Identification rapide des interactions chimiques génétiques dans

Biology

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Dilworth, D., Nelson, C. J. Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (98), e52345, doi:10.3791/52345 (2015).

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Abstract

Déterminer le mode d'action des produits chimiques bioactifs est d'intérêt pour un large éventail d'universitaires, pharmaceutiques, et les scientifiques industriels. Saccharomyces cerevisiae, ou levure bourgeonnante, est un eucaryote modèle pour lequel une collection complète de ~ 6000 mutants de délétion du gène et gène essentiel hypomorphic mutants sont disponibles dans le commerce. Ces collections de mutants peuvent être utilisés pour détecter systématiquement des interactions chimiques de gènes, à savoir les gènes nécessaires pour tolérer un produit chimique. Cette information, à son tour, des rapports sur le mode d'action probable du composé. Ici, nous décrivons un protocole pour l'identification rapide des interactions chimiques-génétiques dans la levure bourgeonnante. Nous démontrons le procédé utilisant l'agent chimiothérapeutique 5-fluorouracile (5-FU), qui possède un mécanisme bien défini de l'action. Nos résultats montrent que l'ARN nucléaire TRAMP exosomes réparation de l'ADN et les enzymes sont nécessaires pour la prolifération en présence de 5-FU, qui est compatible avec m précédenteicroarray approches génétiques basés codes barres chimiques et la connaissance que le 5-FU néfaste à la fois l'ARN et l'ADN métabolisme. Les protocoles de validation requis de ces écrans à haut débit sont également décrits.

Introduction

Les outils et les ressources disponibles dans l'organisme modèle Saccharomyces cerevisiae génétiques ont permis à grande échelle de génomique fonctionnelle études qui fournissent collectivement un nouvel éclairage sur la façon dont les gènes fonctionnent comme des réseaux pour répondre aux exigences des systèmes biologiques. La pierre angulaire de ces outils a été la création en collaboration d'un ensemble complet de délétions de gènes non-essentiels de tous les cadres de lecture ouverts dans la levure 1,2. Une observation frappante était que seulement environ 20% des gènes de levure sont nécessaires pour la viabilité lorsqu'il est cultivé comme haploïdes dans des conditions de laboratoire standard. Cela met en évidence la capacité d'une cellule à tampon contre les perturbations génomiques grâce à l'utilisation des voies biologiques alternatives. Mutants génétiques qui sont viables individuellement, mais en combinaison mortelle, signalent les voies biologiques parallèles ou convergentes connectés et forment des réseaux d'interactions génétiques qui décrivent la fonction biologique. Avec le développement de te conditionnelleallèles mpérature-sensibles et hypomorphic de gènes essentiels de la technologie n'a pas été limité à l'étude des gènes non essentiels 3,4. Ce concept a été appliqué à l'échelle génomique produire une carte d'interaction génétique impartiale illustrant comment les gènes impliqués dans les processus cellulaires similaires se regroupent 5.

Perturbations chimiques des réseaux génétiques suppressions de gènes imiter (Figure 1) 6. Interrogation composés inhibiteurs de croissance contre une matrice haute densité de souches de suppression de l'hypersensibilité identifie un profil d'interaction chimique génétique, ce est à dire une liste de gènes qui est nécessaire pour tolérer le stress chimique. Comme les interactions génétiques, grands écrans de bibliothèques chimiques ont montré que les composés avec un mode similaire de se regroupent sept d'action. Par conséquent, en établissant le profil d'interaction chimique génétique d'un composé du mode d'action peut être déduite par comparaison avec large échelle interaction génétique génétique et chimique de synthèse datasets 8,9.

Écrans chimiques génétique à grande échelle, où des dizaines de composés sont interrogés, ont été réalisées par des analyses de la concurrence de codes à barres. Dans cette approche, la collecte groupée des souches de suppression est cultivé en masse depuis plusieurs générations dans un petit volume de milieu contenant un produit chimique. Depuis chaque mutant de suppression recèle un code-barres génétique unique, la viabilité / croissance des mutants individuels au sein du pool de souches de suppression est suivi par microarray ou séquençage à haut débit 10.

Inférer remise en forme en surveillant la taille des colonies de mutants physiquement disposés en réseau cultivés sur gélose solide contenant un composé bioactif est aussi une méthode efficace pour identifier les interactions chimiques-génétiques 11,12. Cette approche offre une alternative rentable au dépistage fondé sur la concurrence et est bien adapté pour le dosage de petites bibliothèques de produits chimiques.Décrite ici est une méthodologie simple pour produire une liste des interactions chimiques-génétiques dans S. cerevisiae qui ne repose pas sur les manipulations moléculaire ou d'infrastructure biologie. Elle exige seulement une collection de levure de suppression, un appareil de brochage robotisé ou manuel, et librement disponibles des logiciels d'analyse d'images.

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Protocol

NOTE: Le flux de travail général de cette procédure est décrite dans la figure 2.

1. Détermination de la croissance inhibitrice Dose

  1. Préparation de levure culture d'une nuit
    NOTE: Les médias de croissance extrait de levure-peptone-dextrose (YEPD) utilisé dans ce protocole est une recette standard 13.
    1. Streak sur BY4741 (Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 de Mata) cellules sur une plaque de gélose YEPD et incuber pendant 48 heures à 30 ° C ou jusqu'à ce que des colonies visibles forment.
    2. Préparer cultures d'une nuit en inoculant 5 ml de YEPD milieux liquides dans un récipient de culture stérile avec une seule colonie. Incuber une nuit à 30 ° C avec rotation continue ou en secouant. La culture sera typiquement atteindre la saturation par le matin (~ 2 × 10 8 cellules / ml).
  2. Solide préparation des milieux agar contenant diverses doses chimiques
    1. Préparer plusieurs stocks dele produit chimique à tester à 100x la concentration finale souhaitée dans un solvant approprié.
      REMARQUE: Les concentrations efficaces dépendront de la chimie, et doivent être déterminées empiriquement. Il est donc conseillé de tester d'abord une gamme de concentration finale de large; ce est à dire, d'une faible uM à haute mM.
    2. Pour chaque concentration de produit chimique à tester, aliquote de 3 ml de gélose YEPD fondu dans un tube de plusieurs culture stérile. Place à 55 ° C bain d'eau pour garder de se solidifier.
    3. Pour chaque concentration de produit chimique à tester ajouter 30 ul du composé à 100x milieu en fusion, vortex pour mélanger 2-3 secondes, et la pipette 1 ml dans chaque paire de puits en double dans une plaque à 12 puits. Veillez à inclure un véhicule seul contrôle. Permettre aux plaques de fixer pendant une nuit à température ambiante. Jeter ne importe quel média supplémentaire.
  3. cellules Spread placage
    1. Inoculer 10 ml de milieu liquide YEPD avec 2 ul d'une culture de levure saturée, cultivées pendant une nuit comme dans l'étape 1.1.2.
    2. Plate 25 ul de la culture de levure diluée par puits, répartis uniformément en utilisant des billes de verre stériles ou tige, et permettent la plaque sécher sous une flamme. Incuber la plaque à 30 ° C pendant 48 heures.
    3. Évaluer la croissance des levures (à la fois le nombre total et la taille des colonies) sur les plaques. Sélectionner une concentration sublétale d'un composé qui ne inhibe pas la croissance de plus de 10% à 15% pour effectuer la totalité.

2. Systematic crible génétique chimique

  1. Maintien de suppression-mutant-array (DMA) et la préparation de plaque source
    1. Pour une description détaillée sur la construction de réseaux de mutants suppression des stocks de glycérol se il vous plaît se référer à Baryshnikova et al. 14. Une fois que les mutants de deletion ont été revêtu à une densité de 384 colonies par plaque, la DMA peut être stocké pendant plusieurs mois à 4 ° C. Répliquer sur gélose YEPD contenant 200 ug / ml de G418 que nécessaire pour empêcher les colonies de se développer dans chaqueautre.
      Note: plusieurs répétitions de série devraient être évités pour prévenir la perte de souches à croissance lente et de minimiser l'apparition de mutants suppresseurs. Ceci est particulièrement pertinent si le maintien des collections que haploïdes.
    2. Effectuez toutes les étapes réplique placage utilisant un microbienne rangeant système robotique. Alternativement, manipuler colonies en utilisant des outils manuels d 'ancrage vêtu.
      NOTE: La collection de levure de suppression est disponible en haploïdes et diploïdes provenant de plusieurs sources commerciales et est généralement expédié en stocks de glycérol dans des plaques à 96 puits.
  2. Condenser le tableau suppression de mutant
    1. Préparer 250 ml de milieu de gélose YEPD contenant 200 ug / ml de G418. La concentration efficace de G418 peut varier et chaque lot doit être testé empiriquement.
    2. Préparer cinq plaques de gélose YEPD en versant 50 ml d'agar YEPD contenant 200 ug / ml de G418 par plaque. Pour ce faire, un jour avant la condensation du tableau et laisser les plaques refroidir à la température ambianterature nuit sur une surface plane.
      NOTE: Quatre plaques seront requis pour la collecte à une densité 1536-souche, la cinquième plaque est versé comme un supplément.
    3. Retirer les 16 boîtes de Pétri contenant le mutant de deletion de collecte à une densité de 384 colonies par plaque et laisser revenir à la température ambiante (environ 1 heure).
    4. Essuyez toute condensation qui se est formée sur le couvercle de chaque plaque en utilisant une tâche délicate essuyer. Ne pas le faire peut entraîner des gouttelettes d'eau se dépose sur le tableau et la contamination croisée de mutants disposés.
    5. L'utilisation d'un tableau épinglant robots microbienne, condenser la DMA d'une densité de 384 colonies par plaque (16 boîtes de Pétri) à 1536 colonies par plaque (4 boîtes de Pétri). Effectuez cette sorte que le 1 er colonie de la plaque 1 pins à la ligne 1 colonne 1 du tableau condensé, le 1 er colonie de la plaque 2 à la ligne 1 colonne 2, le 1 er colonie de la plaque 3 à la ligne 2 et la colonne 1, et la colonie 1 er de la plaque 4 à la ligne 2colonne 2.
    6. Incuber le tableau consolidé à 30 ° C pendant la nuit.
    7. Examinez le tableau pour assurer un transfert uniforme de colonies à partir de plaques de source. Il y aura plusieurs positions vierges, à dessein incorporés dans la matrice, qui servent de guide pour assurer le DMA a été condensé correctement (figure 4A).
      NOTE: Il se agira des plaques de base pour des répliques sur des milieux contenant le composé d'essai. Une plaque de source unique peut être utilisé pour plusieurs pinnings. Aussi de nombreux robots auront une fonction de compensation, ce qui assurera un nombre similaire de la levure sont transférés à chaque fois.
  3. plaque de gamme Replica suppression de mutant
    1. Préparez 700 ml de contrôle (véhicule seulement) et 700 ml de milieu expérimental (contenant de produits chimiques). Ce est suffisant pour la réalisation du test en trois exemplaires (12 plaques par condition, plus deux extras).
    2. Verser 50 ml de gélose YEPD contenant lutte chimique ou par plaque test. Autoriser les plaques to refroidir à la température ambiante pendant une nuit sur une surface plane.
    3. En utilisant le robot à la plaque de réplique, inoculer le DMA sur trois jeux de plaques contenant des produits chimiques à la concentration déterminée expérimentalement, ainsi que trois jeux de plaques contenant le contrôle du véhicule. Incuber les plaques à température ambiante pendant 24-48 h.

3. Les plaques d'imagerie et d'analyse de données

  1. Retirer les plaques de l'incubateur et leur permettre de revenir à température ambiante (~ 1 h) avant l'imagerie. Cela permettra d'éviter la formation de condensation en imagerie les plaques.
  2. plaques d'image au 24 et 48 h en enlevant le couvercle et placer face vers le bas sur un scanner à plat. Capturez des images à une résolution d'au moins 300 dpi. Sinon, utilisez un appareil photo numérique pour capturer des images. Si faisant, place des plaques face vers le haut sur un fond sombre et retirez les couvercles à l'image.
    NOTE: Le format de fichier et le positionnement des plaques dépendront sur le programme de quantification utilisée. Effectuer la quantification et la comparaison de la taille des colonies de tableau en utilisant l'un des nombreux programmes open source, y compris Balony 15, SGAtools 16 et 17 ScreenMill.

4. Validation de l'écran

NOTE: A ce stade, plusieurs mutants de suppressions de levure seront marquer une hypersensibilité à la substance chimique d'intérêt. Ces interactions chimiques-génétiques doivent être validés prochaine de deux façons. D'abord l'identité des souches sensibles devrait être confirmée par PCR. En second lieu, la sensibilité chimique doit être reçu de façon indépendante. Décrit ci-dessous est un bref protocole pour effectuer des dosages de repérage pour valider hypersensibilité de la souche, une technique courante dans la levure biologie.

  1. Tués sur le souhaite (hypersensible) de la collection de mutants de deletion de la levure sur de la gélose YEPD contenant 200 ug / ml de G418. Incuber à 30 ° C jusqu'à ce que des colonies se forment. Vérifier le génotype de la souche de diagnostic par PCR avec des amorces selon lale protocole du fabricant.
  2. Inoculer 5 ml du liquide YEPD pour chaque souche et incuber une nuit à 30 ° C avec agitation ou rotation.
  3. Mesurer 600 OD et diluer chaque souche à DO 600 = 1 en DH stérile 2 O. Ce sont maintenant les cultures de levure normalisées.
  4. Distribuer 100 ul de normalisée levure de type sauvage (BY4741) la culture de bien A1 d'une plaque de 96 puits. Distribuer 100 ul de jusqu'à sept souches supplémentaires aux puits B1-H1.
  5. Utilisez une pipette multicanaux pour distribuer 90 ul de dH 2 O stérile aux puits A2-H2 à A6-H6. Enfin, préparer une série de dilutions de 1:10 cultures de levures normalisées. Commencez par pipetage en série 10 ul de la colonne 1 à la colonne 2 avec une pipette multicanaux, et continuer à travers la plaque 96 puits jusqu'à six dilutions sont faites (ce est à dire, 10 0 à 10 -5).
  6. 5.2 Transfert ul de cultures de levure dilués dans une grille à l'aide d'un multicanalpipette sur YEPD milieux solides contenant chimique et la maîtrise du véhicule. Incuber les plaques à la température appropriée pour 24 à 48 h.
  7. Inspectez plaques et de comparer la sensibilité de certains mutants aux produits chimiques (par rapport à BY4741 commande). plaques d'image à 24 et 48 heures comme dans l'étape 3.2.
    REMARQUE: Bien que l'identification de plusieurs souches hypersensibles ontologies de gène apparenté ou fonctions prête confiance à la validité de l'écran, la transformation d'une souche de suppression hypersensible avec un plasmide contenant une copie de type sauvage du gène est nécessaire pour établir formellement qu'un gène suppression d'intérêt (et seconde mutations site pas cachés) provoque la sensibilité aux médicaments.

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Representative Results

En tant que validation de cette approche nous avons effectué un écran d'interaction chimique génétique représentant de l'agent chimiothérapeutique 5-fluorouracile (5-FU) en suivant le protocole décrit ci-dessus. 5-FU est connu de perturber la thymidylate synthase, ainsi que le métabolisme de l'ADN et de l'ARN 18. Les interactions génétiques chimiques de 5-FU sont bien étudiés et ont été étudiés par des techniques de levure code à barres de puces à ADN en utilisant les deux collections de suppression hétérozygotes et homozygotes 8,19. Ici, nous montrons que des résultats similaires peuvent être obtenus par quantification comparative de la taille des colonies mutantes.

Il est à noter que l'écran effectuée utilise la collection non essentiel délétion du gène haploïde. Ce type d'écran peut également être effectuée en utilisant des souches diploïdes, des mutants sensibles à la température, et des alleles hypomorphic, ce qui permet l'inclusion de mutants de gènes essentiels. Un avantage de l'utilisation de la collection de suppression haploïde est augmentée drogues sensitivlité de voies cibles, étant donné l'absence complète de produit de gène. Cependant, deux inconvénients importants sont que l'hypersensibilité de gène essentiel ne peut être interrogé, et la collection haploïde est sujette à des mutations spontanées suppresseurs qui sont sélectionnés pour sur plusieurs propagations. Cela peut conduire à la détérioration de la collection. Ainsi, il ya un commerce inhérente compromis entre l'intégrité et l'étendue de la gamme et la sensibilité à l'effet du médicament. Ceci doit être pris en considération et la collecte mutant le plus approprié choisi en fonction de l'application souhaitée.

Tout d'abord, la concentration sublétale appropriée de 5-FU à être utilisé dans l'écran a été déterminée comme étant de 10 uM par BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) des cellules croissant sur ​​l'augmentation de la concentration de 5-FU et d'évaluer visuellement la croissance de levure colonie ( Figure 3A). En variante, des résultats similaires peuvent être obtenus par croissance vousast dans des plaques de microtitrage de culture liquide et une surveillance fréquente de la densité optique des cultures en utilisant un lecteur de microplaque (figure 3B), comme indiqué par les groupes précédents 10,20.

Utilisation du Chanteur ROTOR, le DMA de levure a été reproduit au 1 536 colonies par la densité de la plaque sur milieux contenant 10 pM de 5-FU ou le diméthylsulfoxyde (DMSO) commande (figure 4A). Ces plaques ont été incubées pendant 24 heures à la température ambiante et imagés sur un scanner à plat. Mesure de la taille des colonies pour chaque mutant sur ​​les deux plaques et témoins a été réalisée en utilisant le moteur 15 d'analyse d'image Balony. Le logiciel Balony calcule le rapport de la taille des colonies sur le réseau expérimental par rapport au témoin. L'utilisateur est en mesure de fixer un seuil de rapport et si l'écran est effectuée au moins en triple une p-valeur sera assignée pour chaque mutant. Dans nos mutants d'écran représentatives qui ont montré un ratio de ≤0.8 étaient envisagered être coups. Les résultats de la quantification des colonies peuvent être présentés graphiquement en traçant le rapport de taille de chaque colonie sur l'axe des y et la délétion du gène commandée par la position de la matrice (figure 4B) ou le rapport (figure 4C) sur l'axe des x.

Malades synthétique / mutants létaux identifiés dans l'écran peuvent être regroupés sur la base de descriptions fonctionnelles en effectuant l'ontologie génique (GO) d'analyse. Il existe plusieurs outils publiquement disponibles pour l'analyse des listes de GO S. gènes cerevisiae; y compris Funspec 21, Base de données bioinformatique DAVID 22,23, et la base de données du génome de Saccharomyces (SGD) Go terme Finder 24. suppressions de gènes qui ont un ratio inférieur ou égal à 0,8 sur l'écran 5-FU ont été utilisés comme une liste d'entrée pour Funspec. Funspec accepte une liste de noms de gènes de levure systématique ou commune et émet des résumés des ontologies de gène, classifications fonctionnelles, localisation, complexes protéiques ainsi que otses classifications utiles qui sont enrichis dans cette liste. L'écran représentant effectué a montré un enrichissement d'ontologies pour le métabolisme de l'ARN, y compris ARNt vacille, la modification de l'uridine et de la machinerie de surveillance de l'ARN, et la réponse aux dommages de l'ADN (tableau 1). Ces résultats sont en accord avec les études antérieures qui ont montré 5-FU résultats de traitement dans l'accumulation des ARN non codantes polyadénylés, qui sont traités par le nucléaire Trf / Rrp6 / Air / Mtr4 Polyadénylation (TRAMP) exosomes 25. Ainsi, ces résultats sont en accord avec les écrans génétiques chimiques précédentes et le mécanisme connu de 5-FU bioactivité 8,19.

Comme avec tous les à haut débit approches génomiques fonctionnelles, il est nécessaire de valider les résultats. Pour valider mutants de levure interactions génétiques chimiques doivent d'abord être validées par PCR avec des amorces qui se hybrident à l'intérieur le promoteur du gène cible et kanMX cassette de disruption. Sélection de souches pour valideation est quelque peu arbitraires, des mutants mais priorisation qui montrent un phénotype forte et fonctionnellement groupe fournit un bon point de départ. Ensuite, l'hypersensibilité à un produit chimique est confirmée en utilisant des tests de repérage, une approche commune pour mesurer remise en forme de mutants de levure. A cette fin, des dilutions en série de souches de levure sont repérés dans une grille sur des milieux contenant la dose chimique approprié ainsi qu'un contrôle. A titre d'exemple, nous confirmons l'interaction génétique chimique de 5-FU avec des mutants Air1 trf5 et du complexe de TRAMP (figure 5). Ces gènes codent des composants de la exosomes nucléaire TRAMP. Nous notons que la souche rrp6, manque le noyau 3'-5 'exonucléase de TRAMP, a été perdu dans la collection de DMA haute densité de notre laboratoire. Sur l'obtention d'un mutant de rrp6 frais nous confirmons que rrp6 et 5-FU affichons aussi une interaction génétique chimique, établissant que l'activité de TRAMP est nécessaire de tolérer 5-FU. Ceci illustreque l'intégrité de grandes collections de suppression peut être compromise au fil du temps, ce qui rend l'entretien de DMA et la validation de déformation critique.

Notre écran a également identifié des mutants dans plusieurs enzymes de réparation d'ADN (y compris RAD50, RAD52 et Mre11) que le 5-FU sensibles. La notation de la taille des colonies a indiqué l'aptitude relative de ces mutants sur 10 pM de 5-FU en tant que 0,7, 0,65, et 0,42 par rapport au type sauvage. Sur la base de nos analyses de confirmation de repérage (figure 5), ces valeurs sont un sous-estiment probablement en raison de la plage dynamique limitée de la mesure de remise en forme par la taille de la colonie notation. Cela met en lumière une deuxième raison pour confirmer indépendamment interactions par des taches de série: l'ampleur de certaines interactions génétiques chimiques peut être sous-estimé dans l'analyse des données primaires. Nos résultats montrent que un écran génétique chimique basée sur la croissance réalisée avec ~ 4800 souche collection de suppression haploïde, en trois exemplaires, fournit résol adéquate ution d'isoler confiance interactions génétiques chimiques spécifiques.

Figure 1
Figure 1: Représentation schématique des. Chimiques interactions génétiques deletions de gènes qui se traduisent par une hypersensibilité aux perturbations chimiques permettent l'identification des processus biologiques ciblées par un produit chimique. Voies (A) convergentes peuvent être perturbées par soit délétion du gène (Genea) ou chimiquement (geneB). Individuellement, ces insultes cellulaires peuvent être tolérées en raison de la redondance inhérente dans les voies biologiques. Cependant, en combinaison viabilité des cellules est compromise entraînant soit un phénotype synthétique malade ou mortelle. (B) la suppression de gènes (Genec) critiques pour atténuer le stress induit chimiquement également provoquer une hypersensibilité et d'indiquer les voies biologiques perturbés par traitement chimique. jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Flux de criblage génétique chimique (A) Détermination de la dose sous-inhibitrice. Parentales des souches de levure sont cultivées jusqu'à la phase stationnaire, dilué à 1: 5000, et la propagation plaqué sur un milieu YEPD contenant des solides augmentation de la dose de produits chimiques. La concentration la plus élevée ne ayant pas d'inhibition de croissance supérieure à 10 à 15% est sélectionné pour le criblage contre la DMA. (B) de l'écran génétique systématique chimique: L'utilisation d'un réseau à haut débit épinglant robot de l'S. cerevisiae DMA est une réplique plaquée sur un support contenant la concentration appropriée du produit chimique d'essai. Les plaques sont incubées à température ambiante pendant 24 à 48 h, imagées, et la taille relative des colonies déterminées.ref = cible "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" = "_ blank"> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 :. Détermination de la concentration sous-inhibitrice. (A) La croissance de BY4741 cellules sur des supports solides contenant 5 fluouracil. Culture saturée BY4741 dilué à 1: 5000 et étalée sur des concentrations croissantes de 5-fluoro-uracile. Courbe (B) de croissance de BY4741 cellules dans des milieux liquides contenant du 5-fluorouracile. ~ 4 × 10 4 cellules ont été déposés en triple dans des concentrations croissantes de 5-FU et de DO ont été mesurées toutes les 10 min pendant 22 heures.

Figure 4
Figure 4: écran génétique chimique de 5-Fluorouracile. (A) S. cerevisiae tableau suppression de mutant répliqué sur gélose YEPD contenant 10 pM de 5-FU (à droite) et le contrôle de DMSO (à gauche). (B) Les résultats de Chemical écran génétique: la croissance relative des mutants sur 10 pM de 5-FU par rapport au témoin DMSO commandé par la position du tableau. (C) la croissance relative des mutants sur 10 pM de 5-FU par rapport au témoin DMSO ordonnée par rapport taille de la colonie. Un seuil de rapport de ≤0.8 est indiqué sur les deux graphiques. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Validation des interactions chimiques génétiques. Des dilutions en série de plusieurs souches mutantes isolées cultivées sur DMSO contrôle (A), 10 uM de 5-FU ( C).

GO Catégorie P-valeur Gènes identifiés (hits) # coups Nombre total de gènes dans GO Catégorie
ARNt modification uridine oscillation [GO: 0002098] 2,24 × 10 -6 SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 7 24
transcription, ADN-dépendante [GO: 0006351] 1,69 x 10 -5 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDD3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 Swi6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 32 540
Traduction [GO: 0006412] 4,28 x 10 -5 RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A 22 318
ARNt position de wobble uridine thiolation [GO: 0002143] 1,88 × 10 -4 NCS6 URM1 TUM1 3 5
régulation de la transcription, ADN-dépendante [GO: 0006355] 4,98 × 10 -4 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDD3 SWI3 KTI12 ASH1 Swi6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 27 507
protéines urmylation [GO: 0032447] 6,33 × 10 -4 NCS6 URM1 URE2 3 7
ARNm exportation du noyau en réponse au stress thermique [GO: 0031990] 2,04 × 10 -3 RPB4 NUP120 Nup133 3 10
polyadénylation dépendant nucléaire processus catabolique de la CUT [GO: 0071039] 2,04 × 10 -3 AIR1 TRF5 MPP6 3 10
processus métabolique tryptophane [GO: 0006568] 2,15 × 10 -3 TRP5 Trp3 2 3
Endosome tôt pour le transport Golgi [GO: 0034498] 2,75 × 10 -3 ENT5 TCA17 RCY1 3 11
ribosomal petite sous-unité de la biogenèse [GO: 0042274] 3,63 × 10 -3 SAC3 LTV1 RPS19B RPS19A 4 24
modification de la chromatine [GO: 0016568] 3,64 × 10 -3 LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDD3 ASH1 SGF11ELP3 9 114
Processus métabolique ATP [GO: 0046034] 4,23 × 10 -3 VMA2 VMA1 2 4
type V-proton-ATPase vacuolaire transport assemblage complexe [GO: 0070072] 4,23 × 10 -3 VMA21 VPH2 2 4
la localisation chromosomique [GO: 0050000] 4,23 × 10 -3 NUP120 Nup133 2 4
le transport de l'ARNm [GO: 0051028] 4,59 × 10 -3 DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 Nup133 6 58
acidification vacuolaire [GO: 0007035] 4,89 × 10 -3 VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 4 26
ARNr exportation du noyau [GO: 0006407] 5,63 × 10 <sup> -3 NUP120 Nup133 RPS19B RPS19A 4 27
endocytose [GO: 0006897] 6,57 × 10 -3 SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 Vps1 END3 7 82
la surveillance de l'ARNm nucléaire de maturation de l'ARNm extrémité 3 '[GO: 0071031] 6,92 × 10 -3 AIR1 MPP6 2 5
ncRNA polyadénylation [GO: 0043629] 6,92 × 10 -3 AIR1 TRF5 2 5
polyadénylation dépendant nucléaire processus catabolique snoRNA [GO: 0071036] 6,92 × 10 -3 AIR1 TRF5 2 5
polyadénylation dépendant nucléaire processus catabolique snRNA [GO: 0071037] 6,92 × 10 -3 AIR1 TRF5 2 5
processus de biosynthèse du tryptophane [GO: 0000162] 6,92 × 10 -3 TRP5 Trp3 2 5
insertion de la protéine dans la membrane du RE [GO: 0045048] 6,92 × 10 -3 Get1 GET4 2 5
la stabilisation de l'ARNm [GO: 0048255] 6,92 × 10 -3 ATP25 IGO1 2 5
réponse aux dommages de l'ADN relance [GO: 0006974] 7,05 × 10 -3 Mus81 RAD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 DEF1 MMS22 RAD52 MRE11 RAD50 RMI1 12 197
dans "> # coups
GO Catégorie P-valeur Gènes identifiés (hits) Nombre total de gènes dans GO Catégorie
polyadénylation dépendant nucléaire processus catabolique ARNr [GO: 0071035] 8,46 × 10 -3 AIR1 TRF5 MPP6 3 16

Tableau 1: L'ontologie génétique (GO) Caractérisation de 5-fluorouracile mutants sensibles.

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Discussion

Décrit ici est une approche pour générer des profils d'interaction chimiques génétique. La méthode est simple: en comparant les tailles des colonies de chacune des souches dans des collections complètes de deletion de gène en présence et en absence d'un produit chimique, tous les gènes nécessaires pour tolérer une insulte chimique sont identifiés. analyse de l'enrichissement d'annotation de la liste résultant de souches sensibles peut alors être utilisé pour fournir un aperçu d'un mode d'action des produits chimiques. Bien que ce protocole a été optimisé pour la levure bourgeonnante, il peut également être adapté pour être utilisé avec d'autres collections de suppression microbiennes disposés en réseau, comme le E. Keio collection coli, qui a été utilisé avec succès pour sonder des centaines de perturbations 26,27 cellulaire.

profilage chimique génétique dans la levure et d'autres organismes est bien établi. La majorité de ces études ont eu recours à des tests de compétition qui quantifient regroupées mutants de délétion travers l'analyse des microréseaux ou à haut débit Sequdes codes à barres des diffi- génétiques uniques. Cette approche a fait ses preuves dans la production de profils chimiques génétique robustes de grandes bibliothèques chimiques. La méthodologie décrite ici fournit une alternative utile pour l'analyse chimique et génétique de plus petits nombres de composés d'essai. Le test fournit une lecture simple qui est moins coût prohibitif de séquençage à haut débit ou l'analyse des microréseaux et ne souffre pas de biais de séquence. Bien que le protocole tel que décrit nécessite un instrument robotisé pour la manipulation de la colonie, de tels systèmes sont de plus en plus abordable et, alternativement le protocole pourrait être ajusté pour être utilisé avec des outils manuels d 'ancrage, dont des exemples ont été inclus dans la liste des matériaux.

Il est important d'être conscient des limites de cette approche et le profilage génétique chimique en général. Tout d'abord, le composé doit avoir un effet sur la viabilité de la levure bourgeonnante, ou l'organisme spécifique utilisé. Alors que de nombreux processus biologiques fondamentauxet fonctions sont bien conservées parmi les eucaryotes, les interactions génétiques chimiques spécifiques de l'organisme peuvent varier largement, de même que l'absorption de produits chimiques dans les cellules. Il convient également de noter que plusieurs souches de deletion ont été trouvés pour être sensibles à de multiples traitements médicamenteux 8. Il se agit notamment des gènes impliqués dans l'efflux de drogues, la fonction vacuolaire, et l'intégrité de la membrane. Il est important de prendre en considération la résistance multi-médicamenteuse lors de conclusions à l'égard de diriger et de modes d'action indirects.

L'écran décrit ici a été réalisée en utilisant la collection de suppression haploïde, une approche commune pour l'analyse chimique génétique dans la levure. Il ya maintenant plusieurs collections de mutants de levure disponibles pour de nouvelles aides dans la détermination du mode d'action d'un composé chimique. Cela comprend non seulement l'homozygote complète et collections de suppression diploïdes hétérozygotes, mais aussi mutants conditionnels de gènes essentiels sensibles à la température, le DecreASED Abondance par ARNm Perturbation (humide) de levure bibliothèque de mutants, et une histone H3 et H4 synthétique collection de mutants, qui pourrait être utilisée pour étudier épigénétiques thérapies moléculaires basés 3,4,28, Compte tenu de l'incroyable profondeur des outils disponibles, la facilité de la méthodologie, et l'insuffisance des infrastructures nécessaires, cette approche fournit un format accessible pour accéder à l'information fonctionnelle riche en ce qui concerne le mécanisme d'un composé chimique.

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Acknowledgments

Recherche dans le laboratoire CJN est soutenu par des subventions de fonctionnement du CRSNG, l'Institut de recherche Société canadienne du cancer (IRSCC), et la Fondation du cancer (Direction BC-Yukon) Canadian Breast.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast Extract BioBasic G0961 For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)
Tyrptone Powder BD Biosciences 211820 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)
Dextrose Anachemia 31096-380 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.
Agar A Bio Basic FB0010 For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)
G418 A.G. Scientific Inc. G-1033 Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. 
12-well plate Greiner Bio One 655180
5 ml culture tubes Evergreen Scientific 222-2376-080
10 cm Petri Dish VWR 25384-302
ROTOR HDA Singer Instruments  ROT-001 high-throughput microbial array pinning robot
PLUSPLATE© Petri Dish Singer Instruments  PLU-001 Box of 200 dishes
384 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-384 Box of 1,000 pads
1536 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-1536 Box of 1,000 pads
Alternative Pinning Tools:
Fully Automated Robtic Systems S&P robotics http://www.sprobotics.com Several automated colony handling robitic and imagining systems available.
Manual Pinning Tools V&P Scientific http://www.vp-scientific.com Handheld replication tools and accessories. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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