El aprovechamiento de la demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder Cicloadición para Pretargeted TEP

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Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. J. Vis. Exp. (96), e52335, doi:10.3791/52335 (2015).

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Abstract

Introduction

Durante los últimos treinta años, la tomografía por emisión de positrones (PET) se ha convertido en una herramienta clínica indispensable en el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Los anticuerpos han sido considerados vectores prometedores para la entrega de radioisótopos emisores de positrones a los tumores debido a su exquisita afinidad y especificidad para biomarcadores de cáncer. 1,2 farmacocinética Sin embargo, la relativamente lentos in vivo de anticuerpos ordena el uso de radioisótopos con multi-día semividas físicas. Esta combinación puede producir altas dosis de radiación a los órganos que no son objeto de los pacientes, una complicación importante que es de particular importancia clínica ya radioinmunoconjugados se inyectaron por vía intravenosa, por lo que - a diferencia de las tomografías computarizadas cuerpo parciales - resultado en dosis absorbidas en cada parte del cuerpo, independientemente de los tejidos interrogados.

Para evitar este problema, esfuerzo significativo se ha dedicado a la desallo de estrategias de formación de imágenes de PET que desacoplar el radioisótopo y el resto de dirección, aprovechando así las propiedades ventajosas de anticuerpos bordeando simultáneamente sus limitaciones intrínsecas farmacocinéticos. Estas estrategias - más a menudo denominados predireccionamiento o focalización de varios pasos - emplean típicamente cuatro pasos: (1) la administración de un anticuerpo capaz de unirse tanto un antígeno y un radioligando; (2) la acumulación del anticuerpo en el tejido diana y su aclaramiento de la sangre; (3) la administración de una pequeña molécula de radioligando; y (4) la ligación in vivo del radioligando con el anticuerpo seguido por la rápida eliminación del exceso de radioligando. 3-8 En algunos casos, se inyecta un agente de compensación adicional entre los pasos 2 y 3 con el fin de acelerar la excreción de cualquier anticuerpo Sin embargo, eso tiene que obligar a la tumor y permanece en la sangre. 5

En términos generales, twtipos o de estrategias predireccionamiento son más frecuentes en la literatura. Mientras que ambos han demostrado su eficacia en modelos preclínicos, también poseen limitaciones clave que han impedido su aplicabilidad clínica. La primera estrategia se basa en la alta afinidad entre los anticuerpos conjugados con estreptavidina y radiomarcadores modificados con biotina; Sin embargo, la inmunogenicidad de los anticuerpos modificados con estreptavidina ha demostrado ser un problema preocupante con respecto a la traducción. 5,6,9,10 La segunda estrategia, en cambio, emplea anticuerpos biespecíficos que han sido genéticamente modificados para-unirse tanto un cáncer antígeno biomarcador y un pequeño hapteno marcado radiactivamente molécula. 3,11-14 Mientras que esta última ruta es ciertamente creativo, su amplia aplicabilidad está limitada por la complejidad, gasto, y la falta de modularidad del sistema.

Recientemente, hemos desarrollado y publicado una metodología de formación de imágenes PET pretargeted basado en la demanda de electrones inversa Diels-Alder (IEdda) reacción de cicloadición entre -cyclooctene trans (TCO) y tetrazina (Tz;. Figura 1) 11 Mientras que la reacción misma se conoce desde hace décadas, la química IEDDA ha experimentado un renacimiento en los últimos años como una técnica bioconjugación de química, como se ilustra en el fascinante trabajo de los grupos de Ralph Weissleder, Joseph Fox, y Peter Conti entre otros. 12.15 El IEDDA cicloadición se ha aplicado en una amplia gama de entornos, incluyendo imágenes de fluorescencia con péptidos, anticuerpos, y nanopartículas, así como imágenes nucleares . con ambas radiohalogens y radiometales 16-26 La ligadura es de alto rendimiento, limpia, rápida (k 1> 30000 M -1 s -1), selectiva y - crítica -. bioorthogonal 27 Y mientras que una serie de tipos de química modular - incluyendo cicloadiciones Cu-catalizada por azida alquino, cicloadiciones-azida alquino deformación-promovido y Staudinger ligciones -. bioorthogonal son, así, es la combinación única de la cinética de reacción rápidos y bioorthogonality que hace que la química IEDDA tan bien adecuado para el predireccionamiento aplicaciones en organismos enteros 28,29 A lo largo de estas líneas, es importante tener en cuenta que el reciente informe de nuestro laboratorios no fue el primero en aplicar la química IEDDA a predireccionamiento: el primer informe de la imagenología pretargeted con IEDDA surgió del trabajo de Rossin, y otros, y contó con una metodología que emplea un SPECT 111 tetrazina En marcado 30..

Como ya comentamos anteriormente, la metodología predireccionamiento tiene cuatro pasos muy simples (Figura 2). En el protocolo a la mano, se describirá una estrategia pretargeted para la formación de imágenes PET de cáncer colorrectal que se emplea un 64 marcado con Cu-NOTA radioligando tetrazina y un conjugado modificado-TCO del anticuerpo huA33. Sin embargo, en última instancia, la modularidad de esta metodología es uno de sus grcomieres activos, como el resto -cyclooctene trans se pueden adjuntar a cualquier anticuerpo no internalización, y la tetrazina se pueden unir a una amplia variedad de reporteros radiactivos.

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Protocol

ÉTICA DECLARACIÓN: Todos los experimentos con animales en vivo descritos fueron realizados de acuerdo con un protocolo aprobado y bajo las directrices éticas del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC).

1. Síntesis de Tz-Bn-NOTA

  1. En un pequeño recipiente de reacción, se disuelven 7 mg NH 2--Bn NOTA (1,25 x 10 -2 mmol) en 600 l de NaHCO3 tampón (0,1 M, pH 8,1). Comprobar el pH de la solución. Si es necesario, ajustar el pH de la solución a 8,1 usando pequeñas alícuotas de 0,1 M Na 2 CO 3.
  2. Añadir la solución de NH 2--Bn NOTA a 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
    NOTA: El Tz-NHS o bien se puede pesar a cabo en seco o se añade de una solución madre de DMF seco o DMSO (<50 l).
  3. Dejar que la solución de reacción resultante reaccionara durante 30 min a RTcon agitación suave.
  4. Después de 30 min, purificar el producto mediante cromatografía de C 18 HPLC de fase inversa para eliminar sin reaccionar NH 2--Bn NOTA. El NH 2 -Bn-NOTA puede ser monitoreado en una longitud de onda de 254 nm, mientras que el Tz-NHS y Tz-Bn-NOTA están mejor controlados a una longitud de onda de 525 nm.
    NOTA: Los tiempos de retención son, evidentemente, muy dependiente de la configuración del equipo de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubos, etc.). Sin embargo, para presentar un ejemplo, si un gradiente de 0: 100 MeCN / H 2 O (ambos con 0,1% TFA) a 100: 0 MeCN / H 2 O durante 25 min y una columna analítica 4,6 x 250 mm C 18 se utiliza , los tiempos de retención de Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, y NH-2 -Bn NOTA será de alrededor de 15 min, 16,5 min y 10 min, respectivamente. El producto puede ser purificado de los otros componentes de la reacción, ya sea en una sola carrera o carreras múltiples utilizando una columna de HPLC C 18 semi-preparativa o preparativa. 1 H-NMR, analytical HPLC y ESI-MS son todos los métodos que se pueden utilizar para verificar la pureza del precursor Tz-Bn-NOTA completado. 11
  5. Congelar el eluyente HPLC recogido utilizando nitrógeno líquido.
  6. Envolver el tubo de recogida de congelados en papel de aluminio opaca.
  7. Colocar el tubo de recogida congelado en un recipiente de liofilización de O / N para eliminar la fase móvil de HPLC.
  8. Almacenar el producto purificado (un rosa brillante sólido) en la oscuridad a -80 ° C.
    NOTA: Este es un punto de parada aceptable en el procedimiento. El precursor Tz-Bn-NOTA completado es estable durante al menos 1 año en estas condiciones.

2. Preparación de huA33-TCO Inmunoconjugado

  1. En un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar una 1 mg / ml (2,7 mM) de solución TCO-NHS en DMF seca.
  2. En un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar una 2 mg / ml (13,3 mM) de huA33 en 1 ml de tampón fosfato salino, pH 7,4 (0,01 M PO 4 3-,
  3. El uso de pequeñas alícuotas (<5 mu l) de 0,1 M Na 2 CO 3, ajustar el pH de la solución de anticuerpo a 8,8-9,0. Utilice papel de pH o un medidor de pH con un microelectrodo para monitorear el pH, y tener cuidado de no permitir que el pH se eleve por encima de pH 9,0.
  4. Una vez que la solución de anticuerpo está en el pH correcto, añadir un volumen de la solución TCO-NHS correspondiente a 8 equivalentes molares del éster activado. Por ejemplo, añadir 7,9 l de la solución de 1 mg / ml TCO-NHS (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) a los 1 ml de solución de 2 mg / ml de anticuerpo huA33 (1,33 x 10 -8 mol huA33). No superar el 5% de DMF en volumen en la solución.
  5. Mezclar suavemente la solución invirtiendo el tubo de microcentrífuga varias veces.
  6. Envuelva el tubo de microcentrífuga en papel de aluminio opaco.
  7. Deje que la solución se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave.
  8. Después de 1 hora a temperatura ambiente, purificar el inmunoconjugado resultante utilizando un siz desechable preenvasadose exclusión columna de desalación. En primer lugar, enjuagar la columna de exclusión de tamaño como se describe por el proveedor para eliminar cualquier conservantes presentes en la columna durante el almacenamiento. A continuación, añadir la mezcla de reacción a la columna de exclusión por tamaño, enjuagar la columna con 1.5 ml 0.9% de solución salina estéril, y posteriormente recoger el producto usando 2 ml de 0,9% de solución salina estéril como eluyente.
    NOTA: Este paso será dar el terminado huA33-TCO como una solución de 2 ml.
  9. Medir la concentración de la resultante huA33-TCO en un espectrofotómetro UV-Vis.
  10. Si se desea una mayor concentración, concentrar la solución huA33-TCO utilizando una unidad de filtro centrífugo con un peso molecular 50.000 de corte.
    NOTA: Es importante observar que mientras que huA33 y una variedad de otros anticuerpos conocidos (por ejemplo, bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, y J591) son muy tolerantes de concentrarse, la agregación y la precipitación pueden ocurrir después de la concentración en otros casos. Los investigadores de intentar este procedUre con un nuevo anticuerpo debe confiar en la literatura o su propio conocimiento del anticuerpo en cuestión con respecto a si es o no concentrar el anticuerpo.
  11. Guarde el inmunoconjugado huA33-TCO completado a 4 ° C en la oscuridad.
    NOTA: Este es un punto de parada aceptable en el procedimiento. El conjugado de mAb-TCO completado debe ser estable durante al menos 3 meses en estas condiciones de almacenamiento.

3. 64 Cu radiomarcaje de Tz-Bn-NOTA

NOTA: Este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos - o la realización de cualquier otro trabajo con radiactividad - investigadores deben consultar con el Departamento de Seguridad Radiológica de su institución de origen. Tomar todas las medidas posibles para minimizar la exposición a la radiación ionizante.

  1. En un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar una 0,5 mg / ml (723 mM) de solución de Tz-Bn-NOTA.
  2. En una MicroC 1,7 mltubo entrifuge, añadir 10 l de la solución Tz-Bn-NOTA (5 mg) a 400 l de NH4OAc 0,2 M, pH 5,5.
  3. En aras de la radioquímica nota de mantenimiento de la correcta, medir y registrar la cantidad de radiactividad en la muestra usando un calibrador de dosis antes y después de los pasos siguientes en el protocolo a continuación (3.4 a 3.8). Esto le ayudará con la determinación precisa de los rendimientos de radioquímica.
  4. Agregar 2000 Ci (74 MBq) de 64 Cu a la solución Tz-Bn-NOTA.
    NOTA: Típicamente, [64 Cu] CuCl 2 se suministra en un volumen pequeño (<30 l) de HCl 0,1 N, y por tanto sólo pequeños volúmenes (<10 l) de esta solución madre se necesitan para la reacción de radiomarcado. Si se necesitan mayores volúmenes de la [64 Cu] CuCl 2 stock, la reacción de radiomarcaje es tolerante de aumentar el volumen de reacción total. Sin embargo, el pH de la solución de reacción de radiomarcaje debe controlarse cuidadosamente para asegurarque no caiga por debajo de pH 4,0.
  5. Deje que la solución se incuba durante 10 min a TA con agitación suave.
  6. Después de 10 min de incubación, purificar el producto mediante cromatografía de HPLC de fase inversa C 18. Los tiempos de retención son, evidentemente, muy dependiente de la configuración del equipo de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubos, etc.). Sin embargo, para presentar un ejemplo, si un gradiente de 5:95 MeCN / H 2 O (ambos con 0,1% TFA) a 95: 5 MeCN / H 2 O durante 15 min se utiliza, el tiempo de retención de 64 Cu-Tz- Bn-NOTA debe estar alrededor de 9,8 minutos, mientras gratis, no acomplejada 64 Cu eluirá con el frente del disolvente en torno a 2-4 min.
  7. Usando un evaporador rotatorio, retire el eluyente HPLC.
  8. Se vuelve a disolver el producto 64 Cu-Tz-Bn-nota en el 0,9% de solución salina estéril.
    NOTA: Dado el 12,7 hr vida media física de 64 Cu, esto no es un punto de parada aceptable en el procedimiento. Realizar la síntesis de 64 Cu-Tz-Bn-NOA inmediatamente antes de la inyección del radioligando, y seguir paso a paso inmediatamente 3,7 4,5.

4. En Vivo Pretargeted TEP

NOTA: Como en la sección Protocolo 3, este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos investigadores deben consultar con el Departamento de Seguridad Radiológica de su institución de origen. Tomar todas las medidas posibles para minimizar la exposición a la radiación ionizante.

  1. En un ratón atímicos hembra, implante subcutáneamente 1 x 10 células de cáncer colorrectal 6 SW1222 y permita que éstas se conviertan en un xenotrasplante 100-150 mm 3 (9-12 días después de la inoculación). 11
  2. Diluir una alícuota de la solución huA33-TCO de la sección Protocolo 2 a una concentración de 0,5 mg / ml en 0,9% de solución salina estéril.
  3. Inyectar 200 l de la solución huA33-TCO (100 g) en la vena de la cola del ratón de xenoinjerto de soporte.
  4. Permita 24 horas para la acumulación de la huA33-TCO en el tumor del ratón.
  5. Diluir el 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radioligando a una concentración de 1,5 mCi / ml en 0,9% de solución salina estéril.
  6. Inyectar 200 l de la solución de radioligando Cu-Tz-Bn-NOTA 64 (300 Ci; 11,1 MBq; 1,6 nmol de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, asumiendo una actividad específica de 6,7 MBq / nmol) en la vena de la cola de la xenoinjerto ratones portadores.
  7. En el punto de tiempo de formación de imágenes deseado (por ejemplo, 2, 6, 12, o 24 horas después de la inyección), anestesiar al ratón con un isoflurano 2%: mezcla de gas de oxígeno.
  8. Coloque el ratón sobre la cama del pequeño escáner PET animal. Mantener la anestesia durante el análisis utilizando un isoflurano al 1%: mezcla de gas de oxígeno. Antes de colocar el animal en el escáner, verifique la anestesia utilizando el método del dedo del pie-pinch y aplicar ungüento veterinario a los ojos del ratón para evitar que se seque durante la anestesia.
  9. Adquirir los datos de PET para el ratón a través de una estáticaescanear con un mínimo de 20 millones de eventos coincidentes utilizando una ventana de energía de 350-700 keV y una ventana de tiempo coincidencia de 6 nseg. Después de completar la adquisición de la imagen, no deje el ratón sin atención y no lo coloque en una jaula con otros ratones hasta que se haya recuperado la conciencia.

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Representative Results

Los tres pasos iniciales del experimento - la síntesis de Tz-Bn-NOTA, la conjugación de TCO para huA33, y el radiomarcado del Tz-Bn-NOTA construyen (Figuras 3 y 4) - son altamente confiables. En el caso del procedimiento anterior, el constructo Tz-Bn-NOTA se sintetizó de alto rendimiento y pureza. El anticuerpo huA33 fue modificado con 4,2 ± 0,6 TCO / mAb, y Tz-Bn-NOTA fue radiomarcado con 64 Cu para producir el radioligando purificada en> 99% de pureza radioquímica,> 85% desintegración corregida rendimiento, y una actividad específica de ~ 6,7 MBq / nmol (Figura 5). La reactividad del conjugado huA33-TCO y el radioligando tetrazina pueden ser probados usando cromatografía instantánea radiactivo en capa fina (ITLC). Esto se hace mezclando el tetrazina radiomarcado (100 Ci; 0,55 nmol, asumiendo una actividad específica de 6,7 MBq / nmol) con un ligero exceso de huA33-TCO (50 mg; 0,66 nmol) en phosphate-solución salina tamponada (pH 7,4) a temperatura ambiente durante 5 min. Entonces, aproximadamente 1 Ci de la solución se vio en un C 18 placa de TLC de fase inversa y se deja secar. La TLC se ejecuta en 9: 1 MeCN: H 2 O, y la placa analizó usando un lector de placa de TLC radiactivo. Si la reacción clic funciona como estaba previsto, la ligaron 64 Cu-NOTA-A33 debe permanecer en la línea de base; Si, por otro lado, falla la reacción, libre de 64 Cu-Tz-Bn-nota aparecerá en o cerca del frente de disolvente.

Pasando a los experimentos in vivo de imágenes, en el protocolo descrito anteriormente, se emplearon ratones desnudos atímicos que llevan A33 que expresan el antígeno, SW1222 xenoinjertos de cáncer colorrectal. Tanto biodistribución aguda (n = 5 por punto de tiempo) y de formación de imágenes PET (n = 12) experimentos revelan que la estrategia de predireccionamiento es capaz de delinear el crecimiento del tumor colorrectal con contraste de la imagen excelente y altas relaciones de actividad tumor a fondo (Figura 6). La captación del 64 Cu-Tz-Bn-nota en el tumor es evidente en los momentos iniciales: 3,5% ± 0,6% ID / g y el 4,1% ± 0,6% ID / g en 1 hora y 4 horas después de la inyección, respectivamente. Sin embargo, en estos puntos de tiempo, es fácilmente oscurecido por la cantidad de radiactividad de compensación a través del tracto intestinal del ratón (11,9% ± 4,4% ID / g y 8,8% ± 3,4% ID / g en las heces en 1 hr y 4 pi h, respectivamente). En el transcurso de varias horas, el exceso de radioligando despeja través de las heces (1,4% ± 0,5% ID / g a las 24 h pi), y el tumor se convierte en la característica más prominente en la imagen (4,0% ± 0,9% ID / g en 24 pi h). En estos puntos de tiempo posteriores, el tumor está bien delineada en la imagen, y las razones de actividad tumoral-a fondo son bastante altos; por ejemplo, la estrategia da tumor: proporciones musculares de 26,6 ± 6,6 a las 12 h pi y 27,0 ± 7,4 a las 24 h pi No es sorprendente que los experimentos de control usando sólo 64 Cu-Tz-Bn-Nota, los anticuerpos no específicos, or huA33 sin restos de TCO conjugados todo resultó en la captación mínima en el tumor.

Como se discutirá más adelante, esta estrategia de predireccionamiento - como todas las estrategias de predireccionamiento - tiene un número de variables que se requieren optimización cuando se aplica a los nuevos sistemas de anticuerpo / antígeno. Dos de las más importantes son la masa de mAb-TCO constructo inyectado y la longitud del intervalo entre la inyección del constructo mAb-TCO y la inyección del radioligando. Si la cantidad de mAb-TCO conjugado es demasiado alto o el tiempo de intervalo entre las inyecciones es demasiado corto, la cantidad de libre mAb-TCO en la sangre sube y la probabilidad de reacciones clic producen en la sangre en lugar de a los aumentos tumorales. Por ejemplo, en el sistema 64 Cu / huA33 discutido aquí, tanto la administración de 300 mg de huA33 (en lugar de 100 g) o el uso de un intervalo de tiempo de 12 horas (en lugar de 24 h) dio como resultado aumentos notables en tque cantidad de radiactividad visible en el corazón del ratón (Figura 7A y la Figura 7B, respectivamente). En ambos casos, la reacción todavía se producía clic claramente en el tumor, como se ilustra por la cantidad de captación tumoral en los puntos de tiempo tempranos; sin embargo, la formación de anticuerpo radiomarcado en la sangre también es evidente. Si bien esto es tentador descartar debido a que el anticuerpo radiomarcado formado en la sangre seguirá siendo finalmente encontrar su camino hacia el tumor, esto anula tanto el propósito de utilizar una metodología premarcado, como circulará el anticuerpo radiomarcado lentamente antes de que alcance el tumor y por lo tanto elevar tarifas a órganos que no son objeto de la dosis. Por el contrario, si se usa demasiado poco anticuerpo, la cantidad de captación en el tumor, naturalmente sufrir. Excesivamente largos tiempos de intervalo también pueden reducir los niveles de captación tumoral como resultado de la internalización lenta anticuerpo, isomerización transcyclooctene, o anticuerpo / antígeno derramamiento. El diagnóstico de la ésimoproblemas ESE es más difícil y no puede lograrse simplemente mediante el examen de los datos de PET. Es evidente que se debe mantener un delicado equilibrio. Por lo tanto, se recomienda que los investigadores tratan de aplicar esta estrategia a un nuevo anticuerpo sistema / antígeno utilizan grandes cantidades de mAb-TCO constructo (≥ 200 mg) y los tiempos de intervalo corto (≤ 24 h) como puntos de partida y optimizar a partir de ahí.

Figura 1
Figura 1. La inversa de electrones demanda Diels-Alder [4 + 2] cicloadición clic ligadura entre tetrazina y transcyclooctene.

Figura 2
Figura 2. Un ejemplo de los cuatro pasos de la metodología predireccionamiento. Esta cifra se basa en una investigación publicada originalmente en JNM. Zeglis, BM et al. Una mascota pretargeted bas estrategia de imagened en bioorthgonal clic química Diels-Alder. Diario de Medicina Nuclear. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 por la Sociedad de Medicina Nuclear e Imagen Molecular, Inc. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Un esquema para la modificación de huA33 con TCO-NHS.

Figura 4
Figura 4. Un esquema para la síntesis y 64 Cu radiomarcaje de Tz-Bn-NOTA. Esta cifra se basa en una investigación publicada originalmente en JNM. Zeglis, BM et al. Una estrategia de formación de imágenes PET pretargeted basado en bioorthgonal Diels-Alder clic química. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). Y# 169; 2013 por la Sociedad de Medicina Nuclear e Imagen Molecular, Inc. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Un rastro de radio-HPLC de purificada 64 Cu-Tz-Bn-NOTA.

Figura 6
Figura 6. Imágenes de PET de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA / A33-TCO predireccionamiento estrategia. Ratones portadores de xenoinjertos SW1222 subcutáneas (100-150 mm 3) se administraron huA33-TCO (100 mg) mediante inyección en la vena de la cola. Después de 24 horas, los mismos ratones se les administró 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325] Ci) a través de inyección en la vena de la cola y posteriormente incluidas en la imagen 2, 6, 12, y 18 horas después de la administración de la radiofármaco. Transverse (arriba) y coronal (abajo) imágenes planas cruzan el centro de los tumores. Los altos niveles de absorción en el intestino en los puntos de tiempo tempranos (es decir, 2 y 6 hr) en gran parte claros por 12 horas, dejando el tumor (flecha blanca) claramente delineada de todo el tejido no objetivo por 12 y 18 horas después de la inyección. Esta cifra se basa en una investigación publicada originalmente en JNM. Zeglis, BM et al. Una estrategia de formación de imágenes PET pretargeted basado en bioorthgonal Diels-Alder clic química. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 por la Sociedad de Medicina Nuclear e Imagen Molecular, Inc. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7. imágenes PET de experimentos predireccionamiento subóptimas. (A) Ratones beaanillo xenoinjertos subcutáneos SW1222 (100-150 mm 3, flecha) se administraron huA33-TCO (100 mg) a través de inyección en la vena de la cola. Después de 12 horas, los mismos ratones se les administró 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 Ci]) inyección en la vena de la cola. (B) Los ratones con xenoinjertos subcutáneos SW1222 (100-150 mm 3, flecha) se les administró A33-TCO (300 mg) mediante inyección en la vena de la cola. Después de 24 horas, los mismos ratones se les administró 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 Ci]) inyección en la vena de la cola. En ambos casos, los ratones fueron imágenes 12 hr después de la inyección de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA. En ambos paneles, transversal (arriba) y coronal (inferior) imágenes planares se cruzan el centro de los tumores. Mientras que la estrategia de predireccionamiento delinea claramente el tumor en ambos casos, los resultados en ambas imágenes son de calidad inferior en comparación con los que se muestran en la Figura 6. En tanto 7A y 7B, hay unacantidad significativa de la actividad de fondo captación en el corazón. Bajo las condiciones de la figura 7A, esto es más probable el resultado de la huA33-TCO tiempo suficiente construir no se presta a localizar en el tumor. Bajo las condiciones de la Figura 7B, esto es probablemente una consecuencia de la inyección demasiado huA33-TCO y tener exceso de inmunoconjugado todavía circula en la sangre incluso 24 h después de la inyección. Esta cifra se basa en una investigación publicada originalmente en JNM. Zeglis, BM et al. Una estrategia de formación de imágenes PET pretargeted basado en bioorthgonal Diels-Alder clic química. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). 2013 por la Sociedad de Medicina Nuclear e Imagen Molecular, Inc. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La principal ventaja de esta estrategia de formación de imágenes PET pretargeted es que es capaz de delinear los tumores con contraste de la imagen-objetivo a fondo a sólo una fracción de la dosis de radiación de fondo producida por los anticuerpos marcados directamente. Por ejemplo, en el sistema de imágenes de cáncer colorrectal se describe aquí, se emplearon datos de los experimentos de biodistribución agudos para realizar cálculos de dosimetría para la estrategia de predireccionamiento a base de Cu 64 junto con directamente marcado con 64 Cu-NOTA-huA33 y 89 Zr-DFO-huA33. Estos cálculos ilustran claramente los beneficios dosimétricos del sistema de premarcado, especialmente en comparación con el anticuerpo marcado con 89 Zr más clínicamente relevante. La dosis efectiva de la estrategia predireccionamiento es 0,0124 mSv / MBq, mientras que la de 89 Zr-DFO-huA33 es más de 30 veces superior: 0,4162 mSv / MBq. El beneficio dosimétrico de predireccionamiento es menos pronunciada cuando se compara con el 64 Cu marcado con unntibody (0,0359 mSv / MBq), aunque aún existe el efecto ventajoso.

Una de las fortalezas más importantes de esta IEDDA predireccionamiento metodología es su modularidad: el -cyclooctene trans se puede añadir a cualquier anticuerpo que no está interiorizando, y una amplia variedad de cargas se puede conectar a la tetrazina. De hecho, nuestra directora motivación para escribir este protocolo es permitir que otros grupos de investigación de emplear este método con diferentes sistemas de anticuerpo / antígeno / radioisótopos. En ese sentido, creemos que es fundamental para hacer frente a una serie de cuestiones que los investigadores deben tener en cuenta al adaptar esta metodología para otros sistemas.

En primer lugar, la selección del anticuerpo es tremendamente importante. En pocas palabras, el anticuerpo debe ser no internalizar o internalizado a un ritmo muy lento. Mientras que los parámetros cinéticos ideales aún no se han determinado, el anticuerpo y el -cyclooctene trans reactiva que lleva debe quedarseel exterior de la célula, por la internalización y el secuestro del anticuerpo antes de la inyección del radioligando se reduciría drásticamente el número de reacciones in vivo clic. En el sistema descrito aquí, las metas y los anticuerpos huA33 se une al antígeno A33, una glicoproteína transmembrana expresada en> 95% de todos los cánceres colorrectales. Es importante destacar que, se ha demostrado que incluso después de la unión a su objetivo, el complejo huA33 anticuerpo / antígeno permanece en la superficie de la célula durante días. 31-33 Si bien la necesidad de un anticuerpo no internalización es ciertamente una limitación a la estrategia, una amplia variedad de anticuerpos no internalización son conocidos, tal vez sobre todo el anticuerpo CC49 TAG72 de metas que Rossin, et al., han explorado en su excelente trabajo predireccionamiento. 30,34,35

En segundo lugar, esta estrategia predireccionamiento - como cualquier otro - requiere una optimización significativa. Además de la identidad de la unantibody y el radioligando tetrazina, dos variables críticas deben ser considerados: la cantidad de anticuerpo inyectado y el tiempo de intervalo entre las inyecciones de anticuerpo y el radioligando. Hemos abordado tanto estas variables en la sección de resultados representativos anterior, pero para reiterar brevemente, si se emplea ya sea demasiado anticuerpo o demasiado corto un intervalo de tiempo, cantidades significativas de mAb-TCO conjugado permanecerá en la sangre en el momento de la inyección del radioligando. Esto, a su vez, dará lugar a la in vivo clic ligadura producen en la sangre en lugar de en el tumor, formando circulante, anticuerpo radiomarcado que se acumulan sólo lentamente en el tumor con el tiempo. Por el contrario, si se emplea demasiado poco anticuerpo o demasiado largo un intervalo de tiempo, el importe final de la radiactividad en el tumor será subóptima. En nuestra opinión, la realización de imágenes rigurosa, o preferiblemente, los experimentos de biodistribución agudas con el Itse anticuerpo marcado directamentelf antes de cualquier experimento predireccionamiento es la forma más fiable para conocer la cantidad de anticuerpos necesario y el tiempo de intervalo ideal después de la inyección inicial de construcción de anticuerpos. Para diferentes masas inyectada de mAb radiomarcado, estos experimentos proporcionarán datos concretos tanto en el aclaramiento del radioinmunoconjugado de la sangre y su acumulación en el tumor, lo que permite la selección de las condiciones más prometedoras para los experimentos premarcado.

Por último, la farmacocinética de radioligando basado en tetrazina deben considerarse al elegir un radioisótopo adecuado. En el sistema descrito aquí, el radiomarcado resto Tz-Bn-NOTA se excreta del cuerpo a través del intestino con una vida media biológica de aproximadamente 3-4 horas, lo que hace 64 Cu el radioisótopo emisor de positrones con la media física más complementaria vida. Por desgracia, la vida media biológica de la fracción tetrazina es demasiado largo para que sea compatible con la famie descomposición más rápida radiometal 68 Ga (t 1/2 = 68 min). En este caso, cualquier radiactividad en el tumor decaería a través de varias vidas medias antes de que el exceso de radioligando terminado la limpieza del cuerpo. Como resultado, las imágenes tendrían que ser adquirida en puntos de tiempo tempranos, cuando las proporciones de actividad tumor a fondo permanecen bajo 36 Idealmente, las futuras generaciones de radioligandos tetrazina sería mecanizado -. Quizás a través de PEGilación, glicación, u otros medios - para excretar desde el cuerpo más rápidamente. Esto permitiría radiomarcaje con radioisótopos en descomposición más rápida como 68 Ga y 18 F, que a su vez mejorar aún más los beneficios dosimétricos de la estrategia de imagen pretargeted. En última instancia, como investigadores adaptar esta tecnología para su uso con otros radioisótopos para formación de imágenes (por ejemplo, 124 I, 111 In, 18 F, 89 Zr, 68 Ga, etc.) o la terapia (por ejemplo, 177, 225 Ac, 125 I, etc.), tendrá que ser desarrollado para incorporar diferentes quelantes o radiomarcado grupos prostéticos nuevos ligandos basados ​​en tetrazina. La investigación a fondo de la farmacocinética de estas nuevas construcciones será esencial para asegurar partidos ventajosas entre las propiedades de aclaramiento de los ligandos y la vida media física de los radionucleidos.

Al final, tenemos muchas esperanzas de que otros investigadores ven la promesa de esta tecnología predireccionamiento y emplean con nuevos sistemas de anticuerpo / antígeno. Mientras que los párrafos precedentes ilustran que este proceso de adaptación no siempre es sencillo, es nuestra convicción de que esta metodología podría tener un impacto significativo en la medicina nuclear, la terapia con radionucleidos dirigida, y más allá.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrazine NHS Ester Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA Macrocyclics B-601 Store at -80 °C

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