המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

1Department for Cardiology, Angiology and Pneumology, Otto von Guericke University Magdeburg, 2Herzzentrum Dresden, Universitätsklinikum an der Technischen Universität Dresden, Technische Universität Dresden, 3Department of Public Health and Primary Care, University of Cambridge
Published 12/27/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Wagner, M., Koester, H., Deffge, C., Weinert, S., Lauf, J., Francke, A., et al. Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes. J. Vis. Exp. (94), e52347, doi:10.3791/52347 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

מחקר זה בוצע באישורה של המדינה סקסוניה וסקסוניה-אנהלט, Regierungspraesidium דרזדן / האלי, על פי סעיף 8 לחוק הגרמני להגנה על בעלי חיים (24D-9,168.11-1 / 2008-24).

בידוד תא 1

1.1 הכנת עצם הירך לבין השוקה

  1. להרדים את העכבר באמצעות 5% ריכוז isoflurane על ידי אידוי isoflurane לפח סגור. לאחר העכבר הפסיק לזוז במשך 3 שניות, לבצע הנקע בצוואר הרחם.
  2. לחטא את הגפיים האחורי עם אתנול (96%). להסיר את העור ושרירים ולהפריד את העצמות עם אזמל סטרילי.
    1. התחל עם חתך בעור מפשעה, ולהרחיב את החתך לכיוון malleolus המדיאלי ולבצע נתיחה חוזר של העור סביב העגל הנמוך. הסר את העור של הרגליים לחלוטין על ידי לקלף אותה proximally.
    2. לנתק את השריר הארבע ראשי מעצם הירך עם אזמל חד, תסיר את שני peroneus הקדמיוקבוצות השרירים הגסטרוקנמיוס וdisarticulate הרגל במפרק הירך על ידי איתור ולנתח את הרצועות.
    3. התחל anteriorly ולהמשיך סביב המפרק על ידי הסיבוב בזהירות את הרגל וtransecting הרצועות, ובכך disarticulating המשותף.
  3. לשטוף עצם ירך ועצם שוק עם 96% אתנול למשך תקופה מינימאלית של 90 שניות כדי להבטיח הכנת תא ספטית. להמשיך את תהליך השטיפה עם PBS סטרילי כדי לשטוף נותר אתנול.
    הערה: כל הצעדים הבאים חייבים להיות סטרילי כדי למנוע זיהום.

1.2 קצירה של מח העצם

  1. חותך את הקצה הפרוקסימלי והדיסטלי של כל עצם עם זוג מספריים קנס כדי לקבל גישה לפירי הירך ושוקה. תיזהר עם צעד זה, שכן העצמות האלה לשבור בקלות רבה.
  2. לשטוף את העצמות עם מדיום חם (M199 10% בסרום + עגל עוברי (FCS), + 1% פניצילין / סטרפטומיצין). השתמש במחט סטרילית 28-G, מזרק 1 מיליליטר, ובין 10-15 מיליליטר בינונייםעצם לשטיפה.
  3. החזק את העצם עם מלקחיים עדינים ולשטוף אחד אחד עד שהוא הופך שקוף למחצה. זהירות להחיל לחץ בסופו של בוכנת המזרק על מנת למזער מתח תא.
  4. סנן את מח העצם באמצעות אינטרנט ניילון 70 מיקרומטר ולאסוף התסנין. כדי לחלץ את הכמות המרבית של מח עצם, לשטוף שוב ושוב מהקצוות דיסטלי ופרוקסימלי.
  5. יש לשטוף את המסננת עם PBS ולאסוף התסנין. לסלק פסולת בזהירות וקונגלומרטים סלולריים על ידי ערבוב וpipetting עדינים.

1.3 טיפוח

  1. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 250 XG במשך 10 דקות ב RT בטל supernatant ו resuspend התאים עם כ 25 מיליליטר של מדיום. חזור פעם אחת.
  2. Resuspend תאי 6 מיליליטר של מדיום לאחר שלב הכביסה השני. מערבבים 50 μl של פתרון התא עם 50 μl של trypan כחול. ספירת התאים בתא ספירה תחת מיקרוסקופ אור. לחשב את מספר גאמות בפתרון באמצעות נוסחה זו:
    משוואת 1
  3. זרעי התאים על צלחות משטח נמוך במיוחד מצורף 6-גם למניעת הדבקה קבועה לתחתית הצלחת. השתמש בריכוז של 10 6 תאים למ"ל עם עד 6 מיליליטר לכל טוב.
  4. להשלים את ההשעיה עם M-CSF מיליליטר / 20 ng לקדם התמיינות תאים.
  5. תרבות התאים במשך 5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ולבחון מדי יום.

1.4 קצירה של תאים

הערה: עליך לבצע פעולות אלה על קרח. המשך עם או 1.4.1 או 1.4.2 בהתאם.

  1. בשלב זה, לקצור את התרבות כולה, כולל מקרופאגים המובחנים שידבקו לתרבות-הצלחות, גם אם הם צלחות משטח נמוך במיוחד קובץ מצורף.
    1. לקצור את כל התרבות על ידי pipetting העדין וניתוק עם פתרון של 4 מעלות צלזיוס PBS, 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA) ו- 2 mM EDTA. חזור על פעולה עד הצלחות ברורות של שנותר תאים חסיד - לאשר תחת מיקרוסקופ אם אינך בטוח.
  2. לחלופין, לבטל מקרופאגים חסיד על ידי איסוף supernatant עם התאים בתרחיף, שבעיקר מכילים מונוציטים.
    1. קציר התאים שאינם חסיד עם פתרון של PBS ללא EDTA וBSA 0.5%. אין ליישם בכוח רב מדי על מנת להימנע מפירוק מקרופאגים המעטה חסיד.

1.5 FACS-ניתוח (אופציונאלי)

הערה: ניתן לרוקן את ההשעיה התא של תאי stem- ואב CD117 + על ידי השימוש בMACS. להשתמש בפרוטוקולי יצרן להליך זה.

  1. קציר התאים על פי שני שלבים 1.4.1 או 1.4.2.
  2. צנטריפוגה התאים ב 250 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C ולחזור על פעולה זו שוב.
  3. Resuspend לפחות 250,000 תאים ב300 μl של FACS בuffer לבדיקה.
  4. העבר את פתרון תא על 96-היטב צלחת (30 μl לכל היטב).
  5. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  6. הסר את supernatant ולהוסיף 25 μl של נוגדן לכל טוב (דילול יצרן שימוש).
  7. כתם התאים עם נוגדנים (להלן פרוטוקולי יצרן לתא phenotyping לאחר צעדי 1.5.1-1.5.6. סמנים בשימוש נפוץ לזיהוי מונוציטים / מקרופאג כוללים CD11b, F4 / 80 (איור 3), CD115 (איור 2), וGr- 1.
    הערה: לתיאור נוסף של פתרונות סלולריים, השימוש בסמנים כמו CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G, וCD192 מומלץ. מאפיינים סלולריים תוארו בעבר 12.
  8. דגירה הבדיקות במשך 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
  9. צנטריפוגה הבדיקות ב 250 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס וגלולה עם 200 μl של חיץ FACS. ה חזורהוא צעד פעמיים.
  10. העבר את הבדיקות לתוך צינורות FACS ולבצע ניתוח FACS 12.
  11. ביצוע ניתוח FACS 12 ביום 0, 3 ו -5 לנתח התמיינות תאים.

הזרקה לוריד 2. זנב

2.1 הכנה

  1. לחמם את בעלי החיים על צלחת חימום על 37 מעלות צלזיוס למשך כ -10 דקות. שים לב לבעלי החיים בזמן ההתחממות לזהות סימנים של התחממות יתר.
  2. Resuspend מונוציטים, מבודדים בצעדי 1.1- 1.4, ב -150 μl של NaCl, ולטעון את התאים לתוך מזרק אינסולין 1 מיליליטר עם מחט 30G. קל מערבולת הפתרון לפני טעינת המזרק על מנת להבטיח את כל מונוציטים מוזרקים. תמיד להתמודד עם תאים על קרח, כדי למנוע עיקול בתיווך חום והפעלה של מונוציטים.

2.2 הרחקה

  1. הימנע מלהפריע עכברים אחרים בכלוב בעת בחירת עכבר להזרקה תוך ורידית.
  2. מניחים את העכבר לעוצר. הימנע יותר מדי יחסי ציבורחסימת חצוצרות ולהיות זהירות עם הגפיים האחורי. (איור 4)
    הערה: לחלופין, להשתמש בהרדמה כללית כדי להבטיח טיפול ללא מתח של בעלי החיים.
  3. ודא שיש לו את העכבר מרחב לנשימה לפני סגירת העוצר.

2.3 הזרקה

  1. לחטא את אזור ההזרקה עם סוכן חיטוי. תרסיס על הזנב של העכבר ולתת לעמוד במשך דקות לפחות 1.
  2. לעצור את זרימת דם ורידית של הזנב על ידי הפעלת לחץ עדין לצד זנב לרוחב מעל אתר ההזרקה, ראות טובה יותר של הוורידים.
  3. הפעל את הזנב 90 מעלות, לפני ההזרקה. (איור 5)
  4. להזריק בזווית של 45 מעלות. להזריק לאט ולא יותר מ 5 μl לז, כדי למנוע פגיעה בבעלי חיים.
  5. אם יש שלפוחית, וזה סימן של הזרקה נכשלה, להפסיק מייד ולחזור על ההזרקה יותר proximally.
  6. לעצור את הדימום בצד ההזרקה על ידי יישום p העדיןressure כ 1 דק '.
  7. בסופו של ההליך, לפתוח את מפשק ומניח את העכבר בכלוב שלה.
  8. שים לב לעכבר במשך 20 דקות על מנת להבטיח כי בעל החיים לא נפגעו על ידי ההזרקה ומתוחזק כיבה sternal. הארך את הזמן של התבוננות עד העכבר להכרה מספקת. החזר את העכבר לחברה של בעלי חיים אחרים רק לאחר שהתאושש באופן מלא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פתרון התא מופק ממוח העצם העכברי מורכב מסוגי תאים שונים. הסוגים העיקריים של התאים לימפוציטים הם, גרנולוציטים ומונוציטים. ניתן להעריך סוגי תאים על ידי גודל וגרעיניות, המוצג באיור 1 עבור שתי השעיות היליד והתאים שנקטפו לאחר 5 ימים של בידול. שים לב להרכב הסלולרי ההסטה במהלך טיפוח. עם זאת, סיווג מדויק של אוכלוסיות חייב לסמוך על ביטוי ייחודי של סמנים תאיים.

הסמן החשוב ביותר המשמש לזיהוי תאים של המערכת-MPS הוא CD115, המתפקד כקולט M-CSF ובא לידי ביטוי דווקא באבות מונוציטים, מונוציטים ומקרופאגים. לכן, זה לא יכול לשמש לזיהוי MPS-תת ייחודי, אבל באופן מהימן יכול להעריך את הסכום המוחלט של תאים מונעים לבידול מונוציטים / מקרופאג. ראה איור 2 לציר זמן של ביטוי CD115 במהלך שונהentiation.

F4 סמן בגרות / 80 הוא שימושי כדי לבדל מונוציטים לנוער, מונוציטים בוגרים, ומקרופאגים. המקרופאגים להראות ביטוי חזק של F4 / 80 בהשוואה לנוער אבות מונוציטים, אשר הם שליליים עבור הסמן. מונוציטים בוגרים להראות ביטוי ביניים של F4 / 80. שילוב של CD115 וF4 / 80 סמנים לכן מייצג שיטה אפשרית לכימות ומעקב אחר התמיינות תאים (ראה איור 3).

השילוב של CD115 וF4 / 80 הוא מספיק לתצפית שגרתית תרבות ובקרת איכות לפני היישום של תאים. בדיקה מפורטת יותר של מונוציטים נגזרים מח עצם ביום 5 של טיפוח מאשרת תכונות המבניות ותפקודיות שלהם בהתאמה לאלה של מונוציטים בדם היקפיים 12.

חשוב לתקן את העכבר בזהירות בעוצר, הימנעות מתח על הזנב. להגביל freedoמ 'של תנועה ככל האפשר בלי עיכוב נשימה כדי להקל על ההזרקה.

איור 1
1. לוח שמאלי איור:. הרכב של סוגי תאים ביום 1 בתרבות סוגי תאים לימפוציטים כוללים, מונוציטים וגרנולוציטים. פנל ימני: שים לב להרכב סלולארי ההסטה במהלך טיפוח. אוכלוסיית תא כוללת מונוציטים ומקרופאגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. ציר זמן של ביטוי CD115 במהלך בידול. שימו לב ש> 95% מכלל תאי CD115 חיובי לאחר 5 ימים של בידול, מצביע על כך שהרוב רוב התאים הם או מונוציטים או מקרופאגים. סיווג יכול להיות מבוסס על גודל תא וגרעיניות, אך סמנים תאיים ספציפיים הם אמינות יותר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. הגדלת הביטוי של מונוציטים / סמן בגרות מקרופאג F4 / 80 יום 5:. שים לב למראה של אוכלוסייה עם F4 / 80 ביטוי ביניים, אשר עולה בקנה אחד עם פנוטיפ מונוציטים. יום 7:. שים לב הימנית המשמרת של F4 ביטוי / 80, עולה בקנה אחד עם התבגרות מקרופאג אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Src =" e 4 "/> / קבצים / ftp_upload / 52,347 / 52347fig4highres.jpg
איור 4. עכבר קבוע בעוצר להזרקה לוריד זנב. ריסון העכבר לאחר בזהירות, לסובב את הזנב 90 מעלות, עד שהוורידים נראים בצד הגב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
5. חתך סכמטי דמותו של זנב העכבר. התמונה ממחישה את מיקומו של כלי שיט בזנב העכבר. העורקים (אדום) נמצאים בצד הגחון ועל גב, והוורידים הם בצד הלטרלי של הזנב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מתארים שיטה פשוטה וחסכונית לבודד את הכמויות גדולות של מונוציטים עכבריים ממח עצם. בהשוואה לפרוטוקולים אחרים באמצעות דם היקפי, הלהשיג תשואות מונוציטים 5 של 1.4 x10 6, אנו מסוגלים להשיג תשואות גבוהות יותר של 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 מונוציטים מעכבר תורם יחיד.

כאשר שוקלים אתגרים בשיטה זו, חשוב לדבר על הפוטנציאל לזיהום בעת העבודה בתנאים שאינם סטרילי. אם שטיפה והצעדים הכביסה הבאה אינם בעקבות כראוי, זיהום על ידי חיידקים ופטריות הוא סביר. בנוסף, מח עצם מורכב מהשעיות תא הטרוגניות, כוללים גרנולוציטים, לימפוציטים ותאי erythroid. בדרך כלל תאים אלה להיעלם בין היום 2 ו -3 לטיפוח בשל היעדרם של גורמי גדילה. לאחר התמיינות גורם מונע צמיחה, מקרופאגים הם המקור העיקרי לזיהום. כדי לשמור על tהוא המספר של מקרופאגים הנמוכים וכדי למזער את הבידול של מונוציטים למקרופאגים, השימוש בלוחות מצורפים נמוכים במיוחד ושלבי הכביסה שהוזכרו לעיל הם קריטיים.

קשה לזהות סמן שהוא רק של מונוציטים ספציפיים. התערבות בין הסמנים מחייבת שימוש בסמן אחד או יותר, ויש שונות בגרעיניות והגודל של תאים בניתוח השעיות תא. הסמנים והתיאורים מוצגים איורים 1-3 חלופות טובות לסוגי תאי נציג בתרבות. זה יכול להיות קשה להבחין בין הסוגים השונים של התאים, במיוחד אחרי יום 5. לכן זה קריטי להשתמש סמנים אחרים כמו CD115 וF4 / 80.

בהתחשב בהרחבה של תאי מח עצם בתנאים ללא הידבקות, בידול מקרופאג יכול להיות ממושך ומונוציטים מובחנים יכולים לצבור. בידול מקרופאג מציין זיהום; עם זאת, duדואר לטבע הדבק שלהם גם על משטחי טיפוח נמוך במיוחד מצורפים-, הם יכולים להיות מושלכים בקלות בעת קצירת רק תאים שאינם דבקים מהתרבות. בניסויים קודמים 1,3, זיהום על ידי מקרופאגים לא הוביל לתופעות לוואי קליניים רציניות. בירור היסטולוגית של איברים ושרירים של עכברים לאחר השתלת התאים הראה כי מקרופאגים מוזרקים מתבוללים באיברים כמו טחול, בכבד או ריאות. ההטמעה של מקרופאגים באיברים אלה הוכיחה ללא תופעות קליניות נצפות בעכברים. המנגנון המולקולרי מופעל על ידי מקרופאגים אלה יכולים להיות שאלות מעניינות לחקירות נוספות.

מונוציטים כמו גם מקרופאגים להשפיע arteriogenesis במחלת עורקים היקפי, במיוחד כשהם מיושמים באופן מערכתי. תופעות לוואי קליניים כגון תסחיף או דלקת מערכתית מסיבית לא יכולים להיבחן גם לאחר ההזרקה של יותר מ -2.5 מיליון מונוציטים, אבל תאים אלה יכולים לעורר דלקת ופוtentially לגרום לתופעות מערכתיות חמורות. בניסויים בבני אדם, השפעות אלו עשויות להיות להם משמעות קלינית. ליבוי arteriogenesis יכול להשפיע על צמיחת גידול או רטינופתיה סוכרתית, והשפעות מערכתיות אפשריות כזה של פתרונות תא שהוחדרו צריכה להיחקר במחקרים עתידיים.

פרסומים קודמים 9 לתאר הבדלים בין המאפיינים של מונוציטים היקפיים דם ועצם נגזר מח, אשר מסבירים מדוע המאפיינים של מונוציטים ממח עצם יכולים להיות שונים מאלו שבודדו מתאי דם היקפיים.

גם השיטה של ​​בידוד היא עניין קליני. ציור דם במקום לחילוץ מח עצם אנושי הוא יותר מעשי בהקשר של רפואה קלינית. חשוב לדאוג לרווחתם של בעלי החיים וליישם שיכוך כאבים במידת צורך. לזריקות תוך ורידי, זה קריטי לתרגל טיפול הן בעלי החיים ואת המזרק באותו הזמן. אם ani אחתmal עובר זריקות מרובות, איכות הוורידים והעור של הזנב סובלים.

למרות חסרונות אלה, שיטה זו היא מאוד שימושית כדי ללמוד את ההתנהגות ומאפיינים של מונוציטים. ניסויים בתחום טרשת עורקים, אימונולוגיה או דלקת יכולים להפיק תועלת משיטה זו. רק 30 דקות נדרשות מהפקת מח עצם לזריעה של תאים על צלחות משטח נמוך במיוחד מצורף 6-גם. חששות אתיים הם מזעריים, כי התשואה הגבוהה של פרוטוקול זה ממזערת את מספר בעלי החיים הנדרשים כתורמי תא. שיטה חדשה זו תהיה מועילה ללימודים רבים מעורבים מונוציטים.

אנחנו כבר התמקדנו בהגדלה טיפולית של צמיחת כלי טחונות באמצעות השתלה של מונוציטים. טבע multifactorial של תהליך זה עשוי להסביר מדוע גורם יחיד מתקרב לתוצאות מעורבות הגדלת של arteriogenesis יצרו 13,14. זה הוביל בvestigation של טיפולים מבוססי תאים. תאי גזע ואב-מח עצם אוטולוגית נגזר זוהו כפוטנציאל תאים להשתלה, אלא רק יתרונות קליניים מתונים דווחו 15. מלבד מחקר על מינון, שיטות בידוד, ומסלולים ממשל, יש צורך במחקר נוסף עדיין כדי לקבוע את סוג התא האופטימלי. חסרון של השתלת תאי אוטולוגי יכול להיות חוסר היכולת שלהם להפעיל את התגובה החיסונית המולדת ו / או הסתגלות, ושניהם קריטיים לarteriogenesis. הגדלת דלקת מקומית עשויה לייצג את הגירוי הטוב ביותר עבור arteriogenesis 16.

הזרקה תוך ורידית של מונוציטים היא שיטה נפוצה להשתלת תאים בתוך מודלים עכבר אם משלוח סמים מערכתי הוא רצוי. בגלל השפעות מערכתיות, תופעות לוואי יכול להתרחש גם כן. ודא שהווריד מיועד להזרקה. זה נפוץ לבלבל עורקים וורידים, במיוחד כאשר הזרקת מיקרופון פיגמנט בכבדותדואר. הזרקת עורקים יכולה לגרום לתסחיפים, אשר יובילו לבעיות מערכתיות שבמחזור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well-ultra-low-attachment plate Corning Incorporated, NY, USA 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice  Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine GE Healthcare, Freiburg, Germany Fraction V, pH 7.0
Canules B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 28G, 30G
CD115 eBioscience, San Diego, USA 12-1152
CD11b eBioscience, San Diego, USA 53-0112
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany With cap, steril
Centrifuge Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10  Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan 
EDTA Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%  Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80 AbD Serotec, Düsseldorf, Germany MCA497APC
FACS buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA BD FACS Canto II
FACS tubes     Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1 eBioscience, San Diego, USA 53-5931
Heating plate  Labotect GmbH, Göttingen, Germany  Hot Plate 062
Incubator Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany Incu safe
Isofluran Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor Sigma Aldrich, Hamburg, Germany SRP3110 
Mechanical shaker IKA, Staufen, Germany ms2 minishaker
Medium 199 PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany Hera safe
Monocyte wash buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer Various
NaCl Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide) Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany pH 7.4, sterile
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit Integra bioscience, Fernwald, Germany Vacusafe comfort
Surgical scissors Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany 15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany Julabo SW22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15, (1), 1-12 (2004).
  2. Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Isolation and transduction of monocytes: promising vehicles for therapeutic arteriogenesis. Langenbecks Arch Surg. 391, (2), 72-82 (2006).
  3. Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American Journal Of Translational Research. 5, (2), 155-169 (2013).
  4. Leon, B., et al. Dendritic cell differentiation potential of mouse monocytes: monocytes represent immediate precursors of CD8- and CD8+ splenic dendritic cells. Blood. 103, (7), 2668-2676 (2004).
  5. Timmerman, J. M., Levy, R. Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 50, 507-529 (1999).
  6. Salem, M. L. The use of dendritic cells for Peptide-based vaccination in cancer immunotherapy. Methods Mol Biol. 1139, 479-503 (2014).
  7. Timmerman, J. M., et al. Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients. Blood. 99, (5), 1517-1526 (2002).
  8. Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43, (6), 367-371 (1981).
  9. Houthuys, E., Movahedi, K., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. Journal Of Immunological Methods. 359, (1-2), 1-10 (2010).
  10. Seeger, F. H., Tonn, T., Krzossok, N., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. European Heart Journal. 28, (6), 766-772 (2007).
  11. Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. The Journal Of Experimental Medicine. 206, (3), 595-606 (2009).
  12. Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties. J. Histochem. Cytochem. 59, (9), 813-825 (2011).
  13. Sneider, E. B., Nowicki, P. T., Messina, L. M. Regenerative medicine in the treatment of peripheral arterial disease. Journal Of Cellular Biochemistry. 108, (4), 753-761 (2009).
  14. Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. A critical review of clinical arteriogenesis research. J Am Coll Cardiol. 55, (1), 17-25 (2009).
  15. Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy. J Vasc Surg. 53, (2), 445-453 (2011).
  16. Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3, (2), e000611 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats