Forberedelse, Imaging, og kvantificering af bakteriel Surface Motilitet assays

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Morales-Soto, N., Anyan, M. E., Mattingly, A. E., Madukoma, C. S., Harvey, C. W., Alber, M., Déziel, E., Kearns, D. B., Shrout, J. D. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338, doi:10.3791/52338 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bakteriel overflade motilitet, såsom sværmer, er almindeligt undersøgt i laboratoriet under anvendelse af plade assays, der kræver specifikke koncentrationer af agar og undertiden optagelse af specifikke næringsstoffer i vækstmediet. Fremstillingen af ​​sådanne eksplicitte medier og overflade vækstbetingelser tjener til at tilvejebringe de gunstige vilkår, der tillader ikke bare bakterievækst, men koordineret motilitet af bakterier i forhold til disse overflader i tynde flydende film. Reproducerbarhed af sværm plade og andre overflade motilitet plade analyser kan være en stor udfordring. Især for mere "tempererede swarmers", der udviser motilitet kun inden agar intervaller af 0,4% -0,8% (vægt / vol), mindre ændringer i protokol eller laboratoriemiljø kan have stor indflydelse sværm analyseresultater. "Fugtningsmulighed" eller vandindhold ved væske-faststof-luft-grænsefladen af ​​disse plade-assays er ofte en vigtig variabel, der skal styres. En yderligere udfordring i vurderingen sværmer er, hvordan at kvantificere observed forskelle mellem to (eller flere) forsøg. Her har vi detaljeret en alsidig tofaset protokol til at forberede og billede sværm assays. Vi inkluderer retningslinjer for at omgå de udfordringer der almindeligvis er forbundet med sværm assaymedier forberedelse og kvantificering af data fra disse analyser. Vi specifikt vise vores fremgangsmåde ved anvendelse af bakterier, der udtrykker fluorescerende eller bioluminescerende genetiske reportere som grønt fluorescerende protein (GFP), luciferase (lux-operonen), eller cellulære pletter at muliggøre time-lapse optisk billeddannelse. Vi yderligere demonstrere evnen til vores metode til at spore konkurrerende sværme arter i det samme forsøg.

Introduction

Mange bakterier videre overflader ved hjælp af forskellige former for selv-fremdrift. Nogle motilitet fænotyper kan forsket i laboratoriet ved hjælp af plade-assays, der er berørt af den flydende miljø forbundet med halvfast pladeassay sammensætning. En undergruppe af nyttige overflade motilitet plade analyser inddrager endvidere en gasfase-typisk rumluft. Herefter vil resultatet af en bestemt overflade motilitet assay, kræver omhyggelig styring af grænsefladen af ​​tre faser: den lokale miljømæssige faste overflade, flydende miljø og gas miljø egenskaber.

De mest almindeligt studerede motilitet tilstand i en sådan trefaset assay er kendt som swarming. Mylder motilitet er koordineret gruppe bevægelse af bakterielle celler, der drives af deres flageller gennem tynde flydende film på overflader 1. Det er typisk undersøgt i laboratorier, som anvender semi-fast plade assays indeholdende 0,4% -0,8% (vægt / vol) agar 1. En vifte afhumane patogener udnytte denne motilitet adfærd til at udforske og kolonisere den humane vært. Eksempelvis Proteus mirabilis bruger myldrende motilitet at bevæge sig op i urinrøret, og nåede og kolonisere blære og nyrer 2. Sværmer motilitet anses generelt en forløber skridt til biofilmdannelse, den primære årsag til patogenese i mange humane patogener 3.

Det sværmer fænotype er meget varieret blandt bakteriearter; eksperimentel succes og reproducerbarhed stærkt afhængige faktorer som næringsstof sammensætning, agar type og sammensætning, sterilisering protokol (f.eks autoklavering), halvfast medier hærdning, og omgivende fugt (f.eks sæsonudsving), blandt andre 3-5. Variabiliteten af ​​overfladevand motilitet svar understreger de udfordringer, er stødt på i disse undersøgelser og den betydelige indflydelse medier og miljø kan øve. For nogle sværmen arter, såsom Pseudomonas, swarming motility kan opstå på en række forskellige medier kompositioner, selv om den observerede fænotype og ledsagende sværm ekspansion sats vil variere meget 3. Tilsammen disse faktorer kan gøre overfladen motilitet undersøgelser ekstremt udfordrende. Seasonal variation inden for en lab kan påvirke disse trefasede assays: assays kan fungere bedre i den fugtige luft i sommeren og værre i den tørre luft om vinteren. Her præsenterer vi generelle retningslinjer at omgå nogle af de mest bemærkelsesværdige udfordringer, når du udfører overflade motilitet plade studier.

For nogle overflade motilitet undersøgelser, udvikling af specifikke fænotyper er af stor interesse. De fleste, men ikke alle, publicerede undersøgelser for at undersøge myldrer af P. aeruginosa viser dannelsen af slyngtråde eller fraktaler udstråler fra et podning center 3-9. Forskelle mellem P. aeruginosa-stammer er blevet dokumenteret 5,8, men meget af tilstedeværelsen eller fraværet af tråde kan tilskrives specific medium og protokol, der bruges til disse sværm motilitet plade assays. Her nævnes vi oplysninger om, hvordan man kan fremme tendril-dannende sværme for P. aeruginosa. Fordi P. aeruginosa er blot en af mange sværme bakterier, vi har også oplysninger om vores metode til at undersøge myldrer af Bacillus subtilis og svæveflyvning af Myxococcus xanthus. Ligesom P. aeruginosa, aktuel forskning på B. subtilis og M. xanthus spænder en bred vifte af emner som forskerne arbejder på at skelne aspekter af sporedannelsen, motilitet, stress respons, og overgangs- adfærd 1,10. Der er behov for at kvantificere mønstre og dynamik bestemt adfærd (er) for disse celler i sværme grupper.

Erhvervelse Surface motilitet data, kan analyse og fortolkning være besværlig og kvalitative. Vi har udviklet en protokol for den detaljerede makroskopiske analyse af bakterielle sværme, der giver ud over at sværme zone morfologi og sIZE (f.eks diameter), kvantitativ dynamisk information om sværm ekspansion sats og bakteriel eller bioproduct tæthed fordeling 7. Endvidere kan denne fremgangsmåde udnytte tilgængelige fluorescerende proteiner, luminescens, og farvestoffer for at opnå et samlet overblik over bakterielle interaktioner 8, samt at spore syntesen af Bioproducts (fx P. aeruginosa rhamnolipidbiooverfladeaktivt 7,8) inden for en sværm.

Protocol

1. Swarm assaymedier Forberedelse og Inoculation 4,5,7,8,11

  1. Medier Forberedelse
    BEMÆRK: Mediet sammensætning beskrevet nedenfor er anvendelig til P. aeruginosa hårlok dannelse undersøgelser. Se venligst mediespecifikationer på tabel 1 for P. aeruginosa, B. subtilis, og M. xanthus overflade motilitet assays.
    1. Bland 200 ml FAB-minus (NH4) 2 SO4 sværm medium (Materialer Table), 0,9 g af Noble agar og 0,2 g casaminosyrer (tabel 1) ved omrøring med en magnetisk omrører. Brug små volumener (100-300 ml) for at forbedre sammenhængen mellem forsøgene.
    2. Autoklaver 200 ml agar / media blandingen under anvendelse af en eksponeringstid på 22 min eksponering temperatur på 121,1 ° C, og en hurtig udluftning mulighed. Autoklaven indstillinger muliggør korrekt sterilisering og agar smeltning, men forhindrer agar caramelization.
      BEMÆRK: Noble agar er tilbøjelig til karamelization; bakteriel motilitet ændres på karamelliseret agar.
    3. Umiddelbart efter sterilisation cyklus er afsluttet, lukkes låget af medierne flasken for at forhindre vandtab ved fordampning. Bemærk dog, at stram capping kan forårsage en "vakuum forsegling" -lignende effekt på flasken.
    4. Afkøl mediet til 50 ° C under omrøring ved stuetemperatur (RT), og der tilsættes 2 ml steril 1,2 M glucose. Alternativt placeres medierne i en 60 ° C inkubator eller vandbad, indtil klar til brug (op til 15 timer senere), og fortsættes som beskrevet. For at forhindre dannelsen af ​​bobler i medierne, blandes grundigt ved hjælp af magnetisk omrørerstav; bobler på overfladen af ​​agaren vil forhindre selv swarming.
      BEMÆRK: For andre assays tilsættes på dette trin varmefølsomme komponenter, der ikke kan autoklaveres som yderligere næringsstoffer eller farvestoffer efter behov (f.eks tilsætning af 8 pi Invitrogen syto 63 dye per 100 ml smeltet agar billedet M. xanthus som vist i representative Resultater, nedenfor). Tilsætning af nogle farvestoffer kan påvirke baseline sværmer adfærd, som bør holdes op mod en ikke-dye kontrol.
    5. I et laboratorium hætte, portion 7,5 ml sterilt medier pr 60 mm diameter polystyren petriskål og vedligeholde de plader i et enkelt lag (ikke stablet). For større sværmer overflade, portion 25 ml medier pr 100 mm petriskål. Det er vigtigt at fylde de retter en jævn vandret overflade. Brug en plet niveau for at kontrollere, om overfladen er jævnet med jorden.
      BEMÆRK: For P. aeruginosa analyser, anvendelse af en specifik medie volumen pr plade vil forbedre sammenhængen og reproducerbarhed. For B. subtilis og M. xanthus assays, hånd hælde giver resultater kan sammenlignes med specifikke volumen portioner.
  2. Plate hærdning
    1. For små plader (60 mm), tillade den smeltede agar medium at helbrede (begge indstillet til halvfast og tør overskydende væske) i hætten afsløret (dvs. uden låg) i 30 min. Størreplader (100 mm) kræver længere hærdetid (se diskussion).
      BEMÆRK: Alternativt kan nogle analyser kræver plader til at hærde på bænken øverste natten over (20-24 timer) dækket (dvs. låg) i et enkelt lag (tabel 1). Swarming er følsom over for både overskud og utilstrækkelig fugt. Luftfugtigheden, luftstrøm og temperatur af enhver given lab kan nødvendiggøre variation til plade hærdning at fremme optimal myldrer af jer bakterie.
    2. Podes plader umiddelbart efter tørringen er udløbet. Må ikke opbevares pladerne til videre brug.
      1. Udfør "blæk spread test" ved spotting en testplade med 10 pi blanding af 0,50% (vol / vol) Higgins Vandtæt Black tusch og bakteriel inokulum 11. Hvis blækket / inokulum blanding spreder let (dvs. bevarer ikke dråbeform) på overfladen af medierne, vil medierne brug for ekstra tid til at tørre.
        BEMÆRK: For arter, der er særligt følsomme over for fugt (<em> fx P. aeruginosa), udføre en hurtig "blæk spread test" 11 for at afgøre, om pladerne er tørre nok.
  3. Swarm Assay Podning
    1. Podes 6 ml bouillonkultur medier (se tabel 1 for detaljer) med en isoleret koloni fra en frisk (<5 dage gammel, hvis venstre ved stuetemperatur) lysogeni Broth (LB) pladekultur. Inkuber bouillonkulturer natten over (≤18 HR) ved 30 ° C eller 37 ° C med vandret omrystning (240 rpm).
    2. Podes sværm plader ved spotting med 1-5 pi natten bouillon kultur, eller med "stikke" agar med en steril tand pick eller wire podning nål.
      BEMÆRK: Vi foretrækker sidstnævnte metode, fordi det mindsker risikoen for at sprøjte inoculum og forhindrer tilsætning af yderligere fugt til sværmen overfladeareal.
  4. Swarm Assay Incubation
    1. For generel analyse, inkuberes sværm assayplader ved 30 °C eller 37 ° C (eller endog 42 ° C for B. subtilis; tabel 1) -Det er bakterie specifik. Vend pladerne under inkubation, så overskydende fugt kondenserer på låget, ikke agaren.
      BEMÆRK: Temperatur kan påvirke fænotype samt kinetik. For P. aeruginosa sværme, inkubation ved 37 ° C fører til hurtigere vækst og sværm ekspansion end inkubation ved 30 ° C; imidlertid morfologien af ​​disse sværme ofte afviger med denne ændring i temperatur.
    2. For time-lapse billeddannelse, inkuberes sværm plader ved den passende temperatur før overførsel til billeddannelse station (se tabel 1 for detaljer).
      BEMÆRK: Denne pre-imaging inkubation tillader sværme til at starte deres udvikling og etablere inden transporten til et nyt miljø, som måske eller måske ikke være optimalt for sværmer motilitet.

2. Makroskopisk Imaging af Surface Motilitet Analyser 7,8

<ol>
  • For time-lapse billeddannelse, efter at pre-billeddannende inkubationstid sted sværm assayplader på en klar imaging plade inde i en kommerciel in vivo imaging station. Billede op til seks, diameter 60 mm eller fire, 100 plader mm diameter ved en tid. Da kameraet tager billeder fra under afbildningsplanet, vendes pladerne, så den optiske bane ikke hindres 8. Alternativt inkuberes ved 30 ° C eller 37 ° C (tabel 1) for varigheden af eksperimentet, og fjerne de plader, der skal afbildes fra inkubatoren ved indstillede tidsintervaller.
  • Placer låg af petriskåle oprejst på toppen af ​​pladen modstykke, der holder det podede medier. Fyld lågene af petriskåle med vand for at forhindre overdreven udtørring under billedbehandling, og vedlægge hele sættet op at bruge en anden klar bakke for at bevare fugtigheden under hele forsøget.
  • Brug af Molecular Imaging (MI) software 12, køre assay (r) ved stuetemperatur ved hjælp af imaldrende indstillinger, der er beskrevet i tabel 2. For time-lapse billeddannelse, der er oprettet en protokol med de nødvendige skridt og specifikationer.
  • 3. Databehandling og fortolkning 7,8

    1. Billedbehandling
      1. Brug MI software til batch eksport billeder som 16-bit TIFF-filer: Filer> Eksporter eller Eksporter flere> Vælg fil (er) for at eksportere og eksport lokalitet.
      2. Brug ImageJ at åbne et enkelt billede eller importere et tidsforskudt serien:
        1. Åbn et enkelt billede: Filer> Åbn
        2. Import time-lapse billedsekvens: Filer> Importer Sequence, og vælg "Sorter navne numerisk".
          1. For større time-lapse-filer, skal du vælge "Brug virtuel stak" i "Importer Sequence" vinduet for at stable de eksporterede billeder i passende kategorier (dvs. GFP, RFP, etc.).
      3. Om nødvendigt ændres billederne fra 16-bit-filer til 8-bit-filer: Billede> type> 8-bit
        BEMÆRK: Nogle ImageJ værktøjer kræver 8-bit billeder.
      4. Undersøg, om intensiteten signal til et billede eller tidsforskudt sekvens skal vendes. Placer cursoren på et lyspunkt i billedet (fx fluorescerende mærket vækst) og bemærk signal intensitet "Value" fra ImageJ værktøjslinjen. Derefter placere markøren i en mørk plet uden for denne plade område og bemærk signal intensitet. Hvis signalintensiteten for mørk plet er større end intensiteten for lyspunkt, behov billedet signalintensitet til inverteres (følg undertrin 1-2 nedenfor).
        1. Vend intensitet signaler: Rediger> Inverter
        2. Vend opslagstabellen: Image> opslagstabeller> Inverter LUT
      5. Træk baggrunden: Proces> Træk Baggrund, og bruge en "rullende kugle radius" med en pixel radius, der er den ene halvdel af et billede dimension (f.eks 1.000 pixels for en 2.000 x 2.000 pixel billede).
      6. Kunstigt farve et billede eller tidsforskudt sekvens: Image> opslagstabeller, og vælg den relevante farve fra listen over valgmuligheder.
      7. For film med to eller flere kanaler, flette og afbalancere farverne før besparelse som en film (Image Processing, trin 8). At flette billeder sammen, åbne alle billedstakke i ImageJ, og vælg derefter Billede> Farve> Flet kanaler, og tildele hver stak til en farvekanal.
      8. Spar tid-lapse-sekvens som AVI eller QuickTime-film: Filer> Gem som, og vælg det ønskede format og specifikationer.
    2. Dataanalyse
      1. Erhvervelse Bakteriel Surface Vækst Area at kvantificere Expansion Rate
        1. Åbn billede (r) i ImageJ
        2. For at beregne diameteren af ​​pladen i pixels, tegne en streg hen over midten af ​​en analyseplade med "Straight" værktøj fra og måle dens længde: Analyser> Measure
        3. Standard måleenhed i ImageJ er piXel. Opnå en omregningsfaktor ved at dividere diameteren af assaypladen (fx 60 til 60 mm plade) ved pixel længde opnået i det foregående trin.
        4. Ændre måleenheden fra pixel til mm: Billede> Ejendomme
          1. Ændre "længdeenhed" til "mm" og "Pixel Bredde", "Pixel Højde" og "Voxel Depth" til omregningsfaktoren beregnet i det foregående trin. Vælg "Global" boksen for at opretholde denne omregningsfaktor på tværs af flere billeder.
            BEMÆRK: Hvis ImageJ lukkes og åbnes igen, eller synsfeltet af et billede ændres (dvs. er et billede zoomet i mere end en anden), skal omregningsfaktoren genberegnes. Alternativt kan udføre alle analyser i pixels og derefter konverteret til mm.
        5. For hver ramme, spore og måle sværm området ved hjælp af "Freehand Selections" værktøj i værktøjslinjen for at spore outline af sværmen og måle området ved hjælp af: Analyse> Measure. Dette vil generere en målinger log, der kan gemmes til yderligere analyse i Microsoft Excel eller lignende programmer: Filer> Gem som
      2. Erhvervelse Bakteriel Surface Vækst Intensitet at kvantificere Surface Growth Rate
        1. Når baggrunden trækkes (Image Processing, trin 5), skal du bruge det sidste billede i sekvensen for at bestemme det maksimale areal af sværm (Data Analysis, trin 1).
        2. Brug "Oval" udvælgelse værktøj fra værktøjskassen for at tegne en boks rundt om bakteriel overflade vækst.
        3. Indstil betyde intensitet måling af pixels i kassen ved hjælp af: Analyser> Set Målinger, og vælg "Mean grå værdi".
        4. For at opnå intensitet signalmålinger for hver ramme i time-lapse-sekvens, mens det på det første billede i sekvensen på: Analyser> Measure. Dette vil generere en målinger log, der kan gemmes til yderligere analyse i Mikundemedarbejder Excel eller lignende programmer: Filer> Gem som
      3. Alternativ til det foregående afsnit (Data Analysis, trin 2). Brug ImageJ Makroer plugin til opsætning og køre en Makroer overflade vækst intensitet måling script.
        1. Setup en automatiseret måling script til at analysere flere rammer samtidig: Plugin> Ny> Makro, og indsæt den medfølgende script (nedenfor) ind i feltet og gem som en ImageJ makroer tekstfil: Filer> Gem, og gem til ImageJ programmappen under " makroer ".
          numberOfFrames = N
          for (i = 0; i <numberOfFrames; i ++) {
          køre (»foranstaltning«);
          køre ('Næste Slice [>]');
          }
          BEMÆRK: Her variablen "N" er for en udefineret antal rammer.
        2. Redigere den "numberOfFrames" i makroer plugin for hvert forsøg at afspejle antallet af rammer i billedsekvens, inden du kører scriptet. Anvendelse: Plugin> Makroer>Rediger, og indtast det korrekte antal billeder i sekvensen, og gem (Filer> Gem).
        3. Følg undertrin 1-3 i Dataanalyse-trin 2, og mens du er på det første billede i sekvensen køre makroer plugin: Plugin> Makroer> Kør. Dette vil generere en målinger log, der kan gemmes til yderligere analyse i Microsoft Excel eller lignende programmer: Filer> Gem som

