Laser Capture mikrodissektion - en demonstration af Isolering af Individual dopaminneuroner og hele Ventral tegmentalområde

Neuroscience
 

Summary

Isoleringen af ​​individuelle dopaminneuroner eller ventrale tegmentalområde med direkte eller indirekte immunhistokemi påvises ved hjælp af laser capture mikrodissektion. Parametre til isolering af væv fra et objektglas under anvendelse af en infrarød laser og fra membran- slides anvendes en kombination af en infrarød og ultraviolet laser diskuteres.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kummari, E., Guo-Ross, S. X., Eells, J. B. Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area. J. Vis. Exp. (96), e52336, doi:10.3791/52336 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Laser capture microdissection (LCM) anvendes til at isolere en koncentreret population af individuelle celler eller præcise anatomiske områder af væv fra vævssnit på et objektglas. Når det kombineres med immunohistokemi kan LCM anvendes til at isolere individuelle celler typer baseret på et specifikt protein markør. Her LCM teknikken beskrevet for indsamling af en specifik population af dopaminneuroner direkte mærket med tyrosin hydroxylase immunohistokemi og til isolering af dopamin neuron indeholdende region af det ventrale tegmentale område ved indirekte tyrosinhydroxylase immunhistokemi på en del støder op til dem, der anvendes til LCM. Et infrarødt (IR) capture laser bruges til både dissekere individuelle neuroner samt ventrale tegmentalområde off objektglas og på en LCM hætte til analyse. Fuldstændig udtørring af vævet med 100% ethanol og xylen er kritisk. Kombinationen af ​​IR capture laser og ultraviolet (UV) cutting laser bruges til at isolere individuelle dopaminneuroner eller ventrale tegmentalområde når pennen membran slides. En PEN membran slide har betydelige fordele i forhold et objektglas, da det giver bedre sammenhæng i at fange og indsamle celler, er hurtigere at indsamle store stykker væv, er mindre afhængig af dehydrering og resulterer i fuldstændig fjernelse af væv fra slide. Selv om fjernelse af store områder af væv fra et objektglas er muligt, er det betydeligt mere tidskrævende og ofte efterlader nogle resterende væv bag. Data, der er vist her viser, at RNA af tilstrækkelig mængde og kvalitet kan opnås ved hjælp af disse procedurer for kvantitativ PCR målinger. Selv RNA og DNA er de mest almindeligt isolerede molekyler fra væv og celler opsamlet med LCM, isolation og måling af microRNA, protein og epigenetiske ændringer i DNA kan også drage fordel af den forbedrede anatomiske og cellulær opløsning opnået ved anvendelse af LCM.

Introduction

Alle væv består af en heterozygot population af celler. Dette er særlig relevant for hjernevæv, der består af forskellige morfologisk og / eller neurochemically distinkte neuroner omgivet af forskellige typer af gliaceller (oligodendrocytter, mikroglia og astrocytter). Derudover adskilte regioner i hjernen, såsom områder af cortex eller hjernestammen kerner, har specifikke funktioner. Derfor er evnen til at isolere specifikke populationer af celler eller meget små anatomisk særskilte områder, når de kombineres med analytiske teknikker (dvs., Q-PCR, microarrays, RNA-sekventering, og proteomics), kan markant øge forståelsen af forskellige biologiske processer. LCM er en teknologi, der giver mulighed for at isolere meget diskrete anatomiske områder eller specifikke celler fra væv på et objektglas giver en meget mere homogen kilde til yderligere analyse af forskellige molekyler, såsom RNA, microRNA, DNA og proteiner.

t "> Eftersom LCM blev indført, har flere forskellige fremgangsmåder blevet anvendt til at microdissect celler fra væv 1-3. De tidligste metoder omfattede direkte fastgørelse af væv på et objektglas ved anvendelse af en infrarød (IR) laser, og en termoplastisk film og et ikke- kontakt under anvendelse af en ultraviolet (UV) skæring laser at frigøre en celle eller væv og samling i et rør. Efterfølgende LCM held har været anvendt på en lang række væv og celletyper og vist sig at være forenelige med isolation af forskellige molekyler for downstream analyse herunder RNA, microRNA, DNA og proteiner, herunder enzymatisk aktivitet 1,4-7. Her LCM demonstreres ved hjælp af et LCM, som anvender et skærende UV laser og en capture IR laser til at skære omkring celler eller væv og vedhæfter den til en LCM cap, henholdsvis. Dette LCM system anvender både IR capture laser til at smelte en plastfilm på en hætte over cellen eller væv af interesse, der lægger cellerne til plastfolien og fjerner det fra than væv med fjernelse af hætten (figur 1). Derudover, i kombination med IR-laser, en UV-laser er tilgængelig til at skære ud væv eller celler af interesse fra væv monteret på objektglas med en membran og derefter isoleret ved fastgørelse af væv til LCM hætten ved hjælp af IR-laser (figur 2). En kort oversigt over disse teknikker findes i figur 1 og 2.

Adskillige variationer af denne teknik er beskrevet enten isolere specifikke celler ved hjælp af direkte fluorescerende immunohistokemi og en indirekte immunhistokemi-guided teknik, der anvendes til isolering af et område af væv baseret på ekspressionen af ​​et specifikt protein. Specifikt isolering af dopamin neuroner fra substantia nigra og isolering af den ventrale tegmentale område og efterfølgende isolering af RNA fra friske, frosne hjernevæv vist. RNA er den mest labile molekyler målt (i forhold til DNA eller protein), stEPS for at bevare RNA integritet er inkluderet og data vises på mængden og kvaliteten af ​​RNA opnået.

Protocol

BEMÆRK: Brain væv fra mus blev anvendt i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr, og studere protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Mississippi State University.

1. Fremstilling af Slides og væv

  1. Brug enten Silan-prep dias eller polyethylennaphthalat (PEN) membran objektglas.
  2. For RNA isolation, dip objektglassene i RNase dekontaminering opløsning, vaskes 3 gange med RNase-frit vand og derefter dehydrerer med en gradueret serie af RNase-fri ethanol og vakuum tør for 30 min.
  3. Skær vævssnit ved 10 um tykkelse ved hjælp af en kryostat og montere på den forberedte RNase gratis dias. Hold afsnittene frosne under skæring for at bevare RNA kvalitet.
    BEMÆRK: Sørg for, at vævet er ca. 4 mm væk fra kanterne af dias som LCM kan ikke fjerne væv, der er for tæt på kanten af ​​dias. I order til at fjerne væv fra en PEN-membran dias, sikre, at vævet er 4 mm fra venstre, top og bund og 7 mm fra højre side af slæden som er de dimensioner af membranen, der ikke er knyttet til dias.
  4. Til isolering af individuelle cellepopulationer bruger direkte immunhistokemi, sektion væv på enten den silan-prep dias eller PEN membran dias. Til isolering af regioner af væv ved hjælp af indirekte immunhistokemi styrede teknikker, montere et sæt af sektioner på en silan-prep slide for immunohistokemi og alternative sektioner på enten en PEN membran slide og / eller en silan-prep slide skal anvendes til LCM.

2. Tissue Forberedelse til Laser Capture - Rapid Tyrosin hydroxylase Immunohistokemi for Direkte Laser Capture af immunoreaktive celler

  1. Outline væv med en hydrofob pen og lad det tørre.
  2. Fix væv i acetone-methanol (1: 1) opløsning ved -20 ° C i 10 min.
    BEMÆRK: Our erfaringen har vist, at acetone-methanol fiksering resulterede i langt mere konsekvent immunhistokemi end acetone eller methanol alene.
  3. Skyl slide i phosphatbufret saltvand (PBS) med 1% Triton (RNase-frit).
  4. Cover sektioner med 100-200 ml PBS med 1% Triton med tyrosin hydroxylase-antistof fortyndet 1: 100 med 400 U / ml RNasin. Inkuber i 5-10 min.
  5. Skyl kortvarigt i PBS to gange og PBS-1% Triton.
  6. Dæk væv med 100-200 ml gede-anti-kanin-IgG mærket med Alexa Fluor 488 fortyndet 1: 100 i PBS-1% Triton med 400 U / ml RNasin og 50 ng / ml DAPI. Der inkuberes i 5 min.
  7. Skyl 2 gange i PBS og derefter dehydrerer 30 s i en gradueret serie af RNase ethanol (75% -75% -95% -95% -100% -100%).
  8. Inkuber i to vaske xylen i 1 min og derefter 5 min.
  9. Fjern slides fra Xylen umiddelbart før brug for LCM og lad det lufttørre.

3. Tissue Forberedelse til Laser Capture - TyrosinHydroxylase Immunohistokemi for Indirekte Laser Capture af Immunreaktive Regioner

  1. Proces et dias med sektioner støder op til sektioner monteret på Silan-prep og / eller PEN membran dias for immunhistokemi.
    BEMÆRK: Procedurer, der anvendes her, svarer til dem, der tidligere rapporteret 5. Til demonstration billederne blev diaminobenzidin (DAB) chromagen reaktion bruges til at visualisere tyrosin hydroxylase neuroner af interesse.
  2. For slides anvendes til LCM fastsætte i 5 minutter i 100% acetone ved 4 ° C.
  3. Dehydrer væv i en gradueret serie af RNase ethanol (75% -75% -95% -95% -100% -100%) i 1 min hver.
  4. Inkuber i to vaske xylen i 1 min og derefter 5 min.
  5. Fjern slides fra Xylen umiddelbart før brug for LCM og lad det lufttørre.

4. Brug af Laser Capture mikrodissektion System

BEMÆRK: LCM program har 10 værktøjslinjer og 2 vinduer til at styremikrodissektion procedure. Værktøjslinjer: 1. Mikroskop, 2. Capture Laser, 3. Skæring Laser, 4. Study, 5. Navigation, 6. Materialer, 7. Capture Grupper, 8. mikrodissektion 9. Font, 10. Annotation. Windows: 1. live video og 2. køreplan.

  1. Åbn døren ved at vælge fanen "Åbn dør" i Materials værktøjslinjen i LCM systemsoftware.
  2. Load glider på de tre tilgængelige slots. Til denne demonstration, load et lysbillede med tyrosinhydroxylase immunhistokemi visualiseret med DAB, en Silan-prep dias og en PEN-membran slide hver mærket til hurtig fluorescerende tyrosinhydroxylase immunhistokemi. I et typisk eksperiment, bruge enten umærket acetone faste sektioner med en reference slide mærket til tyrosinhydroxylase hjælp af DAB eller dias direkte mærket med fluorescerende tyrosinhydroxylase til laser capture.
  3. Læg LCM CAPS i det ledige stik.
    BEMÆRK: Makro og HS LCM hætter er til rådighed til brug. Den type LCM cap til at bruge dehænger af antallet af celler eller mængden af ​​væv, der skal indsamles. Makro dias er angivet til at indsamle op til flere tusinde celler, mens HS caps kan samle flere hundrede. MACRO slides give mulighed for mere væv indsamling, men kræver 50 pi lysisbuffer. HS cap, når den anvendes med adaptere, kræver kun 10 pi lysisbuffer, der giver mulighed for større proportional genvinding af RNA.
  4. Luk døren.
  5. Læg dias for at aktivere køreplanen vindue, der udgør et fungerende udsigt over hele dias, dette giver mulighed for valg af regionen af interesse (Figur 3). Se køreplanen på live video-vinduet til at navigere til det område af interesse.
  6. I Materialer værktøjslinjen, identificere de PEN membran glider ved at markere feltet over slide slot. At levere cap egenskaber, højreklik på hætterne i materialerne værktøjer og vælge "Cap levering egenskaber". Marker felterne med angivelse af placering af hætterne og vælg enten Macro eller HS hætter.
  7. Vælg "Fluorescens" fanen i mikroskopet værktøjslinjen for at tænde lysstofrør og gøre det muligt for lysstofrør at varme op. Brug de blå og UV-filtre til at visualisere Alex Fluor 488 og DAPI hhv. Brug "Adjust Camera" Tab for at øge følsomheden af ​​billedet, for at se fluorescens-mærkede celler.
  8. I Materialer værktøjslinjen, skal du højreklikke på en kasket og flytte det til dias af interesse. Dobbeltklik på en placering i køreplanen for at vælge den region, der vises i live video vinduet. Flyt hætten rundt på diaset ved at vælge et område på køreplanen (dobbelt venstre klik) og derefter højreklikke og vælge "Place cap i midten region."
  9. Før du bruger IR capture laser, sigte og tilpasse det til styrke. Sæt hætten i en region af dias væk fra væv. På Capture Laser værktøjslinjen, skal du vælge "Aktiver". Juster Power (3-100 mW), Puls (100-1000000 μ; Sec) og # Hits af laseren. Fire IR laser når hætten er over en del af objektglasset uden væv og kontrollere, om laseren tilstrækkeligt smelter LCM cap membran.
    BEMÆRK: Dette kaldes befugtning som smelter polymermembranen på hætten, så den kommer i kontakt objektglasset. Tilstrækkelig befugtning ses som en mørk ring kondenseret til objektglasset med centrum af ringen klar (se figur 4 for eksempler på tilstrækkelig og utilstrækkelig smeltning). Hvis befugtning ikke er tilstrækkelig, justere magt og puls, og test brand igen, indtil dette er opnået. Derudover kan også anvendes flere brande af laseren.
  10. Når IR laser intensitet justeres, højreklik og vælg "Capture laser er her" at sigte laseren.
    BEMÆRK: Dette trin fortæller computeren, hvor IR-capture laser er rettet mod vævet. Dette trin sigter laseren er kritisk og skal gentages hver gang hætten flyttes eller målet ændres.
  11. 5. Laser Capture mikrodissektion af Individual dopaminneuroner off silan-prep Slides

    1. Flyt til regionen af ​​interesse til at fange celler.
      BEMÆRK: eksempel til isolering af dopamin neuroner er vist her.
    2. At fange de enkelte celler ud af en silan-prep dias, skal du vælge "LCM" fanen og derefter på "single point" ikonet i mikrodissektion værktøjslinjen.
    3. I mikroskopet værktøjslinjen, bruge "Shutter" fanen for at skifte mellem fluorescens og lyse felt med fluorescerende filtre faner for at vælge de rette filtre og bruge mål fanerne for at ændre forstørrelsen. Når cellerne af interesse er synlige i Direkte video-vinduet, justere spot størrelse bruges til at markere celler af interesse for den omtrentlige størrelse af cellerne. Gør dette ved at klikke på fanen Spot på Capture Laser værktøjslinjen og derefter klikke på den ene side af en farvet celle, efterfulgt ved at klikke på den modsatte side.
      BEMÆRK: Denne beregnerdiameter af stedet og viser værdien.
    4. Markér cellerne af interesse ved at klikke på dem, mens de "Single point" ikonet er valgt. Gør dette til at placere en plet markør på hver celle. Her bliver den blå filter og 10X mål bruges til at visualisere dopamin neuroner. Gentest og sigte IR laser på hætten, hvor der ikke vævet under det, som beskrevet i trin 4.9 og 4.10.
    5. Når cellerne er markeret, skal du vælge "Go - klip og capture" fane på mikrodissektion værktøjslinjen og IR laser automatisk skyde på alle markerede celler valgt. Desuden, hvis det er nødvendigt, brand IR laser manuelt på ethvert punkt af interesse (figur 5D).
    6. Flyt hætten væk fra sektionen og på åben region af dias at kontrollere, om cellerne blev fanget på LCM cap. Kontroller, at cellerne af interesse fjernes fra slæden (figur 5B, E) og fastgjort til LCM cap (figur 5C, F). Dokument ther processen ved at klikke på "Capture image" fanen i Microscope værktøjslinjen.
    7. Når du er færdig indsamle væv, fjerne hætten ved at højreklikke på hætten og vælg "Flyt til" og derefter "Aflad."

    6. Laser Capture af Individual dopaminneuroner off af PEN Membrane Slides

    1. At fange de enkelte celler ud af PEN membran dias hjælp af både IR og UV-lasere, vælg "Klip og Capture" fanen i mikrodissektion værktøjslinjen. Vælg fanebladet "single point" for at markere cellerne af interesse. Brug fanen "Cut line" at skitsere hver celle. Sørg for at teste IR laser som beskrevet i trin 4.9 og 4.10 og teste UV laser til at bestemme den minimale intensitet nødvendigt at skære troede PEN membran og væv (figur 4 og 5)
    2. Vælg "Capture og Cut" fane på mikrodissektion værktøjslinjen. Ved indsamling individuelle celler ved hjælp af denne teknik, væreSørg for at fyre IR laser først efterfulgt af UV-laser, da disse små stykker kan gå tabt, hvis de er skåret ud, inden den indsættes i LCM cap.
      BEMÆRK: Denne proces kan også gøres manuelt ved at affyre IR laser ved et interessepunkt og cellerne individuelt skitseret med UV-laser.
    3. Efter opsamling af celler af interesse, flytte LCM cap som beskrevet ovenfor i trin 5.7 at bestemme, om cellerne blev fjernet og fastgjort til hætten (figur 6).
    4. Når du er færdig indsamle væv, fjerne hætten ved at højreklikke på hætten og vælge "Flyt til" og derefter "Aflad."

    7. Optagelse den ventrale tegmentalområde fra Silan-prep Slides

    1. For at identificere området af interesse, skal du bruge slide forarbejdet til immunhistokemi.
      BEMÆRK: For denne demonstration den ventrale tegmentalområde er isoleret (figur 7A).
    2. Læg en LCM hætte og afprøve de lasere som i trins 4.9 og 4.10.
      BEMÆRK: Typisk er en Macro LCM hætte anvendes, men kan også anvendes en HS hætte (se figur 8).
    3. For at isolere et område af væv (dvs. den ventrale tegmentalområde) fra Silan-prep dias, skal du vælge "LCM" fanen i mikrodissektion værktøjslinjen, og vælg derefter fanen "polygon-ydre". Skitsere området af interesse i live video vinduet. Afhængig af størrelsen af ​​området for indsamling, skitsere området af interesse ved lav forstørrelse (2X mål). For indsamling, men instrumentet bruger 10X målet så justere og sigte IR laser under 10X målet før optagelsen.
    4. Vælg "Go - opsamling og cut" fanen i mikrodissektion værktøjslinjen.
      BEMÆRK: Computeren vil automatisk fyre IR laser hele markerede område (figur 7F, I). Hvis LCM membranen ikke er smeltet tilstrækkeligt i hele området, kan laseren blive fyret mandelt eller hele processen gentages.
    5. Flyt LCM hætten af ​​vævet for at bestemme, hvor godt vævet blev opsamlet.
      BEMÆRK: En pass hjælp af denne metode giver typisk nogle væv bag på slæden (Se Figure7G). Hvis dette sker, skal du gentage markeringen og fange trin ovenfor. Gentagelse dette trin kan øge mængden af væv opsamlet (Figur 7J).
    6. Når du er færdig indsamle væv, losse hætten ved at højreklikke på hætten og vælge "Flyt til" og derefter "Aflad."

    8. Optagelse den ventrale tegmentalområde fra PEN Membrane Slides

    1. Brug slide forarbejdet til immunhistokemi som en guide til at vælge det område af interesse fra vævet på membranen slide PEN som ovenfor.
    2. Vælg "Cut og Capture" fanen i mikrodissektion værktøjslinjen. Vælg fanebladet "Cut Line" og beskriver området af interesse ved hjælp af immunohistocheMistry mærket dias som en vejledning.
      BEMÆRK: Programmet vil automatisk tilføje spots for IR laser til at fastgøre væv til hætten. Brug feltet "single point" for at tilføje flere steder at bedre sikre vævet til hætten.
    3. Under 10X målsætning, test ild og sigte IR og UV-laser, som beskrevet i 4.9 og 4.10. Test at UV laser kan trænge ind i membranen på objektglasset, og at dette snit svarer til den placering på computerskærmen. Brug en UV laser styrke, der netop er tilstrækkeligt til at skære membranen og væv, men ikke beskadiger væv (figur 5).
    4. Vælg "Go - opsamling og cut" fanen i mikrodissektion værktøjslinjen.
      BEMÆRK: Computeren vil automatisk fyre IR laser på alle mærkede steder i vævet for at sætte den til hætten derefter affyre UV laser til at skære slide PEN membran og væv (Figur 7C). Yderligere IR smeltede pletter kan være nødvendigt at tilstrækkeligt fastgøre tissagsøge til LCM cap, som også kan tilføjes manuelt.
    5. Flyt LCM hætten af vævet at afgøre, om vævet blev fjernet fra afsnittet (figur 7C) og fastgjort til hætten (Figur 7C).
    6. Når du er færdig indsamle væv, for at fjerne hætten, skal du højreklikke på hætten og vælg "Flyt til" og derefter "Aflad."

    9. Isolering af RNA

    1. At indsamle RNA fra de indfangede celler eller væv inkuberes LCM cap membranen i RNA lysis buffer i 30 minutter ved 37 ° C.
      BEMÆRK: HS kasketter, en adapter er til rådighed, der tillader anvendelse af kun 10 pi lysisbuffer på hætten og tillægger en 0,5 ml mikrocentrifugerør. MACRO caps kræver 50 pi lysisbuffer og lægger direkte til en 0,5 ml mikrocentrifugerør.
    2. Efter inkubation dreje lysisbuffer ned i 0,5 ml mikrocentrifugerør.
    3. For at sikre fuldstændig lysis af alle celler or væv, Træk LCM cap membran af hætten og plads i lysisbuffer.
    4. For at teste for RNA integritet, brug RNA isoleret fra vævet tilbage på dias efter LCM at måle RNA integritet.
      BEMÆRK: På grund af den begrænsede prøve RNA opnået med LCM, er det typisk ikke praktisk at teste RNA integritet på LCM isoleret RNA imidlertid RNA fra det resterende væv giver en god indikator for enhver RNA-nedbrydning på grund af fiksering, immunhistokemi og tid under LCM procedure.

Representative Results

Mikrografiet i figur 6 og 7 demonstrere mulighederne for isolering af individuelle dopamin neuroner. Den nuværende anatomiske opløsning er omkring 5-10 um som den mindste pletstørrelse der konsekvent kan produceres på LCM hætter at isolere en celle. Den eneste begrænsning til isolering af specifikke celletyper er evnen til at visualisere cellerne. Selv LCM er i stand til at isolere individuelle dopaminneuroner forurening af dele af tilstødende umærkede celler mest sandsynligt forekommer. Derfor slutprøven er en koncentreret samling af dopamin neuroner, ikke en ren population af dopamin neuroner. Denne teknologi er også i stand til at isolere små områder af væv, såsom diskrete kerner eller regioner i hjernen, som vist med isolering af det ventrale tegmentale område. Tidligere publikationer har vist denne anvendelse i hjernevæv samt isolere patologisk væv fra normalt væv 5,11.

(figur 9). RNA kvalitet blev reduceret i RNA-prøver fra væv, der anvendes til LCM med lavere integritet efter immunhistokemi (RIN ikke tilgængelig) efterfulgt af acetone fiksering (RIN 2.6) sammenlignet med hele hjernen RNA (RIN 8.2) som kan ses af en relativ reduktion i højden af ​​rRNA S28 top i forhold til S18 top. Imidlertid RNA opretholdes 18S og 28S bands og genekspression kan måles ved hjælp af Q-PCR.

(figur 10A). Til måling RNA mængde med Q-PCR, en række koncentrationer af hele hjernen RNA og RNA fra dopamin neuroner blev revers transkriberet og β-actin-gen blev målt ved anvendelse af Q-PCR som tidligere beskrevet 5. Baseret på disse målinger blev en koncentration på 3,55, 6,82 og 20,58 pg / pl beregnet ud fra 50, 100 og 200 dopaminneuroner, (figur 10B).

For at vise hvor isolering af dopaminneuroner sammenligner isolering af hele ventral tegmentalområde med LCM, dopamin neuron specifikke gener (Nurr1, tyrosin hydroxylase, og dopamin-transporteren) blev målt med Q-PCR i disse to forskellige typer af prøver og i forhold til ekspression af β-actin (figur 11). Da lavere C t-værdier genereres med en højere koncentration af genet af interesse, et fald i ΔC t indikerer en forøget ekspression af dopamin neuron gener i forhold til β-actin. Dette viser, hvordan isoleringen af ​​individuelle dopaminneuroner koncentrerer ekspression af dopamin neuron specifikke gener. I de ventrale tegmentalområde prøver er dopamin neuron specifikke gener fortyndet som andre celler (ikke-dopaminerge neuroner og gliaceller) vil også blive indsamlet, der udtrykker β-actin, men ikke udtrykker dopamin neuron gener.

Figur 1

Figur 2
Figur 2. Laser tage med de infrarøde (IR) capture laser og ultraviolet (UV) skæring laser. For at opnå større områder af væv eller lette inddrivelsen af celler under anvendelse af UV-laser, er væv monteret på et dias med en membran forbundet til slæden langs ydersiden hjørne (PEN membran dias). Den LCM hætte er placeret på than væv og IR capture laser bruges til at smelte hætten membran og fastgøre væv til LCM cap (trin 1 og 2). UV skæring laser anvendes derefter til at skære gennem slæden membranen og væv (trin 3 og 4), således at når hætten er fjernet, væv fjernes fra slæden og forbliver på LCM hætten (trin 5).

Figur 3
Figur 3. Laser Capture mikrodissektion System køreplan. Denne Laser Capture mikrodissektion System har plads til 3 dias ad gangen. Når dias indlæses i mikroskopet, er lav forstørrelse køreplanen billeder for hvert dias genereret. Valg af et område på køreplanen billedet bevæger levende billede vindue til denne region. Til demonstration blev musen mesencephalon opdelt i 10 um sektion på 3 dias. Den første dias blev mærket for tyrosinhydroxylase immunoreactiviTy hjælp diaminobenzidin som chromagen (A). Sektioner blev monteret på enten Silan-prep slides (B) eller PEN membran slides (C). Begge disse objektglas blev mærket under anvendelse af den hurtige fluorescerende tyrosinhydroxylase immunohistokemi. Pile i (C) viser fastgørelsen af PEN membranen til objektglasset. Ingen væv udenfor denne grænse kan opsamles med LCM.

Figur 4
Figur 4. Anvendelse af IR capture laser. IR capture laser bruges til at smelte LCM cap membranen til at fastgøre væv til LCM hætten og fjerne det fra resten af vævet. IR capture laser skal være tilstrækkelig styrke til at smelte LCM cap membranen tilstrækkeligt til at kontakte det underliggende væv og objektglas. Billedet ovenfor viser, når laseren var utilstrækkelig til at smelte membranentil dias (venstre to lokationer). Når den smeltede membran rører objektglasset, kan der observeres en tyk sort kontur (rigtige sted). Intensiteten af ​​laseren kan justeres ved at ændre Power (3-100 mW), Puls (100-1,000,000 usek) og # Hits af laseren. Derudover gentagen affyring af IR laser på samme sted kan også yderligere smelte membranen. Formålet med IR laser skal justeres anytime LCM hætten flyttes eller når målet er ændret. Scale bar = 100 um.

Figur 5
Figur 5. Anvendelse af UV skæring laser. UV skæring laser bruges til at skære gennem PEN membran og væv. Før anvendelse med minimum er nødvendig for at skære gennem membranen og væv skal bestemme, eftersom UV laser kan beskadige væv. Ovenfor er de tre lokationer (pile) af forskellige UV laser intensiteter vist med den venstre spot størrelse er tilstrækkelig til 10 um sektioner, den midterste stedet for tykkere sektioner og det rigtige sted demonstrerer en UV-laser intensitet, der er for høj. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Direkte isolation af tyrosin hydroxylase immunoreaktive neuroner ved hjælp af IR-laser. Dopaminneuroner er vist efter en hurtig fluorescerende mærkning for tyrosin hydroxylase (A). Når IR laser affyres smelter LCM cap membran over disse neuroner (D), fjernelse af hætten henter disse celler ud af slæden (B, E). Disse neuroner kan derefter visualiseres som er fastgjort til LCM cap (C, F). Scale bar = 250 um.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Direkte isolation af tyrosin hydroxylase immunoreaktive neuroner fra PEN membran slides ved hjælp af IR og UV-lasere. Tyrosinhydroxylase mærkede neuroner er vist ovenfor (A). Disse neuroner kan fastgøres til LCM hætten ved hjælp af IR-laser og skåret fra membranen slide pennen ved hjælp af UV-laser (B). Scale bar = 250 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 8
Figur 8. Indirekte isolering af den ventrale tegmentale område med tyrosinhydroxylase immunreaktivitet. Placeringen af dopamin neuroner i det ventrale tegmentale område blev visualiseret i en sektion ved anvendelse af standard immunhistokemiske teknikker (A og E). Dette immunhistokemi mærket afsnit blev anvendt som en skabelon til at lokalisere det ventrale tegmentale område ufarvede tilstødende sektioner (B og F). Ved hjælp af UV-laser, blev ventrale tegmentale område knyttet til LCM hætte med IR laser og skæres fra objektglasset med UV-laser (C og D) og er vist fastgjort til en HS LCM hætte (D). Den ventrale tegmentale region isoleret fra Silan-prep slides kun bruger IR laser er også vist fastgjort til en makro kasket (FK). Bemærk, at mere end ét forsøg var nødvendig for at indsamle størstedelen af væv fra denne region (Sammenlign G og J). Scale bar = 500 um.pload / 52336 / 52336fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 9
Figur 9. RNA kvalitet. Repræsentative elektroferogrammer og tilknyttede gel billeder af kommercielt tilgængelig hele hjernen RNA (A) og RNA isoleret fra sektioner efter acetone fiksering og LCM (B) eller hurtig fluorescerende tyrosinhydroxylase immunohistokemi og LCM (C). Selv RNA kvalitet blev reduceret i afsnit forarbejdet til immunohistokemi forhold til hele hjernen RNA Elektroferogrammerne demonstrere meste intakt RNA baseret på tilstedeværelsen af ​​rRNA S18 og S28 toppe. Hele hjernen RNA-koncentrationen var 6,487 pg / pl med en RIN på 8,2. Acetone fikseret væv RNA-koncentrationen var 5,036 pg / pl med en RIN på 2,6. RNA opnås efter immunhistokemi h ad en koncentration på 4,474 pg / pl og RIN var ikke tilgængelig.

Figur 10
Figur 10. RNA mængde. Til at bestemme mængden af RNA i neuroner opnået med LCM blev en standardkurve for RNA koncentrationer fremstilles ved en fluorospectrometer og Q-PCR. For fluorospectrometer målinger (A), den store graf viser højere række af RNA beløb og den lille graf viser følsomheden af denne analyse ned til 10 pg / pl. Koncentrationer af RNA opnået fra 50, 100 og 200 dopaminneuroner var 17,3, 24,8 og 50,9 pg / pl hhv. Brug af Q-PCR for at måle RNA beløb (B), koncentrationerne af RNA opnået fra 50, 100 og 200 dopaminneuroner var 3,55, 6,82 og 20,58 pg / pl hhv.

es / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg "/>
Figur 11. Koncentration af dopamin neuron specifikke gener med isolering af individuelle dopaminneuroner. Forskellen i Ct (ΔC t) mellem dopamin neuron specifikke gener (Nurr1, tyrosinhydroxylase og dopamin-transporteren) og β-actin i prøver af dopaminneuroner i det ventrale tegmentale område isoleret med LCM sammenlignet med ekspression i dissektioner i hele ventrale tegmentale område er vist. Da lavere C t-værdier genereres med en højere koncentration af genet af interesse, et fald i ΔC t indikerer en forøget ekspression af dopamin neuron gener i forhold til β-actin som andre celler (ikke-dopaminerge neuroner og gliaceller) vil indsamles i de ventrale tegmentalområde prøver, der udtrykker β-actin men ikke udtrykker dopamin neuron gener.

Discussion

LCM er en kraftfuld teknik til dissektion af diskrete populationer af celler eller områder af væv fra vævssnit på et mikroskopobjektglas, og den efterfølgende isolering af RNA, microRNA, DNA og proteiner. Anvendelsen af ​​LCM i kombination med analyse under anvendelse af high-throughput teknologier såsom microarray, næste generation RNA sekventering, epigenetisk analyse af DNA og proteomics bliver mere og mere almindelige, som følsomheden af ​​disse teknikker forbedrer og mængden af ​​udgangsmateriale nødvendige reduceres 8-12. Med LCM, er en bedre anatomisk opløsning opnået for en prøve, og den forståelse fra downstream foranstaltninger af disse prøver er stærkt forbedret. En advarsel med LCM er, at det giver en koncentreret prøve af cellerne af interesse, men ikke nødvendigvis en ren population af celler. Grænserne for præcision betyder, at der vil være nogle urenheder fra tilstødende væv. Denne teknik har dog koncentrere cellerne af interesseat minimere virkninger forbundet med omgivende væv og celler og maksimere de eksperimentelle virkninger på cellerne af interesse.

Direkte versus indirekte Immunohistokemi

Da LCM øjeblikket anvendes primært til isolering og måling af RNA, holde RNA intakt er et meget vigtigt kriterium. Fastholdelse RNA integritet er det vigtigste rationale bag anvendelsen af indirekte immunohistokemi til at lede væv dissektion, som fjerner nødvendigheden af at plette vævet direkte som kan nedbryde RNA (figur 10). Når den eksperimentelle spørgsmål, kræver imidlertid isolering af en specifik population af celler, såsom dopamin neuroner er direkte fluorescerende immunhistokemi påkrævet. Ved hjælp af en hurtig immunhistokemi mærkning protokol kan minimere nedbrydningen af ​​RNA under proceduren. De korte inkubationstider skyldes anvendelsen af ​​høje koncentrationer af primære og sekundære antiorganer, koncentrationer, der er omkring 10-20 gange højere end hvad der er nødvendigt for konventionel immunhistokemi med en 2 timers inkubation. Hvis imidlertid længere inkubationstider påkrævet, Brown og Smith brugte højt saltindhold buffere til at hæmme RNA-nedbrydning og få god kvalitet RNA med lange inkubationstid (op til 20 timer) 13. Denne fremgangsmåde kan også anvendes, hvis der er en betydelig tid, der kræves mellem mærkning af vævet og få adgang til en LCM system.

Valg af dias - PEN membran, Silan-prep og ikke-coatede objektglas

Anvendelsen af ikke-coatede objektglas for LCM er blevet rapporteret 14. I vores laboratorium har Silan-prep slides vist sig at være et optimalt valg, da denne belægning er tilstrækkelig lægger vævet til objektglasset for immunhistokemi uden tab af væv, men stadig giver mulighed for fastgørelse af væv til LCM CAPS og fjernelse fra slide . Ikke-coatede objektglas harviste nogle væv tab med immunhistokemi procedure. Hvis der anvendes indirekte immunhistokemi imidlertid bliver væv tilbageholdelse mindre af et problem. Med korrekt dehydrering, opfange celler eller væv ud af Silan-prep dias har ikke været et problem. Hver af de forskellige tilgange til isolering neuroner eller hjerneområder, der er beskrevet i dette dokument har fordele og ulemper. Til isolering af individuelle dopaminneuroner, anvendelse silan-prep slides har den fordel, bedre optik og er billigere end PEN membran slides. Ulempen er, at nogle gange fange celler kan være vanskeligt, hvis der ikke er tilstrækkelig dehydrering (se nedenfor), og nogle væv kan efterlades på dias. Fordelen af ​​pennen membraner slides er, at der anvendes en kombination af IR-laser og UV-laser sikrer, at dopaminneuroner vil blive indsamlet. Manglende indsamle celler fra en pen membran glider næsten aldrig forekommer, da det er mindre afhængig af dehydrering end objektglas. En yderligere fordel er, at UV-laser kan anvendes til tættere tilnærmelse formen af ​​neuroner af interesse, sammenlignet med en cirkel for at opfange neuroner ud af objektglas med IR laser. Til isolering af områder af væv, de PEN membran dias er langt overlegen og retfærdiggøre den ekstra omkostning. Denne metode resulterer i fuldstændig fjernelse af alt væv skåret ud på membranen, er meget hurtigere end opfange et stort område af væv ved hjælp af IR-laser alene og tykkere vævssnit kan opsamles. Brug kun IR laser kræver, at LCM cap membran er helt smeltet over hele væv området. Derudover ufuldstændig samling af vævet er typisk og normalt kræver flere forsøg. Selv om dette tager længere tid end at isolere væv fra membranen slide PEN, hvis den tilgængelige væv er allerede på et objektglas eller en UV-laser ikke er tilgængelig, dette er en farbar vej, da de fleste af vævet kan indsamles (figur 8J).

ove_content "> Kritiske trin

100% ethanol inkubationer er en af ​​de vigtigste trin. For at indsamle celler fra Silan-prep slides kræves fuldstændig dehydrering af vævet. Derfor vil enhver vand fjernes ikke, som for det meste er forbundet med 100% ethanol inkubation påvirke evnen til at samle op celler fra dias. For at løse dette problem, ofte ændre 100% ethanol løsninger absorption af vand fra luften eller overførsel fra tidligere vasketrin kan påvirke dehydrering. Derudover er molekylsigter anvendes til at absorbere enhver forurening vand. Det LCM bør ideelt være placeret i et lille rum med en affugter til at opretholde betingelser lav luftfugtighed.

Gode ​​cryostatsnit er afgørende for korrekt LCM. Sektioner nødt til at være flad med folder i vævet minimeret. Folder i vævet vil øge afstanden mellem LCM hætte og forhindre det i kontakt than væv. Det bliver derefter vanskeligt at tilstrækkelig smelte membranen hætten på vævet. For objektglas, typisk snittykkelse skal være mellem 6 og 12 um. Tykkere sektioner kan indfanges med pennen membran dias.

LCM tilbyder en teknisk kapacitet til at gøre meget præcise dissektioner af væv og celler fra objektglas. Dette dramatisk øger opløsningen for yderligere analyse i forhold til grov dissektion af væv stykker. Selv LCM kan være tids- og arbejdskrævende, kræver det ikke omfattende uddannelse eller ekspertise og, når kombineret med andre af avanceret teknologi, kan i høj grad øge forståelsen af ​​en biologisk proces, når der anvendes diskrete celler eller anatomiske regioner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Veritas Laser Capture Microdissection System Life Technologies, Grand Island, NY Newer model is now sold
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies, Grand Island, NY LCM0211
CapSure HS LCM Caps Life Technologies, Grand Island, NY LCM0213
PEN Membrane slides Life Technologies, Grand Island, NY s4651
Silane prep-slides Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S4651
95% Ethanol-RNase Free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7148
100% Ethanol-RNase Free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7023
Rnase Free Triton Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T8787
Molecular Sieve EDM Millipore, Billerica, MA MX1583D
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody EDM Millipore, Billerica, MA Ab152
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Life Technologies, Grand Island, NY A-11008
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA G2939AA
Stratagene MX 3005P Agilent Technologies, Santa Clara, CA 401513
Nanodrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreen Life Technologies, Grand Island, NY R11490
RNaseZap Life Technologies, Grand Island, NY AM9780

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  2. Schutze, K., Lahr, G. Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells. Nature biotechnology. 16, 737-742 (1998).
  3. Schutze, K., Posl, H., Lahr, G. Laser micromanipulation systems as universal tools in cellular and molecular biology and in medicine. Cellular and Molecular Biology. 44, 735-746 (1998).
  4. Vandewoestyne, M., Van Nieuwerburgh, F., Van Hoofstat, D., Deforce, D. Evaluation of three DNA extraction protocols for forensic STR typing after laser capture microdissection. Forensic Science International Genetics. 6, 258-262 (2012).
  5. Eells, J. B., Wilcots, J., Sisk, S., Guo-Ross, S. X. NR4A gene expression is dynamically regulated in the ventral tegmental area dopamine neurons and is related to expression of dopamine neurotransmission genes. Journal of Molecular Neuroscience. 46, 545-553 (2012).
  6. Seelan, R. S., et al. Epigenetic analysis of laser capture microdissected fetal epithelia. Analytical Biochemistry. 442, 68-74 (2013).
  7. Kim, W., et al. miR-126 contributes to Parkinson's disease by dysregulating the insulin-like growth factor/phosphoinositide 3-kinase signaling. Neurobiology of Aging. 35, 1712-1721 (2014).
  8. Bohm, C., et al. Effects of antidepressant treatment on gene expression profile in mouse brain: cell type-specific transcription profiling using laser microdissection and microarray analysis. Journal of Neurochemistry. 97, Suppl 1. 44-49 (2006).
  9. Kadkhodaei, B., et al. Transcription factor Nurr1 maintains fiber integrity and nuclear-encoded mitochondrial gene expression in dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2360-2365 (2013).
  10. Miller, R. A., et al. Quantitative Proteomics in Laser Capture Microdissected Sleep Nuclei From Rat Brain. Journal of Neurogenetics. (2014).
  11. Roberts, E., et al. Application of laser capture microdissection and protein microarray technologies in the molecular analysis of airway injury following pollution particle exposure. Journal of Toxicology and Environmental Health. A. 67, 851-861 (2004).
  12. Yuferov, V., Nielsen, D., Butelman, E., Kreek, M. J. Microarray studies of psychostimulant-induced changes in gene expression. Addiction Biology. 10, 101-118 (2005).
  13. Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15, 2364-2374 (2009).
  14. Curran, S., McKay, J. A., McLeod, H. L., Murray, G. I. Laser capture microscopy. Molecular Pathology. 53, 64-68 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics