Rapid Identifikasjon av kjemiske Genetiske interaksjoner i

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dilworth, D., Nelson, C. J. Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (98), e52345, doi:10.3791/52345 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bestemme virknings av bioaktive kjemikalier er av interesse for et bredt spekter av faglige, farmasøytisk og industrielle forskere. Saccharomyces cerevisiae, eller spirende gjær, er en modell eukaryote som en komplett samling av ~ 6000 genet delesjonsmutanter og hypomorphic viktig genet mutanter er kommersielt tilgjengelige. Disse samlinger av mutanter kan bli brukt til å detektere systematisk kjemisk-genet interaksjoner, dvs. gener som er nødvendige for å tåle et kjemikalie. Denne informasjonen, i sin tur, rapporterer om den sannsynlige virkningsmåte av forbindelsen. Her beskriver vi en protokoll for rask identifisering av kjemiske-genetiske interaksjoner i spirende gjær. Vi viser fremgangsmåten ved hjelp av det kjemoterapeutiske middel 5-fluoruracil (5-FU), som har en veldefinert virkningsmekanisme. Våre resultater viser at det kjernefysiske TRAMP exosome RNA og DNA-reparasjonsenzymer er nødvendig for proliferasjon i nærvær av 5-FU, som er i samsvar med tidligere microarray basert strekkoding kjemiske genetiske tilnærminger og vissheten om at 5-FU negativt påvirker både RNA og DNA metabolisme. De nødvendige valideringsprotokoller av disse high-throughput skjermer er også beskrevet.

Introduction

De genetiske verktøy og ressurser tilgjengelig i modellorganisme Saccharomyces cerevisiae har aktivert storskala funksjonell genomikk studier som samlet gir ny innsikt i hvordan gener fungere som nettverk for å oppfylle kravene i biologiske systemer. Hjørnesteinen i disse verktøyene var samarbeids etableringen av et komplett sett av ikke-essensielle gendelesjoner av alle åpne leserammer i gjær 1,2. Et slående observasjon var at bare ~ 20% av gjær gener er nødvendig for levedyktighet når vokst som haploids under standard laboratorieforhold. Dette fremhever muligheten for en celle til buffer mot genomiske forstyrrelser gjennom utnyttelse av alternative biologiske trasé. Genetiske mutanter som er levedyktig individuelt, men dødelig i kombinasjon, signal tilkoblede eller konvergent parallelle biologiske stier og danne genetiske interaksjonsnettverk som beskriver biologisk funksjon. Med utvikling av betinget temperature-sensitive og hypomorphic alleler av essensielle gener teknologien ikke har vært begrenset til studiet av ikke-essensielle gener 3,4. Dette konseptet har blitt brukt på en genomisk skala produsere en upartisk genetisk interaksjon kart som illustrerer hvordan gener involvert i lignende cellulære prosesser klynge sammen fem.

Kjemiske forstyrrelser av genetiske nettverk ligne gendelesjoner (figur 1) 6. Spørring veksthemmende forbindelser mot en høy tetthet rekke sletting stammer for overfølsomhet identifiserer en kjemisk-genetisk interaksjon profil, dvs. en liste av gener som er nødvendig for å tåle kjemisk stress. Som genetiske interaksjoner, har store skjermer av kjemiske biblioteker vist at forbindelser med en lignende virknings klynge sammen syv. Derfor, ved å etablere den kjemiske-genetisk interaksjon profil av en sammensatt modusen for handling, kan utledes ved å sammenligne det med LARge-skala syntetiske genetiske og kjemiske genetisk interaksjon datasett 8,9.

Storskala kjemisk-genetiske skjermer, hvor score av forbindelser er avhørt, har blitt utført av strekkode konkurranse analyser. I denne fremgangsmåten, blir den samlede samling av delesjonsstammer dyrkes en masse i flere generasjoner i et lite volum av medium inneholdende en kjemisk. Siden hver sletting mutant havner en unik genetisk strekkode, er levedyktigheten / vekst av individuelle mutanter i bassenget av slette stammer sporet av microarray eller high-throughput sekvense 10.

