분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

1Department for Cardiology, Angiology and Pneumology, Otto von Guericke University Magdeburg, 2Herzzentrum Dresden, Universitätsklinikum an der Technischen Universität Dresden, Technische Universität Dresden, 3Department of Public Health and Primary Care, University of Cambridge
Published 12/27/2014
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Immunology and Infection

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Summary

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Wagner, M., Koester, H., Deffge, C., Weinert, S., Lauf, J., Francke, A., et al. Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes. J. Vis. Exp. (94), e52347, doi:10.3791/52347 (2014).

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Abstract

Protocol

이 연구는 동물 보호 (24D-9168.11-1 / 2008-24)에 대한 독일 법률 제 8 항에있어서, 작센 및 작센 - 안할 트, Regierungspraesidium 드레스덴 / 할레의 국가의 허가 하였다.

1 세포 분리

대퇴골과 경골의 1.1 준비

  1. 폐쇄함에 이소 플루 란을 기화 5 % 이소 플루 란을 이용하여 농도 마우스를 마취. 마우스가 3 초 동안 이동을 중지 한 후, 자궁 경부 전위를 수행합니다.
  2. 에탄올 (96 %)로 두 다리를 소독. 피부와 근육을 제거하고 멸균 메스와 뼈를 분리합니다.
    1. 사타구니 피부 절개로 시작하고 내과쪽으로 절개를 확장하고 낮은 송아지 주위 피부의 원형 절개를 수행합니다. 근위을 벗겨 완전히 다리의 피부를 제거합니다.
    2. 날카로운 메스와 대퇴골에서 대퇴사 두근 근육을 분리, 전방 peroneus 모두 제거과 비복근의 근육 그룹 및 위치 및 인대를 해부하여 고관절에서 다리 관절이 어긋나 다.
    3. 전방 시작하고 신중하게하여 관절을 disarticulating, 다리를 회전하고 인대에 병행하여 관절 주위를 진행합니다.
  3. 무균 세포의 준비를 보장하기 위해 90 초 최소 96 % 에탄올로 대퇴골과 경골을 씻으십시오. 에탄올 나머지 씻어 멸균 PBS로 세척 과정을 계속합니다.
    참고 : 모든 후속 단계는 오염을 방지하기 위해 멸균해야합니다.

골수의 1.2 수확

  1. 대퇴골과 경골의 축에 접근하도록 미세 가위 뼈 각각의 근위 및 원위 단부를 잘라. 이 뼈는 쉽게 깰 때문에,이 단계에주의하십시오.
  2. 따뜻한 배지로 뼈에 플러시 (M199 + 10 % 소 태아 혈청 (FCS)을, + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신). 멸균 28 G 바늘, 1 ML의 주사기, 10 ~ 15 ml의 매체 당 사이에 사용린스 뼈.
  3. 미세 집게로 뼈를 잡고는 반투명를 꺼질 때까지 하나 하나 씻어. 조심스럽게 세포 스트레스를 최소화하기 위해 주사기 플런저의 단부에 압력을 적용한다.
  4. 70 ㎛의 나일론 웹을 통해 골수를 여과하고 여액을 수집. 골수의 최대 양을 추출하려면, 근위 끝에서 반복 씻어.
  5. PBS와 체를 씻어 여과 액을 수집합니다. 조심스럽게 파편과 부드러운 교반과 피펫 팅에 의해 세포 대기업을 제거.

1.3 재배

  1. RT에서 10 분 동안 250 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 매체의 약 25 ml의 세포를 재현 탁. 한 번 반복합니다.
  2. 2 차 세척 공정 후, 6 ㎖의 배지에서 세포를 재현 탁. 트리 판 블루 50 μL와 세포 용액 50 μl를 섞는다. 광학 현미경 하에서 계수 챔버에서 세포를 카운트. (C)의 수를 계산이 식을 이용하여 용액의 ELL :
    식 (1)
  3. 플레이트의 저부에 영구 부착을 방지하기 위해 6 웰 초저 부착면 플레이트상에서 세포를 시드. 물론 당 최대 6 ml로 1 ㎖ 당 10 6 세포의 농도를 사용합니다.
  4. 세포 분화를 촉진하기 위해 20 NG / ㎖의 M-CSF와 서스펜션을 보완.
  5. 배양은 37 ℃에서 5 일간 세포를 5 % 이산화탄소 및 매일 관찰한다.

세포의 1.4 수확

주의 :이 단계는 얼음을 수행하여야한다. 따라서 1.4.1 또는 1.4.2 중 하나를 진행합니다.

  1. 이 시점에서, 그들은 초저 부착면 판하더라도 배양 플레이트에 부착 차별화 된 대 식세포를 포함한 전체 배양 수확.
    1. 부드러운 피펫 팅하여 전체 문화를 수확, 4 ° C PB 용액으로 분리S, 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 2 mM의 EDTA. 잘 모르는 경우 현미경으로 확인 - 플레이트가 부착 세포를 나머지의 명확한 때까지 반복합니다.
  2. 다른 방법으로, 주로 단핵 세포를 포함하는 현탁액 세포와 상층 액을 수확하여 대 식세포를 폐기합니다.
    1. EDTA가없는 PBS 용액 및 0.5 % BSA와 함께 비 - 부착 세포 수확. 온화하게 대 식세포를 빠지 방지하기 위해 너무 많은 힘을 가하지 마십시오.

1.5 FACS 분석 (선택 사항)

참고 : MACS의 사용에 의해 CD117 + stem- 및 전구 세포의 세포 현탁액을 고갈시킬 수있다. 이 절차에 대한 제조 업체 프로토콜을 사용합니다.

  1. 하나가 1.4.1 또는 1.4.2 단계에 따라 세포를 수확.
  2. 4 ° C에서 10 분 동안 250 XG에서 세포를 원심 분리기 다시이 단계를 반복합니다.
  3. FACS (b)의 300 μL에 재현 탁 적어도 25 만 셀프로브 당 uffer.
  4. 96 웰 플레이트 (물론 당 30 μL)에 세포 솔루션을 전송합니다.
  5. 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기.
  6. 상층 액을 제거하고 각 웰 (사용 제조 업체 희석)에 항체의 25 μl를 추가합니다.
  7. 단계 후 세포 표현형에 대한 제조 업체 프로토콜 다음 항체 (와 세포 1.5.1-1.5.6. 단핵구 / 대 식세포의 식별을 위해 일반적으로 사용되는 마커는 CD11b, F4 / 80 (그림 3), CD115을 포함 얼룩 (그림 2), GR- 1.
    참고 : 셀 솔루션의 또 다른 설명은 CD4, CD8a, 중 CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G 및 CD192 같은 마커를 사용하는 것이 좋습니다. 휴대 특성은 이전 12 설명했다.
  8. 4 ° C에서 20 분 동안 프로브를 품어.
  9. 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 250 XG에 프로브 및 FACS 완충액 200 μL에 재현 탁은. 반복 일두 번 단계입니다.
  10. FACS 튜브에 프로브를 전송하고 FACS 분석 (12)을 수행합니다.
  11. 세포 분화를 분석 일 0, 3 및 5에서 FACS 분석을 수행한다 (12).

2. 꼬리 정맥 주입

2.1 준비

  1. 약 10 분 동안 37 ℃에서 가열 플레이트에 동물을 따뜻하게. 과열 징후를 인식 할 수 승온하면서 동물을 관찰한다.
  2. NaCl을 150 μL에, 단계 1.1 및 1.4에 고립 된 단핵 세포를 재현 탁하고, 30G 바늘을 1 ml의 인슐린 주사기로 세포를로드합니다. 가볍게 모든 단핵 세포가 주입 보장하기 위해 주사기를로드하기 전에 솔루션을 소용돌이. 항상 열 매개 부착 및 단핵구의 활성화를 방지하기 위해 얼음에 세포를 처리합니다.

2.2 금지

  1. 정맥 주사에​​ 대한 마우스를 선택할 때 우리에 다른 쥐를 방해하지 마십시오.
  2. 제한 수단에 마우스를 놓습니다. 너무 많은 홍보를하지 마십시오essure는 뒷다리에주의합니다. (그림 4)
    참고 : 다른 방법으로, 동물의 스트레스없는 취급을 보장하기 위해 전신 마취를 사용합니다.
  3. 마우스가 제한 수단을 닫기 전에 호흡 공간이 있는지 확인하십시오.

2.3 주입

  1. 소독제로 주사 부위를 소독. 마우스의 꼬리에 스프레이를 최소한 1 분간 방치 할 수 있습니다.
  2. 혈관의 가시성을 위해, 주입 부위의 위 측면 꼬리쪽으로 약간 힘을인가하여 꼬리 정맥 혈류를 중지.
  3. 주입하기 전에 꼬리를 90도 돌립니다. (그림 5)
  4. 45도 각도로 주입한다. 천천히 주입 및 g 당 최대 5 μl의 해치는 동물을 피하기 위해.
  5. 실패한 주입의 표시이다 물집이 있으면 즉시 중단하고 더 근접하게 주사를 반복합니다.
  6. 부드러운 P를 적용하여 사출 측 지혈약 1 분 동안 ressure.
  7. 프로 시저의 끝에서, 리 트랙터를 열고 그 장에 ​​마우스를 배치했다.
  8. 20 분은 동물이 주입에 의해 피해를 입지되지 않아 흉골 드러 누움이 유지되도록하는 마우스를 관찰합니다. 마우스가 충분한 의식을 차릴 때까지 관찰의 시간을 연장합니다. 완전히 회복 된 후에 만​​ 다른 동물의 회사에 마우스를 돌려줍니다.

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Representative Results

뮤린 골수로부터 추출 된 세포 용액은 다양한 종류의 세포로 구성된다. 주요 종류의 세포는 림프구, 과립구와 단핵구 수 있습니다. 세포 유형은 분화 5 일 후에 수확 네이티브 현탁 세포도 1에 도시되어 크기 및 입도 (granularity)에 의해 추정 될 수있다. 재배 동안 이동 셀룰러 조성합니다. 그러나 인구의 정확한 분류는 세포 마커의 독특한 표현에 의존해야합니다.

MPS-시스템의 셀들을 식별하는 데 가장 중요한 마커는 M-CSF 수용체로서 작용하고 특별히 전구 세포, 단구, 대 식세포 및 단핵구상에서 발현되는 CD115이다. 따라서, MPS-독특한 서브 세트를 식별하는 데 사용되지 않을 수도 있지만 확실 단핵구 / 대 식세포로 분화 구동 세포의 절대 양을 추정 할 수있다. 다른시 CD115 발현의 타임 라인은 그림 2를 참조하십시오entiation.

성숙 마커 F4 / 80 청소년 단핵구, 성숙한 단핵 세포, 대 식세포를 구별하는 데 유용합니다. 대 식세포는 마커에 대한 부정적 단핵 세포 전구 세포를, 청소년에 비해 F4 / 80의 강한 표현을 보여줍니다. 성숙한 단핵구는 F4 / 80의 중간 표현을 보여줍니다. CD115 및 F4 / 80 마커의 조합은 따라서 세포 분화 (그림 3 참조) 정량화 및 모니터링을위한 실현 가능한 방법을 나타냅니다.

CD115 및 F4 / 80의 조합은 종래의 세포 배양 애플리케이션 루틴 감시 및 품질 관리를 위해 충분하다. 배양 5 일째 골수 유래 단핵구의 더욱 상세한 검사는 말초 혈액 단핵 세포 (12)의 것과 일치 그들의 구조적 및 기능적 성질을 확인한다.

그것은 꼬리에 긴장을 피하고, 제한 수단에 조심스럽게 마우스를 해결하는 것이 중요합니다. freedo 제한주사를 용이하게하기 위해, 호흡 저해하지 않고 최대한 이동 m.

그림 1
그림 1. 왼쪽 패널 :. 문화의 날 (1)에서 세포 유형의 구성 세포 유형은 림프구, 단핵구와 과립구를 포함한다. 오른쪽 패널 : 재배 동안 이동 셀룰러 조성합니다. 셀 인구는 단핵 세포와 대 식세포를 포함한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
분화 동안 CD115의 발현 그림 2. 타임 라인. 모든 세포의> 95 %를 주는 광대 한 것을 나타내는, 차별화 5 일 후 긍정적 인 CD115된다 세포의 대부분은 단핵구 또는 대 식세포 중 하나입니다. 분류가 세포의 크기와 입도,하지만 특정 세포 마커가 더 신뢰할 수있는 기반으로 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
.의 단핵구 / 대 식세포의 성숙 마커 F4 / 80 일 5 식 증가 그림 3. : 단핵 세포 표현형과 일치 중간 F4 / 80 식을 가진 인구의 모양을합니다. 7 일 :. 대식 세포의 성숙과 일치 F4 / 80 식의 오른쪽 시프트 참고 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

전자 4 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 52347 / 52347fig4highres.jpg "/>
그림 4. 마우스, 후 조심스럽게 마우스를 억제. 꼬리 정맥 주입에 대한 제한 수단에 고정 된 정맥 등의 측면에서 볼 때까지 꼬리를 90도 회전합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
마우스 꼬리도 5의 개략적 인 단면도가. 포토 마우스 꼬리 혈관 내에서의 위치를 도시한다. 동맥 (빨간색)이 복부와 등의 측면에 위치하며, 정맥 꼬리의 측면에있는된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리는 골수로부터 단핵구 뮤린 다량 격리시키는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명한다. 단구 수율 X10 6 5 1.4을 수득 말초 혈액을 사용하는 다른 프로토콜에 비해, 우리는 단일 공여자 마우스에서 11 × 106 ± 3 × 106 단핵구 높은 수율을 얻을 수있다.

이 방법의 문제점을 고려할 때, 비 멸균 조건 하에서 작업 할 때 오염 가능성을 언급하는 것이 중요하다. 헹굼 다음 세척 단계가 제대로 따라 박테리아 및 진균에 의한 오염 가능성이없는 경우이다. 또한, 골수 과립구, 림프구 및 적혈구 세포를 포함 이종 세포 현탁액로 구성되어 있습니다. 일반적으로 인해 이들 세포 성장 인자의 부족 일 2와 3 사이의 재배 사라진다. 성장 인자 분화 구동 후 마크로파지는 오염의 주요 원인이다. T를 유지대 식세포 및 단핵 세포의 분화를 최소화하기 위해, 초저 부착 플레이트의 사용과 전술 한 세척 단계가 중요 낮은 식세포 그 번호.

이는 배타적 단핵구 특이 마커를 식별하는 것이 곤란하다. 마커 사이의 간섭은 하나 이상의 표지의 사용을 필요로하고, 가변성은 세포 현탁액을 분석하는 입도 및 세포의 크기가있다. 마커 및 그림 1-3과 같이 설명은 문화의 대표적인 세포 유형에 대한 좋은 대안이다. 그것은 일 5. 따라서 그것은 CD115 및 F4 / 80과 같은 다른 마커를 사용하는 것이 특히 중요하다 후, 다양한 유형의 세포를 구별하기 어려울 수있다.

접착력이없는 조건에서 골수 세포의 팽창을 고려하면, 마크로파지 분화는 연장 될 수 있으며, 미분화 단핵구 축적 할 수있다. 대식 세포의 분화는 오염을 나타내고, 그러나, 뒤단지 문화에서 비 접착 세포를 수확하는 동안도 초저 부착 재배 표면에 자신의 밀착성에 전자, 그들은 쉽게 폐기 할 수있다. 이전 실험 1,3에서 대 식세포에 의한 오염은 심각한 임상 적 부작용에지도 않았습니다. 장기와 세포 이식 후 쥐의 근육의 조직 학적 정밀 검사 주입 대 식세포는 비장, 간이나 폐 등의 장기에 동화 것으로 나타났다. 이들 기관에서 대 식세포의 동화는 쥐에서 더 관찰 임상 효과를 입증하지 않습니다. 이러한 대 식세포에 의해 유발 분자 메커니즘은 더 연구에 대한 흥미로운 질문이 될 수 있습니다.

전신적으로 적용될 때 단핵구 대 식세포뿐만 아니라, 특히, 말초 동맥 질환 동맥 형성에 영향을 미친다. 이러한 색전증 또는 대규모 전신 염증 임상 부작용은 더 이상 250 만 단핵 세포를 주입 한 후 관찰되지 않을 수 있지만,이 세포는 염증과 포를 트리거 할 수 있습니다에 잠재적 인 심각한 전신 효과가 발생합니다. 인간 시험에서, 이러한 효과는 임상 적 중요성을 가질 가능성이 높다. 동맥 신생의 트리거는 종양의 성장 또는 당뇨 망막 병증, 미래의 연구에서 탐구해야 주입 셀 솔루션 등 가능한 전신 효과에 영향을 줄 수 있습니다.

이전 서적 골수 단핵구의 속성 말초 혈액 세포로부터 분리 다를 수있는 이유를 설명 말초 혈액 - 골수 유래 단핵구의 특성 차이를 설명하는 구.

단리의 방법뿐만 아니라 임상 적 관심사이다. 혈액을 그리기 대신에 인간의 골수를 추출하는 임상 의학의 맥락에서 더 실용적입니다. 그것은 동물의 복지를 돌봐하고 필요한 경우 진통제를 적용하는 것이 중요하다. 정맥 내 주사의 경우, 동물과 동시에 주사기를 모두 처리 실천하는 것이 중요하다. 하나의 애니 경우말은 여러 주사를 겪고, 정맥의 품질과 꼬리의 피부는 고통.

이러한 단점에도 불구하고,이 방법은 행동과 단핵 세포의 특성을 연구하는 데 매우 유용하다. 죽상 동맥 경화증, 면역학 또는 염증의 분야에서 실험이 방법 혜택을 누릴 수 있습니다. 만 30 분은 6 자 초저 부착 표면 접시에 세포의 파종에 골수를 추출에서 필요합니다. 이 프로토콜의 높은 수율이 도너 세포로서 필요한 동물의 수를 최소화하기 때문에 윤리적 문제가 최소화된다. 이 새로운 방법은 단핵구와 관련된 많은 연구에 도움이 될 것입니다.

우리는 단핵 세포의 이식을 통해 담보 혈관 성장 치료 확대에 초점을 맞추고있다. 하나의 요인은 동맥 신생의 증가가 생성 한 혼합 된 결과 13, 14에 대한 접근 왜이 과정의 인성 특성을 설명 할 수 있습니다. 이에하게되었다세포 기반 치료법​​ 비롯하여 조사. 자가 골수 유래 줄기 세포 및 선조 세포는 세포 이식에 잠재적으로 식별되고 있지만 임상 적 이점은 보통 15보고되었다. 투여, 분리 방법 및 투여 경로에 대한 연구 외에, 더 많은 연구가 여전히 최적 셀 타입을 결정하기 위해 필요하다. 자가 세포 이식의 단점은 선천성 및 / 또는 적응 면역 반응을 활성화하기 위해 자신의 무능력이 될 수 있으며, 둘 동맥 형성에 중요하다. 로컬 염증의 증가는 동맥 신생 16 가장 자극을 나타낼 수있다.

전신성 약물 투여가 요구되는 경우에는 정맥 내 주사의 단핵구는 마우스 모델 내의 세포 이식을위한 일반적인 방법이다. 때문에 전신 효과, 부작용도 발생할 수있다. 정맥 주사의 대상이되어 있는지 확인합니다. 그것은 특히 심하게 착색 된 마이크를 주입 동맥과 정맥을 혼동하는 것이 일반적이다전자. 동맥 주사는 순환의 전신 문제로 이어질 색전을 일으킬 수 있습니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well-ultra-low-attachment plate Corning Incorporated, NY, USA 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice  Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine GE Healthcare, Freiburg, Germany Fraction V, pH 7.0
Canules B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 28G, 30G
CD115 eBioscience, San Diego, USA 12-1152
CD11b eBioscience, San Diego, USA 53-0112
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany With cap, steril
Centrifuge Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10  Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan 
EDTA Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%  Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80 AbD Serotec, Düsseldorf, Germany MCA497APC
FACS buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA BD FACS Canto II
FACS tubes     Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1 eBioscience, San Diego, USA 53-5931
Heating plate  Labotect GmbH, Göttingen, Germany  Hot Plate 062
Incubator Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany Incu safe
Isofluran Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor Sigma Aldrich, Hamburg, Germany SRP3110 
Mechanical shaker IKA, Staufen, Germany ms2 minishaker
Medium 199 PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany Hera safe
Monocyte wash buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer Various
NaCl Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide) Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany pH 7.4, sterile
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit Integra bioscience, Fernwald, Germany Vacusafe comfort
Surgical scissors Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany 15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany Julabo SW22

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References

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