Preparazione, Imaging, e la quantificazione di Surface batterica motilità Assays

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Morales-Soto, N., Anyan, M. E., Mattingly, A. E., Madukoma, C. S., Harvey, C. W., Alber, M., Déziel, E., Kearns, D. B., Shrout, J. D. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338, doi:10.3791/52338 (2015).

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Abstract

Motilità superficie batterica, come sciamatura, è comunemente esaminato in laboratorio utilizzando saggi piastra che necessitano di specifiche concentrazioni di agar e talvolta inclusione di specifici nutrienti nel mezzo di crescita. La preparazione di tali mezzi espliciti e condizioni di crescita della superficie serve a fornire le condizioni favorevoli che permettano non solo la crescita batterica, ma la motilità coordinato di batteri su queste superfici all'interno film liquidi sottili. Riproducibilità della piastra sciame e altri test piastra motilità superficie può essere una grande sfida. Soprattutto di più "swarmers temperate", che mostrano la motilità solo all'interno di intervalli di agar di 0,4% -0,8% (peso / volume), piccole modifiche nel protocollo o ambiente di laboratorio può influenzare notevolmente i risultati del test sciame. "Bagnabilità", o contenuto di acqua all'interfaccia liquido-solido-aria di questi saggi piastra, è spesso una variabile chiave da controllare. Una sfida ulteriore per valutare sciamatura è come quantificare odifferenze bserved tra due (o più) esperimenti. Qui abbiamo i dettagli di un protocollo a due fasi versatile per preparare e saggi immagine sciame. Includiamo linee guida per aggirare le sfide comunemente associati con test sciame preparazione di terreni e la quantificazione dei dati da questi test. Abbiamo specificamente Dimostriamo il nostro metodo con batteri che esprimono reporter genetici fluorescenti o bioluminescenti come il verde proteina fluorescente (GFP), luciferasi (lux operon), o macchie cellulari per consentire imaging ottico time-lapse. Dimostriamo ulteriormente la capacità del nostro metodo per tenere traccia competere specie sciamare nella stessa sperimentazione.

Introduction

Molti batteri muovono su superfici con diversi mezzi di auto-propulsione. Alcuni fenotipi motilità possono essere ricercate in laboratorio utilizzando saggi targa che sono influenzati dall'ambiente liquido associato alla semi-solida composizione test piatto. Un sottogruppo di superficie utile test piastra motilità coinvolgere ulteriormente un aereo gas fase tipicamente stanza. Di conseguenza, il risultato di un particolare dosaggio motilità superficie, richiede un attento controllo dell'interfaccia di tre fasi: la superficie solida ambientale locale, ambiente liquido, e proprietà dell'ambiente gas.

La modalità motilità più comunemente studiato in tale dosaggio trifase è noto come brulicante. Swarming motilità è il movimento coordinato gruppo di cellule batteriche che sono spinto dalla loro flagelli attraverso film liquidi sottili su superfici 1. E 'tipicamente studiato nei laboratori utilizzando test piastra semi-solidi contenenti 0,4% -0,8% (peso / volume) agar 1. Una serie dipatogeni umani sfruttano questo comportamento motilità di esplorare e colonizzare l'ospite umano. Ad esempio, Proteus mirabilis utilizza brulicante motilità per spostare l'uretra, raggiungere e colonizzare la vescica e reni 2. Swarming motilità è generalmente considerato un passo precursore formazione di biofilm, la prima causa di patogenesi in molti patogeni umani 3.

Il fenotipo brulicante è molto varia tra le specie batteriche; successo sperimentale e riproducibilità fortemente basano su fattori quali la composizione nutritiva, agar tipo e composizione, protocollo di sterilizzazione (ad esempio, in autoclave), polimerizzazione supporti semi-solido, e umidità ambientale (ad esempio, variazioni stagionali), tra gli altri 3-5. La variabilità delle risposte motilità superficie sottolinea le sfide incontrate in questi studi e dei media influenza notevole e l'ambiente può esercitare. Per alcune specie brulicanti, come Pseudomonas, brulicante motility può verificarsi in una varietà di composizioni di media, anche se il fenotipo osservato e accompagnamento tasso di espansione sciame variano notevolmente 3. Insieme, questi fattori possono fare studi di motilità superficie estremamente impegnativo. La variabilità stagionale all'interno di un laboratorio in grado di influenzare questi test trifase: saggi possono funzionare meglio in umido con aria di estate e peggio in aria secca dell'inverno. Qui vi presentiamo le linee guida generali per aggirare alcune delle sfide più importanti quando si eseguono studi piastra motilità superficie.

Per alcuni studi motilità superficie, lo sviluppo di specifici fenotipi è di grande interesse. La maggior parte, ma non tutti, gli studi pubblicati per esaminare brulichio di P. aeruginosa mostrano la formazione di viticci o frattali irradiano da un centro di inoculazione 3-9. Differenze tra P. ceppi aeruginosa sono stati documentati 5,8, ma gran parte della presenza o assenza di viticci può essere attribuito alla specific medi e protocollo utilizzato per questi test piastra sciame motilità. Qui includiamo i dettagli su come promuovere sciami-viticcio formatura per P. aeruginosa. Poiché P. aeruginosa è solo uno dei tanti batteri brulicanti, includiamo anche i dettagli per il nostro metodo di esaminare brulichio di Bacillus subtilis e volo a vela di Myxococcus Xanto. Come P. aeruginosa, ricerca attuale in B. subtilis e M. Xanto si estende su una vasta gamma di argomenti, come i ricercatori stanno lavorando a discernere gli aspetti della sporulazione, motilità, la risposta allo stress, e il comportamento di transizione 1,10. Vi è la necessità di quantificare gli schemi e le dinamiche del comportamento specifico (s) per queste cellule in gruppi che sciamano.

Acquisizione dati motilità superficiale, analisi e interpretazione può essere ingombrante e qualitativa. Abbiamo sviluppato un protocollo per l'analisi macroscopica dettagliata di sciami batteriche che fornisce oltre a sciamare zona morfologia e size (ad esempio, di diametro), informazioni dinamiche quantitative riguardanti tasso di espansione sciame e batterica o la densità di distribuzione bioproduct 7. Inoltre, questo metodo può usufruire di proteine ​​disponibili fluorescenti, luminescenza e coloranti per ottenere una visione completa delle interazioni batteriche 8, nonché per monitorare la sintesi di bioprodotti (ad esempio, P. aeruginosa rhamnolipid 7,8) all'interno di uno sciame.

Protocol

1. Swarm Assay media Preparazione e inoculazione 4,5,7,8,11

  1. Preparazione supporti
    NOTA: La composizione media di seguito descritto è applicabile a P. aeruginosa studi formazione viticcio. Si prega di consultare le specifiche dei media su Tabella 1 per P. aeruginosa, B. subtilis, e M. xanthus saggi motilità superficie.
    1. Mescolare 200 ml di FAB-minus (NH 4) 2 SO 4 medie sciame (Materials Table), 0,9 g di agar Noble, e 0,2 g di acidi Casamino (Tabella 1), mescolando con un bastoncino magnetico. Usare piccoli volumi (100-300 ml) per migliorare la coerenza tra esperimenti.
    2. Autoclavare il composto 200 ml di agar / media utilizzando un tempo di esposizione di 22 min, temperatura di esposizione di 121,1 ° C, e una opzione di sfiato veloce. Le impostazioni autoclave permetteranno un'adeguata sterilizzazione e fusione agar, ma evitare caramellizzazione agar.
      NOTA: agar Noble è incline a caramellozione; motilità batterica è alterata su agar caramellato.
    3. Subito dopo il ciclo di sterilizzazione è finalizzato, chiudere il tappo della bottiglia mezzi per impedire la perdita di acqua per evaporazione. Si noti tuttavia che capping stretto può causare un "vuoto di tenuta" effetto -come sulla bottiglia.
    4. Raffreddare il supporto a 50 ° C sotto agitazione a temperatura ambiente (RT) e 2 ml di 1,2 M sterile glucosio. In alternativa, inserire il supporto in un incubatore o bagnomaria a 60 ° C fino al momento dell'uso (fino a 15 ore più tardi), e procedere come indicato. Per evitare la formazione di bolle in media, miscelare accuratamente con l'ancoretta magnetica; bolle sulla superficie del agar impedirà ancora brulicante.
      NOTA: Per gli altri test, aggiungere in questa fase i componenti sensibili al calore che non possono essere sterilizzati in autoclave come i nutrienti o coloranti supplementari, se necessario (ad esempio, l'aggiunta di 8 ml Invitrogen Syto 63 tinture per 100 ml fuso agar all'immagine M. xanthus come mostrato in representative risultati, sotto). L'aggiunta di alcuni coloranti può influenzare il comportamento brulicante di base, che va confrontato con un controllo non-dye.
    5. In una cappa di laboratorio, aliquota 7,5 ml di mezzi sterile per 60 millimetri di diametro polistirolo piastra di Petri e mantengono le piastre in un singolo strato (non sovrapposti). Per maggiore superficie brulicante, aliquota 25 ml di media per 100 mm di diametro Petri dish. È importante riempire i piatti su una superficie piana orizzontale. Utilizzare livello degli occhi di un toro per verificare se la superficie è livellato.
      NOTA: Per P. saggi aeruginosa, con un volume di supporto specifici per piastra migliorerà la coerenza e la riproducibilità. Per B. subtilis e M. saggi xanthus, mano versando produce risultati paragonabili a aliquote specifiche di volume.
  2. Indurimento Piastra
    1. Per piccole piastre (60 mm), consentono il mezzo agar fuso per curare (sia impostato semi-solido e secco liquido in eccesso) nel cappuccio scoperta (cioè, senza coperchio) per 30 min. Più GrandiPiastre (100 mm) richiedono tempi più lunghi (vedi Discussione).
      NOTA: In alternativa, alcuni saggi possono richiedere piastre per curare il overnight da banco (20-24 ore) coperta (cioè, coperchi via) in un singolo strato (Tabella 1). Sciamatura è sensibile sia l'umidità in eccesso e insufficiente. L'umidità, flusso d'aria, e la temperatura di un determinato laboratorio possono richiedere variazioni al piatto curare per promuovere sciamare ottimale di voi batterio.
    2. Seminare piatti subito dopo il periodo di asciugatura. Non conservare le piastre per un ulteriore uso.
      1. Eseguire il "test spread ink" individuando una targa di prova con 10 microlitri miscela di 0,50% (vol / vol) Higgins nero impermeabile India inchiostro e l'inoculo batterico 11. Se la miscela inchiostro / inoculo diffonde rapidamente (cioè non conserva la forma gocciolina) sulla superficie del supporto, i media avranno bisogno di tempo supplementare per asciugare.
        NOTA: Per le specie che sono particolarmente sensibili all'umidità (<em> ad esempio, P. aeruginosa), eseguire una rapida "test spread ink" 11 per determinare se i piatti sono abbastanza asciutti.
  3. Swarm Assay inoculazione
    1. Seminare 6 ml di terreni di coltura di brodo (vedi Tabella 1 per i dettagli) con una colonia isolata da un fresco (<5 giorni se lasciato a temperatura ambiente) Terreno di Luria Bertani (LB) coltura in piastra. Incubare culture brodo overnight (≤18 HR) a 30 ° C o 37 ° C con agitazione orizzontale (240 rpm).
    2. Seminare piastre sciame individuando con 1-5 ml di brodo di coltura durante la notte, o da "frugando" l'agar con un dente sterili scegliere o filo inoculazione ago.
      NOTA: Noi preferiamo quest'ultimo metodo perché diminuisce la probabilità di schizzi dell'inoculo e impedisce l'aggiunta di umidità aggiuntiva alla superficie sciame.
  4. Swarm Assay incubazione
    1. Per analisi generale, incubare le piastre saggio sciame a 30 °C o 37 ° C (o anche 42 ° C per B. subtilis, tabella 1): è un batterio specifico. Invertire le piastre durante l'incubazione in modo che l'eccesso di umidità si condensa sul coperchio, non il agar.
      NOTA: La temperatura può influenzare il fenotipo e cinetica. Per P. sciami aeruginosa, incubazione a 37 ° C porta ad espansione di sviluppo e sciami veloce di incubazione a 30 ° C; Tuttavia, la morfologia di questi sciami spesso differisce con questo cambiamento di temperatura.
    2. Per l'imaging time-lapse, incubare le piastre sciame alla giusta temperatura prima del trasferimento nella stazione di imaging (vedi Tabella 1 per i dettagli).
      NOTA: Questo incubazione pre-immagini permette sciami di iniziare il loro sviluppo ed insediamento, prima di essere trasferita in un nuovo ambiente, che può o non può essere ottimale per sciamatura motilità.

2. Imaging macroscopica di Surface motilità Assays 7,8

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  • Per l'imaging time-lapse, dopo le pre-immagini piastre luogo periodo di incubazione di analisi sciame su un piatto di imaging chiaro all'interno di un in vivo Imaging Station commerciale. Immagine fino a sei, diametro 60 mm o quattro, 100 mm di diametro piastre alla volta. Poiché la fotocamera cattura immagini da sotto il piano di imaging, capovolgere le piastre in modo che il percorso ottico non ostruire 8. In alternativa, incubare a 30 ° C o 37 ° C (Tabella 1) per tutta la durata dell'esperimento, e rimuovere le piastre per essere ripreso dal termostato ad intervalli di tempo prestabiliti.
  • Posizionare i coperchi delle piastre Petri verticalmente sopra controparte piastra che contiene il supporto inoculata. Riempire i coperchi delle capsule di Petri con acqua per evitare l'essiccamento eccessivo durante l'imaging, e racchiudere l'intero set up con un altro vassoio chiaro a mantenere l'umidità tutto l'esperimento.
  • Utilizzando Imaging Molecolare (MI) 12 software, test eseguire (s) a temperatura ambiente utilizzando l'iminvecchiamento impostazioni descritte nella tabella 2. Per l'imaging time-lapse, impostare un protocollo con i passi e le specifiche necessarie.
  • 3. Elaborazione dati e interpretazione 7,8

    1. Image Processing
      1. Utilizzare il software MI per lotti esportare le immagini come file TIFF a 16 bit: File> Esporta o esportare più> Select file (s) per esportare e posizione di esportazione.
      2. Utilizzare ImageJ per aprire una singola immagine o importare una serie di time-lapse:
        1. Aprire una sola immagine: File> Apri
        2. Import time-lapse sequenza di immagini: File> Importa sequenza, e selezionare "nomi Ordina numericamente".
          1. Per i file time-lapse grandi, selezionare "Utilizza stack virtuale" nella finestra "Importa Sequence" per impilare le immagini esportate in categorie appropriate (ad esempio, GFP, RFP, etc.).
      3. Se necessario, modificare le immagini da file a 16 bit in file a 8 bit: Immagine> Tipo> 8-bit
        NOTA: Alcuni strumenti di ImageJ richiedono immagini a 8-bit.
      4. Determinare se il segnale di intensità per una sequenza di immagini o time-lapse deve essere invertita. Posizionare il cursore su un punto luminoso nell'immagine (ad esempio, la crescita fluorescente) e notare l'intensità del segnale "Value" dalla barra degli strumenti ImageJ. Quindi, posizionare il cursore in una macchia scura di fuori dell'area piastra e notare l'intensità del segnale. Se l'intensità del segnale per il punto nero è maggiore l'intensità del punto luminoso, l'intensità del segnale di immagine deve essere invertita (seguire sottofasi 1-2 sotto).
        1. Invertire i segnali di intensità: Modifica> Inverti
        2. Invertire la tabella di ricerca: Immagine> Tabelle di ricerca> Inverti LUT
      5. Sottrarre il fondo: Processo> Sottrai sfondo, e utilizzare un "raggio di rotolamento della sfera" con un raggio di pixel che è la metà di una dimensione dell'immagine (ad esempio, 1.000 pixel per una 2.000 x 2.000 pimmagine Ixel).
      6. Artificialmente colorare un'immagine o time-lapse sequenza: Immagine> Tabelle di ricerca e selezionare il colore appropriato dalle opzioni della lista.
      7. Per i film con due o più canali, unire e bilanciare i colori prima di salvare come un film (Image Processing, Punto 8). Per unire le immagini insieme, aperto tutte le pile di immagini di ImageJ, quindi selezionare Immagine> Colore> Unisci canali e assegnare ogni pila di un canale di colore.
      8. Risparmia sequenza time-lapse, come AVI o QuickTime Movie: File> Salva con nome e scegliere il formato e le specifiche desiderate.
    2. Analisi Dei Dati
      1. Acquisire batterica Area Crescita Surface per quantificare espansione Tasso
        1. Apri l'immagine (s) in ImageJ
        2. Per calcolare il diametro della piastra in pixel, tracciare una linea attraverso il centro di una piastra di dosaggio con lo strumento "diritta" dal e misurare la lunghezza: Analizzare> Misura
        3. L'unità di misura predefinita in ImageJ è pixel. Ottenere un fattore di conversione dividendo il diametro della piastra di dosaggio (per esempio, 60 per una piastra 60 mm) per la lunghezza pixel ottenuto nel passaggio precedente.
        4. Modificare l'unità di misura da pixel a mm: Immagine> Proprietà
          1. Modificare la "Unità di lunghezza" a "mm", e il "Pixel Width", "altezza Pixel", e "Voxel Depth" per il fattore di conversione calcolata nel passaggio precedente. Selezionare la casella "Global" per mantenere questo fattore di conversione su più immagini.
            NOTA: Se ImageJ è chiuso e riaperto, o il campo di vista di un'immagine viene modificato (cioè, un'immagine viene ingrandita più di un altro), il fattore di conversione deve essere ricalcolata. In alternativa, eseguire tutte le analisi in pixel e poi convertito in mm.
        5. Per ogni frame, tracciare e misurare l'area sciame utilizzando funzione "a mano libera selezioni" nella barra degli strumenti per tracciare il ouTLIN dello sciame e misurare l'area utilizzando: Analizza> Misura. Questo genererà un log misure che possono essere salvate per ulteriori analisi in Microsoft Excel o altri programmi simili: File> Salva con nome
      2. Acquisire batterica Intensità Crescita Surface per quantificare Surface Tasso di crescita
        1. Una volta che il fondo viene sottratta (Image Processing, punto 5), utilizzare l'ultimo fotogramma della sequenza per determinare la superficie massima di sciame (Analisi dei dati, Step 1).
        2. Utilizzare lo strumento di selezione "Oval" dalla barra degli strumenti per disegnare un riquadro attorno alla crescita della superficie batterica.
        3. Impostare la misurazione dell'intensità di pixel nella casella utilizzando significa: Analizza> Set misurazioni, e selezionare "Valore medio grigia".
        4. Per ottenere misure di segnali di intensità per ogni fotogramma della sequenza time-lapse, mentre sul primo fotogramma della sequenza andare a: Analizza> Misura. Questo genererà un log misure che possono essere salvate per ulteriori analisi in Microsoft Excel o programmi simili: File> Salva con nome
      3. Alternativa alla sezione precedente (Analisi dei dati, punto 2). Utilizzare il plugin ImageJ macro per impostare e gestire una crescita superficiale sceneggiatura misura intensità Macro.
        1. Setup uno script di misurazione automatica per analizzare più fotogrammi contemporaneamente: Plugin> Nuovo> Macro, e incollare lo script fornito (sotto) nella casella e salvare come file di testo ImageJ Macro: File> Salva, e salvare la cartella dell'applicazione ImageJ sotto " macro ".
          numberOfFrames = N
          for (i = 0; i <numberOfFrames; i ++) {
          eseguire ('misura');
          eseguire ('Next Slice [>]');
          }
          NOTA: Qui la variabile "N" è un numero indefinito di fotogrammi.
        2. Modificare le "numberOfFrames" nel plug macro per ogni esperimento per riflettere il numero di fotogrammi in sequenza di immagini prima di eseguire lo script. Uso: Plugin> Macro>Modifica e digitare il numero corretto di fotogrammi in sequenza e salvare (File> Salva).
        3. Seguire substeps 1-3 in Data Analysis-Step 2, e mentre sul primo fotogramma della sequenza di esecuzione il plugin macro: Plugin> Macro> Esegui. Questo genererà un log misure che possono essere salvate per ulteriori analisi in Microsoft Excel o altri programmi simili: File> Salva con nome

    Representative Results

    Variazione piastra preparazione può influenzare notevolmente brulicante motilità. L'indurimento o essiccazione dopo versamento di agar fuso colpisce la sottile pellicola di liquido presente sulla superficie saggi di motilità e la motilità batterica nel tempo. Cambiamenti nella composizione nutrizionale influenzano anche sciamio per diversi batteri. La figura 1A mostra un effetto a breve termine del tempo di asciugatura su diffusione India inchiostro e diffusione di un inoculo iniziale di Bacillus subtilis 11. Figura 1B mostra l'effetto del tempo di essiccazione e spettacoli Figura 1C gli effetti di solfato di ammonio [(NH 4) 2 SO 4] upon successivo sviluppo tendril di sciamio P. aeruginosa 5.

    Dati quantificabili possono essere ottenuti da immagini endpoint della motilità superficie utilizzando strategie di imaging più. La figura 2 mostra risultati rappresentativi della crescita della superficie per B. la sua immagine bioluminescenza associata subtilis swarming e; e la crescita della superficie Myxococcus Xanto e l'immagine di fluorescenza rossa associata di SYTO cellule 64-macchiato.

    Espansione di acquisizione dati oltre la semplice ispezione e imaging risultati end-point consente lo studio del comportamento dinamico (s) per i batteri crescono superficiali. Figura 3 7 mostra un esempio di P. aeruginosa brulicante (ripreso per le cellule GFP esprimere), e la sua produzione rhamnolipid associato (ripreso con Nile Red macchia lipidi) viene visualizzato anche -la quantificazione dei dati di queste immagini per mostrare il tasso di espansione di P. aeruginosa brulicante. Video 1 mostra un time-lapse di B. subtilis sciamatura ripreso con luminescenza di un ceppo esprimente lux. Video 2 8 mostra un time-lapse di P. aeruginosa Salmonella enterica sierotipo (rosso-esprimono lux) in un test di sciame competitivo.

    Figura 1
    Figura 1: Esempi di fattori in preparazione della superficie saggio motilità che influenzano il risultato del test Effetto di (A) Tempo di essiccazione su agar agar umidità superficiale e diffusione di inoculo per B.. subtilis (Ref 8), (B) tempo di essiccazione su agar P. aeruginosa brulicante (ristampato da Ref 5 con permesso), e (C) la presenza o l'assenza di solfato di ammonio in P. aeruginosa swarming e la formazione viticcio.

    Figura 2
    Figura 2: Alternative approcci per la crescita di superficie l'imaging e la motilità dei batteri utilizzando una stazione di imaging Bruker. Side immagine lato di una telecamera (a sinistra) e da immagine Bruker (a destra) mostra (A) P. aeruginosa esprimono GFP-ripreso utilizzando le impostazioni Verde di fluorescenza, (B) B. subtilis esprimono lux bioluminescenza giornalista-ripreso utilizzando le impostazioni di luminescenza, e (C) M. xanthus colorati con SYTO 64 ripreso con impostazioni Red fluorescenza II. Vedere la Tabella 2 per l'impostazione dettagli.

    Figura 3
    Figura 3:. Analisi qualitativa e quantitativa di un saggio motilità superficiale (A) analisi time-lapse di distribuzione di densità delle cellule, la produzione rhamnolipid (lipidi macchia Nile Red ripreso utilizzando la fluorescenza rossaI impostazioni; barra della scala = 15 mm), e (B) quantificazione del tasso di espansione da immagini distribuzione densità cellulare di una P. aeruginosa sciame. (Ristampato dal rif 6 con permesso.)

    Video 1. Time-lapse imaging di B. subtilis sciame. B. subtilis esprimendo lux e registrati utilizzando le impostazioni di luminescenza. Vedere la Tabella 2 per l'impostazione dettagli.

    Video 2. concorrenza Interspecie visualizzato dal time-lapse imaging. Sciami di P. aeruginosa (verde, esprimono GFP e registrati utilizzando le impostazioni verde fluorescenza) e S. enterica sierotipo Typhimurium (rosso; exprescantare lux e registrati utilizzando le impostazioni di luminescenza). Vedere la Tabella 2 per l'impostazione dettagli. (Ristampa con il permesso di Rif. ​​7)

    P. aeruginosa P. aeruginosa studi di formazione viticcio B. subtilis M. Xanto
    Brodo di coltura Pernottamento FAB più 30 Glucosio mM FAB più 30 Glucosio mM LIBBRE CTT
    Brodo di cultura Pernottamento temperatura di incubazione 37 ° C 37 ° C 37 ° C 30 ore a 30 ° C
    Supporti Swarm FAB FAB meno (NH 4) 2 SO 4 2% (peso / volume) LB CTT
    Supporti Swarm: componenti aggiuntivi 12 mM glucosio a 10% (peso / volume) CAA, 12 mm glucosio a n / a SYTO® 64 a
    Tipo Agar Agar, Nobile Agar, Noble Granulato agar Agar, Noble Affymetrix
    Concentrazione Agar (peso / volume) 0,45% 0,45% 0,60% All'1,50%
    Dimensioni piastra Swarm 60 millimetri 60 millimetri 100 millimetri 150 millimetri
    Volume supporto per piastra 7,5 ml 7,5 ml Versato a mano Versato a mano
    Impostazione del supporto Swarm / metodo di essiccazione Hood; piastre scoperto Hood; piastre scoperto Da banco; piastre coperte Da banco; piatti coperti
    Impostazione mezzi Swarm / tempo di asciugatura 30 min 30 min Overnight (20 -24 ore) Overnight (20 -24 ore)
    Swarm temperatura test di incubazione 30 o 37 ° C 30 ° C 37 ° C 30 ° C
    Incubazione per l'imaging lasso di tempo 30 ° C per almeno 4 ore 30 ° C per almeno 4 ore 37 ° C per 2 ore RT per 12 ore
    Time-lapse di lunghezza di cattura 24 ore 24 ore 10 hr 66 hr
    Impostazione Time-lapse 1 frame / 10 min 1 frame / 10 min 1 frame / 6 min 1 frame / 10 min
    una aggiunti dopo la sterilizzazione in autoclave.

    Tabella 1:. Specifiche per superfici motilità Assay Preparazione Include superficiesaggio motilità specifiche di preparazione per P. aeruginosa, B. subtilis, e M. Xanto.

    Segnale Verde Fluorescence Red fluorescenza I Red fluorescenza II Luminescence
    Proteine ​​o dye Verde Fluorescence Protein (GFP) proteine ​​mCherry o macchia Nile Red rhamnolipid SYTO® 64 Luciferase da lux operon
    Eccitazione (nm) 480 ± 10 540 ± 10 590 ± 10 Spento
    Onda di emissione (NM) 535 ± 17,5 600 ± 17,5 670 ± 17,5 Nessun filtro
    Tempo di esposizione (sec) 30 60 60 240
    fermata f- 4.0 4.0 2.5 1.1
    FOV (mm) 190 190 140 120
    Piano focale (mm) 27.5 27.5 12.2 4
    Categorizzazione (pixel) Nessuno 2 x 2 Nessuno 8 x 8

    Tabella 2: Imaging Specifiche tecniche stazione di imaging Bruker per fluorescenza rossa e verde, e la luminescenza di imaging di crescita della superficie batterica..

    Discussion

    Raggiungere sciamatura riproducibile in laboratorio può essere impegnativo, come saggi sciami sono molto sensibili a fattori ambientali, come l'umidità e le sostanze nutrienti disponibili. L'aspetto più critico di una superficie dosaggio piastra motilità è umidità sulla superficie di agar. Prima di inoculazione, i media sciame deve essere sufficientemente asciutto per evitare le cellule batteriche dal nuoto attraverso il liquido di superficie, ma non così secco da inibire brulicante motilità 5. L'incubazione deve avvenire in un ambiente sufficientemente umido: troppo poca umidità può causare il test essiccazione durante l'incubazione, mentre troppa umidità può portare a superficie artificiale o artefatta diffusione. A meno che un incubatore umidità controllata è a portata di mano, incubatore e laboratorio di umidità può variare notevolmente. Di conseguenza, un serbatoio supplementare di acqua, un umidificatore o un deumidificatore nella incubatore potrebbero essere necessarie per prevenire l'essiccazione o sopra l'accumulo di umidità in eccesso mantenendo la relative umidità vicino all'80%. Il mantenimento di tale umidità ideale può risultare difficile se i cambiamenti di umidità stagionali sono significative. Se questo è il caso, il protocollo test sciame richiederà alcuni adeguamenti per tener conto delle variazioni stagionali di umidità. Abbiamo scoperto che modificando il tempo di supporto sciame di essiccazione è il modo più semplice per regolare per variazioni di umidità stagionali. Monitoraggio di umidità costante, sia all'interno che all'esterno dell'incubatrice, è raccomandato. Inoltre, si raccomanda che i ricercatori calibrare e validare i loro strumenti, incubatori, bilance, ecc errori come minori di temperatura, volume o quantità di componenti multimediali possono influire riproducibilità di questi test.

    Va inoltre osservato che il tipo e le dimensioni della piastra usato nel saggio possono influenzare piastra umidità, e pertanto brulicante. Piastre ermetica Non sfogare fuori l'umidità in eccesso, incoraggiando così il nuoto motilità. Al contrario, le piastre a doppia facciata permettono troppa umidità a fuggire. Un piatto di Petrifornisce un ambiente ideale perché sfoga fuori abbastanza umidità in eccesso per evitare l'accumulo di liquidi, ma mantiene abbastanza umidità per evitare che il supporto si secchi. Questo metodo dettagli di un protocollo test motilità superficie che permette l'imaging di alta qualità. Per mantenere l'agar chiara per l'imaging 60 millimetri Ø piatti sono pieni di 7,5 ml di agar. Se non è richiesto l'imaging dettagliato, i volumi fino a 20 ml possono anche fornire risultati riproducibili.

    Mentre brulicante motilità può essere realizzato su una vasta gamma di concentrazioni di agar, la gamma ottimale di agar necessaria per sciamare dipende dalla specie. Nel complesso, le concentrazioni più elevate di agar inibiscono brulicante motilità, e di conseguenza il tempo necessario per produrre un'immagine-ready sciame aumenta. P. aeruginosa generalmente sciami sulle concentrazioni agar tra 0,4-0,7% 1, ma troviamo che sciamare ottimale si verifica in un range molto ristretto (0,4-0,5%). Altri, come B. subtilis e S. entericouno sciame al 0,6% agar, e Vibrio parahaemolyticus al 1,5% agar 10. La concentrazione di agar necessaria viene determinata anche dal tipo e marca di agar. Superiori agar purezza, come agar Noble, aumentano fortemente brulicante in P. aeruginosa e sono preferite rispetto granulato agar 13,14. Tuttavia, queste versioni purificati di agar sono anche più inclini a caramellizzazione durante il ciclo di sterilizzazione in autoclave; a seconda dello strumento, un / sequenza di sterilizzazione modificato ridotto (per modificare, eventualmente, il ciclo di scarico per evitare l'esposizione al calore prolungato) può essere richiesto per preparare supporti sciame con agar Noble.

    Composizione media svolge anche un ruolo nel sciame fenotipo osservata 3. P. aeruginosa studi brulicante motilità sono di solito eseguite con terreni di coltura minimo. Preferiamo FAB medio 4,8 (Materials Table), ma anche altri media, come M9, LB, o leggere variazioni a questi mezzi comuni,sono stati utilizzati con successo 9,15,16. Formazione Tendril migliore avviene nelle FAB terreno minimo addizionato con glucosio come fonte di carbonio e acidi Casamino (CAA), ma senza una fonte di azoto addizionale (cioè, (NH 4) 2 SO 4) 6,13. Se la formazione viticcio o la morfologia non è l'obiettivo principale dello studio, quindi FAB terreno minimo (Materiali tabella; Tabella 1) priva di CAA si raccomanda in modo che gli effetti di fonti di carbonio specifici e / o sostanze nutrienti supplementari possono essere studiati in dettaglio. Altre specie, come B. subtilis (presentato qui), sono swarmers versatili, capaci di sciamare su LB e agar granulato. Queste specie sciame facilmente, richiede solo ~ 10 ore per sviluppare uno sciame completo. Questo rapido tasso brulicante fa seguito alla progressione dello sciame potenzialmente difficile, ma il nostro protocollo rende tale monitoraggio molto fattibile. La possibilità di eseguire sciame time-lapse imaging fornisce un sostanziale facilità di acquisizione dati sciame, in particolare da tali sciami accaniti.

    Introduciamo un robusto, completo, protocollo a due fasi e le linee guida volte a migliorare l'esecuzione e la riproducibilità di batteri ricerche motilità superficie ed abbiamo soprattutto sottolineato gli aspetti importanti per esaminare sciamatura flagellare-mediata. Dettagli Questo protocollo test sciame aspetti importanti della composizione e la movimentazione delle lastre motilità superficie media per garantire una maggiore coerenza e riproducibilità all'interno e tra gruppi di ricerca. Ciò permetterà di migliorare la base di confronto tra i diversi studi di ricerca. Inoltre, l'approccio presentato e protocollo prevede mezzi per fare ricerca sulla brulicante e di superficie motilità meno sensibili alle variazioni ambientali, rendendo ricercatori consapevoli che tali fattori influenzano il loro lavoro e fornire possibili soluzioni (ad esempio, come piccoli cambiamenti nella agar influiscono brulicante 4,5 ). Inoltre, il protocollo fornitoquantificare aspetti macroscopici di sciamare, offre la possibilità di misurare molti attributi di crescita superficie batterica che erano in precedenza quantificabile.

    Non abbiamo esaminato tutti i batteri mobili di superficie per lo sviluppo di questo protocollo. Come tale, si prevede che modifiche protocollo saranno necessari per specie non qui presentati. L'efficienza di questo protocollo è limitata dai limiti intrinseci delle apparecchiature e dei materiali impiegati. Per esempio, gli studi relativi alla temperatura non sono possibili ancora con la stazione di imaging Bruker, poiché il controllo della temperatura non è una caratteristica dell'apparecchiatura. Inoltre, l'uso di coloranti (ad esempio Nilo Red macchiare rhamnolipids) può avere limitazioni cinetiche e concentrazione 8. Questa tecnica si basa fortemente sul trattamento e analisi di immagini digitali; migliore automazione dell'analisi di dati (ad esempio, usando macro supplementari funzione di script in ImageJ) sarebbe ridurre il tempo necessario per l'analisied espandere l'utilità dei dati. Infine, a causa della robustezza del protocollo di imaging, le applicazioni future devono mirare ad espandere questa tecnica per esaminare le superfici di crescita meno uniformi che sono più rilevanti per le superfici colonizzate dai batteri ambientali e patogeni.

    Disclosures

    Spese di pubblicazione di questo articolo sono stati parzialmente sponsorizzati da Bruker Corporation.

    Acknowledgments

    Supporto parziale per questo lavoro è stato fornito dal National Institute of Health (R01GM100470 e 1R01GM095959-01A1, per MA e JDS) e un sussidio Core strumento dalla Indiana clinica e traslazionale Sciences Institute (finanziato in parte dal NIH concedere # UL1 TR000006; a JDS).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagentsa
    FAB Minimal Media: Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O.
    (NH4)2SO4 Sigma A4418 2 g.
    Not used in P. aeruginosa tendril formation studies.
    Na2HPO4 x 7H2O Sigma-Aldrich S9390 9 g
    KH2PO Sigma P5655 3 g
    NaCl BDH BDH8014 3 g
    MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) Fisher Scientific M33 1 ml
    CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) Fisher Scientific C79 1 ml
    Trace metal solution (see below) n/a n/a 1 ml
    Trace Metal Solution: Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil.
    CaSO4 x 2H2O Sigma-Aldrich 255548 200 mg
    MnSO4 x H2O Sigma-Aldrich M7634 20 mg
    CuSO4 x 5H2O Fisher Scientific C493 20 mg
    ZnSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich Z4750 20 mg
    CoSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich C6768 10 mg
    NaMoO4 x 2H2O Sigma S6646 10 mg
    H3BO3 Fisher Scientific A74 5 mg
    FeSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich F7002 200 mg
    CTT Media: Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O.
    Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) Amresco 0234 1 ml.
    Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore).
    K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) Sigma-Aldrich P3786 0.1 ml.
    Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore).
    MgSO4 solution Fisher Scientific M65 0.8 ml.
    Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore).
    Casitone BD Diagnostics 225930 1 g
    Additional Reagents:
    LB Broth, Lennox BD Diagnostics 240230 2% (wt/vol)
    D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media.
    Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving.
    Casamino acids (CAA) Amresco J851 0.10% (wt/vol).
    Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving.
    Agar, Noble Sigma-Aldrich A5431 0.45% (wt/vol).
    Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving.
    Agar, Noble Affymetrix 10907 1.50% (wt/vol).
    Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving.
    Agar, Granulated Fisher Scientific BP1423 0.60% (wt/vol)
    Higgins Waterproof Black India Ink Higgins HIG44201 0.50% (vol/vol).
    Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture.
    SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain Invitrogen S-11346 Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 μl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving).
    Relevant Materials and Equipment
    Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia. x H) VWR 25384-326
    Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia. x H) VWR 25384-342
    Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia. x H) VWR 25384-092
    In-Vivo Xtream Bruker Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html
    Bruker MI software Bruker http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf
    ImageJ software NIH http://imagej.nih.gov/ij/
    aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information.

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    References

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