    Representative Results

    Variation i forberedelse plade kan have stor indflydelse sværmer motilitet. Hærdningen eller tørring tid efter at hælde smeltet agarmedium påvirker den tynde væskefilm stede på overfladen motilitet assays og den bakterielle motilitet over tid. Ændringer i næringsstofsammensætning påvirker også swarming flere bakterier. Figur 1A viser en kortvarig virkning tørretid ved spredning af tusch og spredning af en indledende inokulum af Bacillus subtilis 11. Figur 1B viser virkningen af tørretid og Figur 1C viser virkningerne af ammoniumsulfat [(NH4) 2 SO 4] ved efterfølgende hårlok udvikling ved swarming P. aeruginosa 5.

    Målelige oplysninger kan fås fra endpoint billeder af overfladen motilitet ved hjælp af flere billeddiagnostiske strategier. Figur 2 viser repræsentative overflade vækst resultater for B. subtilis sværmning og dens tilhørende bioluminescens billede; og Myxococcus xanthus overflade vækst og den tilhørende rød fluorescens billede af SYTO 64-farvede celler.

    Udvidelse af dataopsamling over blot inspektion og billeddannelse af end-point resultater giver mulighed for studiet af dynamiske opførsel (er) for overfladevand voksende bakterier. Figur 3 7 viser et eksempel på P. aeruginosa sværmer (afbildet for GFP-udtrykkende celler) og dens tilhørende rhamnolipid produktion (filmede med Nile Red lipid plet) -den kvantificering af data fra disse billeder vises også at vise en udvidelse på P. aeruginosa sværmer. Video 1 viser en time-lapse af B. subtilis sværmer filmede med luminescens af en lux udtrykkende stamme. Video 2 8 viser en time-lapse af P. aeruginosa Salmonella enterica serovar Typhimurium (rød-udtrykkende lux) i et konkurrencepræget sværm assay.

    Figur 1
    Figur 1: Eksempler på faktorer i overfladen motilitet assay præparat, der påvirker assay resultat Effekt af (A) agar tørretid på agar overflade fugt og spredning af inokulum til B.. subtilis (Ref 8), (B) agar Tørretiden på P. aeruginosa swarming (gengivet fra Ref 5 med tilladelse) og (C) nærvær eller fravær af ammoniumsulfat på P. aeruginosa sværmer og hårlok formation.

    Figur 2
    Figur 2: Alternative tilgange til vækst imaging overflade og motilitet af bakterier ved hjælp af en Bruker imaging station. Side om side billede af et kamera (til venstre) og Bruker billede (højre) viser (A) s aeruginosa udtrykker GFP-filmede med grøn fluorescens indstillinger (B) B. subtilis udtrykker lux bioluminescens reporter-filmede med luminescens indstillinger, og (C) M. xanthus farvet med SYTO 64-filmede med rød fluorescens II-indstillinger. Se tabel 2 for indstilling detaljer.

    Figur 3
    Figur 3:. Kvalitativ og kvantitativ analyse af en overflade motilitet assay (A) Time-lapse-analyse af distributionen celletæthed, rhamnolipid produktion (Nile Red lipid pletten afbildet ved hjælp af rød fluorescensJeg indstillinger; skala bar = 15 mm), og (B) kvantificering af den ekspansion sats fra distributions- celledensitet billeder af en P. aeruginosa sværm. (Gengivet fra ref 6 med tilladelse.)

    Video 1. Time-lapse billeddannelse af en B. subtilis sværm. B. subtilis udtrykker lux og registreres ved hjælp af luminescens indstillinger. Se tabel 2 for indstilling detaljer.

    Video 2. Interspecies konkurrence visualiseret ved time-lapse billeddannelse. Sværme af P. aeruginosa (grøn, udtrykker GFP og registreres ved hjælp af grøn fluorescens-indstillinger) og S. enterica serovar Typhimurium (rød; Expressynge lux og registreres ved hjælp af luminescens indstillinger). Se tabel 2 for indstilling detaljer. (Reprint med tilladelse fra ref. 7)

    P. aeruginosa P. aeruginosa slyngtråd dannelse undersøgelser B. subtilis M. xanthus
    Overnight bouillon kulturmedier FAB plus 30 mM glucose FAB plus 30 mM glucose LB CTT
    Overnight bouillonkultur inkubationstemperatur 37 ° C 37 ° C 37 ° C 30 timer ved 30 ° C
    Swarm medier FAB FAB minus (NH 4) 2 SO 4 2% (vægt / vol) LB CTT
    Swarm medier: yderligere komponenter 12 mM glucose en 10% (vægt / vol) CAA, 12 mM glucose en n / a SYTO® 64 a
    Agar typen Agar Noble Agar Noble Granuleret agar Agar Noble Affymetrix
    Agar koncentration (vægt / vol) 0,45% 0,45% 0,60% 1,50%
    Swarm pladestørrelse 60 mm 60 mm 100 mm 150 mm
    Medier volumen pr plade 7,5 ml 7,5 ml Hånd Hældes Hånd Hældes
    Swarm media indstilling / tørring metode Hood; plader afsløret Hood; plader afsløret Benchtop; Pladerne dækkes Benchtop; Pladerne dækkes
    Swarm media indstilling / tørretid 30 min 30 min Natten over (20 -24 h) Natten over (20 -24 h)
    Swarm assay inkubationstemperatur 30 eller 37 ° C 30 ° C 37 ° C 30 ° C
    Inkubation i tid bortfalder billeddannelse 30 ° C i mindst 4 timer 30 ° C i mindst 4 timer 37 ° C i 2 timer RT i 12 timer
    Time-lapse capture længde 24 timer 24 timer 10 timer 66 timer
    Time-lapse indstilling 1 ramme / 10 min 1 ramme / 10 min 1 ramme / 6 min 1 ramme / 10 min
    en Lagt efter autoklavering.

    Tabel 1:. Specifikationer for Surface Motilitet Assay Forberedelse Inkluderer overflademotilitet assay forberedelse specifikationer for P. aeruginosa, B. subtilis, og M. xanthus.

    Signal Grøn fluorescens Rød fluorescens I Rød fluorescens II Luminescens
    Protein eller farvestof Green Fluorescence Protein (GFP) mCherry protein eller Nile Red rhamnolipidbiooverfladeaktivt plet SYTO® 64 Luciferase fra lux operon
    Excitationsbølgelængde (nm) 480 ± 10 540 ± 10 590 ± 10 Af
    Emission bølgelængde (nm) 535 ± 17,5 600 ± 17,5 670 ± 17,5 Ingen filter
    Behandlingstid (sek) 30 60 60 240
    f- stopper 4.0 4.0 2.5 1.1
    FOV (mm) 190 190 140 120
    Focal plan (mm) 27,5 27,5 12.2 4
    Binning (pixel) Ingen 2 x 2 Ingen 8 x 8

    Tabel 2: Billedbehandling Specifikation Bruker imaging station specifikationer for rød og grøn fluorescens, og luminescens billeddannelse af bakteriel overflade vækst..

    Discussion

    Kan være en udfordring at opnå reproducerbare sværmer i et laboratorium, som sværm assays er meget følsomme over for miljøfaktorer, såsom fugtighed og tilgængelige næringsstoffer. Det mest kritiske aspekt af en overflade motilitet plade assay er fugt på agaroverfladen. Før inokulering skal swarm medier være tør nok til at forhindre bakterieceller fra svømning over overfladen flydende, men ikke så tør som at inhibere swarming motilitet 5. Inkubering bør finde sted i en tilstrækkelig fugtigt miljø: for lidt fugt kan resultere i assayet udtørring under inkubation, mens for megen fugt kan føre til en kunstig eller kunstig overflade spredes. Medmindre et fugt-kontrollerede inkubator er ved hånden, kan inkubator og laboratorium fugtighed varierer voldsomt. Derfor kan et yderligere vandreservoir, en luftfugter eller en affugter i inkubatoren være nødvendig for at undgå overtørring eller akkumulering af overskydende fugt og samtidig holde vedrøive luftfugtighed nær 80%. Fastholdelse af denne ideelle luftfugtighed kan vise sig udfordrende, hvis sæsonudsving luftfugtighed er betydelige. Hvis dette er tilfældet, vil sværmen assayprotokollen kræver nogle justeringer for at tage højde for sæsonbetingede ændringer i luftfugtighed. Vi har fundet, at modificere sværmen medier tørretid er den enkleste måde at justere for sæsonudsving luftfugtighed. Overvågning konstant fugtighed, både i og uden for kuvøsen, anbefales. Endvidere anbefales det, at forskerne kalibrere og validere deres instrumenter, væksthuse, skalaer mm som mindre fejl i temperatur, volumen eller mængder af mediekomponenter kan påvirke reproducerbarheden af disse analyser.

    Det skal også bemærkes, at den type og størrelse af den plade, der anvendes i assayet, kan påvirke pladen fugt og dermed swarming. Lufttætte plader ikke lufte overskydende fugt og dermed tilskynde svømning motilitet. Derimod åbne faced plader tillader for meget fugt at undslippe. En petriskåltilvejebringer et ideelt miljø, fordi det vents off nok fugt til at forhindre væske opbygge, men bevarer nok fugt til at forhindre mediet i at tørre ud. Denne metode beskriver en overflade motilitet assay-protokol, der giver mulighed for høj billedkvalitet. For at holde agar klar til retter diameter billeddannelse 60 mm er fyldt med 7,5 ml agar medier. Hvis detaljeret imaging ikke er påkrævet, kan mængder op til 20 ml også give reproducerbare resultater.

    Mens myldrer motilitet kan opnås på en bred vifte af agar koncentrationer, det optimale udvalg af agar kræves for sværmer afhænger af arten. Samlet set hæmmer højere koncentrationer agar sværmer motilitet og dermed den nødvendige tid til at producere et billede-klar sværm stiger. P. aeruginosa generelt nøgne sværme agar-koncentrationer mellem 0,4-0,7% 1, men vi finder, at optimal sværmer forekommer i et meget snævrere interval (0,4-0,5%). Andre, såsom B. subtilis og S. enterisken sværm på 0,6% agar, og Vibrio parahaemolyticus 1,5% agar 10. Den nødvendige agarkoncentration bestemmes også af den type og mærke agar. Højere renhed agarer, ligesom Noble agar, kraftigt øge sværmer i P. aeruginosa og foretrækkes frem granuleret agar 13,14. Disse oprensede udgaver af agar er også mere tilbøjelige til at caramelization i autoklaven steriliseringscyklussen; afhængigt af instrumentet, en forkortet / modificeret sterilisation sekvens (for eventuelt at ændre udstødningen cyklus for at forhindre langvarig varme eksponering) kan det være nødvendigt at forberede sværm medier ved hjælp af Noble agar.

    Media sammensætning spiller også en rolle i den observerede sværmen fænotype 3. P. aeruginosa swarming motilitet undersøgelser udføres sædvanligvis ved hjælp af minimal næringsmedier. Vi foretrækker FAB medium 4,8 (Materialer Table), men andre medier, såsom M9, LB eller små variationer til disse fælles medier,er blevet anvendt med succes 9,15,16. Tendril formation opnås bedst på FAB minimal medium suppleret med glucose som carbonkilden og casaminosyrer (CAA), men uden en yderligere nitrogenkilde (dvs. (NH4) 2 SO4) 6,13. Hvis slyngtråd dannelse eller morfologi er ikke det vigtigste fokus i undersøgelsen, så FAB minimalt medium (Materialer tabel, tabel 1) blottet for CAA anbefales således, at virkningerne af specifikke kulstofkilder og / eller yderligere næringsstoffer kan studeres i detaljer. Andre arter, såsom B. subtilis (præsenteres her), er alsidige swarmers, som kan sværme på LB og granuleret agar. Disse arter sværmer let og kræver kun ~ 10 timer til at udvikle en fuld sværm. Denne hurtige sværmer rente gør efter progression af potentielt vanskelige sværm men vores protokol gør sådan sporing meget realistisk. Evnen til at udføre sværm time-lapse billedbehandling giver en stofferoplys- lethed i købet sværm data, især fra sådanne ivrige swarmers.

    Vi introducerer en robust, omfattende, tofaset protokol og retningslinjer til formål at forbedre gennemførelsen og reproducerbarhed af bakteriel overflade motilitet forskning og har primært understreget aspekter vigtigt at undersøge flagellært-medieret sværmer. Denne sværm assayprotokollen detaljer vigtige aspekter af sammensætning og håndtering af overfladevand motilitet plader medier til at sørge for større sammenhæng og reproducerbarhed inden for og blandt forskergrupper. Dette vil forbedre sammenligningsgrundlaget mellem forskellige forskningsundersøgelser. Desuden præsenteres tilgang og protokol tilvejebringer midler til at gøre forskning sværmning og overflade motilitet mindre modtagelige for miljømæssige variationer ved at forskere klar over, at sådanne faktorer påvirker deres arbejde og levere mulige løsninger (f.eks, hvor små ændringer i agar påvirke swarming 4,5 ). Desuden protokollen i henhold tilkvantificere makroskopiske aspekter af sværmer, giver mulighed for at måle mange attributter af bakteriel overflade vækst, som tidligere ikke kan kvantificeres.

    Vi har ikke undersøgt alle overflader bevægelige bakterier i udviklingen af ​​denne protokol. Som sådan forventes det, at protokol ændringer vil være behov for arter, der ikke præsenteret her. Effektiviteten af ​​denne protokol er begrænset af de iboende grænser for udstyr og materialer anvendes. For eksempel temperatur relaterede undersøgelser er ikke mulig, da endnu med Bruker imaging station, da temperaturkontrol er ikke en funktion af udstyret. Desuden kan anvendelsen af farvestoffer (såsom Nile Red til farvning rhamnolipider) har kinetiske og koncentration begrænsninger 8. Denne teknik stærkt afhængig af behandling og analyse af digitale billeder; forbedret automatisering af dataanalyse (f.eks ved brug af yderligere makroer script funktion i ImageJ) vil reducere den nødvendige tid til analyseog udvide anvendeligheden af ​​de data. Endelig, på grund af robustheden af ​​den billeddannende protokollen, skal fremtidige applikationer sigte på at udvide denne teknik til at undersøge mindre ensartet vækst overflader, der er mere relevante for overflader koloniseret af miljømæssige og patogene bakterier.

    Disclosures

    Offentliggørelse gebyrer for denne artikel er delvist sponsoreret af Bruker Corporation.

    Acknowledgments

    Delvis støtte til dette arbejde blev leveret af National Institute of Health (R01GM100470 og 1R01GM095959-01A1, til MA og JDS) og en Core Facility bevilling fra Indiana Kliniske og Translationelle Sciences Institute (finansieret delvist af NIH tilskud # UL1 TR000006; til JDS).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagentsa
    FAB Minimal Media: Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O.
    (NH4)2SO4 Sigma A4418 2 g.
    Not used in P. aeruginosa tendril formation studies.
    Na2HPO4 x 7H2O Sigma-Aldrich S9390 9 g
    KH2PO Sigma P5655 3 g
    NaCl BDH BDH8014 3 g
    MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) Fisher Scientific M33 1 ml
    CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) Fisher Scientific C79 1 ml
    Trace metal solution (see below) n/a n/a 1 ml
    Trace Metal Solution: Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil.
    CaSO4 x 2H2O Sigma-Aldrich 255548 200 mg
    MnSO4 x H2O Sigma-Aldrich M7634 20 mg
    CuSO4 x 5H2O Fisher Scientific C493 20 mg
    ZnSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich Z4750 20 mg
    CoSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich C6768 10 mg
    NaMoO4 x 2H2O Sigma S6646 10 mg
    H3BO3 Fisher Scientific A74 5 mg
    FeSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich F7002 200 mg
    CTT Media: Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O.
    Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) Amresco 0234 1 ml.
    Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore).
    K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) Sigma-Aldrich P3786 0.1 ml.
    Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore).
    MgSO4 solution Fisher Scientific M65 0.8 ml.
    Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore).
    Casitone BD Diagnostics 225930 1 g
    Additional Reagents:
    LB Broth, Lennox BD Diagnostics 240230 2% (wt/vol)
    D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media.
    Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving.
    Casamino acids (CAA) Amresco J851 0.10% (wt/vol).
    Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving.
    Agar, Noble Sigma-Aldrich A5431 0.45% (wt/vol).
    Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving.
    Agar, Noble Affymetrix 10907 1.50% (wt/vol).
    Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving.
    Agar, Granulated Fisher Scientific BP1423 0.60% (wt/vol)
    Higgins Waterproof Black India Ink Higgins HIG44201 0.50% (vol/vol).
    Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture.
    SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain Invitrogen S-11346 Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 μl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving).
    Relevant Materials and Equipment
    Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia. x H) VWR 25384-326
    Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia. x H) VWR 25384-342
    Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia. x H) VWR 25384-092
    In-Vivo Xtream Bruker Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html
    Bruker MI software Bruker http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf
    ImageJ software NIH http://imagej.nih.gov/ij/
    aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews: Microbiology. 8, (9), 634-644 (2010).
    2. Burall, L. S., et al. et al.Proteus mirabilis. genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: Identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infection and Immunity. 72, (5), 2922-2938 (2004).
    3. Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa. biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62, (5), 1264-1277 (2006).
    4. Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PLoS One. 6, (6), e20888 (2011).
    5. Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa. swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48, (6), 509-515 (2008).
    6. Caiazza, N. C., Shanks, R. M., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187, (21), 7351-7361 (2005).
    7. Du, H., et al. High density waves of the bacterium Pseudomonas aeruginosa. in propagating swarms result in efficient colonization of surfaces. Biophysical Journal. 103, (3), 601-609 (2012).
    8. Morris, J. D., et al. Imaging and analysis of Pseudomonas aeruginosa. swarming and rhamnolipid production. Appl Environ Microbiol. 77, (23), 8310-8317 (2011).
    9. Tremblay, J., Richardson, A. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa. swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9, (10), 2622-2630 (2007).
    10. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. J Bacteriol. 195, (5), 909-918 (2013).
    11. Patrick, J. E., Kearns, D. B. Laboratory strains of Bacillus subtilis .do not exhibit swarming motility. Journal of Bacteriology. 191, (22), 7129-7133 (2009).
    12. Molecular Imaging. Bruker Corporation. Available from: http://www.bruker.com/service/support-upgrades/software-downloads/molecular-imaging.html (2014).
    13. Harshey, R. M., Matsuyama, T. Dimorphic transition in Escherichia coli. and Salmonella typhimurium.: surface-induced differentiation into hyperflagellate swarmer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 91, (18), 8631-8635 (1994).
    14. Rashid, M. H., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate is needed for swimming, swarming, and twitching motilities of Pseudomonas aeruginosa. Proc Nat Acad Sci U.S.A.. 97, (9), 4885-4890 (2000).
    15. Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa. PA14. Journal of Bacteriology. 189, (9), 3603-3612 (2007).
    16. Kuchma, S. L., et al. Cyclic-di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa.: the pilY1. gene and its impact on surface-associated behaviors. J Bacteriol. 192, (12), 2950-2964 (2010).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics