Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

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Summary

Verfahren zur Biopsie des Vastus lateralis, Herstellung von gereinigtem Mitochondrien und respirometrischen Profiling beschrieben. Die Verwendung von kleinen Muskelvolumen macht diese Technik für klinische Forschung.

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Bharadwaj, M. S., Tyrrell, D. J., Lyles, M. F., Demons, J. L., Rogers, G. W., Molina, A. J. Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy. J. Vis. Exp. (96), e52350, doi:10.3791/52350 (2015).

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Abstract

Respirometrische Profilierung von isolierten Mitochondrien wird allgemein zur Atmungskette Funktion zu untersuchen. Wir beschreiben eine Methode zur Gewinnung von Proben menschlichen Vastus lateralis, Isolierung von Mitochondrien minimale Mengen an Skelettmuskelgewebe und Platte basiert respirometrischen Profilerstellung mit einer extrazellulären Fluss (XF) Analysator. Vergleichs respirometrischer Profile erhalten unter Verwendung von 1,0, 2,5 und 5,0 ug Mitochondrien zeigen, daß 1,0 ug ausreichend ist, um die Atmung zu messen, und daß 5,0 ug liefert konstante Ergebnisse basierend auf dem Vergleich der Standardfehler. Western-Blot-Analyse der isolierten Mitochondrien für mitochondriale Marker COX IV und nicht-mitochondrialen Gewebemarker GAPDH darauf hin, dass es nur begrenzte nicht-mitochondrialen Kontamination mit diesem Protokoll. Die Fähigkeit, mitochondriale respirometry in so wenig wie 20 mg des Muskelgewebes studieren ermöglicht Benutzern individuelle Biopsien mehrerer Endpunkte der Studie wurden in der klinischen NutzungForschungsprojekte.

Introduction

Mitochondrien sind die Primärenergieproduktionsstandorte in der Zelle und eine wichtige Rolle bei der Alterung sowie verschiedene altersbedingte Erkrankungen wie Herz-Kreislauf-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Diabetes, Krebs und Fettleibigkeit. Respirometrische Profilierung von isolierten Mitochondrien bietet direkte Analyse der Elektronentransportkette (ETC) Funktion und hat wesentlich zu unserem Verständnis der mitochondrialen Biologie und ihre Rolle in Gesundheit und Krankheit beigetragen. Isolierten Mitochondrien werden verwendet, um verschiedene Aspekte des bioenergetischen dergleichen Substrattransport, ATP-Synthase-Aktivität, Protonenleck usw. Die in diesem Manuskript beschriebenen Methodik wurde optimiert, um respirometrischen Analyse von Mitochondrien aus Skelettmuskelgewebe Biopsien aus humanen Probanden isoliert ermöglichen studieren. Die in dieser Handschrift beschrieben Biopsie-Protokoll wurde von unseren Mitarbeitern für die letzten 12 Jahre genutzt. Unsere Gruppe hat über 700 Verfahren durchgeführt bei Erwachsenen unterschiedlichen Alters,bis zu 90 Jahre alt, und mit verschiedenen chronischen Krankheitszuständen ohne nachteilige Sicherheitsfragen. Ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist, dass es speziell für die minimale Mengen von Gewebe zu verwenden, wodurch ihre Verwendung in klinischen Studien erleichtert.

Verschiedene Protokolle zur Isolierung von Mitochondrien entwickelt. Fernandez-Vizarra et al. 1,2 beschrieben, ein Verfahren zur Isolierung von Mitochondrien aus verschiedenen Rattengeweben sowie kultivierte Zellen. Garcia-Cazarin et al. 3 haben ein Verfahren zur Isolierung von Mitochondrien aus Skelettmuskeln von Ratten und Mäusen berichtet. Verfahren zur Isolierung von Mitochondrien aus Rattenhirn wurde auch von Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross berichtet, et al. 5 über ein Verfahren zur Isolierung von Mitochondrien mit der barocycler und / oder der PCT Schredder. Kürzlich Franko et al. 6 über ein Verfahren zur Isolierung von hochangereichertem Mitochondrien mit Anti-TOM22 Magnetischen Kügelchen.

Während diese Protokolle liefern hervorragende Ergebnisse sind Gewebe Größenanforderungen hoch im Vergleich zu dem in dieser Handschrift beschriebenen Methode. Zum Beispiel, Gross et al. 5 verwendet 1,5-1,8 g des M. gastrocnemius und etwa 2 g des Nierengewebes. Ebenso Franco et al. 6 verwendet 500 mg Mauslebergewebe. Aus unserer Erfahrung, typische Ausbeuten von perkutanen Nadelbiopsie der Skelettmuskulatur (Vastus lateralis) erwarten reichen von 100 bis 200 mg. Die Fähigkeit, die Funktion der Mitochondrien in 20 bis 50 mg mit der hier beschriebenen Protokoll Muskelgewebe zu bewerten ermöglicht Benutzern, mehrere Assessments pro Biopsie und zur Lagerung von Proben für die spätere Verwendung in anderen molekularbiologische Experimente durchführen. Dies ist ein entscheidendes Merkmal in der klinischen Forschung und anderen Studien, die sorgfältige Verwendung von Proben erfordern. Es sei darauf hingewiesen, dass die zuvor eingefroren Mitochondrien sind nicht gut für die Untersuchung gekoppelt Atmung aufgrund oute werdenr Mitochondrienmembran Beschädigung und Verlust von Cytochrom-C-Aktivität. Unsere Methode wurde angepasst und von der von Chappell und Perry 7 veröffentlichte Methode modifiziert.

Mit den in dieser Handschrift beschriebenen Methoden, haben wir vor kurzem berichtet, dass die respirometrischen Profil von Mitochondrien aus menschlichen Vastus lateralis isoliert ist direkt mit Behinderung, gemessen als Gehgeschwindigkeit 8 korreliert.

Protocol

HINWEIS: Die beschriebenen wurde vom Institutional Review Board der Wake Forest School of Medicine genehmigten Protokoll. Eine Einverständniserklärung wurde schriftlich erhalten. Alle Teilnehmer waren gesunden älteren Erwachsenen (65-79 Jahre) beider Geschlechter, mit BMI zwischen 23-35.

1. Skelettmuskelbiopsie

  1. Wie zuvor beschrieben, 9 führen alle Biopsien am frühen Morgen, nachdem ein A / N schnell. Fragen Sie die Themen, zum von Aspirin, verschreibungspflichtigen und OTC-the-counter-nicht-steroidale entzündungshemmende Medikamente oder andere Verbindungen, die Blutungen, Blutplättchen oder Blutergüsse in der Woche vor der Biopsie beeinflussen können unterlassen. Bitten Sie die Teilnehmer auch von jeder anstrengenden Tätigkeit zu enthalten mindestens 36 Stunden vor der Biopsie.
    HINWEIS: Muscle aus dem Vastus lateralis erhalten mit dem perkutanen Nadelbiopsie Technik mit einem perkutanen Nadel unter Lokalanästhesie mit 1% Lidocain. Keine medizinische Komplikationen oder other berichteten Nebenwirkungen von dem Verfahren wurden in unserem klinischen Forschungseinheit aufgetreten.
  2. HINWEIS: Die beschriebene Biopsieprozedur wird von der Bergstrom 10 ausgelegt.
    1. Kurz gesagt, lokal zu verabreichen 1% Lidocain kümmert sich nicht um den Muskel zu infiltrieren. Befolgen Sie diese mit einem 10 Minuten Wartezeit, um eine ausreichende Betäubung ermöglichen.
    2. Nehmen Sie die Biopsien aus dem Bauch des Muskels (der mittlere Bereich des Muskels zwischen Ein- und Herkunft) zu vermeiden subfaszialen und myotendonous Bereichen.
      1. Verwenden perkutane Nadel (eine Saugwirkung unterstützt wiederverwendbaren Gerät mit einem Seitenschneider Fenster und Innenschneidzylinder) und folgen einer Faszien "Pop" oder Widerstand der Faszie als Leitfaden.
      2. Schätzen Sie die Tiefe der Anästhesie Nadel, dann wieder das Gefühl, es mit der schmalen Skalpell und eine 4-5 mm Schnitt durch die Faszie. Die Kanüle durch den Einschnitt, bis es in den Muskel eingeführt wird.
      3. Sammelnmehrere Proben mit dem Fenster gedreht in verschiedenen Richtungen. Bewerben Dauersog mit einem 60-ml-Spritze beim Vorrücken und Zurückziehen Muskelproben in die perkutane Nadel zwei bis vier Mal in verschiedene Richtungen. Unterbrechen Sie die Saug- und entfernen Sie die Nadel.
        HINWEIS: Jeder Durchlauf (Einsetzen und Entfernen der Nadel) weniger als eine Minute.
      4. Einen Assistenten anwenden festen Druck auf Website Punktion für 5 Minuten, um eine Hämostase zu etablieren. Trennen Nadel aus Saugschlauch und entfernen Sie vorsichtig Muskelproben aus dem Fenster und Zylinder.
    3. Einen zweiten Durchgang, wenn mehr Muskel wird durch Wiederholen des obigen Verfahrens benötigt.
    4. Entfernen Sie alle sichtbaren Blutgerinnseln aus der Muskelprobe mit einer Pinzette, wiegen die Probe, und sofort in ein Röhrchen mit eiskaltem DPBS platzieren.
      HINWEIS: Der Durchschnittsertrag mit dieser Methode ist 150 ± 20 mg.

2. Mitochondriale Isolation

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  • Frisch bereiten die Chappel-Perry (CP) und mitochondriale Assay-Lösung (MAS) Puffer (Tabelle 1) am Tag des Experiments oder aliquotieren und lagern Sie sie bei -20 ° C. Bereiten Sie die Verbindungen in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 2,5 mM und aliquote und bei -20 ° C. Verwenden Sie die bei -20 ° C innerhalb von 2 Monaten ab dem Tag der Vorbereitung gespeicherten Puffer und Verbindung Aliquots.
  • Sichtbare Bindegewebe aus der Probe mit einer scharfen Schere und Pinzette; Bei Bedarf Verwendung eines Binokular für diesen Schritt. Gründlich waschen Proben 3-4 mal mit eiskaltem DPBS-Puffer, um Blut zu entfernen. Bewahren Sie die Proben auf eiskaltem DPBS und Verfahren so schnell wie möglich, dabei mehr als 45 Minuten von Biopsie nicht zu überschreiten. Nehmen Sie vorsorglich sorgfältig entfernen Sie alle Sehnen oder Fettgewebe von der Muskelprobe.
  • Unmittelbar hacken Muskelgewebe in feine Stücke mit einer sterilen Schere und Aussetzung in 500 ul zu 1 ml enthält CPI proteinase (Nagarse) in einer Konzentration von 0,2 mg / g Gewebe. Folgen Sie dieser mit einer 5-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur und dann in Eis zu übertragen.
  • Homogenisieren Hackfleisch Gewebe mit Nagarse behandelt unter Verwendung eines automatischen Homogenisator. Halten Sie die Probe auf Eis während des gesamten Prozesses. Homogenisieren jeder Gewebeprobe vier Mal, jedes Mal für einen Impuls von 2 sec, unter Verwendung des automatisierten Homogenisator bei einer Geschwindigkeitseinstellung von 10.000 Upm. Waschen Sie die Sonde mit 70% Ethanol, gefolgt von destilliertem Wasser zwischen Geweben.
  • Mit einem gleichen Volumen von CP I (500 & mgr; l bis 1 ml) und 2x Volumen CP II (1 ml bis 2 ml) waschen des homogenisierten Gewebes und sammeln sich die Inhalte in ein Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 600 × g, 4 ° C für 10 min. Übergeben Sie den Überstand durch ein Käsetuch benetzt, das Filtrat und entsorgen Sie den Pellet und damit die Mehrheit der nicht-mitochondriale Fraktionen zu entfernen.
  • 3. Waschen der Mitochondrien

    1. Zentrifugieren Sie den Überstand aus dem obigen Schritt 10,000 × g, 4 ° C für 10 min. Suspendiere das Pellet in 4 ml CP-Puffer II und weitere Zentrifuge bei 10.000 × g, 4 ° C für 10 min.
      HINWEIS: In seltenen Fällen wird eine dünne Pellet von Blut unter der mitochondrialen Pellet geformt. In diesem Fall nehmen Sie die mitochondriale Pellet durch vorsichtiges Ansaugen mit CPII Puffer. Dieser Schritt kann durch gründliches Waschen entfernt Blut in Schritt 2 vermieden werden.
    2. Hängen Sie das in 2 ml CP I Puffer erhaltenen Pellets. In dieser Phase mit einem kleinen Aliquot dieser Suspension für die Proteinschätzung. Resuspendieren die verbleibende Probe in CP I wie oben Puffer und Zentrifuge. Suspendiere das endgültige Pellet in einer minimalen Menge (200 ul) der mitochondrialen Assaylösung (MAS).
      HINWEIS: Das Protein wird in dieser Phase untersucht, da CP I Puffer keine BSA, während MAS in dem die Proben später ausgesetzt werden muss haben BSA darin.

    4. Schätzen Sie die Mitochondrial Inhalt von Messproteinkonzentration unter Verwendung eines BCA Protein Assay Kit

    5. Führen Sie die XF-Assays wie von Rogers, GW et al. 12

    HINWEIS: Visualisieren der O 2 Verbrauchsrate (OCR) in pMol O 2 / min oder absoluten Werte von O 2 und pH-Wert in dem Datenausgang.

    1. Verwenden 1x MAS um Verbindungen herzustellen, die injiziert werden. Fügen Sie einen 10x Konzentration der Verbindungen auf die Ports AD, um eine Endkonzentration geben wie folgt: Anschluss A, ADP [Adenosin 5 '-diphosphate, 2 mM, 50 ul]; Port B, Oligomycin (2 & mgr; M, 55 & mgr; l); Port C, FCCP [Carbonylcyanid 4- (Trifluormethoxy) Phenylhydrazon, 6 & mgr; M 60 ul]; und Port D, 2 uM Antimycin-A (65 ul). Bereitenausreichendes Volumen von Verbindungen für die erforderliche Anzahl von Vertiefungen.
    2. Die Ermittlung der optimalen Menge an Mitochondrien durch Titration. Zum Beispiel maximal 1,0 ug, 2,5 ug und 5,0 ug Mitochondrien pro Vertiefung in einer 50-ul-Volumen eiskaltem 1x MAS enthaltenden Substrat. Um die Variabilität zwischen den Wells zu minimieren, zunächst verdünnen 10x Mitochondrien in kaltem 1x MAS + Substrat. Anschließend liefern 50 ul dieser Suspension in jede Vertiefung (mit Ausnahme der Untergrundkorrektur Brunnen).
    3. Zentrifugieren Sie die Platte bei 2.000 × g, 20 min bei 4 ° C. Nach dem Zentrifugieren vorsichtig mit 450 ul 1x MAS + Succinat (10 mM) und Rotenon (2 uM) (Anfangsbedingungen, siehe unten) in jede Vertiefung. Die Mitochondrien unter dem Mikroskop sehen homogene Festhalten an der auch vor der Übertragung der Platte an der XF-Analysator zu gewährleisten.
      HINWEIS: Die verwendeten davon ab, ob die Atmung wird entweder durch ETC-Komplex I oder komplexe II gefahren abhängt Anfangsbedingungen. Für komplexe II gesteuerte Beatmung, mit succinate (10 mM) und Rotenon (2 & mgr; M) als Anfangsbedingungen. Rotenon Blöcke Komplex I und Succinat liefert Brennstoff für komplexe II (Succinatdehydrogenase). Die Atmung von Komplex I angetrieben studieren, verwenden entweder Pyruvat und Malat, jeweils bei einer Endkonzentration von 5 mM oder Glutamat und Malat jeweils bei einer Endkonzentration von 10 mM als Anfangsbedingungen. Letzteres kann bei der Unterscheidung Dysfunktion bei Tricarbonsäurezyklus und Substrat-Transport zu helfen. Atmung sowohl Komplex I und komplexe II angetrieben zu studieren, sind Pyruvat und Succinat ohne Rotenon oder Malat als Anfangsbedingungen. Verwenden Palmitoylcarnitin als ein Substrat für β-Oxidation.
    4. Nacheinander messen die mitochondriale Atmung in Echtzeit mit Hilfe der Respirometer durch Programmierung es wie zuvor beschrieben 12. Verwenden Sie die Einstellungen für die Respirometer in Tabelle 2 bereitgestellt.
      HINWEIS: Eine kurze Erläuterung der verschiedenen mitochondrialen Atmung Zustände sind wie folgt:
    5. o = nicht-Phosphorylierung Atmung durch Oligomycin induziert; Staats 3u = maximale abgekoppelt Atmung durch den Entkoppler FCCP stimuliert; Rest nicht-mitochondriale Atmung = Atmung nach komplexen III Hemmung durch Antimycin-A. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass die Länge des OCR-Messung in Kombination mit der mitochondrialen Konzentration konnten die Angaben abbau Sauerstoff während der Messzeiträume zu beeinflussen.

    6. Western Blot

    HINWEIS: Legen Sie die mitochondriale Marker COX IV und ganze Gewebe GAPDH durch Western-Blotting, um die Anreicherung von Mitochondrien in die endgültige Stichprobe zu gewährleisten

    1. Trenne die isolierten Mitochondrien und ganze Gewebeextrakt von 12% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen.
    2. Transfer der Proteine ​​auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran.
    3. Inkubieren mit COX IV-Antikörper (1: 20.000), gefolgt von Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten sekundären Antikörpern. Für GAPDH Bestimmung, Streifen der Blot und Sonde mit einer GAPDH monoklonalen Antikörper (1: 2000).
      HINWEIS: Wenn Unterschiede in der ER Kontamination von Belang sind, umfassen ER Marker wie ERp72, Calnexin, Calreticulin oder in der Analyse.

    Representative Results

    1 zeigt ein detailliertes Flußdiagramm des gesamten Protokolls.

    Western-Blot-Profile von COX IV / GAPDH (Figur 2) zeigen die Expression des mitochondrialen Protein, COX IV, und der nicht-mitochondriale Marker GAPDH. Expression sowohl COX IV und GAPDH in der Gesamtmuskel Lysat evident. Nach Mitochondrien werden mit dem in diesem Protokoll beschriebenen Technik isoliert sind COX IV Bands immer noch deutlich während GAPDH abwesend gleichzeitig Belichtung. Längere Einwirkung kann ein schwaches GAPDH Band offenbaren. Diese Flecken zeigen, dass die isolierten Mitochondrien haben minimale nicht-mitochondrialen Kontamination. Darüber hinaus ist COX IV-Expression in isolierten Mitochondrien Einklang zwischen den Proben.

    Abbildung 3 zeigt typische respirometrischen Profile durch komplexe II (Succinat und Rotenon) angetrieben mit 1,0 ug, 2,5 ug und 5,0 ug Mitochondrien. Wie erwartet, ist die allgemeine OCR w erhöhtith höhere Mengen an Mitochondrien. Die berechnete respiratorische Steuerungsverhältnis (RCR) für diesen Assay ist 7,95, was anzeigt, dass die mitochondriale Zubereitung ist von hoher Qualität. Weiterhin ist Zustand 3u OCR etwas höher als die der Zustand 3, bestätigt mitochondrialen Qualität.

    Um die Konsistenz der Ergebnisse zu vergleichen, wenn Profiling unterschiedliche Mengen an Mitochondrien, führten wir ANOVA (Varianzanalyse) und berechnet die Summe der Quadrate (SS) als Ist-Werte der Varianz mit 1,0 ug, 2,5 ug und 5,0 ug pro Mitochondrien geladen und (4). SS ist für Zustand 2 Zustand 3 Zustand 3u, Antimycin A und RCR vorgestellt. Für den Zustand 2 und Zustand 3 Messungen, war einer ANOVA statistisch signifikant (p <0,01 bzw. p <0,05). Ebenso war die Einweg-ANOVA statistisch signifikant für Antimycin und RCR (p <0,01 und p <0,0001 auf. War kein signifikanter Unterschied für staatliche 3u zwischen den Gruppen zu sehen. These Ergebnisse zeigen, dass 5,0 & mgr; g der Mitochondrien pro Vertiefung gab die niedrigste SS im Vergleich zu anderen Konzentrationen und ist der optimale Betrag in der XF 24-System mit unserer Bevölkerung der Teilnehmer zu verwenden.

    Figur 5 dient als eine Führung, um anzuzeigen, wie viel mitochondrialen Protein, bezogen auf das ursprüngliche Muskelprobengröße erwarten. Wie erwartet gibt es eine starke Korrelation zwischen dem Ausmaß der Muskel (mg) verarbeitet und die Gesamt mitochondriale Proteingehalt (mg) der Endprobe.

    Chappel-Perry-Puffer I (CPI)
    Chemikalie Konzentration
    KCl 100 mM
    MOPS 50 mM
    EDTA 1 mM
    MgSO 4 5 mM
    ATP 1 mM pH 7.4
    Chappel-Perry-Puffer II (CPII)
    Chemikalie Konzentration
    KCl 100 mM
    MOPS 50 mM
    EDTA 1 mM
    MgSO 4 5 mM
    ATP 0,2 mM
    Fettsäurefrei BSA 0,50%
    pH 7.4
    Mitochondrial Assaylösung (MAS) (2X)
    Chemikalie Konzentration
    Saccharose 35 mM
    Mannitol 110 mM
    KH 2 PO 4 2,5 mM
    MgCl2 2,5 mM
    HEPES 1,0 mM
    EGTA 0,5 mM
    Fettsäurefrei BSA 0,10%
    pH 7.4
    Mitochondriale Assay-Lösung (MAS) mit komplexen II Anfangsbedingungen
    Chemikalie Konzentration
    1X MAS
    Bernsteinsäure- 10 mM
    Rotenon 2 & mgr; M
    pH 7.4
    Mitochondriale Assay-Lösung (MAS) mit Komplex I Anfangsbedingungen
    Chemikalie Konzentration
    1X MAS
    Pyruvat 5 mM
    Malate 5 mM
    pH 7.4
    * Alle Puffer in entionisiertem Wasser hergestellt werden

    Tabelle 1 Lösung und Puffer Rezepte.

    >
    Protokoll Schritte
    StartProtocol
    Befehl Zeit (min) Port
    Kalibrieren 0.00
    Warten Sie 10,00
    Mischen 1.00
    Warten Sie 3.00
    Mischen 1.00
    Warten Sie 3.00
    Mischen 0.50
    Maßnahme 3.00
    Mischen 1.00
    Maßnahme 3.00
    Mischen 0.50
    Injizieren A
    Mischen 1.00
    Maßnahme 6.00
    Mischen 1.00
    Injizieren B
    Mischen 1.00
    Maßnahme 3.00
    Mischen 1.00
    Injizieren C
    Mischen 1.00
    Maßnahme 3.00
    Mischen 1.00
    Injizieren D
    Mischen 1.00
    Maßnahme 3.00
    EndProtocol

    Tabelle 2. Mix, messen und mischen Zyklus Einstellung für die Respirometer.

    Figur 1
    Abbildung 1: Flussdiagramm des gesamten Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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    Abbildung 2. Eine repräsentative Western-Blot für ganze Skelettmuskelgewebe sowie isolierten Mitochondrien. Whole Gewebeextrakt sowie isolierte Mitochondrien wurden mit COX IV Antikörper als mitochondrialen Marker und GAPDH-Antikörper für nicht mitochondrialen Kontroll immungeblottet. Kein GAPDH Band wurde in der isolierten Mitochondrien beobachtet, was wenig oder keine Verunreinigungen von nicht-mitochondrialen Quellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

    Figur 3
    Abbildung 3. Repräsentative respirometrischen Profil von Mitochondrien aus menschlichen Vastus lateralis isoliert. Drei Konzentrationen von isolierten Mitochondrien, 5,0 ug, 2,5 ug und 1,0 ug wir Re in diesem Assay verwendet. Endkonzentrationen der Verbindungen nach Port-Injektionen waren 2 mM ADP (Anschluss A); 2 uM Oligomycin (Port B); 6 uM FCCP (Port C); und 2 uM Antimycin A (Port D). Berechnete RCR für diesen Lauf war 7.95. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

    4
    Abbildung 4. Summe der Quadrate. Summe der Quadrate für die verschiedenen mitochondrialen Atmung Staaten und RCR unter Verwendung von 5,0 & mgr; g, 2,5 ug und 1,0 ug Mitochondrien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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    Figur 5. Dies kann als eine Führung verwendet, um die Menge des mitochondrialen Protein, bezogen auf das ursprüngliche Muskel Einwaage Regressionsanalyse erwartenden abzuschätzen:. Der Menge des Muskels (mg) und die gesamten mitochondrialen Proteingehalt (mg). Wie erwartet gibt es eine direkte positive Korrelation zwischen der Menge des Muskels und der Gesamt mitochondrialen Protein erhalten.

    Discussion

    Isolierten Mitochondrien werden oft in Studien, die die Rolle von ETC-Funktion, sowie andere mitochondriale Aktivitäten, einschließlich Substrattransport und TCA-Zyklus-Funktion zu untersuchen genutzt. Respirometrische Tests unter Verwendung von isolierten Organellen ermöglichen direkte Untersuchung der grundlegenden Prozesse der oxidativen Phosphorylierung und intrinsischen Eigenschaften des ETC. Respirometrische Profilierung von isolierten Mitochondrien im Vergleich zu ganzen Zellen oder permeabilisierten Muskelfasern hat den Vorteil, relativ einfach die Interpretation der Daten und das Fehlen von "Einmischung" von nicht-mitochondrialen Prozesse oder Veränderungen im mitochondrialen Masse / Biogenese. Die Normalisierung der Daten auf der mitochondrialen Proteingehalt, wodurch einfache Quervergleich der Mitochondrien zwischen den Proben ermöglicht. Respirometrische Profilierung von isolierten Mitochondrien ist eine bevorzugte Vorgehensweise, wenn das Ziel der Studie ist es, festzustellen, zu Grunde liegenden Mechanismen und die Ermittlung konkreter Ziele wie ETC Komponentes / Komplexen oder mitochondrialen Transportmechanismen.

    Beschrieben ist ein Protokoll zur Muskelbiopsie und Isolierung von funktionellen Mitochondrien aus kleinen Gewebeproben. Diese Methode führt zu reproduzierbaren Ergebnissen zwischen den Benutzern durch die Nutzung eines automatisierten Homogenisator gegenüber Hand bedient Dounce-Homogenisator. Isolierung von Mitochondrien können mit so wenig wie 20 mg des Muskelgewebes geführt werden. Die Menge an isolierter Mitochondrien, die aus dieser Stichprobengröße erhalten werden kann, ist ausreichend, um Seahorse Platte-basierte Respirometrie laufen, während überschüssige Mitochondrien für andere Experimente und die Lagerung für die weitere molekulare Analysen. Es sei darauf hingewiesen, dass dieses Verfahren zum XF 96, wobei auch kleinere Mengen von Mitochondrien kann verwendet werden (1-2 & mgr; g pro Vertiefung) übersetzt werden kann.

    Mehrere Protokolle zur Isolierung von Mitochondrien setzen auf Dounce-Homogenisator für die erste Gewebezerstörung. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die praktische Art der AusgangsgewebeHomogenisierung. Die Kraft und Geschwindigkeit der Stößel im Homogenisator deutlich zwischen den Betreibern 6 variieren. Dies kann im Experiment zu Experiment Variation sowie Labor zu Labor Variation führen, und führt zu Schwierigkeiten beim Vergleich von Daten zwischen den Experimenten. Dies ist von besonderer Bedeutung in Interventionsstudien, wenn Daten von den Teilnehmern an getrennten Zeitpunkten typischerweise vor und nach der Behandlung und möglicherweise an mehreren Stellen gesammelt. Wir verwenden eine automatisierte Homogenisator für einen einheitlicheren Ansatz, der mehr reproduzierbare Ergebnisse mit begrenzten Mensch-zu-Mensch-Variante ergibt. Die Geschwindigkeit der Herstellung macht diesen Ansatz für den Umgang mit mehreren Proben gleichzeitig. Typischerweise können bis zu drei Versuche an einem einzigen Tag durchgeführt werden.

    Potentielle Einschränkungen der hier beschriebenen Technik ergeben sich aus der Verwendung von isolierten Organellen und der Verwendung eines plattenbasierten Format. Beispielsweise Picard et al. haben Dämonstrated dass isolierten Mitochondrien besitzen funktionellen Eigenschaften, die sich grundlegend von denen des intakten Mitochondrien in permeabilisierten Muskelfasern unterscheiden. Sie schlugen vor, dass die mitochondriale Isolationstechniken führen zu veränderten bioenergetischen Funktion, wie deutlich erhöht RCR Vergleich zu permeabilisierten Muskelfasern und verstärkte Produktion reaktiver Sauerstoffspezies 13. Im Vergleich zu permeabilisierten Muskelfasern, Isolierung von Mitochondrien ist erfordern längere Vorbereitungszeit. Auch Verlust zellulären Gehalt vermindert physiologische Relevanz, etwas, das in ganzen Zellen und sogar permeabilisiert Fasern zurückgehalten wird. Die Verwendung von Plattenbasis Respirometrie mit den beschriebenen Technik ermöglicht replizieren Läufe pro Probe. Jedoch müssen Mitochondrien zum Boden jeder Vertiefung haften. Diese Konfiguration unterscheidet sich von ihrer gewohnten Umgebung und können funktionelle Eigenschaften zu beeinflussen. Außerdem sollte beachtet werden, dass unter Verwendung dieses Protokolls für mitochondriale Isolierung there können noch Verunreinigungen von endoplasmatischen Retikulum (ER) in der mitochondrialen Präparation sein. Unterschiede in der ER eine Verunreinigung die Bestimmung der mitochondrialen Ertrag und Einfluss Ergebnisse beeinflussen.

    Abschließend dieser Studie präsentiert Daten, die bestätigt, dass die Mitochondrien aus Gewebe mit diesem Verfahren isoliert sind funktionell aktiv und kann für Studien / Anwendungen, die hochwertige isoliert Mitochondrien aus minimalen Skelettmuskelproben erfordern. Der Vorteil dieser Methode ist, dass: i) ist es möglich, den Mitochondrien von minimalen Mengen an Skelettmuskulatur zu isolieren, ii) das Verfahren ist schnell, iii) mit der Platte auf der Basis-Technologie ist es möglich, mehrere Proben gleichzeitig laufen, und iv) es gibt genug überschüssige Gewebe und isolierten Mitochondrien nach der bioenergetischen Test zur Probenlagerung und andere molekularbiologische Untersuchungen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    Homogenizer Bio-Gen PRO200 BioExpress
    Eppendorf Centrifuge 5804 R Fisher Scientific
    Deepwell late Rotor  Fisher Scientific
    6 mm University College Hospital Needle Cadence
    60 cc syringe Fisher Scientific
    96-well plate reader Tecan (Genios-basic)
    Seahorse XF 24-3 analyzer Seahorse Biosciences, Inc.
    Protein gel system Life Technologies (Invitrogen)
    Kodak Gel Logic 112 Carestream Health, Inc
    Kodak camera assembly Carestream Health, Inc
    Consumables
    XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge Seahorse Bioscience 100850-001
    100867-100
    Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich Co 221473
    Hydrochloric acid (HCl) Acros 12421-0010
    Dulbecco's Phosphate buffered saline  Lonza 17-512F
    Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P333
    MOPS Fisher Scientific BP308
    EDTA Fisher Scientific BP118
    Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich Co M7506
    ATP Sigma-Aldrich Co A9187
    Fatty acid-free BSA Calbiochem 126575
    Sucrose Sigma-Aldrich Co S0389
    Bacterial proteinase Sigma-Aldrich Co P-8038
    D-Mannitol Sigma-Aldrich Co M9546
    KH2PO4 Fisher Scientific P284
    Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich Co M9272
    HEPES Sigma-Aldrich Co H3784
    EGTA Sigma-Aldrich Co E3889
    BCA protein assay kit Sigma-Aldrich Co PI23227
    Succinic Acid* Sigma-Aldrich Co S3674
    Pyruvic acid* Sigma-Aldrich Co P5280
    Malic acid* Sigma-Aldrich Co 2288
    ADP(K+ salt)* Sigma-Aldrich Co A5285
    XF Cell mito stress test kit Seahorse Biosciences 101706
    Tween-20 Santa Cruz Biotechnology, Inc.  SC-29113
    NuPAGE 12% Bis-Tris Gel Life Technologies (Invitrogen) NP0343BOX
    Immobilin Transfer Membranes (0.45 um) Millipore IPVH20200
    MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml Life Technologies (Invitrogen) NP0001
    NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter Life Technologies (Invitrogen) NP0006-1
    Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin) Abcam ab14734
    Primary antibodies (mAB to GAPDH) Abcam ab9484
    Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled PerkinElmer NEF822E001EA
    Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled PerkinElmer NEF812E001EA
    *ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only 

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    References

    1. Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).
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