Vurdering af mitokondrier Forberedelse og respirometrisk Isoleret fra skeletmuskelvæv Fremstillet ved perkutan nålebiopsi

Medicine
 

Summary

Metoder til biopsi af vastus lateralis, udarbejdelse af renset mitokondrier, og respirometrisk profilering beskrives. Brugen af ​​små muskler volumen gør denne teknik er egnet til klinisk forskning applikationer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bharadwaj, M. S., Tyrrell, D. J., Lyles, M. F., Demons, J. L., Rogers, G. W., Molina, A. J. Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy. J. Vis. Exp. (96), e52350, doi:10.3791/52350 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Respirometrisk profilering af isolerede mitokondrier er almindeligt anvendt til at undersøge elektron transportkæde funktion. Vi beskriver en fremgangsmåde til opnåelse af prøver af humane vastus lateralis, isolering mitokondrier fra minimale mængder af skeletmuskelvæv og plade baseret respirometrisk profilering ved anvendelse af en ekstracellulær flux (XF) analysator. Sammenligning af respirometriske profiler fremstillet ved hjælp 1,0, 2,5 og 5,0 ug mitokondrier viser, at 1,0 ug er tilstrækkelig til at måle respiration og at 5,0 ug giver mest konsistente resultater baseret på en sammenligning af standard fejl. Western blot analyse af isolerede mitokondrier for mitokondrie markør COX IV og ikke-mitokondrie væv markør GAPDH indikerer, at der er begrænset ikke-mitokondrie forurening ved hjælp af denne protokol. Evnen til at studere mitokondriel respirometri i så lidt som 20 mg muskelvæv giver brugerne mulighed for at udnytte de enkelte biopsier for flere studier endepunkter i kliniskforskningsprojekter.

Introduction

Mitokondrier er de primære energiproduktion produktionssteder i cellen og har vigtige roller i aldring samt forskellige aldersrelaterede lidelser, såsom hjerte-kar-sygdom, Alzheimers sygdom, diabetes, kræft, og fedme. Respirometrisk profilering af isolerede mitokondrier giver direkte analyse af elektron transportkæden (ETC) funktion og har bidraget væsentligt til vores forståelse af mitokondrie biologi og dens rolle i sundhed og sygdom. Isolerede mitokondrier bruges til at undersøge forskellige aspekter af bioenergetik som substrat transport ATP-syntase-aktivitet, proton lækage etc. er beskrevet i dette manuskript metode er optimeret til at tillade respirometrisk analyse af mitokondrier isoleret fra skeletmuskelvæv biopsier opnået fra humane individer. Den biopsi protokollen beskrevet i dette manuskript er blevet udnyttet af vores personale i de sidste 12 år. Vores gruppe har udført over 700 procedurer på voksne i forskellige aldre,op til 90 år, og med forskellige kroniske sygdomstilstande uden nogen negative sikkerhedsspørgsmål. Et centralt aspekt af denne protokol er, at det er specielt designet til at udnytte minimale mængder af væv, hvilket letter dens anvendelse i kliniske forskningsundersøgelser.

Forskellige protokoller er blevet udviklet til at isolere mitokondrier. Fernandez-Vizarra et al. 1,2 beskrives en fremgangsmåde til isolering af mitokondrier fra forskellige rottevæv samt dyrkede celler. Garcia-Cazarin et al. 3 har rapporteret en metode til isolering af mitokondrier fra skeletmuskler fra rotter og mus. En fremgangsmåde til isolering af mitokondrier fra rottehjerne er også blevet rapporteret af Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross, et al. 5 rapporteret en fremgangsmåde til isolering af mitokondrier hjælp af barocycler og / eller PCT shredder. For nylig Franko et al. 6 rapporteret en fremgangsmåde til isolering af højt beriget mitokondrier anvendelse af anti-TOM22 Magnetiske perler.

Mens disse protokoller give fremragende resultater, er høje krav væv størrelse i forhold til den, der er beskrevet i dette manuskript metode. For eksempel Gross et al. 5 anvendes 1,5-1,8 g musculus gastrocnemius og ca. 2 g af nyrevævet. Tilsvarende Franco et al. 6 anvendes 500 mg mus levervæv. Fra vores erfaring, at typiske udbytter kan forventes af perkutan nål biopsi af skeletmuskulaturen (vastus lateralis) spænder fra 100-200 mg. Evnen til at vurdere mitokondriefunktion i 20-50 mg af muskelvæv under anvendelse af protokollen beskrevet her tillader brugerne at udføre flere vurderinger pr biopsi og til at gemme prøver til senere brug i andre molekylærbiologiske eksperimenter. Dette er et afgørende træk i klinisk forskning og andre undersøgelser, der kræver omhyggelig brug af prøver. Det skal bemærkes, at tidligere frosne mitokondrier er ikke godt for at studere koblet respiration grund outer mitochondriebeskadigelse membran og tab af cytochrom C aktivitet. Vores metode er blevet tilpasset og ændret fra metoden udgivet af Chappell og Perry 7.

Ved hjælp af metoderne beskrevet i dette manuskript, har vi for nylig rapporteret, at respirometrisk profil mitokondrier isoleret fra human Vastus lateralis er direkte korreleret med fysisk formåen, målt som gangart hastighed 8.

Protocol

BEMÆRK: Den beskrevne blev godkendt af Institutional Review Board af Wake Forest School of Medicine protokol. Informeret samtykke blev opnået skriftligt. Alle deltagerne var raske ældre voksne (65-79 år) af begge køn, med BMIs spænder fra 23 til 35.

1. skeletmuskelbiopsi

  1. Som tidligere beskrevet, 9 udføre alle biopsier i den tidlige morgen, efter en O / N hurtigt. Spørg de emner til at afstå fra at tage aspirin, receptpligtige og over-the-counter non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler, eller andre forbindelser, der kan påvirke blødning, blodplader, eller blå mærker for ugen forud for biopsi. Spørg deltagerne også afholde sig fra enhver anstrengende aktivitet i mindst 36 timer forud for biopsi.
    BEMÆRK: Muskel opnås fra Vastus lateralis ved hjælp af perkutan nål biopsi teknik med en perkutan nål under lokalbedøvelse med 1% lidocain. Ingen medicinske komplikationer eller oTher rapporterede bivirkninger fra procedure har fundet sted i vores kliniske forskningsenhed.
  2. BEMÆRK: biopsi beskrevne er tilpasset fra det Bergstrom 10.
    1. Kort fortalt lokalt administrerer 1% lidocain pas på ikke at infiltrere musklen. Følg dette med en 10 min ventetid periode at tillade tilstrækkelig bedøvende.
    2. Tag biopsier fra bugen af ​​musklen (den midterste region af muskel mellem indsættelse og oprindelse) undgå subfascial og myotendonous områder.
      1. Brug perkutan nål (en suge bistået genanvendelig anordning med en side skære vindue og indvendige skærende cylinder) og følge en fascial "pop" eller modstand af fascia som en vejledning.
      2. Skøn dybden med anæstesi nål, så igen føler det med den smalle skalpelblad og lave en 4-5 mm snit gennem fascia. Føres nålen gennem snittet, indtil den er indsat i musklen.
      3. Samlflere prøver med vinduet drejes i forskellige retninger. Anvend kontinuerlig sugning under anvendelse af en 60 ml sprøjte, mens fremme og fratagelse muskel prøver til perkutan nål to til fire gange i forskellige retninger. Afbryd suge- og fjern nålen.
        Bemærk: Hver pass (indføring og fjernelse af nålen) bør tage mindre end et minut.
      4. Har du en assistent anvende fast tryk på punkturstedet i 5 min for at etablere hæmostase. Afbryd nål fra sugeslangen og fjern forsigtigt muskel prøver fra vinduet og tønde.
    3. Lav en anden passage, hvis flere muskler der er behov for ved at gentage ovenstående procedure.
    4. Fjern eventuelle synlige blodpropper fra musklen prøve med pincet, vejer prøven, og straks placere i et rør indeholdende iskolde DPBS.
      BEMÆRK: Det gennemsnitlige udbytte ved hjælp af denne metode er 150 ± 20 mg.

2. mitokondrie Isolation

<ol>
  • Frisk forberede Chappel-Perry (CP) og Mitochondrial testoploesningen (MAS) buffere (tabel 1) på dagen for forsøget, eller portion og gemme dem ved -20 ° C. Forbered forbindelserne i dimethylsulfoxid ved en koncentration på 2,5 mM og alikvot og opbevares ved -20 ° C. Brug buffer og sammensatte portioner opbevaret ved -20 ° C inden 2 måneder fra den dag, forberedelse.
  • Fjern synlig bindevæv fra prøven ved hjælp af skarpe saks og pincet; hvis det er nødvendigt brug et dissektionsmikroskop for dette trin. Vask grundigt prøver 3-4 gange med iskold DPBS buffer til at fjerne blod. Hold prøverne på iskolde DPBS og processen så hurtigt som muligt, pas på ikke at overskride mere end 45 min fra biopsi. Tag forholdsregler for at omhyggeligt fjerne eventuelle sener eller fedtvæv fra musklen prøven.
  • Umiddelbart Hak muskelvæv i fine stykker ved hjælp af en steril saks og suspendere 500 pi til 1 ml CPI indeholdende proteinase (Nagarse) ved en koncentration på 0,2 mg / g væv. Følg dette med en 5 min inkubation ved stuetemperatur, og derefter overføre til is.
  • Homogenisere hakket væv behandlet med Nagarse anvendelse af en automatiseret homogenisator. Hold prøven på is i hele denne proces. Homogeniser hver vævsprøve fire gange, hver gang for en puls af 2 sek, ved hjælp af den automatiserede homogenisator ved en hastighed indstilling på 10.000 rpm. Vask proben med 70% ethanol efterfulgt af destilleret vand mellem væv.
  • Vask homogeniseret væv med et lige volumen af ​​CP I (500 pi til 1 ml) og 2x volumen CP II (1 ml til 2 ml), og samle indholdet i et centrifugerør og centrifugeres ved 600 xg, 4 ° C for 10 min. Før supernatanten gennem et vædet osteklæde, filtratet opsamles og smid pillen, og dermed fjerne de fleste ikke-mitokondrie fraktioner.
  • 3. Vask mitokondrierne

    1. Centrifugeres supernatanten fra det ovennævnte trin ved 10,000 xg, 4 ° C i 10 min. Suspender pelleten i 4 ml CP II puffer og yderligere centrifugering ved 10.000 xg, 4 ° C i 10 min.
      BEMÆRK: I sjældne tilfælde er en tynd pellet af blod dannet under den mitokondrie pellet. I så fald, skal du fjerne mitokondrie pellet ved forsigtig aspiration med CPII buffer. Dette trin kan undgås ved grundig vask væk blod i trin 2.
    2. Suspender den opnåede pellet i 2 ml CP I buffer. På dette stadium bruge en lille portion af denne suspension for protein estimation. Resuspender den resterende prøve i CP-puffer og centrifugeres som ovenfor. Suspender den endelige pellet i en minimal mængde (200 pi) mitochondriel Assay Solution (MAS).
      BEMÆRK: Protein analyseres på nuværende tidspunkt, fordi CP I buffer ikke har BSA, mens MAS, hvor prøverne skal senere suspenderet har BSA i det.

    4. Skøn mitokondrie indhold ved at måle protein koncentration på en BCA Protein Assay Kit

    5. Udfør XF-analyser som beskrevet af Rogers, GW, et al. 12

    BEMÆRK: Visualiser O 2 forbrug sats (OCR) i pMol O 2 / min, eller absolutte O 2 og pH i data output.

    1. Brug 1x MAS at fremstille forbindelser, der skal injiceres. Tilføj en 10x koncentration af forbindelserne til havnene AD at give en endelig koncentration på følgende måde: Port A, ADP [adenosin 5'-diphosphate, 2 mM, 50 pl]; port B, oligomycin (2 uM, 55 pi); port C, FCCP [carbonyl cyanid 4- (trifluormethoxy) phenylhydrazon, 6 uM, 60 pi]; og port D, 2 uM antimycin-A (65 pi). Forberedtilstrækkelig mængde af forbindelser til det nødvendige antal brønde.
    2. Bestemme den optimale mængde af mitokondrier ved titrering. For eksempel belastning 1,0 ug, 2,5 ug, og 5,0 ug af mitokondrier per brønd i en 50 pi volumen iskold 1x MAS substrat. For at minimere variabilitet mellem brønde, først fortyndes 10x mitokondrier i kold 1x MAS + substrat. Dernæst levere 50 pi af denne suspension til hver brønd (undtagen korrektion baggrund brønde).
    3. Centrifugeres pladen ved 2000 xg, 20 min ved 4 ° C. Efter centrifugering, forsigtigt tilsættes 450 pi 1x MAS + succinat (10 mM) og rotenon (2 uM) (oprindelige betingelser, se nedenfor) til hver brønd. Se mitokondrierne under mikroskop for at sikre ensartet overholdelse af godt før overføre pladen til XF analysatoren.
      BEMÆRK: De indledende betingelser anvendes, vil afhænge af, om respiration er drevet af enten ETC kompleks I eller kompleks II. For komplekse II-drevne respiration, bruge succinate (10 mM) og rotenon (2 uM) som oprindelige betingelser. Rotenon blokerer kompleks I og succinat- giver brændstof til komplekse II (succinatdehydrogenase). At studere respiration drevet af kompleks I, enten bruge pyruvat og malat, hver ved en endelig koncentration på 5 mM eller glutamat og malat hver ved en endelig koncentration på 10 mM som oprindelige betingelser. Sidstnævnte kan hjælpe til at skelne dysfunktion blandt tricarboxylsyrecyklen og substrat transport. At studere åndedræt drevet af både kompleks I og kompleks II, omfatter pyruvat og succinat uden rotenon eller malat som oprindelige betingelser. Brug palmitoyl carnitin som et substrat for β-oxidation.
    4. Sekventielt måle mitokondrielle respiration i realtid ved hjælp respirometerkolben ved at programmere det som tidligere beskrevet 12. Brug indstillingerne for respirometer i Tabel 2.
      BEMÆRK: En kort forklaring af forskellige mitokondrie åndedræt stater er som følger:
    5. o = ikke-phosphorylerende åndedræt induceret af oligomycin; Statens 3U = maksimal koblet respiration stimuleret af afkobleren FCCP; Resterende ikke-mitokondriel respiration = respiration efter kompleks III-inhibering af antimycin-A. Det skal også bemærkes, at længden af ​​OCR måling i kombination med mitokondrie fusion kan påvirke dataene ved nedbryder ilt under målingen perioder.

    6. Western Blot

    BEMÆRK: Bestem den mitokondrielle markør COX IV og hele væv GAPDH ved Western blotting for at sikre berigelse af mitokondrier i den endelige stikprøve

    1. Adskil isolerede mitokondrier og hele vævsekstrakt med 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgeler.
    2. Overfør proteinerne på en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran.
    3. Inkuber med COX IV-antistof (1: 20.000), efterfulgt af peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer. For GAPDH beslutsomhed, strimler blottet og sonde med en GAPDH monoklonalt antistof (1: 2.000).
      BEMÆRK: Hvis forskelle i ER forurening er af bekymring, omfatter ER markører, såsom ERp72, calnexin eller calreticulin i analysen.

    Representative Results

    Figur 1 viser en detaljeret rutediagram over hele protokollen.

    Western blot profiler af COX IV / GAPDH (figur 2) afbilder ekspressionen af det mitokondrielle protein, COX IV, og den ikke-mitokondrie markering, GAPDH. Ekspression af både COX IV og GAPDH er tydeligt i hele muskler lysat. Efter mitokondrier isoleres under anvendelse af teknikken beskrevet i denne protokol, COX IV bands er stadig tydelige, mens GAPDH er fraværende på samme eksponering. Længere eksponering kan afsløre et svagt GAPDH band. Disse blots viser, at de isolerede mitokondrier har minimal ikke-mitokondrie forurening. Desuden COX IV ekspression i isolerede mitokondrier er konsistent mellem forskellige prøver.

    Figur 3 viser typiske respirometriske profiler drevet af kompleks II (succinat og rotenon) under anvendelse af 1,0 ug, 2,5 ug, og 5,0 ug af mitokondrier. Som forventet, er samlet OCR øges wed højere mængder af mitokondrier. Den beregnede respiratorisk kontrol ratio (RCR) for dette assay er 7,95, hvilket indikerer, at mitokondrielle præparat er af høj kvalitet. Desuden statslige 3U OCR er lidt højere end for tilstand 3, bekræfter mitokondrie kvalitet.

    For at sammenligne ensartede resultater, når profilering forskellige mængder af mitokondrier, udførte vi ANOVA (variansanalyse) og beregnes summen af ​​kvadrater (SS) som faktiske værdier af varians ved anvendelse af 1,0 ug, 2,5 ug, og 5,0 ug af mitokondrier indlæst pr godt (figur 4). SS præsenteres for tilstand 2, tilstand 3, stat 3U, antimycin, og RCR. For staten 2 og stat 3 målinger, en måde ANOVA var statistisk signifikant (p <0,01 og p <0,05, henholdsvis). Tilsvarende envejs-ANOVA var statistisk signifikant for antimycin og RCR (p <0,01 og p <0,0001, henholdsvis. Ingen signifikant forskel blev set state 3U mellem grupperne. ThESE resultater viser, at 5,0 ug mitokondrier per brønd gav den laveste SS forhold til andre koncentrationer og er den optimale mængde til brug i XF 24 systemet med vores population af deltagere.

    Figur 5 tjener som en guide til at angive, hvor meget mitokondrie protein kan forventes på grundlag af den oprindelige muskel stikprøvestørrelse. Som forventet er der en stærk sammenhæng mellem mængden af ​​muskel (mg) behandlet og det totale mitokondrie proteinindhold (mg) af den endelige prøve.

    Chappel-Perry buffer I (CPI)
    Kemisk Koncentration
    KCI 100 mM
    MOPS 50 mM
    EDTA 1 mM
    MgSO4 5 mM
    ATP 1 mM pH 7.4
    Chappel-Perry buffer II (CPII)
    Kemisk Koncentration
    KCI 100 mM
    MOPS 50 mM
    EDTA 1 mM
    MgSO4 5 mM
    ATP 0,2 mM
    Fatty-syrefri BSA 0,50%
    pH 7.4
    Mitokondrie Assay Solution (MAS) (2X)
    Kemisk Koncentration
    Saccharose 35 mM
    Mannitol 110 mm
    KH 2 PO 4 2,5 mM
    MgCI2 2,5 mM
    HEPES 1,0 mm
    EGTA 0,5 mM
    Fatty-syrefri BSA 0,10%
    pH 7.4
    Mitokondrie testoploesningen (MAS) med komplekse II begyndelsesbetingelser
    Kemisk Koncentration
    1X MAS
    Succinat 10 mM
    Rotenon 2 um
    pH 7.4
    Mitokondrie testoploesningen (MAS) med komplekse I begyndelsesbetingelser
    Kemisk Koncentration
    1X MAS
    Pyruvat 5 mM
    Malate 5 mM
    pH 7.4
    * Alle buffere, der skal foretages i deioniseret vand

    Tabel 1. Solution og buffer opskrifter.

    >
    Protokol
    StartProtocol
    Command Tid (min) Port
    Kalibrer 0.00
    Vent 10.00
    Bland 1.00
    Vent 3.00
    Bland 1.00
    Vent 3.00
    Bland 0,50
    Mål 3.00
    Bland 1.00
    Mål 3.00
    Bland 0,50
    Sprøjt A
    Bland 1.00
    Mål 6.00
    Bland 1.00
    Sprøjt B
    Bland 1.00
    Mål 3.00
    Bland 1.00
    Sprøjt C
    Bland 1.00
    Mål 3.00
    Bland 1.00
    Sprøjt D
    Bland 1.00
    Mål 3.00
    EndProtocol

    Tabel 2. Bland, måle, og bland cyklus indstilling for respirometer.

    Figur 1
    Figur 1. Flowchart af hele protokollen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

    /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg "/>
    Figur 2. Et repræsentativt Western blot for hele skeletmuskelvæv samt isolerede mitokondrier. Hele vævsekstrakt samt isolerede mitokondrier blev immunoblottet med COX IV antistof som mitokondrie markør og GAPDH antistof til ikke-mitokondrie kontrol. Ingen GAPDH bånd blev observeret i isolerede mitokondrier indikerer ringe eller ingen forurening fra ikke-mitokondrie kilder. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

    Figur 3
    Figur 3. Repræsentant respirometrisk profil mitokondrier isoleret fra human Vastus lateralis. Tre koncentrationer af isolerede mitokondrier, 5,0 ug, 2,5 ug, og 1,0 ug vi re anvendes i dette assay. Endelige koncentrationer af forbindelser efter port injektioner var 2 mM ADP (port A); 2 um oligomycin (port B); 6 uM FCCP (port C); og 2 um antimycin (port D). Beregnet RCR for denne kørsel var 7.95. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

    Figur 4
    Figur 4. Sum af kvadrater. Sum af kvadrater for de forskellige mitokondrie åndedræt stater og RCR hjælp af 5,0 ug, 2,5 ug, og 1,0 ug mitokondrier. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

    ig5highres.jpg "/>
    Figur 5. Dette kan anvendes som en vejledning til at estimere mængden af mitokondrie-protein, der kan forventes på grundlag af den oprindelige muskel prøvevægt Regressionsanalyse:. Af mængden af muskel (mg) og total mitokondrieprotein udbytte (mg). Som forventet er der en direkte positiv korrelation mellem mængden af ​​musklen og den samlede mitokondrielle protein opnået.

    Discussion

    Isolerede mitokondrier er ofte anvendt i studier, der undersøger rolle ETC funktion, samt andre mitochondriale aktiviteter, herunder substrat transport og TCA cyklus funktion. Respirometriske assays under anvendelse af isolerede organeller tillader direkte undersøgelse af grundlæggende processer for oxidativ phosphorylering og iboende egenskaber ETC. Respirometrisk profilering af isolerede mitokondrier i sammenligning med hele celler eller permeabiliserede muskelfibre har fordelene ved forholdsvis let fortolkning af data og den manglende "indblanding" fra ikke-mitokondrie processer eller ændringer i mitokondrie masse / biogenese. Normalisering af data er baseret på mitokondrie proteinindhold, hvorved enkel cross-sammenligning af mitokondrier mellem prøverne. Respirometrisk profilering af isolerede mitokondrier er en foretrukken fremgangsmåde, når målet med undersøgelsen er at bestemme underliggende mekanismer og identificere specifikke mål såsom ETC komponents / komplekser eller mitokondrie transportmekanismer.

    Beskrevet er en protokol til muskel biopsi og isolering af funktionel mitokondrier fra små vævsprøver. Denne metode giver reproducerbare resultater mellem brugere på grund af udnyttelse af en automatiseret homogenisator versus håndbetjent dounce homogenisatorer. Isolering af mitochondrier kan udføres med så lidt som 20 mg af muskelvæv. Mængden af ​​isolerede mitokondrier, der kan opnås fra denne stikprøve er tilstrækkelig til at køre Seahorse plade-baserede respirometri mens overskydende mitokondrier til andre eksperimenter og opbevaring for yderligere molekylære analyser. Det kan bemærkes, at denne metode kan oversættes til XF 96, hvor selv mindre mængder af mitokondrier kan anvendes (1-2 ug per brønd).

    Adskillige protokoller til isolering mitokondrier afhængige dounce homogenizers for første væv forstyrrelser. En ulempe ved denne metode er praktisk karakter af den oprindelige vævhomogenisering. Den kraft og hastighed støder i homogenisatoren kan variere betydeligt mellem operatører 6. Dette kan resultere i forsøg-til-forsøg variation samt lab-to-lab variation, og fører til vanskeligheder med at sammenligne data mellem eksperimenter. Dette er af særlig bekymring i interventionsstudier humane når data fra deltagerne samles på separate tidspunkter, typisk før og efter behandling, og der kan blive flere steder. Vi bruger en automatiseret homogenisator for en mere sammenhængende tilgang, der giver mere reproducerbare resultater med begrænset fra person til person variation. Hastigheden af ​​præparatet også gør denne fremgangsmåde egnet til håndtering af flere prøver samtidigt. Typisk kan op til tre forsøg udføres i en enkelt dag.

    Potentielle begrænsninger af teknikken beskrevet her stammer fra anvendelsen af ​​isolerede organeller og anvendelse af en plade-baseret format. For eksempel Picard et al. har dæmonstrated at isolerede mitokondrier har funktionelle egenskaber, der adskiller sig fundamentalt fra de intakte mitokondrier i permeabiliserede myofibre. De foreslog, at mitokondrielle isoleringsteknikker resulterer i ændret bioenergetic funktion, såsom væsentligt forøget RCR forhold til permeabiliserede myofibre ledsaget af en større reaktiv ilt arter produktion 13. Sammenlignet med permeabiliserede muskelfibre, er isolering af mitokondrier kræve længere forberedelsestid. Også tab af cellulære indhold formindsker fysiologiske relevans, noget der er bevaret i hele celler og endda permeabiliserede fibre. Anvendelsen af ​​plade-baserede respirometri med de beskrevne teknik tillader replikere kørsler pr prøve. Dog skal mitokondrier klæbe til bunden af ​​hver brønd. Denne konfiguration er forskellig fra deres normale miljø og kan påvirke funktionelle egenskaber. Desuden skal det bemærkes, at ved hjælp af denne protokol for mitokondrie isolation ther,e kan stadig være forurening fra endoplasmatiske reticulum (ER) i den mitokondriske præparat. Forskelle i ER forurening kan påvirke bestemmelsen af ​​mitokondrielle udbytte og påvirke resultatet.

    Afslutningsvis denne undersøgelse præsenterer data, der bekræfter, at mitokondrier isoleret fra væv ved hjælp af denne procedure er funktionelt aktive og kan bruges til undersøgelser / applikationer, der kræver høj kvalitet isolerede mitokondrier fra minimal mængde af skeletmuskulaturen prøver. Fordelen ved denne metode er, at: i) det er muligt at isolere mitokondrier fra minimale mængder af skeletmuskulatur, ii) fremgangsmåden er hurtig, iii) med pladen baseret teknologi, er det muligt at køre flere prøver på samme tid, og iv) der er nok overskydende væv og isolerede mitokondrier efter bioenergetic assay for prøve opbevaring og andre molekylærbiologiske undersøgelser.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    Homogenizer Bio-Gen PRO200 BioExpress
    Eppendorf Centrifuge 5804 R Fisher Scientific
    Deepwell late Rotor  Fisher Scientific
    6 mm University College Hospital Needle Cadence
    60 cc syringe Fisher Scientific
    96-well plate reader Tecan (Genios-basic)
    Seahorse XF 24-3 analyzer Seahorse Biosciences, Inc.
    Protein gel system Life Technologies (Invitrogen)
    Kodak Gel Logic 112 Carestream Health, Inc
    Kodak camera assembly Carestream Health, Inc
    Consumables
    XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge Seahorse Bioscience 100850-001
    100867-100
    Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich Co 221473
    Hydrochloric acid (HCl) Acros 12421-0010
    Dulbecco's Phosphate buffered saline  Lonza 17-512F
    Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P333
    MOPS Fisher Scientific BP308
    EDTA Fisher Scientific BP118
    Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich Co M7506
    ATP Sigma-Aldrich Co A9187
    Fatty acid-free BSA Calbiochem 126575
    Sucrose Sigma-Aldrich Co S0389
    Bacterial proteinase Sigma-Aldrich Co P-8038
    D-Mannitol Sigma-Aldrich Co M9546
    KH2PO4 Fisher Scientific P284
    Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich Co M9272
    HEPES Sigma-Aldrich Co H3784
    EGTA Sigma-Aldrich Co E3889
    BCA protein assay kit Sigma-Aldrich Co PI23227
    Succinic Acid* Sigma-Aldrich Co S3674
    Pyruvic acid* Sigma-Aldrich Co P5280
    Malic acid* Sigma-Aldrich Co 2288
    ADP(K+ salt)* Sigma-Aldrich Co A5285
    XF Cell mito stress test kit Seahorse Biosciences 101706
    Tween-20 Santa Cruz Biotechnology, Inc.  SC-29113
    NuPAGE 12% Bis-Tris Gel Life Technologies (Invitrogen) NP0343BOX
    Immobilin Transfer Membranes (0.45 um) Millipore IPVH20200
    MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml Life Technologies (Invitrogen) NP0001
    NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter Life Technologies (Invitrogen) NP0006-1
    Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin) Abcam ab14734
    Primary antibodies (mAB to GAPDH) Abcam ab9484
    Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled PerkinElmer NEF822E001EA
    Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled PerkinElmer NEF812E001EA
    *ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only 

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).
    2. Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods. 26, 292-297 (2002).
    3. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (2011).
    4. Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA. Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).
    5. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).
    6. Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PloS One. 8, e82392 (2013).
    7. Chappell, J. B., Perry, S. V. The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria. The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).
    8. Tyrrell, D. J., et al. Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. (2014).
    9. Nicklas, B. J., et al. Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women. Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).
    10. Bergstrom, J. Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).
    11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746 (2011).
    12. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS One. 6, e18317 (2011).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics