Forberedelse og respirometrisk Vurdering av Mitokondrier Isolert fra Skeletal Muscle Tissue Oppnådd ved perkutan Needle Biopsi

Medicine
 

Summary

Metoder for biopsi av vastus lateralis, utarbeidelse av renset mitokondrier, og respirometrisk profilering er beskrevet. Bruken av små muskelvolum gjør denne teknikken egnet for klinisk forskning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bharadwaj, M. S., Tyrrell, D. J., Lyles, M. F., Demons, J. L., Rogers, G. W., Molina, A. J. Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy. J. Vis. Exp. (96), e52350, doi:10.3791/52350 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Respirometrisk profilering av isolerte mitokondrier er vanlig å undersøke elektrontransportkjeden funksjon. Vi beskriver en fremgangsmåte for å oppnå prøver av humane vastus lateralis, isolere mitokondrier fra minimale mengder av skjelettmuskelvevet, og plate basert respirometrisk profilering ved hjelp av et ekstracellulært fluks (XF) analysator. Sammenligning av respirometrisk profiler oppnådd ved anvendelse av 1,0, 2,5 og 5,0 ug av mitokondrier indikerer at 1,0 ug er tilstrekkelig å måle respirasjon og at 5,0 ug gir mest konsistente resultater basert på sammenligning av standardfeil. Western blot-analyse av isolerte mitokondrier for mitokondriell markør COX IV og ikke-mitokondriell vev markør GAPDH indikerer at det er begrenset ikke-mitokondriell kontaminering ved bruk av denne protokollen. Muligheten til å studere mitokondrie respirometri i så lite som 20 mg av muskelvev lar brukerne benytte individuelle biopsier for flere studieendepunkter i kliniskforskningsprosjekter.

Introduction

Mitokondriene er de primære energiproduksjonsstedene i cellen, og har en viktig rolle i aldrings samt ulike aldersrelaterte forstyrrelser slik som kardiovaskulær sykdom, Alzheimers sykdom, diabetes, kreft og fedme. Respirometrisk profilering av isolerte mitokondrier gir direkte analyse av elektrontransportkjeden (ETC) funksjon og har bidratt betydelig til vår forståelse av mitokondriell biologi og dens rolle i helse og sykdom. Isolerte mitokondrier brukes til å studere ulike aspekter av bioenergi som, underlaget transport, ATP syntase aktivitet, proton lekkasje, etc. Metodikken er beskrevet i dette manuskriptet har blitt optimalisert for å tillate respirometrisk analyse av mitokondrier isolert fra skjelettmuskel vevsbiopsier hentet fra mennesker. Biopsi protokoll beskrevet i dette manuskriptet har blitt utnyttet av våre ansatte for de siste 12 årene. Vår gruppe har utført over 700 prosedyrer på voksne i ulike aldre,opp til 90 år gammel, og med ulike kroniske sykdomstilstander, uten noen uønskede sikkerhetsspørsmål. En sentral del av denne protokollen er at den er spesielt utviklet for å utnytte minimale mengder vev, og dermed tilrettelegge for sin bruk i kliniske studier.

Ulike protokoller har blitt utviklet for å isolere mitokondrier. Fernandez-Vizarra et al. 1,2 er beskrevet en fremgangsmåte for isolering av mitokondrier fra forskjellige rottevev samt dyrkede celler. Garcia-Cazarin et al. 3 har rapportert en metode for å isolere mitokondrier fra skjelettmuskulatur fra rotte og mus. En fremgangsmåte for isolering av mitokondrier fra rottehjerne er også blitt rapportert av Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross, et al., 5 rapportert en fremgangsmåte for å isolere mitokondrier hjelp av barocycler og / eller PCT ruller. Nylig, Claus et al. 6 rapporterte en metode for isolering av høyanriket mitokondrier ved hjelp av anti-TOM22 Magnetiske kuler.

Mens disse protokollene gi utmerkede resultater, krav vev størrelse er høy sammenlignet med den metode som er beskrevet i dette manuskriptet. For eksempel, Gross et al. 5 anvendes 1,5 til 1,8 g av gastrocnemius muskelen, og omtrent 2 g av nyrevevet. Tilsvarende Franco et al. 6 anvendt 500 mg muse levervev. Fra vår erfaring, typiske avkastning som kan forventes av perkutan nålebiopsi av skjelettmuskulaturen (vastus lateralis) varierer 100-200 mg. Evne til å vurdere mitokondriefunksjonen i 20-50 mg av muskelvev ved hjelp av protokollen beskrevet her tillater brukere å utføre flere vurderinger per biopsi og til å lagre prøvene for fremtidig bruk i andre molekylærbiologiske eksperimenter. Dette er en kritisk funksjon i klinisk forskning og andre studier som krever flittig bruk av prøver. Det skal bemerkes at tidligere frosne mitokondrier er ikke bra for å studere koplet åndedrett på grunn av ytre ringr mitokondrie membran skade og tap av Cytokrom C aktivitet. Vår metode er tilpasset og modifisert fra metoden utgitt av Chappell og Perry 7.

Ved hjelp av fremgangsmåtene beskrevet i dette manuskriptet, har vi nylig rapportert at respirometrisk profilen til mitokondriene isolert fra human vastus lateralis er direkte korrelert med fysiske egenskaper, målt som gangart hastighet 8.

Protocol

MERK: Protokollen er beskrevet ble godkjent av Institutional Review Board of Wake Forest School of Medicine. Informert samtykke ble innhentet skriftlig. Alle deltakerne var friske eldre voksne (65-79 år) av begge kjønn, med BMI som spenner 23-35.

1. Skeletal Muscle Biopsi

  1. Som beskrevet tidligere, 9 utføre alle biopsier i tidlig morgen etter en O / N fort. Spør fag å avstå fra å ta aspirin, reseptbelagte og over-the-counter ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler eller andre stoffer som kan påvirke blødning, blodplater, eller blåmerker for uken før biopsi. Be deltakerne også avstå fra anstrengende aktivitet i minst 36 timer før biopsi.
    MERK: Muskel oppnås fra vastus lateralis ved hjelp av perkutan kanyle biopsi teknikk med en perkutan kanyle under lokalbedøvelse med 1% lidokain. Ingen medisinske komplikasjoner eller other rapporterte bivirkninger fra prosedyren har skjedd i vår klinisk forskning enhet.
  2. MERK: biopsiprosedyren beskrevet er tilpasset fra den av Bergstrom 10.
    1. Kort, lokalt administrere 1% lidokain ta vare ikke å infiltrere muskelen. Følg denne med en 10 min vente periode for å tillate tilstrekkelig lammende.
    2. Ta biopsier fra magen av muskelen (midten regionen i muskel mellom innsetting og opprinnelse) å unngå subfascial og myotendonous områder.
      1. Bruk perkutan nål (en suge assistert gjenbrukbare enhet med en side kutte vindu og indre skjæring sylinder) og følge en fascial "pop" eller motstand av fascia som en guide.
      2. Anslå dybden med anestesi nål, så igjen føler det med den smale skalpell blad og lage en 4-5 mm snitt gjennom konseptet. Før nålen gjennom innsnittet inntil den er ført inn i muskelen.
      3. Samleflere prøver med vinduet vendt i forskjellige retninger. Påfør kontinuerlig sug ved hjelp av en 60 cc sprøyte mens fremme og uttak av muskelprøver inn i perkutan nål to til fire ganger i forskjellige retninger. Avvikle suging og ta ut nålen.
        MERK: Hver pass (innsetting og fjerning av nål) bør ta mindre enn et minutt.
      4. Har en assistent gjelder fast trykk for å punktere området for 5 min å etablere hemostase. Koble nål fra sugeslangen og fjern forsiktig muskelprøver fra vinduet og fat.
    3. Ta et nytt drag hvis mer muskler er nødvendig ved å gjenta prosedyren ovenfor.
    4. Fjern eventuelle synlige blodpropper fra muskelprøven ved hjelp av pinsett, veie prøven, og umiddelbart plassere i et rør som inneholder iskalde DPBS.
      MERK: Den gjennomsnittlige avkastningen ved hjelp av denne metoden er 150 ± 20 mg.

2. Mitokondrie Isolation

<ol>
  • Fersk forberede Chappel-Perry (CP) og mitokondriell undersøkelse Solution (MAS) buffere (tabell 1) på dagen for forsøket, eller delmengde og lagre dem ved -20 ° C. Fremstille forbindelsene i dimetylsulfoksyd ved en konsentrasjon på 2,5 mM, og alikvoter og oppbevares ved -20 ° C. Bruk buffer og sammensatte alikvotene lagret ved -20 ° C innen 2 måneder fra den dagen forberedelse.
  • Fjern synlig bindevev fra prøven ved å bruke skarp saks og pinsett; om nødvendig å bruke en disseksjonsmikroskop for dette trinnet. Grundig vask prøver 3-4 ganger med iskald DPBS buffer for å fjerne blod. Hold prøvene på iskalde DPBS og prosessen så snart som mulig, tar seg ikke å overstige mer enn 45 min fra biopsi. Ta forholdsregler for å forsiktig fjerne eventuelle sener eller fettvev fra muskelprøven.
  • Umiddelbart hogge muskelvev til fine stykker ved hjelp av en steril saks og suspendere i 500 ul til 1 ml inneholdende pr CPIoteinase (Nagarse) ved en konsentrasjon på 0,2 mg / g vev. Følg dette med en 5 min inkubasjon ved romtemperatur og deretter overføre til is.
  • Homogenisere hakket vev behandlet med Nagarse ved hjelp av en automatisert homogenisator. Holde prøven på is i løpet av denne prosessen. Homogen hver vevsprøve fire ganger, hver gang for en puls av 2 sekunder, ved hjelp av automatisert homogenisator ved en hastighet på 10.000 rpm. Vask sonden med 70% etanol, etterfulgt av destillert vann mellom vev.
  • Vask den homogeniserte vev med et likt volum av CP I (500 ul til 1 ml) og 2 x volum av CP II (1 ml til 2 ml), og samle opp innholdet i et sentrifugerør og sentrifuger ved 600 xg, 4 ° C i 10 min. Passere supernatanten gjennom et fuktet osteklede, samle opp filtratet og kast pelleten, og dermed fjerne mesteparten av ikke-mitokondrielle fraksjoner.
  • 3. Vask den Mitokondrier

    1. Sentrifuger supernatanten fra det foregående trinn ved 10,000 xg, 4 ° C i 10 min. Suspendere pelleten i 4 ml CP II buffer og videre sentrifuge ved 10 000 xg, 4 ° C i 10 min.
      MERK: I sjeldne tilfeller er en tynn pellet av blod dannet under mitokondrie pellet. I så fall bør du fjerne mitokondrie pellet ved forsiktig aspirasjon med CPII buffer. Dette trinnet kan unngås ved grundig å vaske vekk blodet ved trinn to.
    2. Suspendere pellet fås i 2 ml av CP jeg buffer. På dette stadiet bruke en liten porsjon av denne suspensjon til protein estimering. Resuspender den gjenværende prøven i CP I-buffer og sentrifugering som ovenfor. Suspendere den endelige pellet i en minimal mengde (200 mL) av mitokondriell undersøkelse Solution (MAS).
      MERK: protein analyseres på dette trinn fordi CP I-buffer ikke har BSA, mens MAS hvori prøvene blir senere suspendert har BSA i den.

    4. Beregn mitokondrie Innhold etter Måling Protein Konsentrasjon hjelp av en BCA Protein Assay Kit

    5. Utfør XF analyser som beskrevet av Rogers, GW, et al. 12

    MERK: Visual O 2 forbruk rate (OCR) i pmol O 2 / min, eller absolutte nivåer av O 2 og pH i datautgang.

    1. Bruk 1x MAS å fremstille forbindelser som skal injiseres. Legg til en 10x konsentrasjon av forbindelsene til portene AD for å gi en sluttkonsentrasjon på følgende måte: Port A, ADP [Adenosin 5 '-diphosphate, 2 mM, 50 pl]; port B, oligomycin (2 pM, 55 ul); port C, FCCP [-karbonyl cyanid 4- (trifluormetoksy) phenylhydrazone, 6 mikrometer, 60 mL]; og porten D, 2 uM antimycin-A (65 ul). Forberedetilstrekkelig volum av forbindelser for det nødvendige antall brønner.
    2. Bestemme den optimale mengde av mitokondria ved titrering. For eksempel last 1,0 ug, 2,5 ug og 5,0 ug av mitokondrier per brønn i en 50 ul volum av iskald 1x MAS inneholdende substrat. Å redusere variabiliteten mellom brønner, først fortynne 10x mitokondriene i kaldt 1x MAS + underlaget. Deretter leverer 50 pl av denne suspensjon til hver brønn (med unntak av bakgrunnskorrigering brønner).
    3. Sentrifuger plate ved 2000 xg, 20 min ved 4 ° C. Etter sentrifugering, tilsett 450 mL av 1x MAS + succinate (10 mm) og rotenon (2 mm) (startbetingelser, se nedenfor) til hver brønn. Vis mitokondriene under mikroskop for å sikre homogen tilslutning til den godt før overføre platen til XF analysator.
      MERK: De innledende betingelser som benyttes vil avhenge av om respirasjon er drevet av enten ETC kompleks I eller kompleks II. For komplekse II-drevet åndedrett, bruke succinate (10 mm) og rotenon (2 mm) som startbetingelsene. Rotenon blokker kompleks I og suksinat- gir drivstoff for kompleks II (succinatdehydrogenase). For å studere respirasjon drevet av kompleks I, bruke enten pyruvat og malat, hver ved en sluttkonsentrasjon på 5 mM eller glutamat og malat hver ved en sluttkonsentrasjon på 10 mM som startbetingelser. Sistnevnte kan hjelpe med å skille dysfunksjon blant tricarboxylic syresyklusen og underlaget transport. Å studere åndedrett drevet av både komplekse jeg og kompleks II, inkluderer pyruvat og succinate uten rotenon eller malat som startbetingelsene. Bruk palmitoyl carnitin som et substrat for β-oksidasjon.
    4. Sekvensielt måle mitokondriell respirasjon i sanntid ved hjelp av respirometer ved å programmere det som tidligere beskrevet 12. Bruk innstillingene for respirometer gitt i tabell 2.
      MERK: En kort forklaring av ulike mitokondrielle åndedrett stater er som følger:
    5. o = ikke-fosforylerende respirasjon indusert av oligomycin; State 3u = maksimal ukoplet åndedrett stimulert av uncoupler FCCP; Gjenværende ikke-mitokondriell respirasjon = åndedrett etter kompleks III inhibering av antimycin-A. Det skal også påpekes at, lengden av OCR-måling i kombinasjon med den mitokondrielle konsentrasjonen kan påvirke dataene ved å tappe oksygen under måleperiodene.

    6. Western Blot

    MERK: Bestem mitokondrie markør COX IV og hele vev GAPDH ved Western blotting å sikre anriking av mitokondrier i den endelige prøven

    1. Separer den isolerte mitokondrier og hele vev-ekstrakt med 12% natriumdodecylsulfat polyakrylamidgeler.
    2. Overfør proteinene på et polyvinylidenfluorid (PVDF) membran.
    3. Inkuber med COX IV-antistoff (1: 20.000), etterfulgt av pepperrotperoksydase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer. For GAPDH besluttsomhet, strippe den blot og sonde med en GAPDH monoklonalt antistoff (1: 2000).
      MERK: Hvis forskjeller i ER forurensning er av interesse, inkluderer ER markører som ERp72, calnexin, eller calreticulin i analysen.

    Representative Results

    Figur 1 viser et detaljert flytskjema av hele protokollen.

    Western blot profiler av COX IV / GAPDH (figur 2) viser ekspresjonen av mitokondrie protein, COX IV, og den ikke-mitokondriell markør, GAPDH. Uttrykk for både COX IV og GAPDH er tydelig i hele muskelen lysatet. Etter mitokondrier er isolert ved hjelp av den teknikk som er beskrevet i denne protokollen, COX IV band er fremdeles tydelig mens GAPDH er fraværende på samme eksponering. Lengre eksponeringer kan avsløre en svak GAPDH band. Disse blots tyder på at de isolerte mitokondrier har minimal ikke-mitokondriell forurensning. Videre er COX IV uttrykk i isolerte mitokondrier konsekvent mellom prøvene.

    Figur 3 viser typiske respirometrisk profiler drevet av kompleks II (succinat og rotenon) ved anvendelse av 1,0 ug, 2,5 ug og 5,0 ug av mitokondrier. Som forventet er samlet OCR økt wed høyere mengder av mitokondrier. Den beregnede respiratorisk kontrollforhold (RCR) for denne analysen er 7,95, noe som indikerer at den mitokondrielle preparat er av høy kvalitet. Videre state 3U OCR er noe høyere enn for tilstand 3, bekrefter mitokondrie kvalitet.

    For å sammenligne konsistensen av resultatene ved profilering forskjellige mengder av mitokondrier, utførte vi ANOVA (analyse av varians) og beregnet av summen av kvadratene (SS) som er-verdier av variansen ved anvendelse av 1,0 ug, 2,5 ug og 5,0 ug av mitokondrier lastet per vel (figur 4). SS er presentert for tilstand 2, tilstand 3, statlige 3U, antimycin, og RCR. For staten 2 og stat 3 målinger, var en måte ANOVA statistisk signifikant (p <0,01 og p <0,05, henholdsvis). Likeledes var det en statistisk signifikant måte ANOVA for antimycin og RCR (p <0,01 og p <0,0001, respektivt. Ingen signifikant forskjell ble observert for state 3u mellom gruppene. ThESE resultater indikerer at 5,0 ug mitokondrier per brønn ga den laveste SS sammenlignet med andre konsentrasjoner, og er den optimale mengde som skal brukes i XF 24 system med vår populasjon av deltakere.

    Figur 5 fungerer som en guide for å indikere hvor mye mitokondrie protein kan forventes basert på den opprinnelige muskelutvalgsstørrelsen. Som ventet er det en sterk korrelasjon mellom mengden av muskelen (mg) behandlet, og det totale mitokondrieproteininnhold (mg) av den endelige prøven.

    Chappel-Perry buffer I (KPI)
    Kjemisk Konsentrasjon
    KCl 100 mM
    MOPS 50 mM
    EDTA 1 mm
    MgSO4 5 mm
    ATP 1 mm pH 7.4
    Chappel-Perry buffer II (CPII)
    Kjemisk Konsentrasjon
    KCl 100 mM
    MOPS 50 mM
    EDTA 1 mm
    MgSO4 5 mm
    ATP 0,2 mm
    Fettsyre gratis BSA 0.50%
    pH 7.4
    Mitokondrie analysen Solution (MAS) (2X)
    Kjemisk Konsentrasjon
    Sukrose 35 mm
    Mannitol 110 mm
    KH 2 PO 4 2,5 mM
    MgCl2 2,5 mM
    HEPES 1,0 mm
    EGTA 0,5 mm
    Fettsyre gratis BSA 0,10%
    pH 7.4
    Mitokondrie analysen Solution (MAS) med komplekse II startbetingelser
    Kjemisk Konsentrasjon
    1X MAS
    Suksinat 10 mm
    Rotenon 2 mikrometer
    pH 7.4
    Mitokondrie analysen Solution (MAS) med komplekse I startbetingelser
    Kjemisk Konsentrasjon
    1X MAS
    Pyruvat 5 mm
    Malat 5 mm
    pH 7.4
    * Alle buffere til å bli gjort i deionisert vann

    Tabell 1. Løsning og buffer oppskrifter.

    >
    Protokoll Steps
    StartProtocol
    Kommando (Min) Port
    Kalibrere 0.00
    Vent 10.00
    Bland 1.00
    Vent 3.00
    Bland 1.00
    Vent 3.00
    Bland 0.50
    Mål 3.00
    Bland 1.00
    Mål 3.00
    Bland 0.50
    Injisere A
    Bland 1.00
    Mål 6.00
    Bland 1.00
    Injisere B
    Bland 1.00
    Mål 3.00
    Bland 1.00
    Injisere C
    Bland 1.00
    Mål 3.00
    Bland 1.00
    Injisere D
    Bland 1.00
    Mål 3.00
    EndProtocol

    Tabell 2. Mix, måle, og bland syklus innstilling for respirometer.

    Figur 1
    Figur 1. Flytskjema av hele protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg "/>
    Figur 2. En representant Western blot for hele skjelettmuskulatur vev samt isolerte mitokondrier. Whole vevsekstrakt samt isolerte mitokondrier ble immunblottet med COX IV antistoff som mitokondrie markør og GAPDH antistoff for ikke-mitokondrie kontroll. Ingen GAPDH bandet ble observert i den isolerte mitokondrier indikerer liten eller ingen forurensning fra ikke-mitokondrie kilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 3
    Figur 3. Representant respirometrisk profilen til mitokondriene isolert fra menneskelig vastus lateralis. Tre konsentrasjoner av isolerte mitokondrier, 5,0 mikrogram, 2,5 mikrogram, og 1,0 mikrogram vi re benyttet i denne analysen. Endelige konsentrasjoner av forbindelser etter port injeksjoner var 2 mM ADP (port A); 2 mikrometer oligomycin (port B); 6 mikrometer FCCP (port C); og 2 pM antimycin (port D). Beregnet RCR for denne kjøringen var 7,95. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    Figur 4. Sum av kvadrater. Sum av kvadrater for de ulike mitokondrie åndedrett stater og RCR bruker 5,0 mikrogram, 2,5 mikrogram, og 1,0 mikrogram mitokondrier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    ig5highres.jpg "/>
    Figur 5. Dette kan brukes som en guide for å estimere mengden av mitokondrie protein som kan forventes på grunnlag av den opprinnelige muskelprøven vekt Regresjonsanalyse:. Av mengden av muskel (mg) og total mitokondrie protein utbytte (mg). Som forventet, er det en direkte positiv korrelasjon mellom mengden av muskelen og den totale mitokondrie protein erholdt.

    Discussion

    Isolerte mitokondrier er ofte benyttet i studier som undersøker rollen til ETC funksjon, så vel som andre mitokondrielle aktivitet, blant annet substrat transport og TCA-syklus funksjon. Respirometrisk analyser ved hjelp av isolerte organ tillate direkte undersøkelse av grunnleggende prosesser i oksidativ fosforylering og iboende egenskapene til ETC. Respirometrisk profilering av isolerte mitokondrier i forhold til hele celler eller permeabiliserte muskelfibre har fordeler av relativt enkel data tolkning og fravær av "forstyrrelser" fra ikke-mitokondrie prosesser eller endringer i mitokondriell masse / biogenese. Normalisering av data er basert på mitokondrie proteininnhold, og dermed lar grei cross-sammenligning av mitokondrier mellom prøver. Respirometrisk profilering av isolerte mitokondrier er en foretrukket tilnærming når målet med studien er å bestemme underliggende mekanismer og identifisere spesifikke mål som ETC komponents / komplekser, eller mitokondrielle transportmekanismer.

    Beskrevet er en protokoll for muskelbiopsi og isolering av funksjonell mitokondrier fra små vevsprøver. Denne metode gir reproduserbare resultater mellom brukere på grunn av utnyttelse av en automatisert homogenisator versus hånddrevne Dounce homogenisatorer. Isolering av mitokondriene kan utføres med så lite som 20 mg av muskelvev. Mengden av isolerte mitokondrier som kan hentes fra denne utvalgsstørrelsen er tilstrekkelig til å kjøre Seahorse plate-baserte respirometri samtidig la overskudd mitokondrier for andre eksperimenter og lagring for ytterligere molekylære analyser. Det kan bemerkes at denne metoden kan oversettes til XF 96, hvor enda mindre mengder av mitokondriene kan brukes (1-2 ug per brønn).

    Flere protokoller for å isolere mitokondrier stole på Dounce homogenizers for første vev avbrudd. En ulempe med denne metoden er at praktisk natur av den opprinnelige vevhomogenisering. Den kraft og hastighet av stampe i homogenisatoren kan variere betydelig mellom operatører 6. Dette kan resultere i eksperiment til eksperiment variasjon, samt lab-på-lab variasjon, og fører til vanskeligheter ved sammenligning av data mellom eksperimentene. Dette er av spesiell bekymring i humane intervensjonsstudier når data fra deltakerne blir samlet ved forskjellige tidspunkter, vanligvis før og etter behandling, og eventuelt på flere steder. Vi bruker en automatisert homogenisator for en mer konsistent metode som gir mer reproduserbare resultater med begrenset person-til-person-variant. Hastigheten til preparatet gjør også denne metode er egnet for håndtering av flere prøver på samme tid. Vanligvis kan opp til tre eksperimenter utføres på en enkelt dag.

    Potensielle begrensninger av den teknikk som er beskrevet her oppstår fra bruken av isolerte organeller og bruken av en plate basert format. For eksempel, Picard et al. har demonstrated at isolerte mitokondrier har funksjonelle egenskaper som skiller seg fundamentalt fra de av intakte mitokondrier i permeabiliserte myofibers. De foreslo at mitokondrie isolasjonsteknikker føre til endrede bioenergetisk funksjon, for eksempel betydelig økt RCR forhold til permeabiliserte myofibers ledsaget av større reaktive oksygenarter produksjon 13. Sammenlignet med permeabiliserte muskelfibre, isolering av mitokondrier krever lengre forberedelsestid. Også tap av celleinnholdet avtar fysiologiske relevans, noe som er fastholdt i hele celler og selv permeabiliserte fibre. Bruken av plate-baserte respirometri med de beskrevne teknikken tillater replikere kjører per prøve. Imidlertid må mitokondrier holder seg til bunnen av hver brønn. Denne konfigurasjonen er forskjellige fra deres normale miljø og kan påvirke funksjonelle egenskaper. I tillegg bør det bemerkes at bruk av denne protokollen for mitokondrie isolasjon, there kan fortsatt være forurensning fra endoplasmatisk retikulum (ER) i mitokondrie preparatet. Forskjeller i ER forurensning kan påvirke fastsettelsen av mitokondrie avkastning og påvirke resultatene.

    Som konklusjon, viser denne studien data som bekrefter at mitokondriene isolert fra vevene ved hjelp av denne fremgangsmåten, er funksjonelt aktiv og kan anvendes for undersøkelser / applikasjoner som krever høy kvalitet isolerte mitokondrier fra minimal mengde av skjelettmuskelprøver. Fordelen med denne metoden er at: i) det er mulig å isolere mitokondrier fra minimale mengder av skjelettmuskulatur, ii) fremgangsmåten er rask, iii) med plate-basert teknologi, er det mulig å kjøre flere prøver på samme tid, og iv) det er nok overskudd vev og isolerte mitokondrier etter bioenergetisk assay for prøveoppbevaring og andre molekylærbiologiske undersøkelser.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    Homogenizer Bio-Gen PRO200 BioExpress
    Eppendorf Centrifuge 5804 R Fisher Scientific
    Deepwell late Rotor  Fisher Scientific
    6 mm University College Hospital Needle Cadence
    60 cc syringe Fisher Scientific
    96-well plate reader Tecan (Genios-basic)
    Seahorse XF 24-3 analyzer Seahorse Biosciences, Inc.
    Protein gel system Life Technologies (Invitrogen)
    Kodak Gel Logic 112 Carestream Health, Inc
    Kodak camera assembly Carestream Health, Inc
    Consumables
    XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge Seahorse Bioscience 100850-001
    100867-100
    Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich Co 221473
    Hydrochloric acid (HCl) Acros 12421-0010
    Dulbecco's Phosphate buffered saline  Lonza 17-512F
    Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P333
    MOPS Fisher Scientific BP308
    EDTA Fisher Scientific BP118
    Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich Co M7506
    ATP Sigma-Aldrich Co A9187
    Fatty acid-free BSA Calbiochem 126575
    Sucrose Sigma-Aldrich Co S0389
    Bacterial proteinase Sigma-Aldrich Co P-8038
    D-Mannitol Sigma-Aldrich Co M9546
    KH2PO4 Fisher Scientific P284
    Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich Co M9272
    HEPES Sigma-Aldrich Co H3784
    EGTA Sigma-Aldrich Co E3889
    BCA protein assay kit Sigma-Aldrich Co PI23227
    Succinic Acid* Sigma-Aldrich Co S3674
    Pyruvic acid* Sigma-Aldrich Co P5280
    Malic acid* Sigma-Aldrich Co 2288
    ADP(K+ salt)* Sigma-Aldrich Co A5285
    XF Cell mito stress test kit Seahorse Biosciences 101706
    Tween-20 Santa Cruz Biotechnology, Inc.  SC-29113
    NuPAGE 12% Bis-Tris Gel Life Technologies (Invitrogen) NP0343BOX
    Immobilin Transfer Membranes (0.45 um) Millipore IPVH20200
    MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml Life Technologies (Invitrogen) NP0001
    NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter Life Technologies (Invitrogen) NP0006-1
    Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin) Abcam ab14734
    Primary antibodies (mAB to GAPDH) Abcam ab9484
    Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled PerkinElmer NEF822E001EA
    Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled PerkinElmer NEF812E001EA
    *ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only 

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).
    2. Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods. 26, 292-297 (2002).
    3. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (2011).
    4. Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA. Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).
    5. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).
    6. Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PloS One. 8, e82392 (2013).
    7. Chappell, J. B., Perry, S. V. The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria. The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).
    8. Tyrrell, D. J., et al. Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. (2014).
    9. Nicklas, B. J., et al. Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women. Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).
    10. Bergstrom, J. Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).
    11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746 (2011).
    12. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS One. 6, e18317 (2011).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics