में रासायनिक आनुवंशिक बातचीत की तेजी से पहचान

Biology

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Dilworth, D., Nelson, C. J. Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (98), e52345, doi:10.3791/52345 (2015).

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Abstract

बायोएक्टिव रसायनों की कार्रवाई की विधा का निर्धारण शैक्षिक, दवा की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए ब्याज, और औद्योगिक वैज्ञानिकों की है। Saccharomyces cerevisiae, या नवोदित खमीर, एक मॉडल यूकेरियोट है जिसके लिए ~ 6000 जीन विलोपन म्यूटेंट और hypomorphic आवश्यक जीन की एक पूरी संग्रह म्यूटेंट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। म्यूटेंट के इन संग्रहों में व्यवस्थित ढंग से एक रासायनिक सहन करने के लिए आवश्यक रासायनिक जीन बातचीत, यानी जीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह जानकारी, बारी में, यौगिक की कार्रवाई की संभावना मोड पर रिपोर्ट। यहाँ हम नवोदित खमीर में रासायनिक आनुवंशिक बातचीत की तेजी से पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। हम कार्रवाई की एक अच्छी तरह से परिभाषित तंत्र है जो chemotherapeutic एजेंट 5 fluorouracil (5-फू), का उपयोग करते हुए विधि प्रदर्शित करता है। हमारे परिणाम परमाणु आवारा exosome और डीएनए की मरम्मत एंजाइमों पिछले मीटर के साथ संगत है, जो 5-फू की उपस्थिति में प्रसार के लिए आवश्यक हैं शाही सेना बताते हैं किआधारित बार कोडिंग रासायनिक आनुवंशिक दृष्टिकोण और 5-फू पर प्रतिकूल दोनों आरएनए और डीएनए चयापचय को प्रभावित करता है कि ज्ञान icroarray। इन उच्च throughput स्क्रीन के लिए जरूरी सत्यापन प्रोटोकॉल भी वर्णित हैं।

Introduction

आनुवंशिक उपकरण और मॉडल जीव Saccharomyces cerevisiae में उपलब्ध संसाधनों का सामूहिक रूप से जीन नेटवर्क जैविक प्रणालियों की आवश्यकताओं को पूरा करने के रूप में कार्य कैसे में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करना है कि बड़े पैमाने पर कार्यात्मक जीनोमिक्स के अध्ययन के लिए सक्षम है। इन उपकरणों की आधारशिला खमीर 1,2 में सभी खुले पढ़ने के तख्ते की गैर जरूरी जीन विलोपन का एक पूरा सेट के सहयोगी सृजन किया गया था। एक हड़ताली अवलोकन मानक प्रयोगशाला परिस्थितियों में haploids के रूप में विकसित जब खमीर जीन की केवल ~ 20% व्यवहार्यता के लिए आवश्यक हैं कि था। इस वैकल्पिक जैविक रास्ते के उपयोग के माध्यम से जीनोमिक perturbations के खिलाफ बफर करने के लिए एक सेल की क्षमता पर प्रकाश डाला गया। जेनेटिक व्यक्तिगत रूप से व्यवहार्य हैं कि म्यूटेंट, लेकिन संयोजन में घातक, जुड़ा हुआ है या अभिसरण समानांतर जैविक रास्ते संकेत और जैविक समारोह का वर्णन है कि आनुवंशिक बातचीत के नेटवर्क के रूप में। सशर्त ते के विकास के साथआवश्यक जीन की mperature के प्रति संवेदनशील और hypomorphic एलील प्रौद्योगिकी गैर जरूरी जीन 3,4 का अध्ययन करने के लिए सीमित नहीं किया गया है। इस अवधारणा को भी इसी सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल जीनों 5 साथ क्लस्टर illustrating कैसे एक निष्पक्ष आनुवंशिक बातचीत नक्शा उत्पादन एक जीनोमिक पैमाने पर लागू किया गया है।

आनुवंशिक नेटवर्क के रासायनिक perturbations नकल जीन विलोपन (चित्रा 1) 6। अतिसंवेदनशीलता के लिए विलोपन उपभेदों के एक उच्च घनत्व सरणी के खिलाफ विकास निरोधात्मक यौगिकों क्वैरी रासायनिक तनाव को सहन करने के लिए आवश्यक है कि जीन की एक सूची है, यानी एक रासायनिक आनुवंशिक बातचीत प्रोफाइल को पहचानती है। आनुवंशिक बातचीत की तरह, रासायनिक पुस्तकालयों की बड़े पैमाने पर स्क्रीन कार्रवाई क्लस्टर एक साथ सात की एक ऐसी ही विधा के साथ यौगिकों दिखाया है। इसलिए, एक यौगिक के रासायनिक आनुवंशिक बातचीत प्रोफाइल की स्थापना के द्वारा कार्रवाई की विधा LAR के साथ तुलना करके निष्कर्ष निकाला जा सकता हैजीई पैमाने पर सिंथेटिक आनुवंशिक और रासायनिक आनुवंशिक बातचीत 8,9 डेटासेट।

यौगिकों के स्कोर से पूछताछ कर रहे हैं, जहां बड़े पैमाने पर रासायनिक-आनुवंशिक स्क्रीन, बारकोड प्रतियोगिता assays के द्वारा प्रदर्शन किया गया है। इस दृष्टिकोण में, विलोपन उपभेदों के जमा संग्रह एक रसायन युक्त मीडिया की एक छोटी मात्रा में कई पीढ़ियों के लिए सामूहिक रूप से उगाया जाता है। प्रत्येक विलोपन उत्परिवर्ती एक अद्वितीय आनुवंशिक बारकोड बंदरगाहों के बाद से, विलोपन उपभेदों के पूल के भीतर व्यक्तिगत म्यूटेंट की व्यवहार्यता / विकास माइक्रोएरे या उच्च throughput अनुक्रमण 10 ने पता लगाया है।

एक bioactive यौगिक युक्त ठोस अगर पर हो शारीरिक रूप से तैनात म्यूटेंट की कॉलोनी आकार की निगरानी के द्वारा फिटनेस inferring भी रासायनिक आनुवंशिक बातचीत 11,12 की पहचान करने के लिए एक प्रभावी तरीका है। यह दृष्टिकोण प्रतियोगिता आधारित स्क्रीनिंग के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प प्रदान करता है और रसायनों के छोटे पुस्तकालयों परख करने की क्रिया के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।यहाँ उल्लिखित एस में रासायनिक आनुवंशिक बातचीत की एक सूची का निर्माण करने के लिए एक सरल पद्धति है जीव विज्ञान जोड़तोड़ या बुनियादी सुविधाओं के आणविक पर निर्भर नहीं करता है कि cerevisiae। यह केवल एक खमीर विलोपन संग्रह, एक रोबोट या मैनुअल लगाए तंत्र, और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर की आवश्यकता है।

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Protocol

नोट: इस प्रक्रिया के सामान्य कार्यप्रवाह चित्रा 2 में उल्लिखित है।

विकास निरोधात्मक खुराक के 1. निर्धारण

  1. खमीर रातोंरात संस्कृति की तैयारी
    नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया खमीर निकालने-peptone-डेक्सट्रोज विकास मीडिया (YEPD) एक मानक नुस्खा 13 है।
    1. BY4741 (माता HIS3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) एक YEPD अगर प्लेट पर कोशिकाओं बाहर स्ट्रीक और 30 डिग्री सेल्सियस या दिखाई कालोनियों फार्म तक 48 घंटे के लिए सेते हैं।
    2. एक ही कॉलोनी के साथ एक बाँझ संस्कृति पोत में YEPD तरल मीडिया के 5 मिलीलीटर inoculating द्वारा रातोंरात संस्कृतियों तैयार करें। निरंतर रोटेशन या झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं। संस्कृति आम तौर पर सुबह (~ 2 × 10 8 कोशिकाओं / एमएल) द्वारा संतृप्ति तक पहुंच जाएगा।
  2. ठोस अगर मीडिया तैयारी बदलती रासायनिक खुराक युक्त
    1. के कई शेयरों को तैयाररासायनिक एक उपयुक्त विलायक में 100x वांछित अंतिम एकाग्रता में परीक्षण किया जा सके।
      नोट: प्रभावी सांद्रता रासायनिक पर निर्भर करेगा, और अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। उच्च मिमी करने के लिए कम माइक्रोन से, यानी, यह शुरू में एक व्यापक अंतिम एकाग्रता रेंज परीक्षण करने के लिए इसलिए उचित है।
    2. रसायन के प्रत्येक एकाग्रता के लिए एक कई बाँझ संस्कृति ट्यूब के लिए विभाज्य पिघला हुआ YEPD अगर की 3 मिलीलीटर, परीक्षण किया जाना है। 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह solidifying से रखने के लिए।
    3. परीक्षण करने के लिए रसायन के प्रत्येक एकाग्रता के लिए एक 12 अच्छी तरह से थाली में डुप्लिकेट कुओं में से प्रत्येक जोड़ी में पिघला हुआ मीडिया, भंवर मिश्रण करने के लिए 2-3 सेकंड, और पिपेट 1 मिलीलीटर 100x परिसर के 30 μl जोड़ें। केवल नियंत्रण एक वाहन शामिल करना न भूलें। प्लेटें कमरे के तापमान पर रातोंरात सेट करने की अनुमति दें। किसी भी अतिरिक्त मीडिया त्यागें।
  3. फैलाओ चढ़ाना कोशिकाओं
    1. चरण 1 में के रूप में रातोंरात बड़े हो एक संतृप्त खमीर संस्कृति के 2 μl, साथ YEPD तरल मीडिया के 10 एमएल टीका लगाना।1.2।
    2. अच्छी तरह से प्रति पतला खमीर संस्कृति के 25 μl, बाँझ कांच के मोती या छड़ी का उपयोग कर समान रूप से फैला है, और थाली एक लौ के तहत शुष्क करने की अनुमति प्लेट। 48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
    3. प्लेटों पर खमीर के विकास (कालोनियों के दोनों कुल संख्या और आकार के) का मूल्यांकन। स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए अधिक से अधिक से अधिक 10% से -15% विकास को बाधित नहीं करता है कि परिसर के एक उप-घातक एकाग्रता का चयन करें।

2. सिस्टमैटिक रासायनिक जेनेटिक स्क्रीन

  1. स्रोत प्लेट का विलोपन उत्परिवर्ती-सरणी के रखरखाव (डीएमए) और तैयारी
    1. ग्लिसरॉल शेयरों से हटाए जाने के उत्परिवर्ती सरणियों के निर्माण पर विस्तृत विवरण के लिए Baryshnikova एट अल। 14 देखें। विलोपन म्यूटेंट प्रति प्लेट 384 कालोनियों के घनत्व पर arrayed किया गया है एक बार, डीएमए 4 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है। प्रत्येक में बढ़ती से कालोनियों को रोकने के लिए G418 के रूप में आवश्यक के 200 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / युक्त YEPD अगर पर दोहरानेअन्य।
      नोट: कई धारावाहिक अनुकरण धीमी गति से बढ़ रही है उपभेदों के नुकसान को रोकने और शमन म्यूटेंट की उपस्थिति को कम करने से परहेज किया जाना चाहिए। इस haploids के रूप में संग्रह को बनाए रखने अगर विशेष रूप से प्रासंगिक है।
    2. रोबोट प्रणाली arraying एक माइक्रोबियल का उपयोग करके सभी प्रतिकृति चढ़ाना चरणों का प्रदर्शन। वैकल्पिक रूप से, मैनुअल लगाए उपकरण का उपयोग कर कालोनियों arrayed हेरफेर।
      नोट: खमीर विलोपन संग्रह कई वाणिज्यिक स्रोतों से haploids और diploids के रूप में उपलब्ध है और आम तौर पर 96 अच्छी तरह से प्लेट में ग्लिसरॉल शेयरों के रूप में भेज दिया है।
  2. विलोपन उत्परिवर्ती सरणी संघनक
    1. G418 के 200 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / युक्त YEPD अगर मीडिया की 250 मिलीलीटर की तैयारी। G418 के प्रभावी एकाग्रता भिन्न हो सकते हैं और प्रत्येक स्थल empirically का परीक्षण किया जाना चाहिए।
    2. प्लेट प्रति G418 के 200 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / युक्त YEPD अगर की 50 मिलीलीटर गिरने से पाँच YEPD अगर प्लेटें तैयार करें। सरणी संघनित करने से पहले इस एक दिन करना और प्लेट कमरे में अस्थायी पर शांत करने की अनुमतिerature रातोंरात एक फ्लैट भी सतह पर।
      नोट: चार प्लेटों 1536 तनाव घनत्व पर संग्रह के लिए आवश्यक हो जाएगा, पांचवें प्लेट एक अतिरिक्त के रूप में डाल दिया है।
    3. प्रति प्लेट 384 कालोनियों के घनत्व पर उत्परिवर्ती विलोपन संग्रह युक्त 16 पेट्री डिश निकालें और कमरे के तापमान (~ 1 घंटा) के लिए आने की अनुमति देते हैं।
    4. एक नाजुक कार्य पोंछे का उपयोग करते हुए प्रत्येक थाली के ढक्कन पर गठन किया गया है कि किसी भी संक्षेपण साफ कर लें। पानी की बूंदों में हो सकता है ऐसा करने में विफलता सरणी और arrayed म्यूटेंट के पार संदूषण पर जमा किया जा रहा है।
    5. एक माइक्रोबियल सरणी लगाए रोबोट का प्रयोग, प्लेट प्रति 1536 कालोनियों (4 पेट्री डिश) के लिए प्रति प्लेट 384 कालोनियों (16 पेट्री डिश) की एक घनत्व से डीएमए गाढ़ा। प्लेट एक पिन से एक सेंट कॉलोनी गाढ़ा सरणी के एक स्तंभ 1 पंक्ति के लिए इतना है कि इस प्रदर्शन, थाली 2 में से 1 सेंट कॉलोनी एक स्तंभ 2, 2 और स्तंभ एक पंक्ति थाली 3 में से 1 सेंट कॉलोनी पंक्ति एवं को थाली 4 में से 1 सेंट कॉलोनी दो पंक्तिस्तंभ 2।
    6. रातोंरात 30 डिग्री सेल्सियस पर समेकित सरणी सेते हैं।
    7. स्रोत प्लेटों से कालोनियों की वर्दी हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए सरणी की जाँच करें। डीएमए सही ढंग से (चित्रा -4 ए) संघनित किया गया है सुनिश्चित करने के लिए एक गाइड के रूप में सेवा करते हैं जो जानबूझकर सरणी में शामिल कई रिक्त पदों, वहाँ हो जाएगा।
      नोट: ये परीक्षण यौगिक युक्त मीडिया पर प्रतिकृति चढ़ाना के लिए स्रोत प्लेटें किया जाएगा। एक ही स्रोत थाली कई pinnings के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा कई रोबोट हर बार स्थानांतरित किया जा रहा खमीर के समान संख्या सुनिश्चित करेगा जो एक offsetting सुविधा, होगा।
  3. प्रतिकृति थाली विलोपन उत्परिवर्ती सरणी
    1. नियंत्रण के 700 मिलीलीटर (वाहन केवल) और प्रयोगात्मक मीडिया (रासायनिक युक्त) के 700 मिलीलीटर तैयार करें। यह तीन प्रतियों में परख (हालत प्रति 12 प्लेटें, प्लस दो अतिरिक्त) का प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है।
    2. परीक्षण रासायनिक या प्लेट प्रति नियंत्रण युक्त YEPD अगर की 50 मिलीलीटर डालो। प्लेटों टी की अनुमति देंओ एक फ्लैट भी सतह पर रात भर कमरे के तापमान पर ठंडा।
    3. प्रतिकृति थाली करने के लिए रोबोट का प्रयोग, प्रयोगात्मक निर्धारित एकाग्रता में रसायन युक्त प्लेटों के तीन सेट, साथ ही वाहन नियंत्रण युक्त प्लेटों के तीन सेट पर डीएमए टीका लगाना। 24-48 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटें सेते हैं।

3. इमेजिंग प्लेट्स और डेटा विश्लेषण

  1. इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालें और उन्हें कमरे के तापमान (~ 1 घंटा) इमेजिंग के लिए पहले करने के लिए आने के लिए अनुमति देते हैं। इस प्लेटों इमेजिंग जबकि बनाने से संक्षेपण को रोकने जाएगा।
  2. ढक्कन को दूर करने और एक फ्लैट बिस्तर स्कैनर पर चेहरा नीचे रखकर 24 और 48 घंटा में छवि प्लेटें। कम से कम 300 डीपीआई के एक प्रस्ताव पर छवियों पर कब्जा। वैकल्पिक रूप से, छवियों पर कब्जा करने के लिए एक डिजिटल कैमरा का उपयोग करें। ऐसा करने हैं, जगह प्लेटें एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर चेहरा और छवि को पलकों को हटा दें।
    नोट: प्लेटों की फ़ाइल स्वरूप और स्थिति का इस्तेमाल किया मात्रा का ठहराव कार्यक्रम पर निर्भर करेगा। मात्रा का ठहराव और Balony 15, SGAtools 16, और ScreenMill 17 सहित कई खुला स्रोत कार्यक्रमों में से एक का उपयोग कर सरणी कॉलोनी आकार की तुलना प्रदर्शन करना।

स्क्रीन के 4. मान्यकरण

नोट: इस चरण में कई खमीर विलोपन म्यूटेंट ब्याज की रासायनिक के रूप में अत्यंत अनुभुत स्कोर होगा। ये रासायनिक आनुवंशिक बातचीत अगले दो मायनों में मान्य किया जाना चाहिए। प्रथम संवेदनशील उपभेदों की पहचान पीसीआर द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए। दूसरा, रासायनिक संवेदनशीलता स्वतंत्र रूप से रन बनाए जाना चाहिए। नीचे दिये तनाव अतिसंवेदनशीलता, खमीर जीव विज्ञान में आम एक तकनीक को मान्य करने के लिए खोलना assays के प्रदर्शन के लिए एक संक्षिप्त प्रोटोकॉल है।

  1. स्ट्रीक बाहर G418 के 200 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / युक्त YEPD अगर पर खमीर विलोपन संग्रह से (अत्यंत अनुभुत) म्यूटेंट वांछित। कालोनियों फार्म तक 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। प्राइमरों के अनुसार साथ नैदानिक ​​पीसीआर द्वारा तनाव की जीनोटाइप सत्यापित करेंनिर्माता प्रोटोकॉल।
  2. प्रत्येक तनाव के लिए YEPD तरल के 5 मिलीलीटर टीका लगाना और रोटेशन या झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  3. आयुध डिपो के 600 उपाय और बाँझ DH 2 ओ में 600 = 1 आयुध डिपो के लिए प्रत्येक तनाव पतला ये अब सामान्यीकृत खमीर संस्कृतियों हैं।
  4. एक 96 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से A1 के लिए सामान्यीकृत जंगली प्रकार खमीर (BY4741) संस्कृति के 100 μl बांटना। कुओं बी 1-एच 1 अप करने के लिए सात अतिरिक्त उपभेदों के 100 μl बांटना।
  5. ए 6-H6 के माध्यम से कुओं ए 2-एच 2 बाँझ DH 2 हे के 90 μl बांटना एक multichannel pipettor का प्रयोग करें। अंत में, सामान्यीकृत खमीर संस्कृतियों के 01:10 dilutions की एक श्रृंखला तैयार करते हैं। क्रमानुसार एक multichannel pipettor के साथ स्तंभ से 2 कॉलम 1 के 10 μl pipetting द्वारा शुरू करो, और छह dilutions के बने होते हैं, जब तक 96 अच्छी तरह से थाली भर में जारी (यानी, 10 0-10 -5)।
  6. एक multichannel का उपयोग कर एक ग्रिड में पतला खमीर संस्कृतियों के 2-5 μl स्थानांतरणरासायनिक और वाहन नियंत्रण युक्त YEPD ठोस मीडिया पर pipettor का। 24-48 घंटे के लिए उचित तापमान पर प्लेटें सेते हैं।
  7. प्लेटों का निरीक्षण किया और (BY4741 नियंत्रण के सापेक्ष) रासायनिक करने के लिए चयन म्यूटेंट की संवेदनशीलता की तुलना करें। छवि 24 में प्लेटें और 3.2 कदम के रूप में 48 घंटा।
    नोट: संबंधित जीन ontologies या कार्यों के साथ कई अत्यंत अनुभुत उपभेदों की पहचान स्क्रीन की वैधता के लिए आत्मविश्वास बख्शी है, जबकि जीन की एक जंगली प्रकार की नकल युक्त प्लाज्मिड के साथ एक अत्यंत अनुभुत विलोपन तनाव के परिवर्तन औपचारिक रूप से एक जीन है कि स्थापित करने के लिए आवश्यक है ब्याज का विलोपन (और नहीं छिपा दूसरी साइट म्यूटेशन) दवा संवेदनशीलता का कारण बनता है।

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Representative Results

इस दृष्टिकोण का एक सत्यापन के रूप में हम ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल के बाद chemotherapeutic एजेंट 5 fluorouracil (5-फू) के एक प्रतिनिधि रासायनिक आनुवंशिक बातचीत स्क्रीन प्रदर्शन किया। 5-फू thymidylate सिन्थेज़ के साथ ही डीएनए और आरएनए चयापचय 18 को बाधित करने के लिए जाना जाता है। 5-फू का रासायनिक आनुवंशिक बातचीत अच्छी तरह से अध्ययन कर रहे हैं और विषमयुग्मजी और समयुग्मक विलोपन संग्रह 8,19 दोनों का उपयोग कर खमीर बारकोड माइक्रोएरे तकनीक के द्वारा जांच की गई है। यहाँ हम इसी तरह के परिणाम उत्परिवर्ती कॉलोनी आकार का तुलनात्मक quantitation के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

यह प्रदर्शन स्क्रीन गैर जरूरी अगुणित जीन विलोपन संग्रह इस्तेमाल करता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। स्क्रीन के इस प्रकार का भी आवश्यक जीन म्यूटेंट के शामिल किए जाने के लिए अनुमति देता है, द्विगुणित उपभेदों, तापमान के प्रति संवेदनशील म्यूटेंट, और hypomorphic एलील का उपयोग किया जा सकता है। अगुणित विलोपन संग्रह का उपयोग करने के लिए एक लाभ यह दवा sensitiv बढ़ जाती हैलक्ष्य रास्ते में से अल्पसंख्यक, जीन उत्पाद के पूर्ण अभाव दिया। बहरहाल, दो महत्वपूर्ण नुकसान आवश्यक जीन अतिसंवेदनशीलता पूछे नहीं किया जा सकता है कि कर रहे हैं, और अगुणित संग्रह कई propagations से अधिक के लिए चयन कर रहे हैं कि सहज शमन म्यूटेशन की संभावना है। इस संग्रह की गिरावट के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इस प्रकार, दवा प्रभाव के लिए सरणी और संवेदनशीलता की अखंडता और चौड़ाई के बीच बंद एक अंतर्निहित व्यापार नहीं है। यह ध्यान में रखा जाना चाहिए और चयनित सबसे उपयुक्त उत्परिवर्ती संग्रह वांछित आवेदन पर आधारित है।

सबसे पहले, 5-फू का उचित उप घातक एकाग्रता स्क्रीन में इस्तेमाल किया जा करने के लिए (5-फू की एकाग्रता बढ़ाने पर BY4741 (माता HIS3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) कोशिकाओं से बढ़ रहा है और नेत्रहीन खमीर कॉलोनी विकास के मूल्यांकन के द्वारा 10 माइक्रोन होने के लिए निर्धारित किया गया था चित्रा 3A)। वैकल्पिक रूप से, इसी तरह के परिणाम से बढ़ तु द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैपिछले समूहों 10,20 द्वारा उल्लिखित के रूप में तरल संस्कृति और एक microplate पाठक (3B चित्रा) का उपयोग संस्कृतियों ऑप्टिकल घनत्व की लगातार निगरानी में microtiter प्लेट में AST,।

सिंगर रोटर का उपयोग करना, खमीर डीएमए 10 माइक्रोन 5-फू या एक डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) नियंत्रण (चित्रा -4 ए) युक्त मीडिया पर थाली घनत्व प्रति 1536 कालोनियों को दोहराया गया था। ये प्लेटें कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए incubated और एक फ्लैट बिस्तर स्कैनर पर imaged थे। दोनों प्रयोगात्मक और नियंत्रण प्लेटों पर प्रत्येक उत्परिवर्ती के लिए कॉलोनी आकार माप Balony छवि विश्लेषण इंजन 15 का उपयोग किया गया था। Balony सॉफ्टवेयर को नियंत्रित करने के प्रयोगात्मक सरणी रिश्तेदार पर कालोनियों के आकार के अनुपात की गणना करता है। उपयोगकर्ता एक अनुपात सीमा निर्धारित करने में सक्षम है और स्क्रीन में किया जाता है, तो कम से कम एक पी मूल्य प्रत्येक उत्परिवर्ती के लिए आवंटित किया जाएगा तीन प्रतियों। पर विचार कर रहे थे ≤0.8 के अनुपात से पता चला है कि हमारे प्रतिनिधि स्क्रीन म्यूटेंट मेंएड हिट होने के लिए। कॉलोनी मात्रा का ठहराव के परिणामों Y अक्ष पर प्रत्येक कॉलोनी और एक्स-अक्ष पर सरणी स्थिति (4B चित्रा) या अनुपात (चित्रा 4C) ने आदेश दिया जीन को हटाने के लिए आकार के अनुपात की साजिश रचने के द्वारा रेखांकन प्रस्तुत किया जा सकता है।

सिंथेटिक बीमार / स्क्रीन में पहचान की घातक म्यूटेंट जीन आंटलजी (जाओ) विश्लेषण प्रदर्शन से कार्यात्मक विवरण के आधार पर बांटा जा सकता है। एस की सूचियों के चलते विश्लेषण के लिए कई सार्वजनिक रूप से उपलब्ध उपकरण हैं cerevisiae जीन; Funspec 21, डेविड जैव सूचना विज्ञान डाटाबेस 22,23, और Saccharomyces जीनोम डाटाबेस (SGD) जाने टर्म खोजक 24 भी शामिल है। 5-फू स्क्रीन में 0.8 से कम या बराबर के अनुपात था कि जीन विलोपन Funspec के लिए एक इनपुट सूची के रूप में इस्तेमाल किया गया। Funspec व्यवस्थित या आम खमीर जीन नामों की सूची को स्वीकार करता है और ओ.टी. के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीन ontologies, कार्यात्मक वर्गीकरण, स्थानीयकरण, प्रोटीन परिसरों का सारांश outputsउस सूची में समृद्ध कर रहे हैं कि उसे उपयोगी वर्गीकरण। प्रदर्शन किया प्रतिनिधि स्क्रीन uridine संशोधन और आरएनए निगरानी मशीनरी, और डीएनए की क्षति (तालिका 1) के जवाब, tRNA wobbles सहित शाही सेना चयापचय के लिए ontologies का संवर्धन दिखाया। इन परिणामों के परमाणु टीआरएफ / Rrp6 / एयर / Mtr4 polyadenylation (आवारा) exosome 25 से कार्रवाई कर रहे हैं जो polyadenylated noncoding RNAs, के संचय में 5-फू उपचार के परिणाम से पता चला है कि पिछले अध्ययनों से सहमत हूँ। इस प्रकार इन निष्कर्षों पिछले रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन के साथ समझौते और 5-फू bioactivity 8,19 के ज्ञात तंत्र में हैं।

सभी उच्च throughput कार्यात्मक जीनोमिक दृष्टिकोण के साथ के रूप में यह परिणाम को मान्य करने के लिए आवश्यक है। रासायनिक आनुवंशिक बातचीत खमीर म्यूटेंट पहले कि लक्ष्य जीन के प्रमोटर और KANMX व्यवधान कैसेट के भीतर पानी रखना प्राइमरों के साथ पीसीआर मान्य किया जाना चाहिए मान्य करने के लिए। वैध के लिए उपभेदों का चयनसमझना एक मजबूत फेनोटाइप दिखाने के लिए और समूह कार्यात्मक एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है कि कुछ हद तक मनमाना, हालांकि प्राथमिकता म्यूटेंट है। इसके बाद, एक रासायनिक को अतिसंवेदनशीलता खोलना assays के, खमीर म्यूटेंट की फिटनेस को मापने के लिए एक आम दृष्टिकोण का उपयोग कर पुष्टि की है। यह अंत करने के लिए, खमीर उपभेदों के धारावाहिक dilutions उपयुक्त रासायनिक खुराक के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक नियंत्रण युक्त मीडिया पर एक ग्रिड में देखा जाता है। एक उदाहरण के रूप में, हम (चित्रा 5) आवारा परिसर के air1 और trf5 म्यूटेंट के साथ 5-फू का रासायनिक आनुवंशिक बातचीत की पुष्टि करें। इन जीनों आवारा परमाणु exosome के घटकों को सांकेतिक शब्दों में बदलना। हम कोर आवारा की 3'-5 'exonuclease गतिविधि की कमी rrp6 तनाव, हमारी प्रयोगशाला की उच्च घनत्व डीएमए संग्रह में खो गया था कि ध्यान दें। एक ताजा rrp6 उत्परिवर्ती प्राप्त करने पर हम उस rrp6 की पुष्टि करें और 5-फू यह भी है कि आवारा गतिविधि 5-फू को सहन करने के लिए आवश्यक है की स्थापना, एक रासायनिक आनुवंशिक बातचीत प्रदर्शित करते हैं। यह दिखाता हैबड़े विलोपन संग्रह की अखंडता को उचित डीएमए रखरखाव और तनाव सत्यापन महत्वपूर्ण बना रही है, समय के साथ समझौता हो सकता है।

हमारे स्क्रीन भी संवेदनशील 5-फू के रूप में (rad50, rad52 और mre11 सहित) कई डीएनए की मरम्मत एंजाइमों में म्यूटेंट की पहचान की। कॉलोनी आकार की स्कोरिंग जंगली प्रकार की तुलना में 0.7, 0.65, और 0.42 के रूप में 10 माइक्रोन 5-फू पर इन म्यूटेंट के रिश्तेदार फिटनेस संकेत दिया। हमारे पुष्टि खोलना assays के (चित्रा 5) के आधार पर, इन मूल्यों की वजह से कॉलोनी आकार स्कोरिंग द्वारा फिटनेस माप की सीमित गतिशील रेंज के लिए एक कम संभावना है। यह स्वतंत्र रूप से धारावाहिक खोलना से बातचीत की पुष्टि के लिए एक दूसरा कारण डाला: कुछ रासायनिक आनुवंशिक बातचीत की भयावहता प्राथमिक डेटा विश्लेषण में कम करके आंका जा सकता है। हमारे परिणाम तीन प्रतियों में, ~ 4800 तनाव अगुणित विलोपन संग्रह के साथ प्रदर्शन में एक विकास आधारित रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन, पर्याप्त Resol प्रदान करता है कि उदाहरण देकर स्पष्ट करना ution आत्मविश्वास से विशिष्ट रासायनिक आनुवंशिक बातचीत को अलग-थलग करने के लिए।

चित्र 1
चित्रा 1:। रासायनिक गड़बड़ी करने अतिसंवेदनशीलता में परिणाम है कि रासायनिक आनुवंशिक बातचीत की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जीन विलोपन एक रासायनिक द्वारा लक्षित जैविक प्रक्रियाओं की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। (ए) के अभिसरण रास्ते या तो जीन विलोपन (geneA) या रासायनिक (geneB) द्वारा बाधित किया जा सकता है। व्यक्तिगत रूप से, इन सेलुलर अपमान के कारण जैविक रास्ते में अंतर्निहित विकल्प को सहन किया जा सकता है। हालांकि, संयोजन सेल व्यवहार्यता में या तो एक synthetically बीमार या घातक फेनोटाइप में जिसके परिणामस्वरूप समझौता किया है। (बी) भी अतिसंवेदनशीलता के कारण और रासायनिक उपचार से बाधित जैविक रास्ते से संकेत मिलता है रासायनिक प्रेरित तनाव कम करने के लिए महत्वपूर्ण जीनों (geneC) का विलोपन। jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: रासायनिक जेनेटिक स्क्रीन के लिए कार्यप्रवाह उप निरोधात्मक खुराक की (ए) के निर्धारण:। पैतृक खमीर उपभेदों स्थिर चरण के लिए बड़े हो रहे हैं, एक पतला: 5000, और प्रसार में वृद्धि रासायनिक खुराक युक्त ठोस YEPD मीडिया पर चढ़ाया। कोई एक से अधिक 10-15% की वृद्धि निषेध होने के सर्वोच्च एकाग्रता डीएमए के खिलाफ प्रदर्शन के लिए चुना गया है। (बी) के व्यवस्थित रासायनिक जेनेटिक स्क्रीन: एस रोबोट लगाए एक उच्च throughput सरणी का उपयोग करना cerevisiae डीएमए परीक्षण रसायन की उचित एकाग्रता युक्त मीडिया पर चढ़ाया प्रतिकृति है। प्लेट्स, 24-48 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर incubated imaged, और रिश्तेदार कॉलोनी आकार निर्धारित कर रहे हैं।रेफरी = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" लक्ष्य = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र तीन :. उप निरोधात्मक एकाग्रता का निर्धारण। 5-fluouracil युक्त ठोस मीडिया पर BY4741 कोशिकाओं की (ए) के विकास। संतृप्त BY4741 संस्कृति एक पतला: 5,000 और 5 fluorouracil की बढ़ती सांद्रता पर चढ़ाया। 5-flurouracil युक्त तरल मीडिया में BY4741 कोशिकाओं (बी) वृद्धि वक्र। ~ 4 × 10 4 कोशिकाओं 22 घंटा के लिए हर 10 मिनट मापा गया 5-फू और ODS की सांद्रता बढ़ाने में तीन प्रतियों में जमा थे।

चित्रा 4
चित्रा 4: 5- कैमिकल जेनेटिक स्क्रीनफ्लूरोरासिल। (ए) एस cerevisiae विलोपन उत्परिवर्ती सरणी 10 माइक्रोन 5-फू (दाएं) युक्त YEPD अगर और DMSO के नियंत्रण (बाएं) पर दोहराया। (बी) रासायनिक जेनेटिक स्क्रीन के परिणाम: सरणी स्थिति ने आदेश दिया DMSO के नियंत्रण की तुलना में 10 माइक्रोन 5-फू पर म्यूटेंट के सापेक्ष विकास। कॉलोनी आकार के अनुपात द्वारा आदेश दिया DMSO के नियंत्रण की तुलना में 10 माइक्रोन 5-फू पर म्यूटेंट (सी) सापेक्ष विकास। ≤0.8 के अनुपात दहलीज दोनों रेखांकन पर संकेत दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: रासायनिक आनुवंशिक बातचीत के मान्यकरण। DMSO के नियंत्रण (ए) पर हो कई अलग उत्परिवर्ती उपभेदों के धारावाहिक dilutions, 10 माइक्रोन 5-फू ( ग)।

जाओ श्रेणी पी मूल्य पहचान जीन (हिट) # हिट जाओ श्रेणी में जीनों की कुल #
tRNA लड़खड़ा uridine संशोधन [जाना: 0002098] 2.24 × 10 -6 SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 7 24
ट्रांसक्रिप्शन, डीएनए निर्भर [जाना: 0006351] 1.69 × 10 -5 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 32 540
अनुवाद [जाना: 0006412] 4.28 × 10 -5 RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A 22 318
tRNA लड़खड़ा स्थिति uridine thiolation [जाना: 0002143] 1.88 × 10 -4 NCS6 URM1 TUM1 3 5
प्रतिलेखन के नियमन, डीएनए निर्भर [जाना: 0006355] 4.98 × 10 -4 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 27 507
प्रोटीन urmylation [जाना: 0032447] 6.33 × 10 -4 NCS6 URM1 URE2 3 7
जवाब में नाभिक से mRNA के निर्यात [तनाव गर्मी के लिएजाना: 0031990] 2.04 × 10 -3 RPB4 NUP120 NUP133 3 10
परमाणु polyadenylation निर्भर कट catabolic प्रक्रिया [जाना: 0071039] 2.04 × 10 -3 AIR1 TRF5 MPP6 3 10
tryptophan चयापचय की प्रक्रिया [जाना: 0006568] 2.15 × 10 -3 TRP5 TRP3 2 3
जल्दी गोल्गी परिवहन के लिए endosome [जाना: 0034498] 2.75 × 10 -3 ENT5 TCA17 RCY1 3 1 1
राइबोसोमल छोटे सबयूनिट जीवजनन [जाना: 0042274] 3.63 × 10 -3 SAC3 LTV1 RPS19B RPS19A 4 24
क्रोमेटिन संशोधन [जाना: 0016568] 3.64 × 10 -3 LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ASH1 SGF11ELP3 9 114
एटीपी चयापचय की प्रक्रिया [जाना: 0046034] 4.23 × 10 -3 VMA2 VMA1 2 4
vacuolar प्रोटॉन-परिवहन वि प्रकार जटिल विधानसभा ATPase [जाना: 0070072] 4.23 × 10 -3 VMA21 VPH2 2 4
गुणसूत्र स्थानीयकरण [जाना: 0050000] 4.23 × 10 -3 NUP120 NUP133 2 4
mRNA के परिवहन [जाना: 0051028] 4.59 × 10 -3 DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 6 58
vacuolar अम्लीकरण [जाना: 0007035] 4.89 × 10 -3 VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 4 26
नाभिक से rRNA के निर्यात [जाना: 0006407] 5.63 × 10 <समर्थन> -3 NUP120 NUP133 RPS19B RPS19A 4 27
endocytosis [जाना: 0006897] 6.57 × 10 -3 SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 END3 7 82
mRNA के 3'-अंत प्रसंस्करण के परमाणु mRNA के निगरानी [जाना: 0,071,031] 6.92 × 10 -3 AIR1 MPP6 2 5
ncRNA polyadenylation [जाना: 0043629] 6.92 × 10 -3 AIR1 TRF5 2 5
परमाणु polyadenylation निर्भर snoRNA catabolic प्रक्रिया [जाना: 0071036] 6.92 × 10 -3 AIR1 TRF5 2 5
परमाणु polyadenylation निर्भर snRNA catabolic प्रक्रिया [जाना: 0071037] 6.92 × 10 -3 AIR1 TRF5 2 5
ट्रिप्टोफान biosynthetic प्रक्रिया [जाना: 0000162] 6.92 × 10 -3 TRP5 TRP3 2 5
ईआर झिल्ली में प्रोटीन प्रविष्टि [जाना: 0045048] 6.92 × 10 -3 GET1 GET4 2 5
mRNA के स्थिरीकरण [जाना: 0048255] 6.92 × 10 -3 ATP25 IGO1 2 5
डीएनए की क्षति उत्तेजना के जवाब [जाना: 0006974] 7.05 × 10 -3 MUS81 RAD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 DEF1 MMS22 RAD52 MRE11 RAD50 RMI1 12 197
"> # हिट फिल्मों में
जाओ श्रेणी पी मूल्य पहचान जीन (हिट) जाओ श्रेणी में जीनों की कुल #
परमाणु polyadenylation निर्भर rRNA catabolic प्रक्रिया [जाना: 0071035] 8.46 × 10 -3 AIR1 TRF5 MPP6 3 16

तालिका 1: जीन आंटलजी (जाओ) 5 fluorouracil संवेदनशील म्यूटेंट की विशेषता।

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Discussion

रासायनिक आनुवंशिक बातचीत प्रोफाइल को पैदा करने के लिए एक दृष्टिकोण यहाँ दिये। विधि सरल है: एक रसायन की उपस्थिति और अनुपस्थिति में व्यापक जीन विलोपन संग्रह में प्रत्येक तनाव की कॉलोनी आकार की तुलना द्वारा एक रसायन के अपमान को सहन करने के लिए आवश्यक सभी जीनों की पहचान की जाती है। संवेदनशील उपभेदों के परिणामस्वरूप सूची की व्याख्या संवर्धन विश्लेषण तो कार्रवाई की एक रसायन मोड में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल नवोदित खमीर के लिए अनुकूलित किया गया है, यह भी इस तरह के के रूप में अन्य arrayed माइक्रोबियल विलोपन संग्रह, के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है सेलुलर perturbations 26,27 के सैकड़ों की जांच के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है जो कोलाई कीयो संग्रह।

खमीर और अन्य जीवों में रासायनिक आनुवंशिक रूपरेखा अच्छी तरह से स्थापित है। इन अध्ययनों के बहुमत माइक्रोएरे विश्लेषण या उच्च throughput sequ के माध्यम से हटाए जाने म्यूटेंट जमा यों कि प्रतियोगिता में assays पर भरोसा किया हैअद्वितीय आनुवंशिक बारकोड की encing। यह दृष्टिकोण बड़ी रासायनिक पुस्तकालयों की मजबूत रासायनिक आनुवंशिक प्रोफाइल के निर्माण में सफल साबित हुई है। यहाँ वर्णित कार्यप्रणाली परीक्षण यौगिकों की छोटी संख्या के रासायनिक आनुवांशिक विश्लेषण के लिए एक उपयोगी विकल्प प्रदान करता है। परख उच्च throughput अनुक्रमण या माइक्रोएरे विश्लेषण से भी कम लागत बैठती है और अनुक्रम पूर्वाग्रह से ग्रस्त नहीं है कि एक साधारण readout प्रदान करता है। उल्लिखित के रूप में प्रोटोकॉल कॉलोनी हेरफेर के लिए एक रोबोट साधन की आवश्यकता है, इस तरह के सिस्टम एकांतर प्रोटोकॉल सामग्री की सूची में शामिल किया गया है उदाहरण हैं जिनमें से मार्गदर्शन लगाए उपकरण, के साथ प्रयोग के लिए समायोजित किया जा सकता है, और अधिक किफायती होता जा रहा है और कर रहे हैं।

यह सामान्य रूप में इस दृष्टिकोण और रासायनिक आनुवंशिक प्रोफाइलिंग की सीमाओं के बारे में पता होना जरूरी है। सबसे पहले, यौगिक नवोदित खमीर में व्यवहार्यता पर एक प्रभाव होना चाहिए, या विशिष्ट जीव का उपयोग किया जा रहा है। कई मौलिक जैविक प्रक्रियाओं जबकिऔर कार्य अच्छी तरह से कोशिकाओं में रसायनों के तेज के रूप में होगा यूकेरियोट्स, जीव विशिष्ट रासायनिक आनुवंशिक बातचीत, व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं के बीच में संरक्षित कर रहे हैं। यह भी कई विलोपन उपभेदों कई दवा उपचार 8 के प्रति संवेदनशील होना पाया गया है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। ये दवा तपका, vacuolar समारोह, और झिल्ली अखंडता में शामिल जीनों में शामिल हैं। यह निर्देशित करने के लिए सम्मान और कार्रवाई के अप्रत्यक्ष मोड के साथ निष्कर्ष करते समय विचार बहु ​​दवा प्रतिरोध में लेने के लिए महत्वपूर्ण है।

यहाँ वर्णित स्क्रीन अगुणित विलोपन संग्रह, खमीर में रासायनिक आनुवांशिक विश्लेषण के लिए एक आम दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। कार्रवाई का एक रासायनिक यौगिक के मोड के निर्धारण में आगे सहायता के लिए उपलब्ध खमीर म्यूटेंट के कई संग्रहों अब कर रहे हैं। यह पूरा समयुग्मक और विषमयुग्मजी द्विगुणित विलोपन संग्रह, लेकिन यह भी सशर्त तापमान के प्रति संवेदनशील आवश्यक जीन म्यूटेंट, Decre न केवल शामिलउपलब्ध उपकरणों की अविश्वसनीय गहराई, आसानी से देखते हुए epigenetic आधारित आणविक उपचारों 3,4,28 जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो mRNA के Perturbation (नम) खमीर उत्परिवर्ती पुस्तकालय, और एक कृत्रिम हिस्टोन H3 और एच 4 उत्परिवर्ती संग्रह, द्वारा ased बहुतायत कार्यप्रणाली, और आवश्यक सीमित बुनियादी ढांचे, इस दृष्टिकोण एक रासायनिक यौगिक के तंत्र के लिए सम्मान के साथ अमीर कार्यात्मक जानकारी का उपयोग करने के लिए एक सुलभ स्वरूप प्रदान करता है।

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Acknowledgments

CJN प्रयोगशाला में अनुसंधान NSERC, कनाडा के कैंसर सोसायटी अनुसंधान संस्थान (CCSRI), और कनाडा के स्तन कैंसर फाउंडेशन (ईसा पूर्व-युकोन शाखा) से परिचालन अनुदान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast Extract BioBasic G0961 For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)
Tyrptone Powder BD Biosciences 211820 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)
Dextrose Anachemia 31096-380 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.
Agar A Bio Basic FB0010 For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)
G418 A.G. Scientific Inc. G-1033 Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. 
12-well plate Greiner Bio One 655180
5 ml culture tubes Evergreen Scientific 222-2376-080
10 cm Petri Dish VWR 25384-302
ROTOR HDA Singer Instruments  ROT-001 high-throughput microbial array pinning robot
PLUSPLATE© Petri Dish Singer Instruments  PLU-001 Box of 200 dishes
384 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-384 Box of 1,000 pads
1536 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-1536 Box of 1,000 pads
Alternative Pinning Tools:
Fully Automated Robtic Systems S&P robotics http://www.sprobotics.com Several automated colony handling robitic and imagining systems available.
Manual Pinning Tools V&P Scientific http://www.vp-scientific.com Handheld replication tools and accessories. 

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