Dedusere fitness ved å overvåke koloni størrelse på fysisk oppstilt mutanter dyrket på fast agar inneholder en bioaktive stoffet er også en effektiv metode for å identifisere kjemiske-genetiske interaksjoner 11,12. Denne tilnærmingen gir et kostnadseffektivt alternativ til konkurransebasert screening og er godt egnet for analyse av små bibliotek av kjemikalier.Skissert her er en enkel metode for å produsere en liste over kjemiske-genetiske interaksjoner i S. cerevisiae som ikke er avhengig av molekylærbiologi manipulasjoner eller infrastruktur. Det krever bare en gjær sletting samling, en robot eller manuell låsing apparat, og fritt tilgjengelig programvare for bildeanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Den generelle arbeidsflyten av denne prosedyren er skissert i figur 2.

1. Bestemmelse av vekst-inhiberende dose

  1. Utarbeidelse av gjær natten kultur
    MERK: gjær-ekstrakt-pepton druesukker vekstmedier (YEPD) som brukes i denne protokollen er en standard oppskrift 13.
    1. Strek ut BY4741 (Mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) celler på en YEPD agar plate og inkuberes i 48 timer ved 30 ° C eller inntil synlige kolonier dannes.
    2. Forbered over natten kulturer ved å inokulere 5 ml YEPD flytende medier i et sterilt kulturbeholder med en enkelt koloni. Inkuber over natten ved 30 ° C med kontinuerlig rotasjon eller rysting. Kulturen vil typisk nå metning ved morgen (~ 2 x 10 8 celler / ml).
  2. Solid agar media preparat som inneholder varierende kjemiske doser
    1. Forberede flere bestander avkjemikaliet som skal testes ved 100x ønskede sluttkonsentrasjon i et egnet oppløsningsmiddel.
      MERK: Effektive konsentrasjoner vil være avhengig av den kjemiske og må bestemmes empirisk. Det er derfor lurt å først teste en bred endelig konsentrasjonsområde, dvs. fra lav mikrometer til høy mM.
    2. For hver konsentrasjon av kjemikaliet som skal testes, aliquot 3 ml smeltet YEPD-agar til en steril flere dyrkningsrør. Sted i 55 ° C vannbad for å holde fra stivner.
    3. For hver konsentrasjon av kjemikaliet som skal testes legges 30 ul av 100x forbindelsen til smeltede media, vortex 2-3 sekunder for å blande og pipette 1 ml i hvert par av to brønner i en 12-brønns plate. Sørg for å inkludere et kjøretøy bare kontroll. La platene til å sette over natten ved romtemperatur. Kast noen ekstra media.
  3. Spre plating celler
    1. Inokulere 10 ml YEPD flytende medier med 2 mL av en mettet gjærkultur, dyrket over natten som beskrevet i trinn 1.1.2.
    2. Plate 25 ul av fortynnet gjærkultur pr brønn, fordeles jevnt ved hjelp av sterile glasskuler eller stang, og tillater platen å tørke under en flamme. Inkuber platen ved 30 ° C i 48 timer.
    3. Vurdere veksten av gjær (både totalt antall og størrelse av kolonier) på platene. Velge en sub-letal konsentrasjon av forbindelsen som hemmer ikke vekst av større enn 10% -15% for å utføre skjermen.

2. Systematisk Kjemisk Genetisk Screen

  1. Vedlikehold av sletting-mutant-array (DMA) og klargjøring av Source Plate
    1. For en detaljert beskrivelse på å konstruere sletting mutant arrays fra glyserol aksjer henvises til Baryshnikova et al. 14. Når delesjonsmutanter er blitt oppstilt med en tetthet på 384 kolonier per plate, kan DMA lagres i flere måneder ved 4 ° C. Replikert på YEPD-agar som inneholdt 200 ug / ml G418 som er nødvendig for å hindre kolonier fra å vokse inn i hverandreandre.
      Merk: Flere seriekjøringer bør unngås for å hindre tap av langsomt voksende stammer og redusere forekomsten av suppressor mutanter. Dette er spesielt relevant hvis opprettholde samlingene som haploids.
    2. Utføre alle replica-plating trinn ved hjelp en mikrobiell arraying robotsystem. Alternativt, manipulere kledd kolonier ved bruk av manuelle låsing verktøy.
      MERK: gjær sletting samlingen er tilgjengelig som haploids og diploidene fra flere kommersielle kilder og er vanligvis sendes som glyserol aksjer i 96-brønners plater.
  2. Kondense slettingen mutant matrise
    1. Forbered 250 ml YEPD-agar medium inneholdende 200 ug / ml G418. Den effektive konsentrasjon av G418 kan variere, og hvert parti skal bli testet empirisk.
    2. Forbered fem YEPD-agarplater ved å helle 50 ml YEPD-agar som inneholdt 200 ug / ml G418 pr plate. Gjør dette en dag før kondense matrisen og la platene avkjøles i romtemperaturlitteraturen overnatter på et flatt underlag.
      MERK: Fire plater vil være nødvendig for samlingen på 1536-belastning tetthet, er den femte plate strømmet som en ekstra.
    3. Fjern de 16 petriskåler inneholdende det muterte sletting samling ved en tetthet på 384 kolonier per plate og tillates å komme til romtemperatur (~ 1 time).
    4. Tørk eventuell kondens som har dannet på lokket av hver plate ved hjelp av en delikat oppgave tørke. Unnlatelse av å gjøre det kan resultere i vanndråper som blir avsatt på rekke og krysskontaminering av kledd mutanter.
    5. Ved hjelp av en mikrobiell rekke låsing robot, kondensere DMA fra en tetthet på 384 kolonier per plate (16 petriskåler) til 1536 kolonier per plate (4 petriskåler). Utføre dette slik at en st kolonien fra plate en pins til rad 1 kolonne 1 av kondensert array, til 1. koloni av plate 2 rad 1 kolonne 2, 1 st kolonien plate 3 til rad 2 og kolonne 1, og 1 st kolonien plate 4 til rad 2kolonne 2.
    6. Inkuber konsoliderte matrise ved 30 ° C over natten.
    7. Undersøke array for å sikre ensartet overføring av kolonier fra kildeplater. Det vil være flere tomme posisjoner, med hensikt innlemmet i rekken, som fungerer som en guide for å sikre at DMA er blitt kondensert riktig (Figur 4A).
      MERK: Disse vil være kildeplater for kopiplate på medier som inneholder testforbindelsen. En enkelt kilde plate kan brukes for flere byrdene. Også mange roboter vil ha deknings funksjonen, som vil sikre lignende tall av gjær blir overført hver gang.
  3. Replica plate sletting mutant matrise
    1. Forbered 700 ml kontroll (kjøretøy bare) og 700 ml eksperimentell media (kjemisk-holdig). Dette er nok for utførelse av analysen i triplikat (12 plater pr tilstand, pluss to ekstra).
    2. Hell 50 ml YEPD-agar som inneholdt forsøksstoff eller kontroll per plate. Tillate platene to avkjøles i romtemperatur over natten på et flatt underlag.
    3. Ved hjelp av roboten til replika-plate, inokulere DMA på tre sett av plater inneholdende kjemikalier i den eksperimentelt bestemte konsentrasjon, samt tre sett av plater inneholdende kjøretøykontroll. Inkuber platene ved romtemperatur i 24-48 timer.

3. Imaging Plater og dataanalyse

  1. Fjerne platene fra inkubator og tillate dem å komme til romtemperatur (~ 1 time) før bildebehandling. Dette vil forhindre at det dannes kondens mens bildebehandling platene.
  2. Bilde plater på 24 og 48 timer ved å fjerne lokket og plassere ansiktet ned på en flat seng skanner. Ta bilder med en oppløsning på minst 300 dpi. Alternativt kan du bruke et digitalt kamera for å ta bilder. Hvis du gjør dette, plasserer platene møte opp på en mørk bakgrunn og fjerne lokkene til bilde.
    MERK: Filformatet og posisjonering av plater vil avhenge av kvantifisering program som brukes. Utføre kvantifisering og sammenligning av matrisekoloni størrelser ved hjelp av en av flere åpen kildekode-programmer, inkludert Balony 15, SGAtools 16, og ScreenMill 17.

4. Validering av Screen

MERK: På dette stadiet flere gjær slettinger mutanter vil score så overfølsom for den kjemiske av interesse. Disse kjemiske-genetiske interaksjoner må neste valideres på to måter. Først identiteten til sensitive stammer bør bekreftes ved PCR. For det andre må kjemisk sensitivitet være uavhengig scoret. Skissert nedenfor er en kort protokoll for å utføre spotting analyser for å validere belastning overfølsomhet, en teknikk vanlig i gjær biologi.

