Выделение и внутривенное введение мышиных костного мозга моноцитов

1Department for Cardiology, Angiology and Pneumology, Otto von Guericke University Magdeburg, 2Herzzentrum Dresden, Universitätsklinikum an der Technischen Universität Dresden, Technische Universität Dresden, 3Department of Public Health and Primary Care, University of Cambridge
Published 12/27/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Wagner, M., Koester, H., Deffge, C., Weinert, S., Lauf, J., Francke, A., et al. Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes. J. Vis. Exp. (94), e52347, doi:10.3791/52347 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Это исследование было выполнено с разрешения Саксонии и Саксонии-Ангальт, Regierungspraesidium Дрездене / Галле, в соответствии с разделом 8 Закона о Германии по защите животных (24D-9168.11-1 / 2008-24).

1 Выделение клеток

1.1 Подготовка бедра и голени

  1. Обезболить мыши, используя 5% изофлуран концентрации путем испарения изофлуран в закрытой емкости. После мыши перестал двигаться в течение 3 секунд, выполните шейки дислокации.
  2. Дезинфекцию задних конечностей с этанолом (96%). Удалить кожу и мышцы и отделить кости с помощью стерильного скальпеля.
    1. Начнем с паховой разрез кожи и продлить разрез по направлению к медиальной лодыжки и выполнять круговое рассечение кожи вокруг нижней теленка. Снимите кожу ног полностью очищая это проксимально.
    2. Снять четырехглавой мышцы от бедра с острым скальпелем, удалить оба передних малоберцовойи группы икроножных мышц и разъединять ногу в тазобедренном суставе, обнаруживая и рассечения связки.
    3. Начните вперед и приступить вокруг сустава, тщательно поворачивая ногу и пересекающих связки, тем самым disarticulating сустав.
  3. Промыть бедра и голени с 96% -ным этанолом в течение как минимум 90 секунд, чтобы гарантировать асептические клеточный препарат. Продолжить процесс стирки стерильной PBS, чтобы смыть оставшийся этанол.
    Примечание: Все последующие шаги должны быть стерильными, чтобы избежать загрязнения.

1.2 Сбор костного мозга

  1. Вырезать проксимальный и дистальный конец каждой кости с парой тонких ножниц, чтобы получить доступ к бедренной и большеберцовой кости валов. Будьте осторожны с этим шагом, так как эти кости сломать очень легко.
  2. Флеш кости с теплой средой (M199 + 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), + 1% пенициллина / стрептомицина). Использование стерильного 28-G иглу, 1 мл шприц, а также между 10-15 мл среды накости для полоскания.
  3. Держите кости с тонким пинцетом и промыть один за другим, пока она не станет полупрозрачный. Осторожно давить на конце поршень шприца, чтобы минимизировать нагрузку клеток.
  4. Фильтр костный мозг через нейлоновую сети 70 мкм и собрать фильтрат. Чтобы извлечь максимальное количество костного мозга, промыть несколько раз в дистальных и проксимальных концах.
  5. Промойте сито с PBS и собрать фильтрат. Осторожно выбить мусора и клеточных конгломератов осторожном перемешивании пипеткой.

1.3 Выращивание

  1. Центрифуга клеточной суспензии при 250 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в приблизительно 25 мл среды. Повторить один раз.
  2. Ресуспендируют клеток в 6 мл среды после второй стадии промывки. Смешайте 50 мкл раствора клеток с 50 мкл трипанового синего. Граф клеток в счетной камере под световым микроскопом. Подсчитать количество Cлоктей в растворе, используя эту формулу:
    Уравнение 1
  3. Семенной клеток на 6-луночных поверхности сверхнизким крепления пластин, чтобы предотвратить постоянное сцепление с нижней части пластины. Использование концентрации 10 6 клеток на мл до 6 мл на лунку.
  4. Дополнение суспензии с 20 нг / мл M-CSF, чтобы способствовать клеточной дифференциации.
  5. Культуры клеток в течение 5 дней при 37 ° С и 5% диоксида углерода и наблюдать ежедневно.

1.4 Сбор клеток

Примечание: Эти шаги должны быть выполнены на льду. Продолжайте либо 1.4.1 или 1.4.2 соответственно.

  1. На данный момент, урожай всю культуру, в том числе дифференцированных макрофагов, которые присоединятся к культуре пластин, даже если они ультра-низким крепления на поверхности пластины.
    1. Заготавливают всю культуру, осторожно пипеткой и снятие с раствором 4 ° C PBS, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мМ ЭДТА. Повторяйте, пока плиты не ясны оставшихся прилипшие клетки - подтвердить под микроскопом, если не уверены.
  2. С другой стороны, отбросить прилипшие макрофаги, собирая супернатант с клетками в суспензии, которые содержат преимущественно моноциты.
    1. Урожай неадгезированных клетки с раствором ЭДТА бесплатно PBS и 0,5% БСА. Не наносите слишком много сил для того, чтобы избежать выбивании мягко прикрепленных макрофаги.

1,5 FACS-анализа (Необязательно)

Примечание: Можно разрушают клеточную суспензию CD117 + stem- и клеток-предшественников с использованием MACS. Используйте протоколы производителя для этой процедуры.

  1. Сбора клеток по любому шаги 1.4.1 или 1.4.2.
  2. Центрифуга клетки при 250 х г в течение 10 мин при 4 ° С и повторить этот шаг снова.
  3. Ресуспендируют, по меньшей мере 250000 клеток в 300 мкл FACS бuffer за зондом.
  4. Передача раствора клеток на 96-луночного планшета (30 мкл на лунку).
  5. Центрифуга клеточной суспензии при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
  6. Удалить супернатант и добавить 25 мкл антитела в каждую лунку (использование изготовлением разбавления).
  7. Пятно клеток с антителами (следующих протоколов производителя для сотового фенотипирования после стадий 1.5.1-1.5.6. Часто используемые маркеры для идентификации моноцитов / макрофагов включают CD11b, F4 / 80 (рис 3), CD115 (Рисунок 2), и Gr- 1.
    Примечание: Для дальнейшего описания сотовых решений, использование маркеров, таких как CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G и CD192 рекомендуется. Сотовые характеристики были описаны ранее 12.
  8. Инкубируйте зондов в течение 20 мин при 4 ° С.
  9. Центрифуга зонды на 250 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 200 мкл FACS буфера. Повторите йэто шаг в два раза.
  10. Передача зонды в FACS труб и выполнить анализ FACS 12.
  11. Выполнение анализа FACS 12 в день 0, 3 и 5 для анализа клеточной дифференциации.

2. Хвост вену

2.1 Подготовка

  1. Теплый животных на нагревательной плитке при 37 ° С в течение примерно 10 мин. Соблюдайте животных при нагревании распознавать признаки перегрева.
  2. Ресуспендируют моноциты, выделенные с шагом 1.1- 1,4, в 150 мкл NaCl, и загрузить клеток в 1 мл инсулиновый шприц с иглой в 30G. Слегка вихрь решение перед загрузкой в ​​шприц, чтобы обеспечить все моноциты вводили. Всегда обрабатывать клетки на льду, чтобы избежать приложение тепла и опосредованной активации моноцитов.

2.2 Удерживающие

  1. Не беспокоить других мышей в клетке при выборе мыши для внутривенной инъекции.
  2. Наведите в фиксатор. Избегайте слишком много прEssure и будьте осторожны с задних конечностей. (Рисунок 4)
    Примечание: В качестве альтернативы, использовать общую анестезию, чтобы гарантировать стресс свободное обращение с животными.
  3. Убедитесь, что мышь имеет пространство для дыхания перед закрытием фиксатор.

2.3 Injection

  1. Лечить инъекции с дезинфицирующего средства. Спрей на хвосте мыши и дать постоять по крайней мере, 1 мин.
  2. Остановка венозного кровотока хвоста, слегка надавливая на боковую хвостовую части выше места инъекции, для лучшей видимости вен.
  3. Включить задние 90 градусов, перед инъекцией. (Рисунок 5)
  4. Вводите под углом 45 градусов. Вводите медленно и не более 5 мкл на грамм не допустить причинения вреда животным.
  5. Если есть волдырь, который является признаком неудачной инъекции, немедленно прекратить и повторить инъекцию проксимальнее.
  6. Остановить кровотечение на стороне впрыска путем легкого рия около 1 мин.
  7. В конце процедуры, открыть втягивающим и поместить курсор в клетке.
  8. Обратите внимание на мышь в течение 20 мин, чтобы гарантировать, что животное не страдают от инъекции и грудины лежачее положение сохраняется. Увеличьте время наблюдения до мыши не восстановит достаточное сознание. Вернуться мышь, чтобы компании других животных только после того, как он полностью выздоровел.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Раствор экстрагировали клеток из мышиного костного мозга состоит из различных типов клеток. Основные типы клеток являются лимфоциты, гранулоциты и моноциты. Типы клеток можно оценить по размеру и степени детализации, который показан на фиг.1 как для нативных суспензий и клеток, полученных после 5 суток дифференцировки. Обратите внимание на зыбучих клеточный состав в процессе культивирования. Тем не менее, точная классификация населения должны полагаться на отличительные экспрессии клеточных маркеров.

Наиболее важным маркером используется для идентификации клеток из депутатов-системы CD115, который функционирует как рецептор M-CSF и специфически экспрессируется на моноцитов-предшественников, моноцитов и макрофагов. Таким образом, он не может быть использован для идентификации отличительных MPS-подмножества, но может достоверно оценить абсолютное количество клеток, вбитым в моноцитов / макрофагов дифференциации. На рисунке 2 хронологию выражения CD115 во время отличаютсяentiation.

Срок погашения маркер F4 / 80 полезно различать несовершеннолетних моноциты, зрелые моноциты и макрофаги. Макрофаги показать сильное выражение F4 / 80 по сравнению с малолетним моноцитов-предшественников, которые негативно для маркера. Зрелые моноциты показать промежуточный выражение F4 / 80. Сочетание CD115 и F4 / 80 маркеров, следовательно, представляет приемлемый метод для количественной оценки и мониторинга дифференцировку клеток (рис 3).

Сочетание CD115 и F4 / 80 достаточно для рутинного наблюдения культуры и контроль качества перед нанесением клеток. Более подробное изучение костного мозга, полученных моноцитов в 5-й день культивирования подтверждает их структурные и функциональные свойства В соответствии с тем, моноцитов периферической крови 12.

Важно, чтобы исправить мыши тщательно в фиксатор, избегая напряжение на хвосте. Ограничить FreeDoм движения в максимально возможной степени и не ингибируют дыхание, чтобы облегчить инъекции.

Рисунок 1
Рисунок 1. Левая панель:. Состав клеточных типов в 1-й день в культуре виды Сотовые относятся лимфоциты, моноциты и гранулоциты. Правая панель: Обратите внимание на зыбучих клеточный состав в процессе культивирования. Клеточной популяции включает в себя моноциты и макрофаги. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. Хронология CD115 выражения во время дифференцировки. Обратите внимание, что> 95% всех клеток CD115 положительным после 5 суток дифференцировки, указывая, что подавляющее Большинство клеток являются либо моноциты или макрофаги. Классификация может быть основана на размер ячейки и детализации, но конкретные клеточные маркеры являются более надежными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Увеличение экспрессии моноцитов / макрофагов маркер зрелости F4 / 80 День 5:. Обратите внимание на внешний вид населения с промежуточным F4 / 80 выражение, которое согласуется с фенотипом моноцитов. День 7:. Обратите внимание на правую сдвиг F4 / 80 выражение, в соответствии с макрофагов созревания Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

е 4 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52347 / 52347fig4highres.jpg "/>
Рисунок 4. Мышь фиксируется в фиксатор для инъекций в хвостовую вену. После тщательного сдерживания мышь, поверните хвост 90 градусов, пока вены не видны на спинной стороне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Схема сечение хвоста мыши. Рисунок иллюстрирует расположение судов в хвосте мыши. Артерии (красные) расположены на брюшной и спинной стороне, и вены на боковой стороне хвоста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы опишем простой и экономичный способ, чтобы изолировать большое количество крысиных моноцитов из костного мозга. По сравнению с другими протоколов, использующих периферической крови, которые получают моноцитов урожайности 5 1,4 x10 6, мы можем получить более высокие урожаи от 11 х 10 6 ± 3 х 10 6 моноцитов от одного донора мыши.

При рассмотрении проблемы с этим методом, важно отметить, потенциал для загрязнения при работе в нестерильных условиях. Если промывка и следующие шаги стиральные не соблюдаются должным образом, загрязнение бактериями и грибами, скорее всего. Кроме того, костный мозг состоит из гетерогенных клеточных суспензий, в том числе гранулоцитов, лимфоцитов и эритроидных клеток. Обычно эти клетки исчезают между днем ​​2 и 3 культивирования из-за отсутствия факторов роста. После фактора роста приводом дифференциации, макрофаги являются основным источником загрязнения. Чтобы тон количество макрофагов низких и свести к минимуму дифференциацию моноцитов в макрофаги, использование ультра-низких пластин крепления и шаги стиральные упомянутые выше критической.

Трудно определить маркер, который исключительно моноцитов конкретного. Помехи между маркерами делает необходимым использование более чем одного маркера, и есть различия в степени детализации и размера клеток в анализе клеточных суспензий. Маркеры и описания, приведенные на фиг.1-3 являются хорошей альтернативой для представительных типов клеток в культуре. Это может быть трудно различить различные типы клеток, в особенности после того, как день 5. Поэтому важно использовать другие маркеры, такие как CD115 и F4 / 80.

Учитывая расширение клеток костного мозга при адгезии свободной условиях, макрофагов дифференциации может быть продлен и недифференцированные моноциты могут накапливаться. Макрофагов дифференциация указывает загрязнения; Однако, Duе их клейкой природы, даже на ультра-крепления культивирования поверхностей, они могут быть легко отброшены, а только заготовки, не адгезивные клетки от культуры. В предыдущих экспериментах 1,3, загрязнение макрофагами не привело к серьезным клиническим побочных эффектов. Гистологическое проработка органов и мышц мышей после трансплантации клеток показали, что введенные макрофаги усваивается в органах, таких как селезенка, печень или легкие. Ассимиляция макрофагов в этих органах не выявлено каких-наблюдаемые клинические эффекты у мышей. Молекулярный механизм срабатывает в этих макрофагов может быть интересные вопросы для дальнейших исследований.

Моноциты, а также макрофаги влияют артериогенез в периферической артериальной болезни, особенно при применении системно. Клинические побочные эффекты, такие как эмболии или массивной системного воспаления не наблюдалось даже после инъекции более 2500000 моноцитов, но эти клетки могут вызвать воспаление и ПОtentially вызвать серьезные системные эффекты. В испытаниях на людях, эти эффекты, вероятно, имеют клинического значения. Срабатывание артериогенеза может повлиять на рост опухоли или диабетической ретинопатии, и такие возможные системные эффекты инъекционных растворов клеточных должны быть изучены в будущих исследованиях.

Предыдущие публикации 9 описывают различия между характеристиками периферийных циркулирующей крови и костного мозга, полученных моноцитов, которые объясняет, почему свойства моноцитов из костного мозга могут отличаться от тех, выделенных из периферической крови клеток.

Способ изоляции имеет клинический интерес, а также. Забор крови вместо извлечения костного мозга человека является более практичным в контексте клинической медицине. Важно заботиться о благосостоянии животных и, если необходимо применить обезболивание. Для внутривенных инъекций, важно на практике обработки как животное и шприц в то же время. Если один АниMAL проходит многократные инъекции, качество вен и кожи хвоста страдать.

Несмотря на эти недостатки, этот метод является очень полезным для изучения поведения и характеристики моноцитов. Эксперименты в области атеросклероза, иммунологии или воспаления могут извлечь выгоду из этого метода. Только 30 мин требуется от добычи костного мозга посева клеток на 6-а поверхности пластин ультра-низким крепления. Этические проблемы минимизированы, потому что высокий выход этого протокола минимизирует число животных, необходимых в качестве клеток доноров. Этот новый метод будет полезен для многих исследований, связанных с моноциты.

Мы были сосредоточены на терапевтического увеличения коллатерального роста сосудов через трансплантации моноцитов. Многофакторный характер этого процесса может объяснить, почему один фактор подходы для увеличения артериогенеза породили смешанными результатами 13,14. Это привело к инисследова- ние клеточной терапии. Аутологичного костного мозга стволовые клетки и предшественники были идентифицированы в качестве потенциальных клеток для трансплантации, но только умеренные клинические преимущества были зарегистрированы 15. Кроме того, исследования по дозировке, методы выделения и путей введения, проведение дальнейших исследований для того, чтобы определить оптимальный тип клеток. Недостатком трансплантации аутологичных клеток может быть их неспособность, чтобы активировать врожденную и / или адаптивный иммунный ответ, и оба имеют решающее значение для артериогенеза. Увеличение местное воспаление может представлять лучший стимул для артериогенеза 16.

Внутривенное введение моноцитов является общим методом трансплантации клеток в мышиных моделях, если системное введение препарата желательно. Из-за системных побочных эффектов, побочные эффекты могут возникать также. Убедитесь, что вены предназначен для инъекций. Оно является общим для путайте артерий и вен, особенно при внутривенном введении сильно пигментированные микрофоне. Инъекции Артериальная может привести к эмболии, которые приводят к системным вопросам, находящихся в обращении.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well-ultra-low-attachment plate Corning Incorporated, NY, USA 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice  Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine GE Healthcare, Freiburg, Germany Fraction V, pH 7.0
Canules B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 28G, 30G
CD115 eBioscience, San Diego, USA 12-1152
CD11b eBioscience, San Diego, USA 53-0112
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany With cap, steril
Centrifuge Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10  Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan 
EDTA Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%  Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80 AbD Serotec, Düsseldorf, Germany MCA497APC
FACS buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA BD FACS Canto II
FACS tubes     Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1 eBioscience, San Diego, USA 53-5931
Heating plate  Labotect GmbH, Göttingen, Germany  Hot Plate 062
Incubator Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany Incu safe
Isofluran Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor Sigma Aldrich, Hamburg, Germany SRP3110 
Mechanical shaker IKA, Staufen, Germany ms2 minishaker
Medium 199 PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany Hera safe
Monocyte wash buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer Various
NaCl Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide) Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany pH 7.4, sterile
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit Integra bioscience, Fernwald, Germany Vacusafe comfort
Surgical scissors Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany 15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany Julabo SW22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15, (1), 1-12 (2004).
  2. Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Isolation and transduction of monocytes: promising vehicles for therapeutic arteriogenesis. Langenbecks Arch Surg. 391, (2), 72-82 (2006).
  3. Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American Journal Of Translational Research. 5, (2), 155-169 (2013).
  4. Leon, B., et al. Dendritic cell differentiation potential of mouse monocytes: monocytes represent immediate precursors of CD8- and CD8+ splenic dendritic cells. Blood. 103, (7), 2668-2676 (2004).
  5. Timmerman, J. M., Levy, R. Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 50, 507-529 (1999).
  6. Salem, M. L. The use of dendritic cells for Peptide-based vaccination in cancer immunotherapy. Methods Mol Biol. 1139, 479-503 (2014).
  7. Timmerman, J. M., et al. Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients. Blood. 99, (5), 1517-1526 (2002).
  8. Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43, (6), 367-371 (1981).
  9. Houthuys, E., Movahedi, K., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. Journal Of Immunological Methods. 359, (1-2), 1-10 (2010).
  10. Seeger, F. H., Tonn, T., Krzossok, N., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. European Heart Journal. 28, (6), 766-772 (2007).
  11. Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. The Journal Of Experimental Medicine. 206, (3), 595-606 (2009).
  12. Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties. J. Histochem. Cytochem. 59, (9), 813-825 (2011).
  13. Sneider, E. B., Nowicki, P. T., Messina, L. M. Regenerative medicine in the treatment of peripheral arterial disease. Journal Of Cellular Biochemistry. 108, (4), 753-761 (2009).
  14. Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. A critical review of clinical arteriogenesis research. J Am Coll Cardiol. 55, (1), 17-25 (2009).
  15. Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy. J Vasc Surg. 53, (2), 445-453 (2011).
  16. Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3, (2), e000611 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats