ou de l'azote gazeux sec pour enlever l'eau atmosphérique du système. Attendez au moins 45 minutes avant l'imagerie pour assurer un Purg approfondiee.
  3. Refroidir à la fois le détecteur FPA (79 K) et le détecteur MCT interne dans le microscope FT-IR en utilisant de l'azote liquide. Refroidir les détecteurs environ tous les 6 heures.
    ATTENTION! L'azote liquide est un fluide cryogénique et peut causer des brûlures par le froid, des engelures et dans des espaces clos asphyxie.
  4. Montez la lame de l'échantillon sur la platine du microscope pour l'imagerie FT-IR.
  5. Assurer la lumière visible est "ON" et ensuite, soit en utilisant les jumelles ou le programme de capture d'échantillon (qui fournit en temps réel d'image visible du tissu), se concentrer sur l'échantillon.
  6. Ouvrez le logiciel de paquet tels que des résolutions pro et cliquez sur «Collect», puis cliquez sur "Diagnostics", puis sélectionnez "Aligner spectromètre. Vérifiez que le trajet de faisceau vers le détecteur spectromètre interne ne est pas obstrué.
  7. Cliquez sur 'Configuration d'imagerie.
  8. Dans l'onglet 'Electronique', sélectionnez le «Speed» appropriée, 'Sous SaRatio de mpling (UDR) »et« paramètres »Filtres en fonction du système.
    NOTE: Dans cet exemple, le réglage est Vitesse = 2,5 KHz, UDR = 4 et Filtres = Aucune.
  9. Dans l'onglet 'Optique' assurer que «source Mid-IR», «Ouvrir l'ouverture» et «100% atténuateur de faisceau» sont sélectionnés.
  10. Pour calibrer le système, dans l'onglet 'Optique', sélectionnez 'détecteur' que 'Ground »,« Microscope Detector »comme de« gauche », puis sélectionnez« Transmission »ou« réflexion »sous« mode Optique »selon le type de glisser utilisé.
  11. Cliquez sur Configuration, qui ouvrira la fenêtre «Control Lancer '.
    NOTE: Pour le mode de réflexion suivez les instructions dans 1,12 et 1,13 et pour le mode de transmission de suivre les instructions à 01.14 à 01.16. Continuer à partir de 1,17 pour la réflexion et la transmission.
  12. Pour le mode de réflexion, dans &# 8216; »cliquez sur« Control Lancer Raw. Aide de la manette de contrôle de scène et regarder l'affichage en direct de l'image interférogramme FT-IR (l'image en haut à droite), se déplacer vers une zone propre sur la diapositive.
  13. Réglez le temps d'intégration à environ 8000 chefs d'accusation. Ensuite, déplacez la scène pour trouver un morceau de tissu avec la structure, de préférence le bord d'un tissu, et de parfaire la mise au point de l'image. Change 'Chaleur' ​​et les options 'Contraste' pour aider à former une image pour améliorer la focalisation, cela ne aura aucun effet sur les données IR. Continuer à partir de 1,18.
  14. Pour le mode de transmission, cliquez sur «Lancer de contrôle» sur «brut». Aide de la manette de contrôle de scène et regarder l'affichage en direct de l'image interférogramme FT-IR (l'image en haut à droite), se déplacer vers une zone propre de la diapositive.
  15. Réglez le temps d'intégration à environ 8000 chefs d'accusation.
  16. Réglez la focalisation basse / objectif de condenseur pour augmenter le nombre de chefs d'accusation à son Maximum. Regardez la forme de l'image en bas à droite dans le contrôle Lancer pour se assurer qu'il est en apparence gaussien et relativement uniforme. Ajustez à nouveau le temps d'intégration à environ 8000 chefs d'accusation.
    NOTE: Si l'un des pixels de l'image d'interférogramme FT-IR tourner blanc, réduire le temps d'intégration.
  17. Déplacez la scène pour trouver un morceau de tissu avec la structure, de préférence le bord d'un tissu et de parfaire la mise au point de l'image. Vous pouvez également modifier les options de chaleur et de contraste pour aider à former une image pour améliorer la focalisation, mais ne aura aucun effet sur les données d'IR.
  18. Aide de la manette de commande de l'étage, se déplacer vers une zone propre de la diapositive. Appuyez sur le bouton «Calibrer». Assurer la 'Out Of Range (BR)' valeur est inférieure à 50 et la différence entre le 'haut flux' et compte 'faible flux' est au moins 4000 points.
  19. Sélectionnez deux fois 'OK'. Dans les onglets de sélectionner optique; «MCT» 'détecteur' =, 'Microsface Detector '= «droit» puis cliquez sur «Setup». À ce stade, il y aura un interférogramme FT-IR sur l'écran. Cliquez sur "Trouver Centerburst '. Cliquez sur 'Ok'.
  20. Dans l'onglet 'Optique', sélectionnez de nouveau 'détecteur' = 'Ground', 'Microscope Detector' = 'gauche' et sélectionnez 'Configuration'.
  21. In Control Lancer - assurer l'image est toujours sur une surface propre et cliquez sur «Calibrer» à nouveau. Cliquez sur 'Ok'.
  22. Ensuite, recueillir une image FT-IR fond pour corriger absorbance de l'atmosphère, le système et un toboggan. Allez à l'onglet 'Electronique' et sélectionnez une résolution spectrale appropriée, typiquement de 4 cm -1 ou 8 cm -1 pour le tissu.
  23. Allez à l'onglet «Contexte» et tapez 128 dans les «scans de co-add». Sélectionnez le 'Nouveau fichier ... "bouton et placer le fichier dans le pli de fond appropriéeer. Vérifiez l'onglet «Imaging» pour assurer une mosaïquage est de 1. Cliquez sur «Contexte», attendez pour le balayage à la fin et confirmer où enregistrer le fichier. Cliquez sur une région sur l'image FT-IR fond et vérifier le spectre.
  24. Pour prendre une grande image en mosaïque de l'échantillon, sélectionnez l'onglet 'imagerie' et insérez le nombre de X et Y cadres pour la taille de la mosaïque que vous souhaitez acquérir.
  25. Cliquez sur 'Setup' et dans le contrôle Lancer utiliser la vue en direct IR pour trouver la zone d'intérêt. Si vous prenez une mosaïque, centrer le flux en direct dans le milieu de la zone d'intérêt. Cliquez sur 'Ok'. Allez à l'onglet 'Electronique' et tapez le nombre de balayages de co-ajouter (généralement une valeur comprise entre 2 et 16 balayages pour le tissu). Cliquez sur «Scan».
  26. Vérifiez l'image FT-IR recueillies sur l'écran pour se assurer qu'il regarde ciblée. Cliquez sur l'image pour faire apparaître un spectre IR partir de cet emplacement et vérifier qu'il semble avoir un signal acceptable au bruit. Acquire une image visible de l'échantillon.
  27. Enregistrez l'image et de l'exporter au format requis, tels que ENVI-IDL.

2. Adapter un microscope à FT-IR pour les capacités haute définition

REMARQUE: La plupart des systèmes FT-IR sont équipés d'un objectif d'environ un grossissement 15X et 0,5 ouverture numérique (NA). Pour l'image en mode haute définition, un IR compatible 36X ou 74X objectif peut être utilisé pour donner des capacités d'imagerie de diffraction limitées.

  1. Retirer 15X L'objectif du système en dévissant dans le sens antihoraire.
  2. Visser soit l'objectif 36X ou 74X à sa place. Alignez l'objectif avant de l'utiliser. Utilisation des tubes d'extension de la lentille pour amener l'objectif suffisamment proche de l'échantillon.
  3. Placez le tissu sous le nouvel objectif et de se concentrer en utilisant la lumière visible en utilisant soit les jumelles ou programme Capture échantillon.
    NOTE: imagerie haute définition doit être effectuée en mode de transmission. La distance de travail très proche de laobjectifs soi (1-2 mm) et très faible profondeur de focalisation exige concentrant lentement et avec précaution, en prenant le temps d'abaisser l'objectif sans toucher l'échantillon.
  4. Suivez les instructions de 1,6 à 1,11.
    NOTE: En raison d'être beaucoup plus difficile de se concentrer et beaucoup moins de lumière atteignant le détecteur, le protocole suivant est ajusté en fonction de 1,14.
  5. En mode de transmission, cliquez sur «brut». Aide de la manette de contrôle de scène et regarder l'affichage en direct de l'image interférogramme FT-IR (l'image en haut à droite), se déplacer vers le tissu et se concentrer (idéalement sur un bord).
    REMARQUE: Cela peut être difficile, donc ajuster la «chaleur» et les options «Contraste» pour aider à former une image pour améliorer la focalisation (ces options ne ont aucun effet sur les données d'IR).
  6. Une fois la mise, en utilisant la manette de contrôle de scène et le Live View IR passage à un endroit propre de la diapositive. Réglez le temps d'intégration à environ 8000 chefs d'accusation. Ajuster le bas pour objectif de focalisationaugmenter le nombre de coups au maximum. Ajustez à nouveau le temps d'intégration à environ 8000 chefs d'accusation.
  7. Déplacez la scène pour trouver un morceau de tissu avec la structure, de préférence le bord d'un tissu, et de parfaire la mise au point de l'image.
  8. Si mosaïquage une image à haute résolution, régler le stade pour permettre le mouvement correcte exigée sur de longues distances pour mosaïquage précis. Pour modifier les réglages de la distance de la scène, allez à 'étape de configuration "dans le contrôle Lancer et régler les paramètres d'alignement horizontal et vertical pour permettre correcte mosaïquage.
  9. En utilisant le joystick mouvement de commande de scène à un endroit propre de la diapositive. Appuyez sur le bouton «Calibrer». Assurer la hors de portée (BR) valeur est inférieure à 50 pour les deux 36X et 74X objectifs. Assurez-vous la différence entre le haut flux et les valeurs faible flux est au moins 1 000 chefs d'accusation pour l'objectif 74X et 2000 compte pour l'objectif 36X.
  10. Continuer de 1,19 à 1,27. Le nombre de balayages à 1,23 et1,25 devront être ajustées en raison de signal réduit à environ 256 scans pour l'image de fond et de 16 à 128 analyses pour l'image de tissu.

3. Visualisation et de classer les ensembles de données spectrales IR

NOTE: Dans cette section, nous allons discuter de la façon de visualiser et extraire des données à partir d'images spectrales en utilisant le traitement d'image géospatiales et l'analyse des logiciels tels que ENVI + IDL, mais le processus est très similaire pour tout logiciel alternatif tels que MATLAB, logiciels libres tels que CytoSpec ou propre logiciel de l'instrument développeur. Il ya quelques différentes techniques de traitement spectrale qui peuvent être effectuées sur les données IR.

  1. Ouvrir traitement d'images géospatiales et des logiciels d'analyse et de charger le fichier de données IR.
  2. Appliquer un algorithme de correction de base pour les données IR en sélectionnant «Outils spectrales» et faire défiler vers le bas et cliquez sur "spectres d'absorbance". Observer un menu pop-up et sélectionnez "Baseline Correction "
    REMARQUE: correction de base va supprimer une pente décalage de base à partir des données due à la diffusion
  3. Effectuer une normalisation spectrale, en faisant le rapport des données à un certain pic spectral (typiquement d'amide I (1650 cm -1) ou un amide II (1550 cm -1)) ou de la zone sous une région définie du spectre. Pour cela, sélectionnez "spectres normale" dans les "spectres d'absorption" des options de menu.
    REMARQUE: Spectral normalisation est effectuée de sorte que les différences dans les spectres sont de véritables différences biochimiques et non en raison de l'épaisseur ou les différences de densité entre les échantillons.
  4. Utilisez un algorithme de réduction du bruit pour supprimer le bruit à partir des spectres si nécessaire 28.
    NOTE: Il ya plusieurs approches disponibles par lequel la correction de base, la normalisation spectrale et la réduction du bruit peuvent être atteints, avec la plupart des logiciels ayant algorithmes automatisés construits dans En outre, il ya un nombre d'approches nouvelles qui permettront de corriger pour.aberrations spectrales, qui ont été examinées en détail 29-42; Toutefois, la communauté ne pas encore d'accord sur lequel d'entre eux sont nécessaires.
  5. Observez une liste de toutes les fréquences IR recueillies dans l'image (généralement d'une gamme spectrale de 900 à 4000 cm -1). Cliquer sur les fréquences qui correspondent à des biomolécules spécifiques d'observer une image du tissu à la fréquence sélectionnée.
    1. Par exemple, cliquez sur la bande de 1,650 cm d'observer la distribution des protéines dans l'échantillon. Vous pouvez également cliquer sur la bande de 1,080 cm d'observer la distribution des acides nucléiques dans l'échantillon. Utilisez nombre d'onde 1650 cm -1.
  6. Créez des images supplémentaires en calculant rapports spectraux de pointe de hauteur, les ratios de surface de pic etc. qui permettront pour la visualisation des différents composants biomoléculaires. Cliquez sur 'Outils' spectrales puis sélectionnez «Ratios de la hauteur du pic» ou «Calculer Zone de l'image 'pour créer des images.
  7. Scannez la coupe de tissu adjacent correspondant qui est colorées en utilisant un système coulissant imageur tout distinct qui capture des images en fond clair. Parallèlement à l'image IR, faire apparaître l'image numérique du tissu coloré avec un programme d'image visible.
  8. Faites un clic droit sur l'image à une région d'intérêt et sélectionnez le profil de Z '. Cela donnera l'information spectrale au pixel sélectionné.
  9. Regardez les spectres IR de plusieurs pixels de plusieurs classes, telles que la comparaison des types de cellules, états pathologiques. Marquer les pixels spécifiques sur l'image à l'aide du «zones d'intérêt» (ROI) outil. Pour effectuer cela, cliquez droit sur l'image et sélectionnez "outil de ROI. Créez les classes qui doivent être étiquetés, par exemple normale, la dysplasie, et les classes de cancer. Sélectionnez ensuite, «type de ROI '-' Point '. Ensuite, sélectionnez la classe à sélectionner des pixels pour et se appuyer sur les pixels appropriés sur l'image IR. Dériver les spectres moyens fou chacune des classes en utilisant l'outil «ROI moyen '.
  10. Comparer spectres dérivés en traçant dans le logiciel graphique.

Representative Results

FT-IR imagerie permet la dérivation d'images infrarouges de tissus qui peuvent donner des contrastes différents en fonction de la fréquence infrarouge d'intérêt. En outre, dans une image d'IR, chaque pixel comprend de l'ensemble du spectre IR, avec des pics correspondant aux différentes biomolécules qui peuvent donner des informations sur les propriétés biochimiques des types cellulaires ou états maladifs (figure 1). Ici, nous avons montré comment comparer les signatures spectrales entre les classes, mais plus avancé classement automatisé est possible en utilisant des algorithmes supplémentaires 3,43-50, telles que la classification bayésienne, les forêts aléatoires, réseaux de neurones artificiels, et Hiérarchique Cluster Analysis peut être effectuée sur le données. Approches de classification supervisée permettront la construction d'un classificateur qui peuvent être formés pour permettre la reconnaissance automatique des types de cellules ou états pathologiques. Méthodes de classification non supervisées peuvent être utilisés pour rechercher des dif naturelleconférences dans les tissus ou cellules en raison de la variance biochimique.

Instruments FT-IR a évolué au cours des dernières décennies, de la mesure dans un simple / mode de mappage de point à l'aide IR ouvertures opaques en mode d'imagerie utilisant objectifs Cassegrain, en utilisant soit un objectif d'éclairage couplé avec un objectif de collecte dans la transmission-mode ou un seul objectif que les deux se allume et se accumule dans la réflexion en mode (Figure 2). Il a été récemment démontré que l'objectif de collecte dans le mode de transmission peut être commutée pour un plus fort grossissement et l'ouverture numérique de l'objectif pour permettre la formation d'images IR diffraction limitée, qui conduit à des augmentations substantielles de la résolution spatiale des images infrarouges collectées 4,5. Les progrès de la résolution spatiale pour l'imagerie de tissus ont été d'une importance critique comme on peut maintenant déterminer les types de cellules et des structures tissulaires, par exemple les unités fonctionnelles du rein, les glomérules, en utilisant adapté à l'interneSystèmes FT-IR (Figure 3).

Haute définition imagerie FT-IR permet des images détaillées des tissus à examiner pour identifier les régions anormales et d'identifier les différences biochimiques entre les différents types de cellules. Dans une âme en tissu de foie, il est possible de visualiser les hépatocytes et les régions de l'infiltration fibrose qui divise deux zones distinctes de la dysplasie et la cirrhose non dysplasique (figure 4). Nous travaillons à exploiter cette direction la fabrication d'outils de diagnostic automatisés pour une utilisation dans les cas difficiles de maladie du foie.

Fait important, la résolution spatiale accrue peut désormais nous permettre d'isoler les caractéristiques structurelles spécifiques qui peuvent être modifiés chimiquement par la maladie avant que des changements histologiques sont apparents. Par exemple, nous nous concentrons sur l'identification des changements biochimiques dans les structures rénale glomérulaire tels que la capsule de Bowman, mésangium, membrane basale glomérulaire et la membrane basale tubulaire, avant changements identifiés par le pathologiste peuvent être observées (Figure 5). En particulier, nous sommes intéressés à identifier les changements associés à la progression de la néphropathie diabétique et le rejet chronique chez les patients transplantés, où les techniques actuelles ne parviennent pas à identifier les changements dans un mode assez tôt pour une intervention réussie.

Figure 1
Figure 1. images FT-IR et le spectre d'un noyau de foie. Image de (A) H & E colorées base de biopsie du foie et des images d'absorbance IR de l'article de série du même noyau en (B) 3286 cm -1 et (C) 2603 cm -1, ce qui a mis en évidence différentes caractéristiques structurelles. (D) du spectre IR typique du tissu, avec des pics importants marqués. Barre d'échelle = 100 um.fig1large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Optique détaillant __gVirt_NP_NNS_NNPS<__ modes de fonctionnement du microscope FT-IR schématiques. (A) dans le mode de transmission, l'échantillon est illuminé à travers l'objectif de fond, et la lumière traversant l'échantillon est recueilli par l'objectif prioritaire. (B) En mode de réflexion, l'objectif prioritaire sert à la fois pour éclairer l'échantillon et pour recueillir la lumière réfléchie. L'objectif de fond ne est pas utilisé. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Comparaison des différenobjectifs de microscope sur les images t FT-IR d'un glomérule rénal à 2925 cm -1. (A) 15X collecte objectifs avec NA = 0,5 (taille 5,5 x 5,5 um de pixel). (B) l'objectif 36X de collecte avec NA = 0,5 (taille 2,2 x 2,2 um de pixel). (C) la collecte objectif 74X avec NA = 0,65 (taille 1,1 x 1,1 um de pixel). La barre d'échelle = 50 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. différences spectrales entre fibrose et hépatocytes dans un noyau du foie. (A) H & E teinté coeur de la biopsie hépatique. (B) l'image d'une section noyau en série numérisée dans FT-IR (configuration objectif 36X). (C) RepLes spectres représen- des hépatocytes et la fibrose, pris à partir de régions de tissus indiqués par des flèches (A) et (B). Barre d'échelle = 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Différenciation des caractéristiques de biopsie de tissu rénal par l'utilisation de l'imagerie haute définition FT-IR. (A) section acide périodique de Schiff colorées avec les caractéristiques à extraire étiqueté. (B) à haute définition d'image FT-IR de la région CH 2 asymétrique étirement (36X d'installation objectif) d'une section de série du même tissu. (C) Caractéristiques étiqueté (A) extrait en utilisant l'image FT-IR (B) pour pouvoir chimiquement differentiate les quatre caractéristiques du tissu. La barre d'échelle = 50 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

FT-IR est une modalité émergente pour sans étiquette biochimique imagerie des coupes de tissus, avec le potentiel d'avoir un rôle important dans l'amélioration de la norme actuelle de diagnostic en pathologie. La norme de référence actuelle pour la pathologie nécessite tissus à biopsie, fixe dans le formol, inclus en paraffine, sectionnés à plusieurs reprises, et colorés avec plusieurs taches. Un pathologiste hautement qualifié doit évaluer subjectivement visuellement la structure de tissu et de la morphologie cellulaire pour déterminer un diagnostic. Ici, nous montrons comment recueillir les images infrarouges haute résolution à partir du même type de sections et de discuter de certaines des approches informatiques pour examiner les différences chimiques entre les types de cellules et états pathologiques.

Les étapes critiques au sein de ce protocole doivent se assurer que les tissus sont très soigneusement ciblées et que le système est bien calibrés pour assurer que les données spectroscopiques de très haute qualité. La prise en charge lors de la configuration du système est particulièrement Criti cal lorsque vous travaillez avec des objectifs à fort grossissement. Pour faciliter le dépannage, la liste suivante couvre certaines des difficultés rencontrées potentiels;

Problème: Faible intensité IR lors de l'imagerie en réflexion. Solution: Vérifiez IR diaporama orientation que le revêtement réfléchissant peut être du mauvais côté de la glissière.

Problème: Signal faible / Rouge panneau d'avertissement dans le contrôle Lancer. Solution: détecteurs Refroidir les LN2. L'azote liquide est nécessaire pour les détecteurs FPA pour fonctionner et nécessite d'être régulièrement complété.

Problème: Velocity erreurs erreur / de mouvement. Solution: Réinitialiser spectromètre et réduire les vibrations. Vibrations causeront le miroir se déplaçant dans l'interféromètre être dérangé.

Problème: les pointes de vapeur d'eau dans les données. Solution: Augmentez purge sur le système et protéger l'échantillon de l'air.

Problème: centerburst valide. Solution: Trouver centerburst nouveau.

e_content "> Problème:. Faible différence de flux de transmission, même si concentré. Solution: Ajustez condenseur fond Cela se produira comme la lumière infrarouge ne est pas focalisé sur un point de l'échantillon.

Dans cet article, nous nous sommes concentrés sur la façon d'acquérir des images haute définition IR de tissus de transmission ou de mode de transflectance. La nature de l'imagerie FT-IR, est qu'il existe de multiples modifications qui peuvent être apportées à l'acquisition de données, tels que, type de substrat, technique de fixation, l'épaisseur de l'échantillon, la résolution spectrale, interféromètre vitesse au miroir etc. L'effet de ces paramètres a été discuté de façon très détaillée récemment 4,5,17,51.

Il ya un certain nombre de modifications qui peuvent être apportées au système d'imagerie y compris l'imagerie en mode ATR 10,24,26 et thermiques utilisant des approches à l'échelle nanométrique 52,53 pour permettre l'imagerie infrarouge haute résolution. La principale limitation à l'imagerie infrarouge haute résolution est que le tiProblèmes et doivent être soigneusement préparés et assez mince pour IR pour passer à travers (généralement 4 um d'épaisseur). En outre, la transmission et la réflexion FT-IR imagerie exige que les échantillons à être sec en raison de l'absorption de IR par l'eau. Cependant, l'imagerie FT-IR a des avantages significatifs par rapport aux autres techniques, en ce qu'elle peut très rapidement l'image de grandes zones de tissu tout en découlant informations biochimiques riche et détaillé. D'autres techniques similaires qui dérivent informations biochimiques dans un mode sans marquage comprennent la spectroscopie Raman, mais le moment de l'acquisition des données est beaucoup plus lente pour acquérir des images. Approches d'imagerie Raman New émergent y compris la diffusion Raman stimulée (SRS) et cohérente antistokes diffusion Raman (CARS); cependant, ils ont une portée un accès limité ou imagerie spectrale à fréquence unique.

Les progrès de la vitesse d'acquisition de données, la résolution spatiale, et la disponibilité des approches computationnelles ont été d'une valeur inestimable dans la prise imag FT-IRment une approche plus réalisable pour la traduction comme un nouvel outil d'imagerie dans la pathologie. Les progrès récents de la résolution spatiale ont été particulièrement importantes pour la pathologie tissulaire due à des types de cellules clés ne étant pas résolu en utilisant des systèmes classiques d'imagerie FT-IR. L'étude récente de Reddy et al. a montré comment modéliser un système idéal pour obtenir la résolution spatiale optimale d'un système d'imagerie 5 FT-IR. L'exemple de tissu rénal présentée dans cet article démontre l'importance des résolutions spatiales plus élevées afin d'en extraire des informations à partir de structures biochimique glomérulaire (de la figure 3 et la figure 5). Dans l'avenir, de nouvelles avancées dans Quantum Cascade Lasers comme très vives sources de lumière IR 54-57, imagerie spectrale 3D 58, et des percées dans le domaine des technologies à l'échelle nanométrique IR 52,53,59,60 détiennent de nouvelles avenues passionnants de la recherche qui peuvent avoir énormes implications dans l'avenir de l'imagerie des tissus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cary 600 Series FT-IR system Agilent Multiple configurations  Alternate FT-IR imaging systems exist
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR Edmund Optics 66-592
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR Edmund Optics 66-586
MirrIR slide Kevley Technologies CFR For FT-IR reflection-mode measurements
Barium Fluoride slides International Crystal Laboratories Multiple sizes For FT-IR transmission-mode measurements
Calcium Fluoride slides International Crystal Laboratories Multiple sizes For FT-IR transmission-mode measurements
Dry Nitrogen/Dry Air gas Multiple gas suppliers Multiple sizes
Hexane Sigma Aldrich Multiple sizes For deparafinizing tissue
Liquid Nitrogen Multiple cryogenic liquid suppliers Multiple sizes
ENVI-IDL software Exelis-Vis Other software packages available
Whole slide Imager Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) To image stained slides

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