  1. Serie ut ønskede (overfølsom) mutanter fra gjær sletting samling på YEPD-agar som inneholdt 200 ug / ml G418. Inkuber ved 30 ° C inntil kolonier dannet. Kontroller genotypen av stammen ved diagnostisk PCR med primere ifølgeprodusentens protokoll.
  2. Inokulere 5 ml av YEPD væske for hver stamme og inkuberes over natten ved 30 ° C med rotasjon eller rysting.
  3. Måle OD 600 og fortynne hver stamme til OD 600 = 1 i sterile dH 2 O. Disse er nå de normalisgjærkulturer.
  4. Dispensere 100 ul av normaliserte villtype gjær (BY4741) kultur til brønn A1 av en 96-brønns plate. Dispensere 100 mL av opptil syv ekstra påkjenningen til brønner B1-H1.
  5. Bruk en multikanalpipette å dispensere 90 mikroliter sterilt dH 2 O til brønnene A2-H2 gjennom A6-H6. Til slutt, fremstille en serie av 1:10 fortynninger av normaliserte gjærkulturer. Start ved serielt å pipettere 10 ul av en kolonne til kolonne 2 med en multikanalpipette, og fortsette på tvers av 96-brønns plate før seks fortynninger blir utført (dvs. 10 0 til 10 -5).
  6. Overfør 2-5 mL av utvannet gjærkulturer i et rutenett ved hjelp av en flerkanalspipettor på YEPD faste medier som inneholder kjemiske og kjøretøy kontroll. Inkuber platene ved den passende temperatur i 24-48 timer.
  7. Inspisere plater og sammenligne følsomheten av utvalgte mutanter til kjemisk (i forhold til BY4741 kontroll). Bilde plater på 24 og 48 timer som i trinn 3.2.
    MERK: Mens identifisering av flere hypersensitive stammer med tilhørende genet ontologier eller funksjoner gir tillit til gyldigheten av skjermen, er transformasjon av en overfølsom sletting stamme med et plasmid som inneholder en vill-type kopi av genet som kreves for å formelt etablere at et gen sletting av interesse (og ikke skjulte andre sete-mutasjoner) forårsaker narkotika følsomhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som en validering av denne tilnærmingen vi utført en representant kjemisk genetisk interaksjon skjermen på kjemoterapeutikum 5-fluorouracil (5-FU) etter ovenfor skissert protokollen. 5-FU er kjent for å forstyrre tymidylatsyntase, samt DNA- og RNA-metabolisme 18. De kjemiske genetiske interaksjoner av 5-FU er godt studert og har blitt undersøkt av gjær strekkode microarray teknikker ved hjelp av både heterozygote og homozygote sletting samlinger 8,19. Her viser vi at tilsvarende resultater kan oppnås ved å sammen kvantifisering av mutant koloni størrelse.

Det skal bemerkes at skjermen utføres benytter den ikke-essensielle haploid genet delesjon samling. Denne type skjerm kan også utføres ved hjelp diploide stammer, temperaturfølsomme mutanter, og hypomorphic alleler, slik inkludering av essensielle genet mutanter. En fordel å utnytte haploid sletting samlingen er økt narkotika sensitivligheten av målet trasé, gitt fullstendig fravær av genet produktet. Men to betydelige ulemper er at viktig genet overfølsomhetsreaksjon ikke kan spørres, og haploid samlingen er utsatt for spontane suppressor mutasjoner som er valgt for over flere propagations. Dette kan føre til forringelse av samlingen. Således er det en iboende avveining mellom integriteten og bredden av matrisen og følsomhet for legemiddeleffekt. Dette må tas i betraktning, og den mest passende mutant samling velges basert på den ønskede anvendelse.

Først passende sub-dødelige konsentrasjonen av 5-FU som skal brukes i skjermen som ble bestemt til å være 10 pM ved å dyrke BY4741 (Mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) celler med økende konsentrasjon av 5-FU og visuelt å vurdere gjærkolonivekst ( Figur 3A). Alternativt kan tilsvarende resultater oppnås ved å dyrke dereast i mikrotiterplater i flytende kultur og hyppig overvåking av kulturer optisk tetthet ved hjelp av en mikroplateleser (figur 3B), som skissert av tidligere grupper 10,20.

Ved hjelp av Singer ROTOR, ble gjæren DMA replikert på 1536 kolonier per plate tetthet på media inneholdende 10 uM 5-FU eller dimetylsulfoksyd (DMSO) kontroll (figur 4A). Disse plater ble inkubert i 24 timer ved romtemperatur og avbildes på en flat seng skanner. Kolonistørrelse måling for hver mutant både eksperimentelle og kontrollplatene ble utført ved hjelp av bildeanalyse Balony motoren 15. Den Balony programvare beregner størrelsen forholdet mellom kolonier på den eksperimentelle rekke forhold å kontrollere. Brukeren er i stand til å sette en terskelforholdet, og hvis skjermen er utført i det minste i triplikate en p-verdi vil bli tildelt for hver mutant. I våre representative skjerm mutanter som viste en ratio på ≤0.8 ble vurdereed å være treff. Resultatene av kolonien kvantifisering kan presenteres grafisk ved å plotte størrelsesforholdet for hver koloni på y-aksen og genet delesjon beordret av matrisen (figur 4B) eller forholdet (figur 4C) på x-aksen.

Syntetisk syk / dødelige mutanter identifisert i skjermen kan grupperes basert på funksjonsbeskrivelser ved å utføre genet ontologi (GO) analyse. Det er flere offentlig tilgjengelige verktøy for GO analyse av lister over S. cerevisiae gener; inkludert Funspec 21, DAVID Bioinformatikk Database 22,23, og Saccharomyces Genome Database (SGD) Go Term Finder 24. Gendelesjoner som hadde et forhold på mindre enn eller lik 0,8 i 5-FU-skjermen ble anvendt som et inngangsliste for Funspec. Funspec aksepterer en liste over systematisk eller vanlig gjær genet navn og utganger sammendrag av genet ontologier, funksjonelle klassifikasjoner, lokalisering, protein komplekser samt othennes nyttige klassifikasjoner som er beriket i denne listen. Representanten skjerm utført viste en berikelse av ontologier for RNA metabolisme, inkludert tRNA wobbles, uridin modifikasjon og RNA overvåking maskiner, og svar på DNA-skader (tabell 1). Disse resultatene er enig med tidligere studier som har vist 5-FU behandling resulterer i akkumulering av Polyadenylert ikke-kodende RNA, som behandles av den kjernefysiske Trf / Rrp6 / Luft / Mtr4 polyadenylering (TRAMP) exosome 25. Dermed disse funnene er i samsvar med tidligere kjemiske genetiske skjermer og den kjente mekanismen for 5-FU bioaktivitet 8,19.

Som med alle high-throughput funksjonelle genomiske tilnærminger er det nødvendig å bekrefte resultatene. Å validere kjemiske genetiske interaksjoner gjærmutanter bør først PCR-validert med primere som annealer innenfor målet genet promoter og KANMX avbrudd kassett. Utvalg av stammer for gyldigasjon er noe vilkårlig, men prioritere mutanter som viser en sterk fenotype og gruppen gir funksjonelt et godt utgangspunkt. Neste, er overfølsomhet overfor en kjemisk bekreftet ved hjelp spotting analyser, en felles tilnærming for å måle trenings av gjærmutanter. For dette formål blir seriefortynninger av gjærstammer oppdaget i et rutenett på media inneholdende det passende kjemisk dose, så vel som en kontroll. Som et eksempel, bekrefter vi den kjemiske genetisk interaksjon av 5-FU med Air1 og trf5 mutanter av den TRAMP kompleks (Figur 5). Disse genene koder komponenter av TRAMP atom exosome. Vi oppmerksom på at rrp6 belastning, mangler kjernen 3'-5 eksonukleaseaktivitet av TRAMP, gikk tapt i vårt laboratorium med høy tetthet DMA samling. På å skaffe en fersk rrp6 mutant vi bekrefte at rrp6 og 5-FU også vise en kjemisk genetisk interaksjon, å etablere at TRAMP aktivitet er nødvendig for å tåle 5-FU. Dette illustrererat integriteten av store delesjonssamlinger kan bli nedsatt over tid, noe som gjør korrekt DMA vedlikehold og strekk validering kritisk.

Vår skjermen også identifisert mutanter i flere DNA-reparasjonsenzymer (inkludert rad50, rad52 og mre11) som 5-FU sensitive. Scoring av kolonistørrelse indikerte den relative egnethet av disse mutanter på 10 mm 5-FU som 0,7, 0,65, og 0,42 sammenlignet med villtype. Basert på våre bekreftende spotting analyser (figur 5), disse verdiene er for lave sannsynlig på grunn av begrenset dynamisk område av trenings måling av kolonistørrelse scoring. Dette fremhever en annen grunn til å uavhengig bekrefte interaksjon ved serie spotting: omfanget av noen kjemiske genetiske interaksjoner kan undervurderes i primærdataanalyse. Våre resultater viser at et vekstbaserte kjemiske genetisk skjerm utført med ~ 4800-stamme haploid sletting samling, in triplo, gir tilstrekkelig resol ution å trygt isolere bestemte kjemiske genetiske interaksjoner.

Figur 1
Fig. 1: Skjematisk fremstilling av kjemi Genetiske Interactions Gene slettinger som resulterer i hypersensitivitet overfor kjemisk perturbasjon tillate identifisering av biologiske prosesser rettet av et kjemikalie. (A) Konvergent trasé kan bli forstyrret av enten genet sletting (Genea) eller kjemisk (geneB). Individuelt, kan disse cellulære fornærmelser tolereres på grunn av den iboende redundans i biologiske reaksjonsveier. Imidlertid, i kombinasjon celleviabilitet er kompromittert som resulterer i enten et syntetisk syk eller dødelig fenotype. (B) Sletting av gener (geneC) kritiske for formildende kjemisk indusert spenning også forårsake overfølsomhet og indikere biologiske pathways forstyrret ved kjemisk behandling. jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Arbeidsflyt for Chemical Genetisk Screen (A) Fastsettelse av sub-hemmende dose:. Foreldregjærstammer er vokst til stasjonær fase, fortynnet 1: 5000, og spredning belagt på solide YEPD medier som inneholder økende kjemisk dose. Den høyeste konsentrasjon med ikke mer enn 10 til 15% veksthemming er valgt for screening mot DMA. (B) Systematisk Kjemisk Genetisk Screen: Ved hjelp av en høy gjennomstrømming rekke låsing robot S. cerevisiae DMA er replika sådd ut på medium inneholdende den passende konsentrasjon av forsøksstoff. Platene ble inkubert ved romtemperatur i 24-48 timer, avbildes, og relativ kolonistørrelse bestemmes.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3 :. Fastsettelse av Sub-hemmende konsentrasjon. (A) Vekst av BY4741 celler på faste medier som inneholder 5-fluouracil. Mettet BY4741 kultur fortynnet 1: 5000 og sådd ut på økende konsentrasjoner av 5-fluorouracil. (B) Vekst kurve av BY4741 celler i flytende medier som inneholder 5-flurouracil. ~ 4 x 10 4 celler ble deponert i triplikat i økende konsentrasjoner av 5-FU og OD ble målt hvert 10. minutt i 22 timer.

Figur 4
Figur 4: Kjemisk Genetisk Screen of 5-Fluorouracil. (A) S. cerevisiae sletting mutant rekke replikert på YEPD agar inneholder 10 mm 5-FU (til høyre) og DMSO kontroll (venstre). (B) Resultater av kjemiske Genetisk Screen: Relativ vekst av mutanter på 10 mm 5-FU i forhold til DMSO kontroll bestilt av matrise posisjon. (C) Relativ vekst av mutanter på 10 mm 5-FU i forhold til DMSO kontroll bestilt av koloni størrelse ratio. Et forhold terskelen ≤0.8 er indikert på begge grafer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Validering av kjemiske Genetiske interaksjoner. Serielle fortynninger av flere isolerte mutantstammer dyrket i DMSO kontroll (A), 10 uM 5-FU ( C).

GO Kategori P-verdi Gener identifisert (treff) # treff Antall av gener i GO Kategori
tRNA slingre uridine modifikasjon [GO: 0002098] 2.24 × 10 -6 SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 Tum1 ELP3 7 24
transkripsjon, DNA-avhengig [GO: 0006351] 1.69 × 10 -5 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 pop2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 32 540
oversettelse [GO: 0006412] 4,28 × 10 -5 RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A 22 318
tRNA slingre posisjon uridin thiolation [GO: 0002143] 1.88 × 10 -4 NCS6 URM1 Tum1 3 5
regulering av transkripsjon, DNA-avhengig [GO: 0006355] 4,98 × 10 -4 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 pop2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 27 507
protein urmylation [GO: 0032447] 6,33 × 10 -4 NCS6 URM1 URE2 3 7
mRNA eksport fra kjernen som respons på varmestress [GO: 0031990] 2,04 × 10 -3 RPB4 NUP120 NUP133 3 10
atom polyadenylering avhengig CUT katabolsk prosess [GO: 0071039] 2,04 × 10 -3 Air1 TRF5 MPP6 3 10
tryptofan metabolske prosessen [GO: 0006568] 2.15 × 10 -3 TRP5 TRP3 2 3
tidlig endosomet til Golgi transport [GO: 0034498] 2,75 × 10 -3 ENT5 TCA17 RCY1 3 11
ribosomal liten subenhet biogenese [GO: 0042274] 3,63 × 10 -3 SAC3 LTV1 RPS19B RPS19A 4 24
kromatin modifikasjon [GO: 0016568] 3,64 × 10 -3 LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ASH1 SGF11ELP3 9 114
ATP metabolske prosessen [GO: 0046034] 4,23 × 10 -3 VMA2 VMA1 2 4
vacuolar proton-transport av V-type ATPase kompleks sammenstilling [GO: 0070072] 4,23 × 10 -3 VMA21 VPH2 2 4
kromosom lokalisering [GO: 0050000] 4,23 × 10 -3 NUP120 NUP133 2 4
mRNA transport [GO: 0051028] 4,59 × 10 -3 DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 6 58
vacuolar forsuring [GO: 0007035] 4,89 × 10 -3 VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 4 26
rRNA eksport fra kjernen [GO: 0006407] 5.63 × 10 <sup> -3 NUP120 NUP133 RPS19B RPS19A 4 27
endocytose [GO: 0006897] 6.57 × 10 -3 SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 End3 7 82
kjernekraft mRNA overvåking av mRNA 3'-ende behandling [GO: 0071031] 6.92 × 10 -3 Air1 MPP6 2 5
ncRNA polyadenylering [GO: 0043629] 6.92 × 10 -3 Air1 TRF5 2 5
atom polyadenylering avhengig snoRNA katabolsk prosess [GO: 0071036] 6.92 × 10 -3 Air1 TRF5 2 5
atom polyadenylering avhengig snRNA katabolsk prosess [GO: 0071037] 6.92 × 10 -3 Air1 TRF5 2 5
tryptofan biosyntetiske prosess [GO: 0000162] 6.92 × 10 -3 TRP5 TRP3 2 5
protein innsetting i ER membran [GO: 0045048] 6.92 × 10 -3 Get1 GET4 2 5
mRNA stabilisering [GO: 0048255] 6.92 × 10 -3 ATP25 IGO1 2 5
svar på DNA-skader stimulus [GO: 0006974] 7,05 × 10 -3 MUS81 RAD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 dEF1 MMS22 RAD52 MRE11 RAD50 RMI1 12 197
i "> # treff
GO Kategori P-verdi Gener identifisert (treff) Antall av gener i GO Kategori
atom polyadenylering avhengig rRNA katabolsk prosess [GO: 0071035] 8,46 × 10 -3 Air1 TRF5 MPP6 3 16

Tabell 1: Gene ontologi (GO) Karakterisering av 5-Fluorouracil Sensitive Mutants.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Skissert her er en tilnærming for å generere kjemiske-genetisk interaksjon profiler. Fremgangsmåten er enkel: ved å sammenligne koloni størrelser av hver stamme i omfattende genet delesjons samlinger i nærvær og fravær av en kjemisk, er alle gener nødvendige for å tolerere en kjemisk skade identifisert. Stempler anrikning analyse av det resulterende listen av følsomme stammer kan deretter brukes til å gi innsikt i en kjemikalier virkningsmåte. Mens denne protokollen har blitt optimalisert for spirende gjær, kan det også være tilrettelagt for bruk med andre oppstilt mikrobielle sletting samlinger, for eksempel E. coli Keio kolleksjonen, som har vært brukt med hell for å sondere hundrevis av mobilnettet forstyrrelser 26,27.

Kjemisk-genetisk profilering i gjær og andre organismer er godt etablert. De fleste av disse studiene har stolt på konkurranse analyser som kvantifisere sammenslåtte delesjonsmutanter gjennom microarray analyse eller høy gjennomstrømming sequtene av unike genetiske strekkoder. Denne tilnærmingen har vist seg vellykket i å produsere robuste kjemiske-genetiske profiler av store kjemiske biblioteker. Den metodikk som er beskrevet her gir et nyttig alternativ til kjemisk-genetisk analyse av et mindre antall av testforbindelser. Analysen gir en enkel avlesning som er mindre enn kostnaden prohibitive high-throughput-sekvensering eller mikromatriseanalyse og ikke lider av sekvensen skjevheter. Mens protokollen som skissert krever en robot instrument for koloni manipulasjon, er slike systemer blir mer overkommelig, og vekselvis protokollen kan justeres for bruk med manuelle låsing verktøy, eksempler som er tatt med i listen over materialer.

Det er viktig å være klar over begrensningene ved denne tilnærmingen og kjemisk genetisk profilering generelt. For det første må forbindelsen ha en effekt på levedyktigheten i spirende gjær, eller den spesifikke organisme utnyttes. Mens mange grunnleggende biologiske prosesserog funksjoner er godt bevart blant eukaryoter, kan organisme spesifikke kjemiske genetiske interaksjoner variere mye, så vil opptaket av kjemikalier inn i cellene. Det skal også bemerkes at flere delesjonsstammer har blitt funnet å være følsomme for flere legemiddelbehandlinger 8. Disse inkluderer gener involvert i legemiddelutstrømningen, vacuolar funksjon, og membran integritet. Det er viktig å ta hensyn til multimedikamentresistens ved å lage konklusjoner med hensyn til direkte og indirekte virkningsmåter.

Skjermen er beskrevet her, ble utført ved anvendelse av haploid sletting samling, en vanlig metode for kjemisk-genetisk analyse i gjær. Det finnes nå flere samlinger av gjærmutanter tilgjengelige for ytterligere å hjelpe til ved bestemmelsen av en kjemisk forbindelse er virkningsmåte. Dette omfatter ikke bare fullstendig homozygot og heterozygot diploide sletting samlinger, men også betinget temperatursensitive essensielle genet mutanter, den Decréased Overflod av mRNA forstyrrelse (fuktig) gjær mutant bibliotek, og en syntetisk histon H3 og H4 mutant samling, som kan brukes til å undersøke epigenetiske basert molekylær terapi 3,4,28, Gitt den utrolige dybden av verktøyene tilgjengelig, den enkle metodikk, og den begrensede infrastruktur som er nødvendig, gir denne metoden et format for å få tilgang rik funksjonell informasjon med hensyn til virkningsmekanismen av en kjemisk forbindelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forskning i CJN lab er støttet av driftstilskudd fra NSERC, den kanadiske Cancer Society Research Institute (CCSRI), og den kanadiske Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast Extract BioBasic G0961 For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)
Tyrptone Powder BD Biosciences 211820 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)
Dextrose Anachemia 31096-380 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.
Agar A Bio Basic FB0010 For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)
G418 A.G. Scientific Inc. G-1033 Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. 
12-well plate Greiner Bio One 655180
5 ml culture tubes Evergreen Scientific 222-2376-080
10 cm Petri Dish VWR 25384-302
ROTOR HDA Singer Instruments  ROT-001 high-throughput microbial array pinning robot
PLUSPLATE© Petri Dish Singer Instruments  PLU-001 Box of 200 dishes
384 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-384 Box of 1,000 pads
1536 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-1536 Box of 1,000 pads
Alternative Pinning Tools:
Fully Automated Robtic Systems S&P robotics http://www.sprobotics.com Several automated colony handling robitic and imagining systems available.
Manual Pinning Tools V&P Scientific http://www.vp-scientific.com Handheld replication tools and accessories. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
  2. Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
  3. Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
  4. Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
  6. Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
  7. Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
  8. Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
  9. Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
  10. Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
  11. Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
  12. Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10, (6), (2010).
  13. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
  14. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
  15. Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
  16. Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
  17. Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
  18. Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
  19. Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
  20. Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
  21. Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
  22. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
  24. Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
  25. Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
  27. Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
  28. Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics