Aproveitando a demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder para Pretargeted PET Imagem

1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally
Bioengineering

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Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. J. Vis. Exp. (96), e52335, doi:10.3791/52335 (2015).

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Abstract

Introduction

Ao longo dos últimos trinta anos, a tomografia por emissão de pósitrons (PET) tornou-se uma ferramenta indispensável para o diagnóstico e tratamento do câncer. Os anticorpos têm sido considerados promissores vectores para a entrega de radioisótopos emissores de positrões para tumores devido à sua afinidade e especificidade para requintado biomarcadores de cancro. 1,2 farmacocinética No entanto, a relativamente lenta in vivo de anticorpos exige a utilização de radioisótopos com multi-dia semi-vidas físicas. Esta combinação pode render altas doses de radiação para os órgãos não-alvo de doentes, uma importante complicação que é de especial importância clínica desde radioimunoconjugados são injetados por via intravenosa e, portanto, - ao contrário de tomografias corpo parciais - resultado em doses absorvidas em cada parte do corpo, independentemente dos tecidos interrogados.

A fim de contornar este problema, esforço significativo foi dedicado ao desenvolvimento de estratégias de imagem PET que dissociar o radioisótopo e do grupo alvo, o que reforça as propriedades vantajosas de anticorpos contornando simultaneamente suas limitações farmacocinéticos intrínsecos. Estas estratégias - mais frequentemente denominado pr�marca�o ou segmentação de várias etapas - empregam tipicamente quatro passos: (1) a administração de um anticorpo capaz de se ligar tanto a um antigénio e um radioligando; (2) a acumulação de anticorpos no tecido-alvo e a sua depuração do sangue; (3) a administração de uma pequena molécula radioactivo; e (4) da ligação in vivo do ligando radioactivo ao anticorpo, seguido pela rápida eliminação do excesso de radioligando 3-8 Em alguns casos., um agente de compensação adicional é injectado entre as etapas 2 e 3, a fim de acelerar a eliminação de qualquer anticorpo que ainda tem que se ligar o tumor e permanece no sangue. 5

Em termos gerais, twO tipos de estratégias pré-direccionamento são mais prevalentes na literatura. Embora ambos provaram ser um sucesso em modelos pré-clínicos, eles também possuem limitações fundamentais que têm impedido a sua aplicabilidade clínica. A primeira estratégia baseia-se na elevada afinidade entre os anticorpos e conjugados estreptavidina-radiomarcadores modificados com biotina; no entanto, a imunogenicidade dos anticorpos modificados com estreptavidina provou ser um problema preocupante no que diz respeito à tradução. 5,6,9,10 A segunda estratégia, em contrapartida, utiliza anticorpos biespecíficos que foram geneticamente modificadas para se ligarem tanto um cancro antigénio biomarcador e um pequeno hapteno marcado radioactivamente molécula. 3,11-14 Embora esta última via é certamente criativa, a sua ampla aplicabilidade é limitada pela complexidade, custo e falta de modularidade do sistema.

Recentemente, desenvolveu e publicou uma metodologia de imagem PET pretargeted baseado na procura de elétron inversa Diels-Alder (IEDDA) reação de cicloadição entre -cicloocteno trans (TCO) e tetrazina (Tz;. Figura 1) 11 Embora a própria reação tem sido conhecida há décadas, IEDDA química experimentou um renascimento nos últimos anos como uma técnica bioconjugação clique química, como ilustrado pelo o trabalho fascinante dos grupos de Ralph Weissleder, Joseph Fox, e Peter Conti entre outros. 12-15 A IEDDA cicloadição foi aplicado numa grande variedade de configurações, incluindo imagiologia por fluorescência com péptidos, anticorpos e nanopartículas, bem como imagiologia nuclear . com ambas radiohalogens e radiometais 16-26 A ligação é de alto rendimento, limpo, rápido (k 1> 30.000 M-1 s-1), seletivo, e - criticamente -. bioorthogonal 27 E, enquanto uma série de tipos de clique química - incluindo cicloadições catalisada por Cu azida-alcino, cicloadições azida-alcino promoveu-deformação e Staudinger ligções -. bioorthogonal estão bem, é a combinação única de cinética de reação rápida e bioorthogonality que faz IEDDA química tão bem adaptado para pr�marca�o aplicações em organismos inteiros 28,29 Nesse sentido, é importante notar que o relatório recente da nossa laboratórios não foi o primeiro a aplicar IEDDA química para pr�marca�o: o primeiro relato da imagem pretargeted com IEDDA surgiu a partir do trabalho de Rossin, et al e contou com uma metodologia SPECT empregando um 111 tetrazina Em marcado 30..

Como discutimos acima, a metodologia pr�marca�o tem quatro passos bastante simples (Figura 2). No protocolo a mão, uma estratégia para a pretargeted imagens PET de cancro colo-rectal que emprega uma 64 Cu-NOTE-radioligando marcado tetrazina e um conjugado de TCO-modificada do anticorpo huA33 será descrito. No entanto, em última análise, a modularidade desta metodologia é um dos seus grEatest activos, como a porção -cicloocteno trans pode ser adicionado a qualquer anticorpo não de internalização, e o tetrazina pode ser ligado a uma vasta variedade de repórteres radioactivos.

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Protocol

ÉTICA DECLARAÇÃO: Todas as experiências com animais in vivo descritos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado e sob as diretrizes éticas do Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).

1. Síntese de Tz-Bn-NOTA

  1. Num recipiente de reacção pequeno, dissolver 7 mg NH2-Bn-NOTE (1,25 x 10 ~ 2 mmol) em 600 ul de tampão de NaHCO3 (0,1 M, pH 8,1). Verificar o pH da solução. Se necessário, ajustar o pH da solução para 8,1 utilizando pequenas alíquotas de 0,1 M de Na 2 CO 3.
  2. Adicionar a solução de NH 2-Bn-NOTE a 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
    NOTA: O Tz-NHS pode ser pesadas seco ou adicionado de uma solução de estoque de DMSO ou DMF seco (<50 ul).
  3. Permitir que a solução de reacção resultante a reagir durante 30 min à TAcom agitação moderada.
  4. Após 30 min, purificar o produto utilizando cromatografia em C 18 de HPLC de fase reversa, para remover não reagido NH2-Bn-NOTE. O NH 2 -Bn-NOTA pode ser monitorado em um comprimento de onda de 254 nm, enquanto o Tz-NHS e Tz-Bn-NOTA são melhor monitorados em um comprimento de onda de 525 nm.
    NOTA: Os tempos de retenção são obviamente altamente dependente da configuração do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc). No entanto, para apresentar um exemplo, se um gradiente de 0: 100 de MeCN / H 2 O (ambos com 0,1% de TFA) até 100: 0 de MeCN / H2O ao longo de 25 min e uma analítica de 4,6 x 250 mm coluna C 18 é usada , os tempos de retenção de Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, e NH2-Bn-NOTE será de cerca de 15 min, 16,5 min e 10 min, respectivamente. O produto pode ser purificado a partir de outros componentes da reacção em um único ou múltiplos de execução é executado utilizando uma coluna C 18 preparativa ou semi-preparativa de HPLC. 1 H-RMN, analytical HPLC e ESI-MS são todos os métodos que podem ser utilizados para verificar a pureza do precursor de completada Tz-Bn-NOTE 11.
  5. Congelar o eluente HPLC coletados utilizando nitrogênio líquido.
  6. Enrole o tubo de coleta congelado em papel de alumínio opaco.
  7. Colocar o tubo de recolha congelado num recipiente de liofilização S / N para remover a fase móvel de HPLC.
  8. Armazenar o produto purificado (um sólido cor de rosa claro) no escuro a -80 ° C.
    NOTA: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. O precursor Tz-Bn-NOTE concluída é estável durante pelo menos 1 ano, sob estas condições.

2. Preparação de huA33-TCO Imunoconjugado

  1. Num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar um 1 mg / ml de solução de TCO-NHS em DMF seca (2,7 mM).
  2. Num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar uma solução de (13,3 mM) de huA33 em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 (0,01 M de PO 4 3- 2 mg / ml,
  3. Usando pequenas alíquotas (<5 ul) de 0,1 M de Na 2 CO 3, ajustar o pH da solução de anticorpo para 8,8-9,0. Utilize um papel de pH ou um medidor de pH com uma microeletrodos para monitorar o pH, e ter cuidado para não permitir que o pH a subir acima de pH 9,0.
  4. Uma vez que a solução de anticorpo é o pH correcto, adicionar um volume da solução de TCO-NHS correspondentes a 8 equivalentes molares do éster activado. Por exemplo, adicionar 7,9 mL de solução a 1 mg / ml TCO-NHS (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) para 1 ml de solução de 2 mg / mL de anticorpo huA33 (1,33 x 10 -8 moles huA33). Não ultrapasse 5% em volume em DMF a solução.
  5. Misturar suavemente a solução invertendo o tubo várias vezes microcentrífuga.
  6. Enrole o tubo de microcentrífuga em papel de alumínio opaco.
  7. Permitir que a solução a incubar durante 1 hr à temperatura ambiente com agitação suave.
  8. Após 1 h à temperatura ambiente, purificar o imunoconjugado resultante utilizando um siz descartável pré-embaladoe exclusão coluna de dessalinização. Em primeiro lugar, lavar a coluna de exclusão de tamanho tal como descrito pelo fornecedor para remover quaisquer conservantes presentes na coluna durante o armazenamento. Em seguida, adicione a mistura de reacção para a coluna de exclusão de tamanho, lavar a coluna com 1,5 ml de 0,9% de solução salina estéril, e em seguida recolher o produto utilizando-se 2 ml de solução salina estéril a 0,9%, como o eluente.
    NOTA: Esta etapa irá produzir o concluída huA33-TCO como uma solução de 2 ml.
  9. Medir a concentração da resultante huA33-TCO em um espectrofotómetro de UV-Vis.
  10. Se uma concentração mais elevada é desejada, concentra-se a solução huA33-TCO utilizando uma unidade de filtração centrífuga com um peso molecular de 50.000 de corte.
    NOTA: É importante observar que enquanto huA33 e uma variedade de outros anticorpos conhecidos (por exemplo, bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, e J591) são muito tolerantes de ser concentrada, agregação e precipitação pode ocorrer após concentração em outros casos. Pesquisadores de tentar esta procedure com um novo anticorpo deve confiar na literatura ou o seu próprio conhecimento do anticorpo em questão diz respeito à possibilidade ou não de se concentrar o anticorpo.
  11. Guardar o imunoconjugado completado huA33-TCO a 4 ° C no escuro.
    NOTA: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. O conjugado mAb TCO preenchido deve ser estável durante pelo menos 3 meses sob estas condições de armazenamento.

3. 64 Cu Radiomarcação de Tz-Bn-NOTA

NOTA: Este passo do protocolo envolve o manuseamento e manipulação de radioactividade. Antes de executar estes passos - ou realizar qualquer outro trabalho com radioatividade - pesquisadores deve consultar com Radiação Secretaria de Segurança de sua instituição de origem. Tomar todas as medidas possíveis para minimizar a exposição à radiação ionizante.

  1. Num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar uma solução de Tz-Bn-NOTE 0,5 mg / ml (723 uM).
  2. Numa MicroC 1,7 mlentrifuge tubo, adicionar 10 ul da solução Tz-Bn-NOTE (5 ug) a 400 uL de tampão NH4OAc 0,2 M pH 5,5.
  3. No interesse do bom radioquímica nota-keeping, medir e registrar a quantidade de radioactividade na amostra usando um calibrador de dose antes e depois das etapas que se seguiram no protocolo abaixo (3,4-3,8). Isso vai ajudar com a determinação exata da yields radioquímica.
  4. Adicionar 2.000 �i (74 MBq) de 64 Cu à solução Tz-Bn-NOTA.
    NOTA: Tipicamente, [64 Cu] CuCl 2 é fornecido em um pequeno volume (<30 ul) de HCl 0,1 N, e, por conseguinte, apenas pequenas quantidades (<10 ul) desta solução de estoque são necessários para a reacção de marcação radioactiva. Se forem necessárias maiores volumes do [64 Cu] CuCl2 estoque, a reacção de marcação radioactiva é tolerante de aumentar o volume de reacção total. No entanto, o pH da solução de reacção radiomarcação devem ser cuidadosamente monitorizados para assegurarque ele não caia abaixo de pH 4.0.
  5. Permitir que a solução a incubar durante 10 min à temperatura ambiente com agitação suave.
  6. Após 10 min de incubação, purificar o produto usando cromatografia de HPLC de fase reversa C-18. Os tempos de retenção são obviamente altamente dependente da configuração do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc). No entanto, para apresentar um exemplo, se um gradiente de 5:95 de MeCN / H 2 O (ambos com 0,1% de TFA) a 95: 5 de MeCN / H2O ao longo de 15 min é usada, o tempo de retenção de 64 Cu-Tz- Bn-NOTA deve ser em torno de 9,8 min, enquanto livre, não complexada 64 Cu eluirá com a frente do solvente em cerca de 2-4 min.
  7. Usando um evaporador rotativo, remover o eluente de HPLC.
  8. Recolher o produto de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA em 0,9% de solução salina estéril.
    NOTA: Tendo em conta a 12,7 h meia-vida física de 64 Cu, este não é um ponto de paragem no processo aceitável. Realizar a síntese de 64 Cu-Tz-Bn-NOTUm imediatamente antes da injeção do radioactivo, e siga o passo a passo 3.7 imediatamente 4.5.

4. In Vivo Pretargeted de imagem PET

NOTA: Como no Protocolo Secção 3, esta etapa do protocolo envolve o manuseamento e manipulação de radioactividade. Antes de executar estes passos pesquisadores deve consultar com Radiação Secretaria de Segurança de sua instituição de origem. Tomar todas as medidas possíveis para minimizar a exposição à radiação ionizante.

  1. Em um rato nu atímica feminino, implante subcutâneo 1 x 10 células de câncer colorretal 6 SW1222 e ​​permitir que estes se transformar em um 100-150 mm 3 heterólogo (9-12 dias após a inoculação) 11.
  2. Dilui-se uma alíquota da solução-huA33 TCO Protocolo de secção 2 para uma concentração de 0,5 mg / ml em 0,9% de solução salina estéril.
  3. Injectar 200 ul da solução-huA33 TCO (100 ug) na veia da cauda do rato xenoenxerto de rolamento.
  4. Permitir que 24 horas para a acumulação do huA33-TCO no tumor do mouse.
  5. Dilui-se a 64 de Cu-Tz-Bn-NOTE radioligando para uma concentração de 1,5 mCi / ml em 0,9% de solução salina estéril.
  6. Injectar 200 ul da solução de ligando radioactivo 64 Cu-Tz-Bn-NOTE (300 uCi; 11,1; 1,6 MBq de 64 nmol de Cu-Tz-Bn-NOTA, assumindo uma actividade especifica de 6,7 MBq / nmol) na veia da cauda do camundongos portadores de xenotransplante.
  7. No ponto de tempo de imagem desejada (por exemplo, 2, 6, 12, ou 24 horas após a injecção), anestesiar o rato com uma isoflurano a 2%: mistura de gás oxigénio.
  8. Posicione o mouse em cima da cama do pequeno scanner de PET animal. Manter a anestesia durante a varredura usando um isoflurano 1%: mistura de gás oxigênio. Antes de colocar o animal na mesa do scanner, verifique anestesia utilizando o método toe-pitada e aplicar pomada veterinária aos olhos do mouse para evitar o ressecamento durante a anestesia.
  9. Adquirir os dados de PET para o mouse através de um estáticodigitalizar com um mínimo de 20 milhões de eventos coincidentes, utilizando uma janela de energia de 350-700 keV e uma janela de tempo coincidência de 6 ns. Depois de concluir a aquisição da imagem, não deixe o mouse autônoma e não colocá-lo em uma gaiola com outros ratos até que recuperou a consciência.

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Representative Results

Os três primeiros passos da experiência - a síntese de Tz-Bn-NOTA, a conjugação da TCO para huA33, e a marcação radioactiva do Tz-Bn-NOTE construir (Figuras 3 e 4) - são altamente fiáveis. No caso do processo acima descrito, o construto Tz-Bn-NOTE foi sintetizado com elevado rendimento e pureza. O anticorpo foi modificado com huA33 4,2 ± 0,6 TCO / mAb, e Tz-Bn-NOTE foi marcado radioactivamente com 64 Cu, para se obter o radioligando purificada em> 99% de pureza radioquímica> 85% de rendimento corrigido para a decomposição, e uma actividade específica de ~ 6,7 MBq / nmol (Figura 5). A reactividade do conjugado huA33-TCO e o radioligando tetrazina pode ser testada utilizando-se cromatografia instantânea radioactivos em camada fina (ITLC). Isto é feito através da mistura da tetrazina radiomarcado (100 uCi; 0,55 nmol, assumindo uma actividade especifica de 6,7 MBq / nmol) com um ligeiro excesso de huA33-TCO (50 mg; 0,66 nmol) em phsalina tamponada com osphate (pH 7,4) à temperatura ambiente durante 5 min. Em seguida, cerca de 1 ^ Ci de a solução é mancha num fase reversa C-18 placa de TLC e deixada a secar. A CCF é executado em 9: 1 MeCN: H 2 O, e a placa analisadas utilizando um leitor de placas de TLC radioactivos. Se a reação clique funciona como planejado, o ligado 64 Cu-NOTA-A33 deve permanecer na linha de base; se, por outro lado, a reacção falhar, livre 64 Cu-Tz-Bn-NOTE aparece na ou perto da frente solvente.

Passando para os experimentos com imagens in vivo, no protocolo descrito acima, foram utilizados ratos nus atimicos com A33-expressando antígeno, SW1222 xenografts câncer colorretal. Ambos biodistribuição aguda (n = 5 por ponto de tempo) e imagiologia de PET (n = 12) experiências revelam que a estratégia de pré-direccionamento é capaz de delinear o crescimento do tumor colorrectal com excelente contraste da imagem e as razões de actividade elevada tumoral-a-branco (Figura 6). A absorção do 64 Cu-Tz-Bn-NOTE no tumor resulta em pontos de tempo iniciais: 3,5% ± 0,6% ID / g e 4,1% ± 0,6% ID / g a 1 h e 4 h pós-injecção, respectivamente. No entanto, nestes pontos de início, ele é facilmente obscurecidos por a quantidade de compensação da radioactividade através do tracto intestinal de rato (11,9% ± 4,4% ID / g e 8,8% ± 3,4% ID / g nas fezes em 1 hora e 4 pi h, respectivamente). Ao longo de várias horas, o excesso de radioligando limpa através das fezes (1,4% ± 0,5% ID / g às 24 h pi), e o tumor torna-se a característica mais proeminente na imagem (4,0% ± 0,9% ID / g às 24 h pi). Nestes pontos de tempo posteriores, o tumor é bem descrita na imagem, e as proporções de actividade tumoral-a-fundo são bastante elevados; por exemplo, a estratégia produz tumor: relação muscular de 26,6 ± 6,6, às 12 horas pi e 27,0 ± 7,4 a 24 hr pi Não surpreendentemente, os experimentos de controle usando apenas 64 Cu-Tz-Bn-nota, os anticorpos não-específicos, or huA33 sem porções TCO conjugados todos resultaram em absorção mínima no tumor.

Como será discutido mais adiante, esta estratégia de pré-direccionamento - como todas as estratégias de pré-direccionamento - tem um certo número de variáveis ​​que requerem optimização quando aplicada a novos sistemas anticorpo / antigénio. Duas das mais importantes são a massa do construto mAb TCO-injectado e o comprimento do intervalo entre a injecção da construção de mAb-TCO e a injecção do radioligando. Se a quantidade de conjugado de mAb-TCO é demasiado elevada ou o tempo de intervalo entre as injecções for demasiado curto, a quantidade de mAb-TCO livre no sangue aumenta e a probabilidade de ocorrência de reacções de clique no sangue, em vez de com os aumentos de tumor. Por exemplo, no sistema 64 Cu / huA33 discutido aqui, tanto a administração de 300 ug de huA33 (em vez de 100 mg) ou a utilização de um intervalo de tempo de 12 horas (em vez de 24 horas) resultou em aumentos notáveis ​​em tele quantidade de radioactividade visível no coração do rato (Figura 7A e Figura 7B, respectivamente). Em ambos estes casos, a reacção clique ainda é claramente ocorrendo no tumor, tal como ilustrado pela quantidade de absorção tumoral em pontos temporais iniciais; no entanto, a formação de anticorpo radiomarcado no sangue é também aparente. Enquanto isto é tentador negar porque o anticorpo radiomarcado formado no sangue vai ainda, eventualmente, encontrar o seu caminho para o tumor, isto derrota um pouco a fim de utilizar um pré-direccionamento metodologia, como o anticorpo marcado radioactivamente irá circular lentamente antes de atingir o tumor e, assim, aumentar taxas de dose para os órgãos não-alvo. Por outro lado, se for demasiado pequeno o anticorpo é utilizado, a quantidade de absorção no tumor irá naturalmente sofrem. Excessivamente longos intervalos de tempo podem também reduzir os níveis de absorção do tumor como um resultado de interiorização lenta anticorpo, transcyclooctene isomerização, ou anticorpo / antigénio derramamento. O diagnóstico de thproblemas ese é mais desafiador e não pode ser feito simplesmente através do exame dos dados PET. Claramente, um delicado equilíbrio deve ser mantida. Portanto, recomenda-se que quaisquer investigadores tentam aplicar esta estratégia para um novo sistema de anticorpo / antígeno usar grandes quantidades de mAb-TCO construct (≥ 200 mg) e tempos de intervalo curto (≤ 24 hr) como pontos de partida e otimizar a partir daí.

Figura 1
Figura 1. O inverso elétron-demand Diels-Alder [4 + 2] cicloadição clique ligação entre tetrazina e transcyclooctene.

Figura 2
Figura 2. Uma ilustração dos quatro passos da metodologia pr�marca�o. Este valor é baseado em pesquisa publicada originalmente em JNM. Zeglis, BM et al. Um animal de estimação pretargeted bas estratégia de imagemed em bioorthgonal Diels-Alder clique química. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 pela Sociedade de Medicina Nuclear e Imagem Molecular, Inc. por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Um esquema para a modificação de huA33 com TCO-NHS.

Figura 4
Figura 4. Um esquema para a síntese e 64 Cu de marcação de Tz-Bn-NOTA. Este valor é baseado em pesquisa publicada originalmente em JNM. Zeglis, BM et al. A estratégia pretargeted de imagem PET com base em bioorthgonal Diels-Alder clique química. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). &# 169; 2013 pela Sociedade de Medicina Nuclear e Imagem Molecular, Inc. por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Um rastreamento de rádio-HPLC de purificada 64 Cu-Tz-Bn-nota.

Figura 6
Figura 6. imagens de PET de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA / A33-TCO pr�marca�o estratégia. Mice tendo xenografts SW1222 subcutâneas (100-150 mm 3) foram administrados huA33-TCO (100) através de injecção na veia da cauda. Após 24 horas, os mesmos ratos foram administrados 64 de Cu-Tz-Bn-NOTE (10,2-12,0 MBq [275-325] uCi) via injecção na veia da cauda e subsequentemente visualizados 2, 6, 12, e 18 horas após a administração do radiofármaco. Transverse (topo) e coronal (inferior) imagens planares se cruzam no centro dos tumores. Altos níveis de absorção no intestino em pontos de tempo iniciais (isto é, 2 e 6 h), em grande parte claras por 12 h, deixando o tumor (seta branca) claramente delineada a partir de todos os tecidos não-alvo, 12 e 18 h pós-injecção. Este valor é baseado em pesquisa publicada originalmente em JNM. Zeglis, BM et al. A estratégia pretargeted de imagem PET com base em bioorthgonal Diels-Alder clique química. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 pela Sociedade de Medicina Nuclear e Imagem Molecular, Inc. por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. As imagens de PET de experimentos pr�marca�o menos favoráveis. (A) Ratos beaanel xenografts subcutâneos SW1222 (100-150 mm 3, seta) foram administrados huA33-TCO (100) através de injecção na veia da cauda. Após 12 horas, os mesmos ratos foram administradas 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 �i]) injecção na veia da cauda. (B) Os ratinhos portadores de xenoenxertos subcutâneos SW1222 (100-150 mm 3, seta) foram administrados A33-TCO (300 ug) por via de injecção na veia da cauda. Após 24 horas, os mesmos ratos foram administradas 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 �i]) injecção na veia da cauda. Em ambos os casos, os ratos foram fotografadas 12 h após a injecção de 64 Cu-Tz-Bn-NOTE. Em ambos os painéis, transversal (topo) e coronal (inferior) imagens planares se cruzam no centro dos tumores. Embora a estratégia de pré-direccionamento mostra claramente o tumor em ambos os casos, os resultados em ambos os sub-imagens são padrão em comparação com aqueles indicados na Figura 6. Em ambos 7A e 7B, existe umaquantidade significativa de absorção de actividade de fundo no coração. Nas condições da Figura 7A, esta é provavelmente o resultado da huA33-TCO construção não sendo dado tempo suficiente para localizar-se no tumor. Nas condições da Figura 7B, esta é provavelmente uma consequência de administrar demasiado huA33-TCO e um excesso de imunoconjugado ainda circulando no sangue até 24 h após a injecção. Este valor é baseado em pesquisa publicada originalmente em JNM. Zeglis, BM et al. A estratégia pretargeted de imagem PET com base em bioorthgonal Diels-Alder clique química. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). 2013 pela Sociedade de Medicina Nuclear e Imagem Molecular, Inc. por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A principal vantagem desta estratégia de imagem PET pretargeted é que ele é capaz de delinear com tumores alvo-fundo-de contraste de imagem em apenas uma fracção da dose de radiação de fundo produzida por anticorpos marcados directamente. Por exemplo, no sistema de imagem do cancro colo-rectal descrito aqui, os dados obtidos em experiências de biodistribuição agudas foram utilizados para realizar os cálculos de dosimetria para a estratégia de pré-direccionamento com base de Cu-64, juntamente com directamente marcada com 64 Cu-NOTE-huA33 e 89 Zr-DFO-huA33. Estes cálculos mostram claramente os benefícios de dosimetria para o sistema de pré-direccionamento, especialmente quando comparado com o anticorpo marcado 89 Zr mais clinicamente relevante. A dose eficaz da estratégia de pré-direccionamento é 0,0124 mSv / MBq, enquanto que a de 89 Zr-DFO-huA33 é mais de 30 vezes maior: 0,4162 mSv / MBq. O benefício de dosimetria de pr�marca�o é menos pronunciado quando se compara aos 64 Cu-rotulado como umntibody (0,0359 mSv / MBq), embora o efeito vantajoso ainda existe.

Uma das vantagens mais significativas da presente IEDDA pr�marca�o metodologia é a sua modularidade: o -cicloocteno trans pode ser adicionado a qualquer anticorpo que não é a internalização, e uma ampla variedade de cargas pode ser ligado ao tetrazina. Na verdade, nossa principal motivação para escrever este protocolo é permitir que outros grupos de pesquisa para empregar este método com diferentes sistemas anticorpo / antígeno / radioisótopos. Ao longo destas linhas, nós acreditamos que é fundamental para abordar uma série de questões que os pesquisadores devem considerar ao adaptar esta metodologia para outros sistemas.

Em primeiro lugar, a selecção do anticorpo é extremamente importante. Simplificando, o anticorpo deve ser não internalizar ou internalizado em um ritmo muito lento. Enquanto os parâmetros cinéticos ideais têm ainda a ser determinado, o anticorpo e o -cicloocteno trans reactivo leva deve permanecer ligadoo do lado de fora da célula, para a internalização e fixação do anticorpo antes da injecção do radioligando diminuiria drasticamente o número de reacções in vivo clique. No sistema aqui descrito, e os alvos de anticorpos huA33 se liga ao antigénio A33, uma glicoproteína transmembranar expressa em> 95% de todos os cancros colo-rectais. É importante notar que foi demonstrado que mesmo após a ligação do seu alvo, o complexo huA33 anticorpo / antigénio permanece na superfície da célula para os dias 31-33. Embora a necessidade de um anticorpo não internalização é reconhecidamente uma limitação para a estratégia, um grande variedade de anticorpos não-internalização são conhecidos, talvez mais notavelmente o CC49 anticorpo-alvo TAG72 que Rossin, et al. exploraram em seu excelente trabalho pr�marca�o. 30,34,35

Em segundo lugar, esta estratégia pr�marca�o - como qualquer outro - requer otimização significativa. Além da identidade de um antibody e o radioligando tetrazina, duas variáveis ​​críticas deve ser considerado: a quantidade de anticorpo injectado e o intervalo de tempo entre as injecções de anticorpo e o ligando radioactivo. Nós, têm abordado estas variáveis ​​na seção Resultados representante acima, mas para reiterar brevemente, se quer muito anticorpo ou muito curto um intervalo de tempo, as quantidades significativas de conjugado mAb-TCO permanecerá no sangue no momento da injeção do radioligando. Este, por sua vez, irá resultar na ligação in vivo clique ocorrendo no sangue em vez de no tumor, formando circulante, anticorpo radiomarcado que só lentamente se acumular no tumor ao longo do tempo. Por outro lado, se quer muito pouco anticorpo ou muito longo um intervalo de tempo é empregado, o montante final da radioactividade no tumor serão os melhores. Em nossa opinião, obter imagens rigorosa, ou, de preferência, os experimentos de biodistribuição agudos com o itse anticorpo marcado directamentelf antes de quaisquer experimentos pr�marca�o é a maneira mais confiável para aprender sobre a quantidade de anticorpos necessária eo tempo ideal de intervalo após a injeção inicial de anticorpo construto. Para diferentes massas injectadas de mAb marcado radioactivamente, estas experiências irão proporcionar dados concretos sobre tanto a folga do radioimunoconjugado a partir do sangue e a sua acumulação no tumor, permitindo a selecção das condições mais promissores para as experiências de pré-direccionamento.

Finalmente, a farmacocinética do radioligando à base tetrazina deve ser considerado na escolha de um radioisótopo apropriado. No sistema aqui descrito, a radiomarcado Tz-Bn-NOTE porção é excretado do corpo através do intestino com uma meia-vida biológica de aproximadamente 3-4 horas, tornando o 64 Cu radioisótopo emissor de positrões com a meia física mais complementar vida. Infelizmente, a sua meia-vida biológica da fracção tetrazina é muito longa para que seja compatível com the se decompõe mais rápido radiometal 68 Ga (t 1/2 = 68 min). Neste caso, qualquer radioactividade no tumor se deteriorariam através de várias meias-vidas antes do excesso de ligando radioactivo acabado a limpeza a partir do corpo. Como resultado, as imagens teriam que ser adquirido em pontos de tempo iniciais, quando os rácios de actividade tumoral-para-baixo do fundo permanecem 36 Idealmente, as gerações futuras de radioligandos tetrazina iria ser manipulada -. ​​Talvez através de PEGilação, glicação, ou outros meios - para excretar a partir do corpo mais rapidamente. Isto permitiria radiomarca�o com radioisótopos mais rapidamente em decomposição, como 68 Ga e 18 F, o que por sua vez, aumentar ainda mais os benefícios de dosimetria da estratégia de imagem pretargeted. Em última análise, os investigadores como adaptar esta tecnologia para utilização com outros radioisótopos para imagiologia (por exemplo, 124 I, 111 In, 18 F, 89 Zr, 68Ga, etc.) ou terapia (por exemplo, 177 Lu, 225 At, 125 I, etc.), novos ligandos à base de tetrazina terá de ser desenvolvido para incorporar diferentes quelantes de radiomarcação ou grupos prostéticos. A investigação completa das farmacocinética destes novas construções será essencial para garantir partidas vantajosas entre as propriedades de apuramento dos ligantes e a meia-vida física dos radionuclídeos.

No final, esperamos sinceramente que outros pesquisadores vêem a promessa dessa tecnologia pr�marca�o e empregá-la com novos sistemas anticorpo / antígeno. Enquanto os pontos anteriores mostram que este processo de adaptação pode não ser sempre simples, é nossa convicção que esta metodologia pode ter um impacto significativo sobre a imagem nuclear, a terapia de radionuclídeo alvo, e mais além.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrazine NHS Ester Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA Macrocyclics B-601 Store at -80 °C

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