अलगाव और murine अस्थि मज्जा की नसों में इंजेक्शन व्युत्पन्न Monocytes

1Department for Cardiology, Angiology and Pneumology, Otto von Guericke University Magdeburg, 2Herzzentrum Dresden, Universitätsklinikum an der Technischen Universität Dresden, Technische Universität Dresden, 3Department of Public Health and Primary Care, University of Cambridge
Published 12/27/2014
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Immunology and Infection

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Summary

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Wagner, M., Koester, H., Deffge, C., Weinert, S., Lauf, J., Francke, A., et al. Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes. J. Vis. Exp. (94), e52347, doi:10.3791/52347 (2014).

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Abstract

Protocol

इस अध्ययन में पशु संरक्षण (24D-9,168.11-1 / 2008-24) के लिए जर्मन कानून की धारा 8 के अनुसार, सैक्सोनी और Saxony-Anhalt, Regierungspraesidium ड्रेसडेन / हाले के राज्य की अनुमति के साथ प्रदर्शन किया गया था।

एक सेल अलगाव

फीमर और टिबिया के 1.1 तैयारी

  1. एक बंद बिन में isoflurane के vaporizing द्वारा एक 5% isoflurane एकाग्रता का उपयोग करने के लिए माउस anesthetize। माउस तीन सेकंड के लिए चलते बंद कर दिया गया है के बाद, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं।
  2. इथेनॉल (96%) के साथ हिंद अंग कीटाणुरहित। त्वचा और मांसपेशियों को हटाने और एक बाँझ स्केलपेल के साथ हड्डियों को अलग।
    1. एक वंक्षण त्वचा चीरा के साथ प्रारंभ करें, और औसत दर्जे का malleolus की ओर चीरा का विस्तार करने और कम बछड़ा के आसपास की त्वचा के एक परिपत्र विच्छेदन प्रदर्शन करते हैं। Proximally यह छीलने से पूरी तरह से पैरों की त्वचा निकालें।
    2. एक तेज स्केलपेल के साथ फीमर से quadriceps मांसपेशियों को अलग करें, पूर्वकाल peroneus दोनों को हटा देंऔर gastrocnemius मांसपेशियों समूहों और पता लगाने और स्नायुबंधन विदारक द्वारा संयुक्त कूल्हे पर पैर बंटना।
    3. पूर्व से शुरू करें और ध्यान से, जिससे संयुक्त disarticulating, पैर घूर्णन और स्नायुबंधन transecting द्वारा संयुक्त चारों ओर आगे बढ़ें।
  3. सड़न रोकनेवाला सेल तैयारी की गारंटी करने के लिए 90 सेकंड की एक न्यूनतम के लिए 96% इथेनॉल के साथ फीमर और टिबिया धो लें। इथेनॉल शेष बंद कुल्ला करने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ कपड़े धोने की प्रक्रिया जारी है।
    नोट: सभी बाद के चरणों संक्रमण से बचने के लिए बाँझ होना चाहिए।

अस्थि मज्जा का 1.2 कटाई

  1. और्विक और टिबियल शाफ्ट के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए ठीक कैंची की एक जोड़ी के साथ प्रत्येक हड्डी के समीपस्थ और बाहर का अंत कट। इन हड्डियों को बहुत आसानी से तोड़ के बाद, इस कदम से सावधान रहें।
  2. गर्म मध्यम के साथ हड्डियों फ्लश (M199 + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन)। एक बाँझ 28-जी सुई, 1 मिलीलीटर सिरिंज, और 10-15 मिलीलीटर मध्यम प्रति के बीच का प्रयोग करेंधोने के लिए हड्डी।
  3. एक ठीक संदंश के साथ हड्डी पकड़ और यह अर्द्ध पारदर्शी बदल जाता है जब तक एक के बाद एक कुल्ला। ध्यान से सेल तनाव को कम करने के क्रम में सिरिंज सवार का अंत करने के लिए दबाव डालते हैं।
  4. एक 70 माइक्रोन नायलॉन वेब के माध्यम से अस्थि मज्जा फ़िल्टर और छानना इकट्ठा होते हैं। अस्थि मज्जा की अधिकतम मात्रा निकालने के लिए, बाहर का और समीपस्थ छोर से बार-बार कुल्ला।
  5. पीबीएस के साथ चलनी कुल्ला और छानना इकट्ठा होते हैं। ध्यान से मलबे और कोमल सरगर्मी और pipetting द्वारा सेलुलर कंपनियों के संगठन बेदखल।

1.3 खेती

  1. आरटी पर 10 मिनट के लिए 250 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और मध्यम के लगभग 25 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं resuspend। एक बार दोहराएँ।
  2. दूसरी धोने कदम के बाद मध्यम के 6 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend। Trypan नीले रंग के 50 μl के साथ सेल समाधान के 50 μl मिलाएं। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत एक गिनती चैम्बर में कोशिकाओं की गणना। ग की संख्या की गणनाइस सूत्र का उपयोग कर समाधान में एल:
    1 समीकरण
  3. प्लेट के नीचे करने के लिए स्थायी आसंजन को रोकने के लिए 6 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव सतह प्लेटों पर कोशिकाओं बीज। अच्छी तरह से प्रति अप करने के लिए 6 मिलीलीटर के साथ मिलीलीटर प्रति 10 6 कोशिकाओं के एक एकाग्रता का प्रयोग करें।
  4. सेल भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए 20 एनजी / एमएल एम-सीएसएफ के साथ निलंबन अनुपूरक।
  5. संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए कोशिकाओं और 5% कार्बन डाइऑक्साइड और दैनिक निरीक्षण करते हैं।

प्रकोष्ठों के 1.4 कटाई

नोट: ये कदम बर्फ पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए। तदनुसार 1.4.1 या 1.4.2 या तो साथ आगे बढ़ें।

  1. इस बिंदु पर, वे अल्ट्रा कम लगाव सतह प्लेटें हैं, भले ही संस्कृति-प्लेटों का पालन करना होगा कि विभेदित मैक्रोफेज सहित पूरे संस्कृति फसल।
    1. कोमल pipetting द्वारा पूरी संस्कृति फसल और 4 डिग्री सेल्सियस पंजाब का एक समाधान के साथ detachingएस, 0.5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 2 मिमी EDTA। अनिश्चित अगर एक खुर्दबीन के नीचे की पुष्टि - प्लेटों पक्षपाती कोशिकाओं शेष का स्पष्ट कर रहे हैं जब तक दोहराएँ।
  2. वैकल्पिक रूप से, मुख्य रूप से monocytes होते हैं जो निलंबन में कोशिकाओं के साथ सतह पर तैरनेवाला फसल कटाई से पक्षपाती मैक्रोफेज त्यागें।
    1. एक EDTA के मुक्त पीबीएस के समाधान और 0.5% BSA के साथ गैर पक्षपाती कोशिकाओं फसल। हल्का पक्षपाती मैक्रोफेज dislodging से बचने के लिए बहुत अधिक बल लागू नहीं है।

1.5 FACS-विश्लेषण (वैकल्पिक)

नोट: यह एमएसीएस के उपयोग के द्वारा CD117 + stem- और पूर्वज कोशिकाओं के सेल निलंबन व्यय करना संभव है। इस प्रक्रिया के लिए निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग करें।

  1. या तो 1.4.1 या 1.4.2 कदमों के अनुसार कोशिकाओं फसल।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 250 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और फिर इस चरण को दोहराएँ।
  3. FACS के बी के 300 μl में Resuspend कम से कम 250,000 कोशिकाओंजांच के प्रति uffer।
  4. एक 96 अच्छी तरह से थाली (अच्छी तरह से प्रति 30 μl) पर सेल समाधान स्थानांतरण।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
  6. सतह पर तैरनेवाला निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से (प्रयोग निर्माता कमजोर पड़ने) के लिए एंटीबॉडी के 25 μl जोड़ें।
  7. कदम के बाद सेल phenotyping के लिए निर्माता प्रोटोकॉल का पालन एंटीबॉडी (के साथ कोशिकाओं 1.5.1-1.5.6। Monocyte / बृहतभक्षककोशिका पहचान के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया मार्करों CD11b, F4 / 80 (चित्रा 3), CD115 शामिल दाग (चित्रा 2), और Gr- 1।
    नोट: सेल के समाधान के लिए एक और विवरण के लिए, सीडी 4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G, और CD192 तरह मार्कर के उपयोग की सिफारिश की है। सेलुलर विशेषताओं को पहले 12 में वर्णित किया गया।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए जांच सेते हैं।
  9. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 XG पर जांच और FACS बफर के 200 μl के साथ Resuspend। दोहराएँ वेंदो बार कदम है।
  10. FACS ट्यूबों में जांच के स्थानांतरण और FACS विश्लेषण 12 प्रदर्शन करते हैं।
  11. सेल भेदभाव का विश्लेषण करने के लिए दिन 0, 3 और 5 पर FACS विश्लेषण 12 प्रदर्शन करते हैं।

2. पूंछ नस इंजेक्शन

2.1 तैयारी

  1. के बारे में 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर जानवरों गर्म। Overheating के लक्षण पहचान करने के लिए वार्मिंग जबकि जानवरों का निरीक्षण करें।
  2. NaCl के 150 μl में, कदम 1.1- 1.4 में पृथक monocytes, Resuspend, और एक 30G सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज में कोशिकाओं को लोड। हल्के से सभी monocytes इंजेक्ट कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए सिरिंज लोड करने से पहले समाधान भंवर। हमेशा गर्मी की मध्यस्थता लगाव और monocytes के सक्रियण से बचने के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को संभाल।

2.2 निरोधक

  1. नसों में इंजेक्शन के लिए एक माउस का चयन करते समय पिंजरे में अन्य चूहों को परेशान करने से बचें।
  2. Restrainer में माउस रखें। बहुत ज्यादा पीआर से बचेंessure हिंद अंग के साथ सावधान रहना होगा और। (चित्रा 4)
    नोट: वैकल्पिक रूप से, जानवरों के तनाव मुक्त हैंडलिंग गारंटी करने के लिए सामान्य संज्ञाहरण का उपयोग करें।
  3. माउस restrainer बंद करने से पहले सांस लेने के लिए जगह है कि सुनिश्चित करें।

2.3 इंजेक्शन

  1. कीटाणुशोधन एजेंट के साथ इंजेक्शन साइट कीटाणुरहित। माउस की पूंछ पर स्प्रे और कम से कम 1 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
  2. नसों के बेहतर दृश्यता के लिए, इंजेक्शन साइट से ऊपर पार्श्व पूंछ ओर करने के लिए कोमल दबाव लागू करने के द्वारा पूंछ के शिरापरक रक्त प्रवाह को रोकने के।
  3. इंजेक्शन से पहले, पूंछ 90 डिग्री बारी। (चित्रा 5)
  4. एक 45 डिग्री के कोण पर इंजेक्षन। धीरे धीरे इंजेक्षन और जी के प्रति अधिक से अधिक 5 μl को नुकसान पहुँचाने जानवरों से बचने के लिए।
  5. एक असफल इंजेक्शन का एक संकेत है जो एक छाला, वहाँ है, तो तुरंत बंद और अधिक proximally इंजेक्शन दोहराएँ।
  6. कोमल पी लगाने से इंजेक्शन पक्ष में रक्तस्राव को रोकने केके बारे में एक मिनट के लिए ressure।
  7. प्रक्रिया के अंत में, प्रतिकर्षक खोलने के लिए और अपने पिंजरे में माउस जगह है।
  8. 20 मिनट पशु इंजेक्शन द्वारा नुकसान पहुंचाया नहीं किया गया था और sternal अवलंबन बनाए रखा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए माउस का निरीक्षण करें। माउस पर्याप्त होश आएगा जब तक प्रेक्षण के समय का विस्तार। यह पूरी तरह से ठीक हो गया है के बाद ही अन्य जानवरों की कंपनी के लिए माउस लौटें।

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Representative Results

murine अस्थि मज्जा से निकाले सेल समाधान के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के होते हैं। प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं लिम्फोसाइटों, granulocytes और monocytes हैं। सेल प्रकार के भेदभाव के 5 दिनों के बाद काटा दोनों देशी निलंबन और कोशिकाओं के लिए चित्र 1 में दिखाया गया है, जो आकार और विघटन, से अनुमान लगाया जा सकता है। खेती के दौरान स्थानांतरण सेलुलर संरचना पर ध्यान दें। हालांकि, आबादी का सही वर्गीकरण सेलुलर मार्करों के विशिष्ट अभिव्यक्ति पर भरोसा करना चाहिए।

एमपीएस-प्रणाली की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल सबसे महत्वपूर्ण मार्कर एम-सीएसएफ रिसेप्टर के रूप में कार्य करता है और विशेष रूप से monocyte पूर्वज, monocytes और मैक्रोफेज पर व्यक्त की है जो CD115 है। इसलिए, यह विशिष्ट एमपीएस-सबसेट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, लेकिन मज़बूती monocyte / बृहतभक्षककोशिका भेदभाव में संचालित कोशिकाओं की पूर्ण राशि का अनुमान कर सकते हैं। भिन्न दौरान CD115 अभिव्यक्ति का एक समय के लिए चित्र 2 देखेंentiation।

परिपक्वता मार्कर F4 / 80 किशोर monocytes, परिपक्व monocytes, और मैक्रोफेज अंतर करने के लिए उपयोगी है। मैक्रोफेज मार्कर के लिए नकारात्मक हैं जो monocyte पूर्वज, किशोर की तुलना में F4 / 80 के मजबूत अभिव्यक्ति दिखा। परिपक्व monocytes F4 / 80 के मध्यवर्ती अभिव्यक्ति दिखा। CD115 और F4 / 80 मार्कर का एक संयोजन इसलिए सेल भेदभाव (चित्रा 3 देखें) बढ़ाता और निगरानी के लिए एक व्यावहारिक विधि का प्रतिनिधित्व करता है।

CD115 और F4 / 80 के संयोजन से पहले कोशिकाओं के आवेदन करने के लिए दिनचर्या संस्कृति अवलोकन और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए पर्याप्त है। खेती के दिन 5 में अस्थि-मज्जा व्युत्पन्न monocytes के अधिक विस्तृत जांच के परिधीय रक्त monocytes 12 के लोगों को क़बूल में उनकी संरचनात्मक और कार्यात्मक संपत्तियों की पुष्टि करता है।

यह पूंछ पर तनाव से बचने, restrainer में ध्यान से माउस को ठीक करने के लिए महत्वपूर्ण है। Freedo प्रतिबंधितइंजेक्शन की सुविधा के लिए साँस लेने में बाधा के बिना जितना संभव आंदोलन की मी।

चित्रा 1
चित्रा 1. वाम पैनल:। संस्कृति में 1 दिन में सेल प्रकार की संरचना प्रकार की कोशिकाओं लिम्फोसाइटों, monocytes और granulocytes शामिल हैं। राइट पैनल: खेती के दौरान स्थानांतरण सेलुलर संरचना पर ध्यान दें। सेल की आबादी monocytes और मैक्रोफेज भी शामिल है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
भेदभाव के दौरान CD115 अभिव्यक्ति की चित्रा 2. इस समय। सभी कोशिकाओं की है कि> 95% नोट विशाल यह दर्शाता है कि भेदभाव के 5 दिनों के बाद सकारात्मक CD115 रहे हैं कोशिकाओं के बहुमत monocytes या मैक्रोफेज या तो कर रहे हैं। वर्गीकरण सेल आकार और विघटन, लेकिन विशिष्ट सेलुलर मार्करों अधिक विश्वसनीय हैं पर आधारित हो सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
। के monocyte / बृहतभक्षककोशिका परिपक्वता मार्कर F4 / 80 दिन 5 अभिव्यक्ति बढ़ाने चित्रा 3: monocyte phenotype के साथ संगत है, जो मध्यवर्ती F4 / 80 अभिव्यक्ति के साथ एक जनसंख्या के स्वरूप को ध्यान दें। दिन 7:। बृहतभक्षककोशिका परिपक्वता के साथ संगत F4 / 80 अभिव्यक्ति के अधिकार पारी नोट इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ई 4 "src =" / फ़ाइलें / ftp_upload / 52,347 / 52347fig4highres.jpg "/>
चित्रा 4. माउस, के बाद सावधानी से माउस निरोधक। पूंछ नस इंजेक्शन के लिए restrainer में तय नसों पृष्ठीय पक्ष पर दिखाई दे रहे हैं जब तक पूंछ 90 डिग्री बारी बारी से। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
माउस पूंछ चित्रा 5. योजनाबद्ध पार अनुभाग। तस्वीर माउस पूंछ के भीतर जहाजों के स्थान को दिखाता है। धमनियों (लाल) उदर और पृष्ठीय पक्ष पर स्थित है, और नसों पूंछ के पार्श्व पक्ष में हैं, कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम अस्थि मज्जा से murine monocytes के बड़ी मात्रा में अलग करने के लिए एक सरल और लागत प्रभावी विधि का वर्णन। Monocyte पैदावार 5 X10 6 1.4 से प्राप्त जो परिधीय रक्त का उपयोग अन्य प्रोटोकॉल, की तुलना में, हम एक ही दाता माउस से 11 एक्स 10 6 ± 3 एक्स 10 6 monocytes के अधिक पैदावार प्राप्त करने में सक्षम हैं।

इस विधि के साथ चुनौतियों पर विचार करते हैं, तो यह गैर बाँझ शर्तों के तहत काम कर रहे हैं जब संदूषण के लिए संभावित उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण है। Rinsing और निम्न धोने कदम, ठीक से पालन बैक्टीरिया और कवक द्वारा संदूषण नहीं कर रहे हैं, तो संभावना है। इसके अतिरिक्त, अस्थि मज्जा granulocytes, लिम्फोसाइटों और एर्य्थ्रोइद कोशिकाओं सहित विषम सेल निलंबन के होते हैं। आम तौर पर इन कोशिकाओं की वजह से वृद्धि कारकों की कमी के दिन दो और खेती के 3 के बीच गायब हो। वृद्धि कारक संचालित भेदभाव के बाद, मैक्रोफेज प्रदूषण का प्रमुख स्रोत हैं। टी रखने के लिएऔर मैक्रोफेज को monocytes के भेदभाव को कम करने, अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों के उपयोग और उपरोक्त धोने कदम महत्वपूर्ण हैं कम मैक्रोफेज की वह संख्या।

यह विशेष रूप से monocyte-विशिष्ट है कि एक मार्कर की पहचान करना मुश्किल है। मार्करों के बीच हस्तक्षेप से अधिक एक मार्कर का उपयोग जरूरी है, और परिवर्तनशीलता सेल निलंबन का विश्लेषण करने में विघटन और कोशिकाओं के आकार में है। मार्करों और आंकड़े 1-3 में दिखाए गए विवरण संस्कृति में प्रतिनिधि प्रकार की कोशिकाओं के लिए अच्छा विकल्प हैं। यह दिन 5. इसलिए यह CD115 और F4 / 80 जैसे अन्य मार्कर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, खासकर के बाद विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं भेद करना मुश्किल हो सकता है।

आसंजन मुक्त शर्तों के तहत अस्थि मज्जा कोशिकाओं के विस्तार को देखते हुए, बृहतभक्षककोशिका भेदभाव लंबे समय तक किया जा सकता है और समान monocytes जमा कर सकते हैं। बृहतभक्षककोशिका भेदभाव संदूषण इंगित करता है; हालांकि, डुकेवल संस्कृति से गैर चिपकने वाला कोशिकाओं कटाई करते हुए भी अल्ट्रा कम लगाव खेती सतहों पर उनके चिपकने वाला स्वभाव के लिए ई, वे आसानी से खारिज किया जा सकता है। पिछले प्रयोगों 1,3 में, मैक्रोफेज द्वारा संदूषण गंभीर नैदानिक ​​साइड इफेक्ट के लिए नेतृत्व नहीं किया है। अंगों और सेल प्रत्यारोपण के बाद चूहों की मांसपेशियों के histological workup इंजेक्ट मैक्रोफेज तिल्ली, जिगर या फेफड़ों जैसे अंगों में आत्मसात कर दिखाया। इन अंगों में मैक्रोफेज के आत्मसात चूहों में कोई नमूदार नैदानिक ​​प्रभाव का प्रदर्शन किया। इन मैक्रोफेज से चालू होने वाले आणविक तंत्र आगे की जांच के लिए दिलचस्प सवाल हो सकता है।

प्रणालीबद्ध जब लागू monocytes के रूप में अच्छी तरह से मैक्रोफेज विशेष रूप से, परिधीय धमनी रोग में arteriogenesis प्रभावित करते हैं। इस तरह के दिल का आवेश या बड़े पैमाने पर प्रणालीगत सूजन के रूप में नैदानिक ​​साइड इफेक्ट भी अधिक से अधिक 2.5 मिलियन monocytes के इंजेक्शन के बाद देखा नहीं जा सकता है, लेकिन इन कोशिकाओं में सूजन और पुलिस को गति प्रदान कर सकते हैंtentially गंभीर प्रणालीगत प्रभाव के कारण। मानव परीक्षणों में, इन प्रभावों नैदानिक ​​महत्व है की संभावना है। arteriogenesis के ट्रिगर ट्यूमर के विकास या मधुमेह रेटिनोपैथी, और भविष्य के अध्ययनों में पता लगाया जाना चाहिए इंजेक्ट सेल के समाधान के लिए इस तरह संभव प्रणालीगत प्रभाव को प्रभावित कर सकते हैं।

पिछले प्रकाशनों अस्थि मज्जा से monocytes के गुण परिधीय रक्त कोशिकाओं से अलग उन लोगों से अलग कर सकते हैं क्यों समझा जो परिधीय blood- और अस्थि मज्जा व्युत्पन्न monocytes, की विशेषताओं के बीच मतभेद का वर्णन 9।

अलगाव की विधि के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक ​​ब्याज की है। रक्त ड्राइंग के बजाय मानव अस्थि मज्जा निकालने के नैदानिक ​​चिकित्सा के संदर्भ में और अधिक व्यावहारिक है। यह जानवरों के कल्याण के बाद देखने के लिए और अगर जरूरत analgesia के लागू करने के लिए महत्वपूर्ण है। नसों में इंजेक्शन के लिए, यह जानवर और एक ही समय में सिरिंज दोनों से निपटने का अभ्यास करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक एकल Ani हैंमल कई इंजेक्शन के दौर से गुजर रहा है, नसों की गुणवत्ता और पूंछ की त्वचा पीड़ित हैं।

इन नुकसान के बावजूद, इस विधि व्यवहार और monocytes की विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी है। Atherosclerosis, इम्यूनोलॉजी या सूजन के क्षेत्र में प्रयोगों के लिए इस विधि से लाभ उठा सकते हैं। केवल 30 मिनट 6 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव सतह प्लेटों पर कोशिकाओं के बोने के लिए अस्थि मज्जा की निकासी से आवश्यक हैं। इस प्रोटोकॉल के उच्च उपज सेल दाताओं के रूप में आवश्यक जानवरों की संख्या कम से कम क्योंकि नैतिक चिंताओं को कम से कम कर रहे हैं। इस नई विधि monocytes शामिल कई अध्ययनों के लिए उपयोगी हो जाएगा।

हम monocytes के प्रत्यारोपण के जरिए जमानत के वाहिनियों की वृद्धि की चिकित्सीय वृद्धि पर ध्यान केंद्रित किया गया है। एकल कारक arteriogenesis की वृद्धि उत्पन्न किया है मिश्रित परिणाम 13,14 के लिए दृष्टिकोण क्यों इस प्रक्रिया के बहुघटकीय प्रकृति समझा जा सकता है। इस में करने के लिए नेतृत्व किया गया हैसेल आधारित चिकित्सा के vestigation। ऑटोलॉगस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए संभावित कोशिकाओं के रूप में पहचान की गई है, लेकिन केवल मध्यम नैदानिक ​​लाभ 15 सूचित किया गया है। खुराक, अलगाव विधियों, और प्रशासन मार्गों पर अनुसंधान के अलावा, आगे शोध अभी भी इष्टतम सेल प्रकार निर्धारित करने की जरूरत है। ऑटोलॉगस कोशिका प्रत्यारोपण का एक नुकसान यह सहज और / या अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय करने के लिए अपनी असमर्थता हो सकता है, और दोनों arteriogenesis के लिए महत्वपूर्ण हैं। स्थानीय सूजन बढ़ाने arteriogenesis 16 के लिए सबसे अच्छा प्रोत्साहन प्रतिनिधित्व कर सकते हैं।

प्रणालीगत दवा वितरण वांछित है monocytes की नसों में इंजेक्शन माउस मॉडल के भीतर सेल प्रत्यारोपण के लिए एक आम तरीका है। क्योंकि प्रणालीगत प्रभाव के साइड इफेक्ट के रूप में अच्छी तरह से हो सकता है। नस इंजेक्शन के लिए लक्षित है कि सुनिश्चित करें। यह विशेष रूप से भारी pigmented mic के इंजेक्शन लगाने जब धमनियों और नसों, भ्रमित करने के लिए आम बात हैई। धमनी इंजेक्शन प्रचलन में प्रणालीगत मुद्दों के लिए नेतृत्व जो एम्बोली, पैदा कर सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well-ultra-low-attachment plate Corning Incorporated, NY, USA 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice  Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine GE Healthcare, Freiburg, Germany Fraction V, pH 7.0
Canules B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 28G, 30G
CD115 eBioscience, San Diego, USA 12-1152
CD11b eBioscience, San Diego, USA 53-0112
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany With cap, steril
Centrifuge Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10  Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan 
EDTA Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%  Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80 AbD Serotec, Düsseldorf, Germany MCA497APC
FACS buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA BD FACS Canto II
FACS tubes     Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1 eBioscience, San Diego, USA 53-5931
Heating plate  Labotect GmbH, Göttingen, Germany  Hot Plate 062
Incubator Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany Incu safe
Isofluran Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor Sigma Aldrich, Hamburg, Germany SRP3110 
Mechanical shaker IKA, Staufen, Germany ms2 minishaker
Medium 199 PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany Hera safe
Monocyte wash buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer Various
NaCl Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide) Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany pH 7.4, sterile
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit Integra bioscience, Fernwald, Germany Vacusafe comfort
Surgical scissors Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany 15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany Julabo SW22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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