Die Nutzung der Bioorthogonale inversem Elektronenbedarf Diels-Alder-Cycloaddition für Pretargeted PET Imaging

1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally
Bioengineering

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Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. J. Vis. Exp. (96), e52335, doi:10.3791/52335 (2015).

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Abstract

Introduction

Im Laufe der letzten dreißig Jahre, Positronenemissionstomographie (PET) ist ein unverzichtbares klinisches Werkzeug bei der Diagnose und Behandlung von Krebs. Antikörper werden seit langem als vielversprechende Vektoren für die Abgabe von Positronen emittierende Radioisotope zu Tumoren durch ihre vorzügliche Affinität und Spezifität für-Biomarkern. 1,2 jedoch die relativ langsame in vivo pharmakokinetischen Eigenschaften von Antikörpern sieht die Verwendung von Radioisotopen mit mehrtägiges physikalische Halbwertszeiten. Im Gegensatz zu Teilkörper-CT-Scans - - in Energiedosen in jedem Teil des Körpers Ergebnis Diese Kombination kann hohe Strahlendosen auf die Nichtzielorgane von Patienten, eine wichtige Komplikation, die von besonderer klinischer Bedeutung ist, da Radioimmunkonjugate intravenös injiziert und damit ergeben unabhängig von den abgefragten Geweben.

Um dieses Problem zu umgehen, hat erhebliche Anstrengungen unternommen worden, um die develo gewidmetpment der PET-Bildgebung Strategien, die die Radioisotops und der Targeting-Einheit zu entkoppeln, wodurch die Nutzung der vorteilhaften Eigenschaften von Antikörpern und gleichzeitig Sockel ihrer intrinsischen pharmakokinetischen Einschränkungen. Diese Strategien - am häufigsten genannt Pretargeting oder mehrstufige Targeting - typischerweise vier Schritte: (1) die Verabreichung eines Antikörpers, der zur Bindung sowohl ein Antigen und ein Radioligand; (2) die Anreicherung des Antikörpers in das Zielgewebe und seine Clearance aus dem Blut; (3) die Verabreichung eines kleinen Moleküls Radioligand; und (4) die in vivo-Ligation des Radioliganden an den Antikörper, gefolgt durch die schnelle Clearance von überschüssigem Radioligand. 3-8 In einigen Fällen kann ein zusätzlicher Klärungsmittel zwischen den Schritten 2 und 3, um die Ausscheidung von jedem Antikörper beschleunigen spritzt Dazu ist es noch, den Tumor zu binden und im Blut bleibt. 5

Im Großen und Ganzen two Arten von Pretargeting Strategien sind besonders häufig in der Literatur. Während beide erfolgreich in präklinischen Modellen nachgewiesen, sie besitzen auch Schlüssel Einschränkungen, die ihre klinische Anwendbarkeit behindert haben. Die erste Strategie beruht auf der hohen Affinität zwischen Streptavidin-konjugierte Antikörper und Biotin-modifizierten Radiomarkierungen; jedoch die Immunogenität der Streptavidin-modifizierten Antikörper erwies sich eine beunruhigende Problem hinsichtlich der Übersetzung sein. 5,6,9,10 Die zweite Strategie, die im Gegensatz dazu verwendet bispezifischen Antikörpern, die genetisch manipuliert wurden, um sowohl eine Krebs binden Biomarker Antigen und ein kleines Molekül radiomarkierten Haptens. 3,11-14 Während dieser letztere Weg ist sicherlich kreativ, wird ihre breite Anwendbarkeit durch die Komplexität, die Kosten und die fehlende Modularität des Systems begrenzt.

In letzter Zeit entwickelt und veröffentlicht eine pretargeted PET Methodik, die auf dem inversem Elektronenbedarf Diels-Alder (I wirEDDA) Cycloaddition zwischen trans -Cycloocten (TCO) und Tetrazin (Tz;. Abbildung 1) 11 Während der Reaktion selbst ist seit Jahrzehnten bekannt, hat IEDDA Chemie eine Renaissance in den letzten Jahren als Klick-Chemie Biokonjugation Technik erlebt, wie dargestellt die faszinierende Arbeit der Gruppen von Ralph Weissleder, Joseph Fox und Peter Conti unter anderem. 12-15 Die IEDDA Cycloaddition wurde in einer Vielzahl von Einstellungen angewendet wurden, einschließlich Fluoreszenz-Imaging mit Peptiden, Antikörpern, und Nanopartikel sowie die nuklearmedizinische Bildgebung . mit beiden Radiohalogene und Radiometalle 16-26 Die Ligation ist ertragreiche, saubere, schnelle (k 1> 30000 M -1 s -1), selektiver und - entscheidend -. bioorthogonale 27 Und während eine Reihe von Arten von Klick-Chemie - einschließlich Cu-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition, spannungskatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition und Staudinger ligtionen -. sind bioorthogonale als gut, es ist die einzigartige Kombination von schnellen Reaktionskinetik und Bioorthogonalität die IEDDA Chemie macht so gut geeignet, um Pretargeting Anwendungen in ganzen Organismen 28,29 In diesem Sinne ist es wichtig zu beachten, dass dem jüngsten Bericht von unserem Labors war nicht der erste, IEDDA Chemie Pretargeting gelten: der erste Bericht über pretargeted Bildgebung mit IEDDA entstand aus der Arbeit von Rossin, et al und enthielt eine SPECT Methodik unter Verwendung einer 111 In-markierten Tetrazin 30..

Wie wir oben diskutiert, hat der Pretargeting Methodik vier ziemlich einfachen Schritten (Abbildung 2). In dem Protokoll zur Hand, wird ein pretargeted Strategie für die PET-Bildgebung von Darmkrebs, der eine 64 Cu-NOTA-markierten Tetrazin Radioliganden und einem TCO-modifizierte Konjugat des Antikörpers huA33 beschäftigt beschrieben werden. Ist einer seiner gr jedoch letztendlich die Modularität dieser Methodikißt Vermögen als trans -Cycloocten Rest kann ein beliebiges nicht-internalisierenden Antikörper angehängt werden, und das Tetrazin kann auf eine Vielzahl von radioaktiven Reporter befestigt werden.

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Protocol

ETHIK STATEMENT: Alle beschriebenen In-vivo-Tierversuchen wurden nach einer genehmigten Protokoll und unter den ethischen Richtlinien des Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt.

1. Synthese von Tz-Bn-NOTA

  1. In einem kleinen Reaktionsgefß löst man 7 mg NH 2 -Bn-NOTA (1,25 x 10 -2 mmol) in 600 & mgr; l NaHCO 3 Puffer (0,1 M, pH 8,1). Überprüfen Sie den pH-Wert der Lösung. Falls erforderlich, den pH-Wert der Lösung einzustellen, um 8.1 mit kleinen Aliquots von 0,1 M Na 2 CO 3.
  2. Füge das NH 2 -Bn-NOTA Lösung auf 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Die Tz-NHS kann entweder trocken gewogen oder aus einer Stammlösung trockenem DMF oder DMSO (<50 ul) hinzugefügt werden.
  3. Ermöglichen die erhaltene Reaktionslösung für 30 min bei RT reagierenunter leichtem Rühren.
  4. Nach 30 min reinigen Sie das Gerät mit Umkehrphasen-C18-HPLC-Chromatographie, um nicht umgesetztes NH 2 Bn-NOTA entfernen. Die NH 2 -Bn-NOTA kann bei einer Wellenlänge von 254 nm überwacht werden, während die Tz-NHS und Tz-Bn-NOTA werden am besten bei einer Wellenlänge von 525 nm überwacht.
    HINWEIS: Die Retentionszeiten sind natürlich stark abhängig von der HPLC-Geräte-Setup jedes Labor (Pumpen, Säulen, Schläuche, etc.). Jedoch, um ein Beispiel zu präsentieren, wenn ein Gradient von 0: 100 MeCN / H 2 O (beide mit 0,1% TFA) bis 100: 0 MeCN / H 2 O über 25 min und einer Analysen 4,6 x 250 mm C18-Säule verwendet wird die Retentionszeiten von Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS und NH 2 -Bn-NOTA wird etwa 15 min, 16,5 min und 10 min, betragen. Das Produkt kann von den anderen Reaktionskomponenten entweder in einem einzigen Durchgang oder mehreren Durchläufen unter Verwendung einer semi-präparativen oder präparative C18-HPLC-Säule 1 H-NMR, anal, gereinigt werden.ytical HPLC und ESI-MS sind Methoden, die verwendet werden können, um die Reinheit des abgeschlossenen Tz-Bn-NOTA Vorläufer verifizieren. 11
  5. Frieren Sie die gesammelten HPLC Eluenten mit flüssigem Stickstoff.
  6. Wickeln Sie das gefrorene Sammelröhrchen in undurchsichtigen Aluminiumfolie.
  7. Das tiefgefrorene Sammelröhrchen in einer Gefriertrocknung Schiff O / N, um das HPLC mobilen Phase zu entfernen.
  8. Lagern Sie das gereinigte Produkt (ein helles rosa Feststoff) im Dunkeln bei -80 ° C.
    Anmerkung: Dies ist eine akzeptable Anhaltepunkt in dem Verfahren. Die fertige Tz-Bn-NOTA Vorstufe für mindestens 1 Jahr unter diesen Bedingungen stabil.

2. Herstellung huA33-TCO Immunkonjugat

  1. In einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine 1 mg / ml (2,7 mM) Lösung von TCO-NHS in trockenem DMF.
  2. In einem 1,7 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine 2 mg / ml (13,3 & mgr; M) Lösung von huA33 in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4 (0,01 M PO 4 3-,
  3. Mit Hilfe von kleinen Aliquoten (<5 & mgr; l) von 0,1 M Na 2 CO 3, pH-Wert der Antikörperlösung auf 8,8-9,0 einzustellen. Verwenden Sie entweder pH-Papier oder ein pH-Meter mit einer Mikroelektrode, um den pH-Wert zu überwachen und darauf achten, nicht, damit der pH-Wert auf pH-Wert über 9,0 steigen.
  4. Nachdem die Antikörperlösung in der richtigen pH, einen Volumen der TCO-NHS-Lösung entsprechend 8 Moläquivalente des aktivierten Esters. Fügen Sie beispielsweise 7,9 ul der 1 mg / ml TCO-NHS-Lösung (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) an die 1 ml 2 mg / ml huA33 Antikörperlösung (1,33 x 10 -8 mol huA33). 5% DMF nicht überschreiten Volumenkonzentration in der Lösung.
  5. Vorsichtig mischen Sie die Lösung durch Invertierung der Mikrozentrifugenröhrchen mehrmals.
  6. Wickeln Sie das Reaktionsgefäß in undurchsichtigen Aluminiumfolie.
  7. Lassen Sie die Lösung für 1 h bei RT unter leichtem Rühren inkubiert.
  8. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur, reinigen das resultierende Immunkonjugat mit einem abgepackten Einweg size Ausschluss Entsalzungssäule. Zuerst spülen Sie die Größenausschlusssäule, wie vom Hersteller beschrieben, welche die über die Spalte vorhanden Konservierungsmittel während der Lagerung zu entfernen. Fügen Sie dann das Reaktionsgemisch auf die Größenausschlusssäule, spülen Sie die Säule mit 1,5 ml 0,9% steriler Kochsalzlösung, und anschließend das Produkt mit 2 ml 0,9% steriler Kochsalzlösung als Laufmittel zu sammeln.
    HINWEIS: Dieser Schritt wird das fertige huA33-TCO als 2 ml Lösung zu erhalten.
  9. Messung der Konzentration des resultierenden huA33-TCO auf einem UV-Vis-Spektrophotometers.
  10. Wenn eine höhere Konzentration gewünscht wird, konzentrieren den huA33-TCO-Lösung unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off.
    HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass, während huA33 und eine Vielzahl von anderen bekannten Antikörpern (zB Bevacizumab, Trastuzumab, Cetuximab und J591) sind sehr tolerant gegenüber, die konzentriert, Aggregation und Präzipitation kann nach Konzentration in anderen Fällen auftreten. Forscher versuchen diese procedure mit einem neuen Antikörper sollte die Literatur oder ihrer eigenen Kenntnisse des fraglichen Antikörpers mit Bezug darauf, ob oder nicht, um den Antikörper zu konzentrieren vertrauen.
  11. Lagern Sie das ausgefüllte huA33-TCO Immunkonjugat bei 4 ° C im Dunkeln.
    Anmerkung: Dies ist eine akzeptable Anhaltepunkt in dem Verfahren. Die fertige mAb-TCO-Konjugat sollte für mindestens 3 Monate unter diesen Lagerbedingungen stabil sein.

3. 64 Cu Radiomarkierung von Tz-Bn-NOTA

Hinweis: dieser Schritt des Protokolls umfaßt die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Vor der Durchführung dieser Schritte - oder bei anderen Arbeiten mit Radioaktivität - Forscher sollten mit Strahlenschutzabteilung ihrer Heimateinrichtung konsultieren. Alle möglichen Maßnahmen, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren.

  1. In einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten Sie eine 0,5 mg / ml (723 & mgr; M) Lösung von Tz-Bn-NOTA.
  2. In einem 1,7 ml MicroCentrifuge Rohr, mit 10 ul des Tz-Bn-NOTA Lösung (5 ug) und 400 ul 0,2 M NH 4 OAc, pH 5,5-Puffer.
  3. Im Interesse einer ordnungsgemäßen radiochemische Hinweis Haltung, Messung und Aufzeichnung der Menge an Radioaktivität in der Probe unter Verwendung einer Dosiskalibrator vor und nach den folgenden Schritten in der folgenden Protokoll (3,4-3,8). Dies wird mit der genauen Bestimmung der radiochemischen Ausbeuten helfen.
  4. In 2000 & mgr; Ci (74 MBq) von 64 Cu auf die Tz-Bn-NOTA Lösung.
    HINWEIS: In der Regel wird [64 Cu] CuCl 2 in einem kleinen Volumen (<30 ul) 0,1 N HCl zugeführt wird, und damit nur geringe Mengen (<10 ul) dieser Stammlösung werden für die Radiomarkierungsreaktion benötigt. Wenn größere Mengen des [64 Cu] CuCl 2 Lager benötigt werden, ist der Radiomarkierungsreaktion tolerant Erhöhung der Gesamtreaktionsvolumen. Jedoch sollte der pH-Wert der Radiomarkierungsreaktion Lösung sorgfältig überwacht, um sicherzustellen,dass er nicht unter pH 4,0 fallen.
  5. Die Lösung wird für 10 min bei RT unter leichtem Rühren inkubiert.
  6. Nach 10 min Inkubation, reinigen Sie das Gerät mit Umkehrphasen-C18-HPLC-Chromatographie. Die Retentionszeiten sind natürlich stark abhängig von der HPLC-Geräte-Setup jedes Labor (Pumpen, Säulen, Schläuche, etc.). Jedoch, um ein Beispiel zu präsentieren, wenn ein Gradient von 5:95 MeCN / H 2 O (beide mit 0,1% TFA) bis 95: 5 MeCN / H 2 O über 15 min verwendet wird, die Rückhaltezeit von 64 Cu-TZ Bn-NOTA sollte etwa 9,8 min, während freie, nicht komplexierte Cu 64 wird mit der Lösungsmittelfront bei etwa 2-4 min zu eluieren.
  7. Mit einem Rotationsverdampfer, entfernen Sie die HPLC Eluenten.
  8. Abgeblasen, und der 64-Cu Tz-Bn-NOTA Produkt in 0,9% steriler Kochsalzlösung.
    HINWEIS: In Anbetracht der 12,7 hr physikalische Halbwertszeit von 64 Cu, ist dies kein akzeptables Anhaltepunkt in dem Verfahren. Führen Sie die Synthese von 64 Cu-Tz-Bn-NICHTEin unmittelbar vor der Injektion des Radioliganden, und folgt nach Schritt 3.7 Schritt 4.5.

4. In Vivo Pretargeted PET Imaging

HINWEIS: Wie in Protocol Abschnitt 3, wird dieser Schritt des Protokolls umfaßt die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Vor der Durchführung dieser Schritte Forscher sollten mit Strahlenschutzabteilung ihrer Heimateinrichtung konsultieren. Alle möglichen Maßnahmen, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren.

  1. In einem weiblichen athymischen nackten Maus, subkutan Implantat 1 x 10 6 SW1222 Kolorektalkrebszellen und ermöglichen, dass diese in einem 100-150 mm 3 Xenograft (9-12 Tage nach der Beimpfung) wachsen. 11
  2. Ein Aliquot des huA33-TCO-Lösung von Protocol Abschnitt 2 auf eine Konzentration von 0,5 mg / ml in 0,9% steriler Kochsalzlösung.
  3. Injizieren 200 ul der huA33-TCO-Lösung (100 & mgr; g) in die Schwanzvene der Xenotransplantat-tragenden Mäusen.
  4. Lassen Sie 24 Stunden für die Akkumulation des huA33-TCO im Tumor der Maus.
  5. Verdünne die 64 Cu-Tz-Bn-NOTA Radioligand in einer Konzentration von 1,5 mCi / ml in 0,9% steriler Kochsalzlösung.
  6. Injizieren 200 ul des 64 Cu-Tz-Bn-NOTA Radioligand-Lösung (300 & mgr; Ci; 11,1 MBq; 1,6 nmol von 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, unter der Annahme einer spezifischen Aktivität von 6,7 MBq / nmol) in die Schwanzvene der Xenotransplantat-tragenden Mäusen.
  7. An der gewünschten Abbildungs ​​Zeitpunkt (zB 2, 6, 12, oder 24 Stunden nach der Injektion), betäuben die Maus mit einer 2% Isofluran: Sauerstoff-Gasgemisch.
  8. Platzieren Sie die Maus auf dem Bett des Kleintier-PET-Scanner. Aufrechterhaltung einer Narkose bei der Untersuchung mit einem 1% Isofluran: Sauerstoff-Gasgemisch. Vor Inbetriebnahme des Tieres auf das Scanner-Bett, überprüfen Anästhesie mit dem Zehe-Pinch-Methode und wenden Tier Salbe auf den Augen der Maus, um das Trocknen während der Narkose zu verhindern.
  9. Erwerben Sie die PET-Daten für die Maus über einen statischenScannen mit einem Minimum von 20 Millionen koinzident Ereignisse unter Verwendung eines Energiefensters von 350-700 keV und eine Koinzidenzzeitfenster von 6 nsec. Nach Abschluss der Akquisition des Bildes, darf die Maus nicht unbeaufsichtigt zu lassen, und stellen Sie sie nicht in einem Käfig mit anderen Mäusen, bis sie wieder zu sich kam.

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Representative Results

Die ersten drei Schritte des Experiments - die Synthese von Tz-Bn-NOTA, die Konjugation von TCO zu huA33 und der radioaktiven Markierung des Tz-Bn-NOTA konstruieren (Abbildungen 3 und 4) - sind sehr zuverlässig. Im Fall der oben beschriebenen Verfahren wurde die Tz-Bn-NOTA Konstrukt in hoher Ausbeute und Reinheit hergestellt. Die huA33 Antikörper wurde mit 4,2 ± 0,6 TCO / mAb modifiziert und Tz-Bn-NOTA wurde radioaktiv markiert und mit 64 Cu, um das gereinigte Radioligand in> 99% radiochemische Reinheit zu ergeben,> 85% zerfalls korrigierte Ausbeute und einer spezifischen Aktivität von ~ 6,7 MBq / nmol (Abbildung 5). Die Reaktivität des huA33-TCO-Konjugat und das Tetrazin Radioliganden können mit radioaktiven sofortige Dünnschichtchromatographie (ITLC) getestet werden. (; 0,55 nmol, unter der Annahme einer spezifischen Aktivität von 6,7 MBq / nmol 100 uCi) mit einem leichten Überschuss an huA33-TCO; ph Dies wird durch Vermischen des radioaktiv markierten Tetrazin geführt (50 & mgr; 0,66 nmol)osphate-gepufferter Salzlösung (pH 7,4) bei Raumtemperatur für 5 min. Dann wird etwa 1 & mgr; Ci der Lösung auf eine Umkehrphasen-C18-TLC-Platte aufgetragen und trocknen gelassen. 1 MeCN:: Die TLC ist in 9 ausgeführt H 2 O, und die Platte analysiert mit Hilfe eines radioaktiven TLC-Plattenlesegerät. Wenn der Klick-Reaktion wie geplant funktioniert, sollte die ligiert 64 Cu-NOTA-A33 an der Grundlinie zu bleiben; Wenn, auf der anderen Seite, die Reaktion ausfällt, free 64 Cu-Tz-Bn-NOTA wird an oder nahe der Mittelfront angezeigt.

Nun zu den in-vivo-Bildgebung Experimenten in dem oben beschriebenen Protokoll wurden athymischen Nacktmäusen mit A33-Antigen exprimierenden, SW1222 Darmkrebs Xenotransplantaten verwendet. Akute Bioverteilung (n = 5 pro Zeitpunkt) und PET-Bildgebung (n = 12) Experimente zeigen, dass die Strategie Pretargeting fähig Abgrenzung des kolorektalen Tumorwachstum mit ausgezeichneten Bildkontrast und eine hohe Tumor-zu-Hintergrund-Aktivitätsverhältnisse (Figur 6). Aufnahme des 64 Cu-Tz-Bn-NOTA im Tumor zu frühen Zeitpunkten deutlich: 3,5% ± 0,6% ID / g und 4,1% ± 0,6% ID / g bei 1 Stunde und 4 Stunden nach der Injektion auf. Jedoch bei diesen frühen Punkten, wird leicht durch die Menge an Radioaktivität Clearing durch den Darmtrakt der Maus (verdeckt 11,9% ± 4,4% ID / g und 8,8% ± 3,4% ID / g im Kot in 1 h und 4 h pi, respectively). Im Verlauf von mehreren Stunden, löscht die überschüssige Radioligand durch den Kot (1,4% ± 0,5% ID / g bei 24 h pi), und der Tumor wird das wichtigste Merkmal in dem Bild (4,0% ± 0,9% ID / g an 24 h pi). Bei diesen späteren Zeitpunkten wird der Tumor gut im Bild abgegrenzt, und die Tumor-zu-Hintergrund-Aktivitätsverhältnisse recht hoch; beispielsweise ergibt die Strategie Tumor: Muskel-Verhältnisse von 26,6 ± 6,6 bei 12 Stunden pi und 27,0 ± 7,4 bei 24 Stunden pi nicht überraschend, Kontrollexperimenten nur mit 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, nicht-spezifischen Antikörpern, or huA33 ohne konjugiert TCO-Einheiten alle in minimal-Aufnahme in den Tumor geführt.

Wie weiter unten diskutiert werden wird, diese Pretargeting Strategie - wie alle Pretargeting Strategien - hat eine Reihe von Variablen, die eine Optimierung erfordern, wann neue Antikörper / Antigen-Systeme angewendet. Zwei der wichtigsten sind die Masse des mAb-TCO-Konstrukt injiziert, und die Länge des Intervalls zwischen der Injektion des mAb-TCO-Konstrukt und der Injektion des Radioliganden. Wenn die Menge an mAb-TCO-Konjugat ist zu groß oder die Intervallzeit zwischen den Injektionen zu kurz ist, die Menge des freien mAb-TCO im Blut steigt und die Wahrscheinlichkeit von Klick-Reaktionen im Blut nicht an den Tumor erhöht auftritt. Beispielsweise in der 64 Cu / huA33 System hier diskutiert wurden die Verwaltung von 300 ug huA33 (anstatt 100 & mgr; g) oder die Verwendung eines 12 h Intervall (statt 24 Stunden) eine spürbare Erhöhung der ter Menge an Radioaktivität in dem Herzen der Maus (7A und 7B) sichtbar. In diesen beiden Fällen wird die Klickreaktion noch deutlich am Tumor auftritt, wie durch die Menge von Tumoraufnahme zu frühen Zeitpunkten dargestellt ist; jedoch ist auch die Bildung von radioaktiv markierten Antikörpers im Blut ersichtlich. Dies ist zwar verlockend, zu entlassen, da das radioaktiv markierte Antikörper im Blut gebildet wird schließlich noch seinen Weg in den Tumor zu finden, diese etwas Niederlagen der Zweck der Verwendung eines Pretargeting Methodik, wie der radioaktiv markierten Antikörper wird langsam zirkulieren, bevor sie den Tumor erreicht und dadurch erhöhen Dosisleistungen für Nichtzielorganen. Umgekehrt, wenn zu wenig Antikörper verwendet wird, die Menge der Aufnahme in den Tumor werden natürlich leiden. Allzu lange Pausenzeiten kann auch Niveaus von Tumoraufnahme zu reduzieren infolge der langsamen Antikörperinternalisierung, transcyclooctene Isomerisierung oder Antikörper / Antigen Abwurf. Die Diagnose einer -tenese Probleme ist schwieriger und kann nicht einfach durch die Untersuchung der PET-Daten erreicht werden. Natürlich muss ein empfindliches Gleichgewicht gehalten werden. Daher wird empfohlen, dass jeder Forscher versucht, diese Strategie zu einer neuen Antikörper / Antigen-System anwenden verwenden große Mengen an mAb-TCO-Konstrukt (≥ 200 ug) und kurzen Pausenzeiten (≤ 24 Stunden) als Ausgangspunkt und von dort zu optimieren.

Figur 1
Abbildung 1. Die inverse Elektronenbedarf Diels-Alder [4 + 2] -Cycloaddition Klick Ligation zwischen Tetrazin und transcyclooctene.

Abbildung 2
Abbildung 2. Eine Abbildung der vier Stufen des Pretargeting Methodik. Diese Zahl basiert auf Forschungs ursprünglich in JNM veröffentlicht wurden. Zeglis, BM et al. Ein pretargeted PET-Bildgebung Strategie based auf bioorthgonal Diels-Alder-Klick-Chemie. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 von der Gesellschaft für Nuklearmedizin und molekulare Bildgebung, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. Ein System zur Modifizierung von huA33 mit TCO-NHS.

4
Abbildung 4. Ein Schema für die Synthese und 64 Cu Radiomarkierung von Tz-Bn-NOTA. Diese Zahl basiert auf Forschungs ursprünglich in JNM veröffentlicht wurden. Zeglis, BM et al. A pretargeted PET-Bildgebung Strategie, die auf bioorthgonal Diels-Alder-Klick-Chemie. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). &# 169; 2013 von der Gesellschaft für Nuklearmedizin und molekulare Bildgebung, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Ein Radio-HPLC-Spur des gereinigten 64 Cu-Tz-Bn-NOTA.

Figur 6
Abbildung 6. PET-Bilder von 64 Cu-Tz-Bn-NOTA / A33-TCO Pretargeting Strategie. Mäuse, die subkutane Xenotransplantate SW1222 (100-150 mm 3) wurden huA33-TCO (100 ug) über die Schwanzvene injiziert. Nach 24 Stunden wurden die gleichen Mäusen 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 & mgr; Ci]) über Schwanzveneninjektion und anschließend abgebildet 2, 6, 12 und 18 Stunden nach der Verabreichung von der Radiopharmaka. Transverse (oben) und koronale (unten) planare Bilder kreuzen das Zentrum der Tumoren. Hohe Aufnahme im Darm zu frühen Zeitpunkten (dh 2 und 6 h) von 12 Stunden weitgehend klar, so dass die Tumor (weißer Pfeil) von allen Nicht-Zielgewebe von 12 und 18 Stunden nach der Injektion klar abgegrenzt. Diese Zahl basiert auf Forschungs ursprünglich in JNM veröffentlicht wurden. Zeglis, BM et al. A pretargeted PET-Bildgebung Strategie, die auf bioorthgonal Diels-Alder-Klick-Chemie. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 von der Gesellschaft für Nuklearmedizin und molekulare Bildgebung, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

7
Abbildung 7. PET-Bilder suboptimaler Pretargeting Experimenten. (A) Mäuse beaRing subkutane Xenotransplantate SW1222 (100-150 mm 3, Pfeil) wurden huA33-TCO (100 ug) über die Schwanzvene injiziert. Nach 12 Stunden wurden die gleichen Mäuse 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 & mgr; Ci]) Schwanzveneninjektion verabreicht. (B) Mäuse, die subkutane Xenotransplantate SW1222 (100-150 mm 3, Pfeil) wurden A33-TCO (300 ug) über die Schwanzvene injiziert. Nach 24 Stunden wurden die gleichen Mäuse 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 & mgr; Ci]) Schwanzveneninjektion verabreicht. In beiden Fällen wurden die Mäuse 12 Stunden nach der Injektion von 64 Cu-Tz-Bn-NOTA abgebildet. In beiden Platten, quer (oben) und der koronalen (unten) ebene Bilder schneiden das Zentrum der Tumore. Während das Pretargeting Strategie eindeutig die Tumor in beiden Fällen sind die Ergebnisse in diesen beiden Bildern sind Sub-Standard im Vergleich zu denen in Figur 6 dargestellt. In beiden 7A und 7B besteht einerhebliche Menge an Hintergrundaktivität Aufnahme im Herzen. Unter den Bedingungen von 7A ist dies wahrscheinlich das Ergebnis der huA33-TCO Konstrukt nicht genügend Zeit, um in den Tumor zu lokalisieren. Unter den Bedingungen der 7B, ist dies wahrscheinlich eine Folge der Injektion zu viel huA33-Gesamtbetriebskosten und mit überschüssigen Immunkonjugat noch nach der Injektion im Blut zirkulierenden sogar 24 Stunden. Diese Zahl basiert auf Forschungs ursprünglich in JNM veröffentlicht wurden. Zeglis, BM et al. A pretargeted PET-Bildgebung Strategie, die auf bioorthgonal Diels-Alder-Klick-Chemie. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). 2013 von der Gesellschaft für Nuklearmedizin und molekulare Bildgebung, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Discussion

Der Hauptvorteil dieser pretargeted PET Strategie ist, dass es in der Lage ist die Abgrenzung von Tumoren mit Ziel-zu-Hintergrund-Bildkontrast bei nur einem Bruchteil der direkt markierten Antikörpern produziert Hintergrund Strahlungsdosis. Zum Beispiel wird in dem hier beschriebenen Darmkrebs Abbildungssystem, Daten von akuten Bioverteilung Experimente wurden verwendet, um die Dosimetrie Berechnungen für die 64 Cu-Basis Pretargeting Strategie zusammen mit direkt markiertem 64 Cu-NOTA-huA33 und 89 Zr-DFO-huA33 auszuführen. Diese Berechnungen zeigen deutlich die dosimetrische Vorteile des Pretargeting System, insbesondere im Vergleich zu den mehr klinisch relevante 89 Zr-markierter Antikörper. Die wirksame Dosis der Pretargeting Strategie 0,0124 mSv / MBq, die des 89 Zr-DFO-huA33 ist über 30 mal höher: 0,4162 mSv / MBq. Die dosimetrischen Vorteil der Pretargeting weniger ausgeprägt ist beim Vergleich mit dem 64 Cu-markierte einntibody (0,0359 mSv / MBq), wenn auch die vorteilhafte Wirkung ist noch vorhanden.

Einer der bedeutendsten Stärken dieser IEDDA Pretargeting Methodik ist die Modularität: Die trans -Cycloocten kann auf jeden Antikörper, der nicht Internalisierungsfaktor angehängt werden, und eine Vielzahl von Ladungen an das Tetrazin befestigt werden. In der Tat ist unsere Hauptmotivation für das Schreiben dieses Protokoll zu anderen Forschungsgruppen ermöglichen, diese Methode mit verschiedenen Antikörper / Antigen / Radioisotop-Systeme verwenden. In diese Richtung, halten wir es für wichtig, eine Reihe von Fragen, die Forscher sollten bei der Anpassung dieser Methodik für andere Systeme anzugehen ist.

Erstens, ist die Auswahl des Antikörpers von enormer Bedeutung. Einfach gesagt, muss der Antikörper nicht-internalisierende oder mit einer sehr langsamen Rate internalisiert werden. Obwohl die idealen kinetischen Parameter wurden noch nicht bestimmt werden, der Antikörper und das reaktive trans -Cycloocten sie trägt eingeschaltet belassendie Außenseite der Zelle, für die Internalisierung und Sequestrierung der Antikörper vor der Injektion des Radioliga dramatisch verringern die Anzahl der in vivo auf Reaktionen. In dem hier beschriebenen System, huA33 Antikörper-Ziele und bindet an das A33-Antigen, einem Trans Glykoprotein in> 95% aller kolorektalen Karzinome ausgedrückt. Wichtig ist, hat es sich gezeigt, daß auch nach Bindung seines Ziel, auf der Oberfläche der Zelle für Tage bleibt die huA33 Antikörper / Antigen-Komplexes. 31-33 Während die Notwendigkeit eines nicht-internalisierenden Antikörper ist zwar eine Einschränkung der Strategie, eine einer Vielzahl von nicht-internalisierenden Antikörper bekannt sind, vor allem wohl das TAG72-Targeting CC49 Antikörper, Rossin, et al. haben in ihrer ausgezeichneten Pretargeting Arbeiten untersucht. 30,34,35

Zweitens, diese Pretargeting Strategie - wie jede andere - erfordert erhebliche Optimierung. Zusätzlich zu der Identität des einenntibody und Tetrazin Radioligand müssen zwei kritische Variablen berücksichtigt werden: die Menge an Antikörper injiziert und die Intervallzeit zwischen den Injektionen des Antikörpers und des Radioliganden. Wir haben diese beiden Variablen in dem Abschnitt Repräsentative Ergebnisse oben gerichtet, aber kurz zu wiederholen, wenn entweder zu viel Antikörper oder ein zu kleines Zeitintervall eingesetzt wird, erhebliche Mengen an mAb-TCO-Konjugat wird im Blut zum Zeitpunkt der Injektion bleibt des Radioliganden. Dieses wiederum wird in den in vivo solche Verknüpfung in dem Blut und nicht am Tumor auftritt, bildet zirkulierenden, radioaktiv markierten Antikörpers, der nur langsam ansammeln im Tumor im Laufe der Zeit führen. Umgekehrt, wenn entweder zu wenig Antikörper oder eine zu lange Intervallzeit verwendet wird, die endgültige Menge an Radioaktivität im Tumor wird suboptimal sein. Unserer Meinung nach Durchführung strenger Bildgebung oder vorzugsweise akuten Bioverteilung Experimente mit der direkt markierte Antikörper itself vor irgend Pretargeting Experimenten ist die zuverlässigste Methode, um die Menge an Antikörper erforderlich, und der ideale Zeitintervall nach der ersten Injektion von Antikörperkonstrukt erlernen. Für verschiedene injiziert Massen radioaktiv markierter mAb werden diese Experimente konkreter Daten sowohl auf der Clearance des Radioimmunkonjugat aus dem Blut und Ansammlung im Tumor zu schaffen, der für die Auswahl der besten Bedingungen für die Pretargeting Experimenten.

Schließlich müssen die Pharmakokinetik des Tetrazin-basierten Radioliganden bei der Wahl eines geeigneten Radioisotop ist. In dem hier beschriebenen System wird das radioaktiv markierte Tz-Bn-NOTA Einheit aus dem Körper über den Magen mit einer biologischen Halbwertszeit von ca. 3-4 Stunden ausgeschieden wird, so dass 64 Cu das Positronen emittierende Radioisotop mit den komplementären physikalischen Halb Leben. Leider ist die biologische Halbwertszeit des Tetrazin Rest zu lang dafür mit th kompatibel zu seine schneller zerfallenden Radio 68 Ga (t 1/2 = 68 min). In diesem Fall würde eine Radioaktivität im Tumor durch verschiedene Halbwertszeiten abklingen, bevor das überschüssige Radioligand abgeschlossen Entleerung aus dem Körper. Dadurch würde Bilder müssen zu frühen Zeitpunkten, wenn Tumor-Hintergrund-Aktivitätsverhältnisse bleiben niedrig erworben werden 36 Idealerweise künftige Generationen von Tetrazin Radioliganden würde entwickelt werden. - Vielleicht über PEGylierung, Glykosylierung oder andere Mittel - zu scheiden aus dem Körper schneller. Dies würde zur radioaktiven Markierung mit mehr schnell abklingenden Radioisotope wie 68 Ga und 18 F, die wiederum weiter verbessern würde die dosimetrische Vorteile der pretargeted Abbildungsstrategie ermöglichen. Letztlich Forscher anzupassen diese Technologie für die Verwendung mit anderen Radioisotopen für die Bildgebung (zB 124 I, 111 In, 18 F, 89 Zr, 68 Ga, etc.) oder Therapie (beispielsweise 177 Lu, 225 Ac, 125 I, etc.), neue Tetrazin-Liganden müssen entwickelt, um verschiedene Chelatoren oder radioaktiven Markierung prosthetische Gruppen integrieren werden. Die gründliche Untersuchung der Pharmakokinetik dieser neuartige Konstrukte, die zur Gewährleistung von Vorteil, Übereinstimmungen zwischen den Freiraum Eigenschaften der Liganden und der physikalischen Halbwertszeit der Radionuklide sein.

Am Ende, wir hoffen sehr, dass andere Forscher sehen die Verheißung dieses Pretargeting Technologie und beschäftigen Sie es mit neuen Antikörper / Antigen-Systeme. Während die vorstehenden Absätze zu veranschaulichen, dass diese Anpassungsprozess nicht immer einfach sein, ist es unsere Überzeugung, dass diese Methodik könnte einen wesentlichen Einfluss auf die nuklearmedizinische Bildgebung, gezielte Radionuklid-Therapie, und darüber hinaus haben.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrazine NHS Ester Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA Macrocyclics B-601 Store at -80 °C

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