Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) והאנלוגי Freebase להציג cytotoxicity תא מייקרו הנמוך. כתב יד זה מתאר תגובת RNA שעתוק, RNA הדמיה עם ג'ל מוכתם ברומיד ethidium, ו- RNA כימות עם ספקטרוסקופיה UV-Vis, על מנת להעריך עיכוב שעתוק על ידי corroles ומדגימה שיטה פשוטה של ​​הערכת נכסי מועמד אנטי-סרטני.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tang, G. Y., Pribisko, M. A., Henning, R. K., Lim, P., Termini, J., Gray, H. B., Grubbs, R. H. An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles. J. Vis. Exp. (97), e52355, doi:10.3791/52355 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

כימותרפיה כרוכה לעתים קרובות סוכנים ציטוטוקסיות ספקטרום רחב עם תופעות לוואי רבים ומיקוד מוגבל. Corroles היא קבוצה של macrocycles tetrapyrrolic שתערוכת נכסי ההפרש cytostatic ורעילים לתאים בשורות תאים ספציפיים, בהתאם לזהות של מתכת chelated וקבוצות פונקציונליות. ההתנהגות הייחודית של corroles פונקציונליות לשורות תאים ספציפיות מציגה את האפשרות של כימותרפיה ממוקדת.

תרופות אנטי-סרטניות רבות מוערכות על ידי היכולת שלהם לעכב שעתוק RNA. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד-אחר-צעד לשעתוק RNA בנוכחות מעכבים ידועים ופוטנציאליים. ההערכה של מוצרי RNA של תגובת השעתוק על ידי ג'ל אלקטרופורזה ו- Vis UV ספקטרוסקופיה מספקת מידע על מאפיינים מעכבים של מועמדים פוטנציאליים ותרופה נגד הסרטן, עם שינויים assay, נוספים על מנגנון הפעולה שלהם.

קטןידוע על המנגנון המולקולרי של פעולה של cytotoxicity corrole. בניסוי זה, אנו רואים שני מתחמים corrole: גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) (Ga (tpfc)) ואנלוגי Freebase 5,10,15- (טריס) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Assay שעתוק RNA שימש לבדוק את המאפיינים המעכבים של corroles. חמש תגובות שעתוק הוכנו: DNA שטופל בactinomycin D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc ב[ מורכב]: יחס [בסיס תבנית ה- DNA] של 0.01, בהתאמה, וקבוצת ביקורת.

תגובות השעתוק נותחו לאחר 4 שעות באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose וספקטרוסקופיה UV-Vis. יש עיכוב ברור על ידי Ga (tpfc), actinomycin D, וtriptolide.

assay שעתוק RNA זה יכול להיות שונה כדי לספק פירוט מכניסטית יותר על ידי שינוי הריכוזים של המתחם אנטי-סרטני, DNA, או אנזים פולימראז, או על ידי דוגרים DNA פולימראז או עם המכלוליםXES לפני שעתוק RNA; שינויים אלה היו להבחין בין מנגנון עיכוב מעורב DNA או האנזים. הוספה המורכבת לאחר שעתוק RNA יכול לשמש כדי לבדוק אם המתחמים להשפיל או hydrolyze RNA. גם assay זה יכול לשמש כדי לחקור מועמדים אנטי-סרטניים נוספים.

Introduction

כימותרפיה כרוכה לעתים קרובות סוכנים ציטוטוקסיות ספקטרום רחב עם תופעות לוואי לא רצויים ומיקוד מוגבל, אך עם הבנה טובה יותר של ביולוגיה של הסרטן, יש ביקוש הולך וגובר לסוכנים אנטי-סרטניים ביעילות סרטן מיקוד גבוהה ופחות תופעות לוואי. 1 תאי סרטן אנושיים לעתים קרובות הופכים ל תלוי באונקוגן אחת מופעל או ביטוי יתר להישרדות 2 כך., תרופות אנטי-סרטניות רבות מוערכות על ידי היכולת שלהם לעכב שעתוק RNA. טיפולים החוסמים את הביטוי של גנים אלה הופכים יעילים בחיסול תאים סרטניים ומובילים למוות של תאים. 3 תאים שינו רגישים יותר להפרעות בשעתוק RNA מ המתאימים לתאים נורמלים. 4 תרופות נגד סרטן המעכבים שעתוק צפויים לעכב באופן סלקטיבי ביטוי של אונקוגנים הנדרשים לתאים הסרטניים לשרוד. כתוצאה מכך 5, אני שעתוק RNAnhibition היא דרך יעילה לאיתורם של מועמדי תרופה נגד הסרטן פוטנציאליים וללמוד עוד על מנגנון הפעולה שלהם. פרוטוקול זה מוכיח כי Ga (tpfc) מעכב שעתוק RNA באותו סדר כמו התרופות כימותרפיות actinomycin D וtriptolide; השוואות דומות יכולות להתבצע באמצעות פרוטוקול זה עם מועמדי תרופה נגד הסרטן אחרים. Actinomycin D הוא מעכב שעתוק RNA הנפוץ לטיפול בסרטן הריונית trophoblastic, סרטן אשכים, הסרטן של וילם, rhabdomyosacoma, וסרקומה 6 של יואינג. Actinomycin D נעשה שימוש בטיפול בסרטן במשך כמעט חמישים שנים מאז שאושר לראשונה על ידי ה- FDA ב1964.Triptolide הוא מעכב שעתוק סלקטיבית שנחקר במבחנה ובמודלים של בעלי חיים שונים נושאות גידולים במשך 30 שנים. 7

טבע macrocyclic amphiphilic של corroles מקנה יתרונות משמעותיים על פני כיתות סמים אחרות כגון מולקולות קטנות או ביולוגיs. 8-14 האופי macrocyclic מאפשר חדירות סלולריות שהוא גדול מהצפוי למולקולות גדולות כזה, והם גדולים מספיק כדי אינטראקציה עם משטחי macromolecular, כגון אלה של חלבונים. 8 Corroles ידוע ליצירת קומפלקסי noncovalent הדוקים עם מולקולות ביולוגיות וסמים. 10 בנוסף לcytotoxicity הטבועה של מסגרת corrole, אנחנו הוכחנו כי מעשי corrole פעיל מעץ כמולקולה מוביל לתרופות כימותרפיות, במיוחד דוקסורוביצין תרופת anthracycline intercalating-DNA. כאשר corrole פעיל מעץ היה coadministered עם דוקסורוביצין, שיפור של פי 3 ב -50 IC של דוקסורוביצין נצפה לDU-145 תאים. 9 מסגרת corrole היא יציבה ובעל תכונות ספיגה הקרינה טבועה ש, כאשר פונקציונליות, לעבור משמרות ספיגה ייחודיות שיכול לשמש לאפיון. 10 Functionalization של הפיגום לא מטבע affect מאפייני photophysical של corrole, 9-15 אבל, כפי שניתן לראות בcorrole פעיל מעץ, באופן סלקטיבי שינוי מסגרת corrole באופן משמעותי יכול לשנות את המאפיינים הביולוגיים שלה. 16 הערכנו בעבר שש metallocorroles נגד שבע שורות תאי הסרטן אנושיות. התוצאות מצביעות על כך שהרעילות לתאי סרטן אנושיים תלויה ביון הספציפי המתכת, כמו גם החלפת קבוצה פונקציונלית. לדוגמא, corroles גליום פעיל מעץ חווה ספיגה סלולרית גבוהה וחדר באופן סלקטיבי לתוך הגרעין של תאים במוח סרטן ערמונית גרורתי (DU-145); תאי סרטן באותו corrole, למרות שזה לא חודר לתוך הגרעין של שורות תאים אחרות, מציג cytotoxicity גדולה יותר לשד (MDA-MB-231), מלנומה (SK-MEL-28), ושחלות (OVCAR-3) מאשר ל סרטן הערמונית. 9

מבחני מבוססי תאים ראשוניים עולים כי תרכובות אלה מראים הבטחה כסוכנים טיפוליים אנטי-סרטניים, שגופת פיורדאחקירה אה למנגנון פעולה. עיכוב תמלול הוא ציין עם מתחמים אורגנו-מתכתיים מסוימים 17-27 ובקשנו לבחון את התהליך הזה כמנגנון אפשרי לציטוטוקסיות התנהגות של משפחת corrole. assay שעתוק זה מספק שיטה פשוטה, זולה, וקלילה להערכת עיכוב שעתוק, שיוביל למידע מפורט יותר על ההשפעות של מולקולות אלה בתאים חיים.

כאן, עיכוב השעתוק של גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) (Ga (tpfc)) והאנלוגי Freebase 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) (tpfc) (איור 1) נבדקים. בניגוד לכמה מתחמי מעבר מתכת, גליום (III) הוא חיזור פעיל ולכן אינו מעורב ישירות בתהליך חיזור של מסלולי מטבוליים המבוסס על חיזור. 28 בכל מקרה, גליום (III) אין להציג נכסים רעילים לתאים ונחקר למטרות טיפוליות. גליום הוא המתכת המבטיחה ביותר השנייה לתרופות אנטי-סרטניות לאחר פלטינה ועבר מחקרים וחקירות רבים; מלחי ניטראט וגליום כלוריד נבדקו במחקרים קליניים כנגד hepatoma, לימפומה, סרטן שלפוחית ​​השתן, ומחלות אחרות. 29-34 גליום (III) לכן הוא מתאים ביותר ללימודי corrole נגד סרטן. נתונים ראשוניים מראים Ga (tpfc) וtpfc יש לי נמוך GI 50, ריכוז תרופת הצורך לעכב 50% מהתפשטות תאים מקסימליים, עם שורות תאי הסרטן שונות (ראה איור 2); זה מאשר את תוקפו של ניסויים נוספים על שני מתחמים אלה כדי לקבוע המאפיינים המעכבים שלהם. אנו משווים תרכובות אלו עם התרופות נגד הסרטן הנפוץ actinomycin D וtriptolide. Actinomycin D intercalates DNA, RNA מעכב התארכות, וגורם למות תאים בשורת תאים מסוימים בריכוזים picomolar 6,35-37 Triptolide הראה לעכב את צמיחת גידול.; הוא נקשר לXPB / ERCC3 האנושי, o למקטעגורם שעתוק f TFIIH, שהוביל לעיכוב של הפעילות השנייה RNA פולימראז. 6-7,38-40

בעוד שהוא מוכר שבcorroles תערוכת נכסים רעילים לתאים, קיים מעט מידע על המנגנונים השונים הנובעים מfunctionalization. עיכוב Corrole של שעתוק RNA היה מציע תובנה רבה יותר על יחסי הגומלין שלהם עם Biomacromolecules. מתחמים אחרים ידועים נקשרים ל- DNA, כגון dirhodium (II, II) מתחמים, כרום (III) מתחמים, רותניום (II) מתחמי polypyridyl, רודיום (III) מתחמים, ואחרים שונים, היו נתונים למבחני שעתוק RNA, 18 27 כתוצאה מכך ההבנה טובה יותר של יחסי הגומלין שלהם עם Biomacromolecules. ניסוי קליל וזמין באופן נרחב זו גם בדיקה ראשונית טובה על מנת להעריך את התכונות הרעילות של מולקולת נתונה ולקבוע אם בדיקות ביולוגיות נוסף ראויים. Assay שעתוק RNA גם מאפשר לשינויים רבים, כגון varying כמות המתחם או אנזימים המשמש; שינוי תקופת דגירה, זמן התגובה ונקודות זמן מדגם; ומשתנה באורך תבנית ה- DNA ורצף, בין משתנים אחרים של עניין, ובכך פוטנציאל לספק כמות גדולה של נתונים. assay שעתוק זה זמין גם בקלות כמו ערכות במחיר סביר עם כל מרכיבי התגובה ההכרחיים בתנאי, למרות שניתן לקנות רכיבים והכינו בנפרד. בניסויים אלה, אנו משתמשים בערכה זמינה מסחרי שידוע שיש תשואה גבוהה. 41

כדי להעריך עיכוב שעתוק, אנו משתמשים בשתי שיטות: ג'ל אלקטרופורזה agarose וספקטרוסקופיה UV-Vis. ג'ל אלקטרופורזה agarose היא שיטה פשוטה ויעילה להפרדה, זיהוי, וטיהור 0.5- לברי DNA ו- RNA 25 kb. 42 ספקטרוסקופיה UV-Vis ניתן להשתמש כדי לקבוע את הריכוז וטוהר RNA. 43

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כאשר עובד עם RNA לשמור על סביבת עבודה נקייה, כדי למנוע זיהום על ידי אנזימי DNase וRNase שלבזות DNA ו- RNA. ודא שטיפי פיפטה וצינורות הם DNase וRNase חופשי. כמו כן הוא מועיל כדי לנגב את משטחי מעבדה וציוד כגון טפטפות, מחזיקי צינור, וכו 'עם פתרון טיהור.

1. RNA תמלול עם טיפול Corrole

  1. הכן את corrole ומעכב תרכובות ב0.01: 1 יחס טוחנת של [מורכב]: [DNA].
    הערה: במקרה שלנו, היחס היה 4.3 מורכב fmol: 0.43 DNA pmol, שבו תבנית ה- DNA משמשת הייתה וקטור APET-28C עם גן Liga מE. coli תחת שליטה של אמרגן T7. DNA אחר עם אמרגן T7 גם מועמדים בתוקף להפעלת assay השעתוק.
    1. לפזר actinomycin D, triptolide, tpfc, וGa (tpfc) בsulfoxide דימתיל (DMSO) במיכלים נקיים, נפרדים. השג את הריכוז הסופי של 0.01: 1 יחס טוחנת של [גomplex]: DNA [] ​​על ידי שימוש בדילולי סדרתי עם מים nuclease חינם.
      1. לפזר 1 מ"ג actinomycin D ב1.8 מיליליטר DMSO. Aliquot 10 μl למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/100. Aliquot 1 μl של הדילול למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000.
        הערה: הריכוז של הפתרון הסופי של actinomycin D הוא 4.3 fmol.
      2. לפזר triptolide 1 מ"ג ב0.64 מיליליטר DMSO. Aliquot 1 μl למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000. Aliquot 1 μl של הדילול למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000 שני.
        הערה: הריכוז של הפתרון הסופי של triptolide היא 4.3 fmol.
      3. לפזר tpfc 1 מ"ג ב2.9 מיליליטר DMSO. Aliquot 10 μl למכל נפרד ולדלל את מיליליטר 1 עם מים nuclease חינם כדי ליצור ד 1/100ilution. Aliquot 1 μl של הדילול למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000.
        הערה: הריכוז של הפתרון הסופי של tpfc היא 4.3 fmol.
      4. לפזר מ"ג Ga 1 (tpfc) 2.6 מיליליטר DMSO. Aliquot 10 μl למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/100. Aliquot 1 μl של הדילול למכל נפרד ולדלל עד 1 מיליליטר עם מים nuclease חינם כדי ליצור דילול 1/1000.
        הערה: הריכוז של הפתרון הסופי של Ga (tpfc) היא 4.3 fmol.
        הערה: corroles ומעכבים אלה אינם מסיסים במים ולקבל מראש את מומס DMSO. כמויות קטנות של DMSO (מתחת ל -1%) לא לגרום cytotoxicity בתאים (נתונים שלא פורסמו).
  2. לפני תחילת תגובת השעתוק, להכין את חומרים כימיים הנחוצים בנפרד או לרכוש אותם מספק מסחרי.
    1. הפשרה על קרח כל קפאריאגנטים n (עיינו בטבלת 1 לרשימה של חומרים כימיים קפוא).
    2. אפשר תגובת המאגר 10x וribonucleotide 4 (ATP, CTP, GTP, וUTP) זמן פתרונות לערבב עד שהם נמסו לגמרי בפתרון.
    3. בקצרה צנטריפוגות כל ריאגנטים על מנת למנוע אובדן של חומר על השפה של הצינור. ברגע שהפשיר, ribonucleotides חנות על קרח, תוך שמירה על 10x תגובת הצפת בRT.
    4. לשלב ריאגנטים עבור תגובת שעתוק בRT (ראה טבלה 2 לרשימה של חומרים כימיים).
      הערה: spermidine ב10x תגובת הצפת יכולה coprecipitate תבנית ה- DNA אם התגובה מורכבת על קרח ולא על RT.
    5. מערבבים היטב על ידי מצליף הצינור או pipetting מעלה ומטה בעדינות את התערובת. לאחר הערבוב, בקצרה צנטריפוגות כדי לאסוף תערובת תגובה בתחתית הצינור.
    6. דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 כולל של משאבי אנוש.
      הערה: זמני התגובה הנדרשים ישתנועם גודל תבנית ה- DNA ורצף. צעד זה עשוי לדרוש אופטימיזציה לרצפים ספציפיים. תבניות קצרות יותר עשויות לדרוש זמני תגובה ארוכים יותר לתשואה גבוהה של רנ"א הכל.
    7. הסר 4 aliquots μl מכל תגובה לאחר כל שעה ולאחסן ב -20 ° C. לשנות בהתאם לצורך לנקודתי זמן רצוי.

טור ספין 2. RNA

  1. בעקבות תגובת השעתוק, לטהר את RNA באמצעות עמודות כרומטוגרפיה microcentrifuge תואם.
    הערה:. שימוש בעמודות ספין RNA לטהר RNA עם יותר מ -20 תוצאות בסיסים בהתאוששות גדולה יותר מ -80% 44
    הערה: כרומטוגרפיה טור היא שיטה נפוצה ונוחה לטיהור RNA. שיטות טיהור אחרות גם קיימות כגון משקעים ליתיום כלורי, פנול: מיצוי כלורופורם, משקעים isopropanol, כמו גם ערכות זמינות מסחרי אחרות.
    1. באופן שווה resuspend מטריצת Sephadex במאגר העמודה על ידי מרץ היפוךטור שלוש פעמים או יותר. עושה זאת על ידי מצליף את הטור בצורה חדה.
    2. הסר את המכסה העליון מהעמודה. תהיה כמה מטריצת Sephadex שייר בכובע; אם הכובע מלא המטריצה, להחליף את הכובע על הטור וחזור על השלב הקודם עד שרוב המטריצה ​​הוא בעמודה.
    3. הצמד מחוץ לקצה התחתון של העמודה.
      הערה: נוזל מסוימים עשוי לברוח מהטור.
    4. לארוז את הטור.
      1. מקום עמודת סטרילי (RNase וDNase חינם) צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
      2. צנטריפוגות הצינור בצנטריפוגה שולחן XG ב 1000 דקות 1.
    5. מחק את צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ eluted מהעמודה.
    6. מייד מניח את הטור בצינור microcentrifuge חדש סטרילי 1.5 מיליליטר ו פיפטה המדגם למרכז מיטת העמודה. השתמש 20-50 μl של מדגם, כדי למנוע עומס יתר על העמודה.
    7. צנטריפוגות הצינור בצנטריפוגה שולחן XG ב 10001 דקות.
      הערה: eluent הוא מדגם RNA המטוהר.

3. Agarose ג'ל אלקטרופורזה (1% Agarose ג'ל) 42

הערה: ברומיד Ethidium מאיר על מחייב את ה- DNA ו- RNA, ולכן ניתן דמיין מולקולות ביולוגיות אלה עם אור UV על ידי דוגריהם עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד פתרון.

  1. הכן פתרון 1,000x המניה במתיל ethidium (0.5 מ"ג / מיליליטר) על ידי המסת 5 מ"ג ethidium ברומיד ב 10 מיליליטר של מים.
  2. הכן טריס Acetate EDTA (טה) חיץ ריצה לג'ל אלקטרופורזה. כדי להפוך חיץ 50x טה לשלב 2.0 M טריס-אצטט עם 0.05 חומצת M Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ולהתאים את ה- pH ל 8.5.
  3. הכן ג'ל agarose 1% (משקל / נפח) על ידי המסת 10 גרם ultrapure Agarose ב 1 L 1x טה חיץ והמסת agarose עם תנור מיקרוגל קונבנציונלי. ברגע שזה מתקרר ל -50 מעלות צלזיוס, להוסיף 1 מיליליטר של 1,000x ethidium ברומיד ל1% solu ג'ל agarosetion, לערבב בעדינות על ידי מתערבלים או על ידי היפוך במכל סגור, ואז לשפוך את פתרון agarose לפלטפורמת הליהוק ג'ל ולאפשר ג'ל לבסס על RT.
    הערה: ברומיד Ethidium הוא mutagen ומסרטן פוטנציאלי. ללבוש כפפות ולטפל פתרונות בזהירות. לנוהלי טיפול הנאותים במתיל ethidium, ראה: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667.
  4. לאחר ג'ל יש הקרושה, למקם את הג'ל הסט במכל אלקטרופורזה. הוסף חוצץ TAE מספיק כדי לכסות את הג'ל עד הבארות שקועות. בדוק שהרמה של חיץ טה היא כ 1 מ"מ מעל לרמה של ג'ל. הסר את מסרק ג'ל.
    הערה: הסרת מסרק לאחר הבארות שקועות מונעת כיסי אוויר מלהילכד בבארות.
  5. הכן את דגימות RNA. לשלב 1 μl של כל aliquot מדגם המטוהר עם טעינת ג'ל μl 1 Buffer (או עם 1 μl 10x חיץ הטעינה וdiluted עד 10 μl עם מים nuclease חינם) ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה עם micropipette.
    הערה: מאגר טעינת 10x מכיל 20% Ficoll 400, 0.1 מ 'Na 2 EDTA, pH 8.0, 1.0% SDS, bromophenol 0.25% כחולים. 0.25% cyanol קסילן גם ניתן להוסיף למאגר הטעינה, כפי שהוא פועל ~ 50% מהר ככל bromophenol הכחול ויכול להיות שימושי עבור ניטור ריצות ארוכות מאוד. 42
  6. טען את הג'ל עם כל דגימה על ידי pipetting בזהירות את הפתרון לחלק התחתון של כל טוב. הקפד לא להשאיר את כל בועות אוויר או לערבב דגימות בין בארות.
    הערה: גם סולם RNA יכול לשמש כדי לקבוע את גודלו של התמליל.
  7. צרף את המוביל, כך שה- DNA יהיה להעביר לתוך הג'ל לכיוון להוביל החיובי. הגדר את המתח לרמה הרצויה, בדרך כלל 1-10 V / סנטימטר של ג'ל. הפעל את הג'ל לכמה זמן מספיק להפרדה משמעותית בין שברי RNA, באמצעות ההגירה של צבעים כדי לפקח על ההתקדמות של ההפרדה.
    NOTE: x 25 סנטימטר ג'ל 23 סנטימטר ב 250 V ייקח כ 1 שעות, בעוד סנטימטר 8 x 8 סנטימטר ג'ל ב -150 V ייקח כ 20 דקות. יש שברי RNA קטנים יותר רזולוציה טובה יותר כאשר לרוץ במתח גבוה.
  8. כבה את אספקת החשמל כאשר הצבע ממאגר הטעינה הגר מרחק להישפט מספיק להפרדה בין שברי RNA.
  9. תמונת RNA תחת אור UV כרומיד ethidium יהיה לזרוח.
  10. קח תמונה של התמונה ולהשוות עוצמות הקרינה של RNA המטוהר מכל מצב.

4. RNA כימות באמצעות ספקטרוסקופיה UV-Vis

  1. מקום 2 μl H 2 O על NanoDrop 2000, או מכונה דומה, ולמדוד את ריק.
  2. בשלב הבא, מקום 2 μl של כל דגימת RNA, הבא טיהור, על ספקטרופוטומטר ולמדוד UV-Vis מטווח אורכי גל של 200 ננומטר ל -800 ננומטר.
    הערה: קריאת 260 של 1.0 היא שווה ערך לכ -40 מיקרוגרם / מיליליטר של RNA,וRNA הטהור יש 260/280 יחס של 2.1. 45
  3. במקרה ספיגה כי הוא מעל 1 OD, לדלל את הדגימות במי nuclease ללא להשיג OD פחות מ 1.
  4. השתמש בתוכנת גרפים עלילת הדגימות השונות ולהשוות OD ב 260 ננומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RNA תמלול איכותי הוערך על ידי Agarose ג'ל אלקטרופורזה

ג'ל אלקטרופורזה agarose משמשת לתמונת RNA עיבד. Ethidium רומיד מאיר על מחייב (λ = 605 nm, λ = 210 nm לשעבר, 285 ננומטר) 46 הדמיה מאפשרת של RNA. להקות כהות יותר בג'ל מתאים לריכוזים גבוהים יותר של RNA. אם actinomycin D, triptolide, או בין אם מורכב corrole מעכב שעתוק RNA, הייצור של RNA מצטמצם והלהקה תופיע קלה. שימוש במושג זה, ניתן להעריך עיכוב יחסי.

איור 3 מציג את הג'ל ברומיד ethidium המוכתם agarose (1%) של תגובות שעתוק RNA מראש שטופלו ללא מורכב, actinomycin D, triptolide, tpfc, או Ga (tpfc) ב[ מורכב]: יחס [בסיס תבנית ה- DNA] של 0.01 : 1. Actinomycin D וtriptolide להראות ירידה ברורה של RNA בהשוואה לזה של השליטה, כצפוי שלהמעכבים-למדו ארוכה הללו. Ga הלהקה (tpfc) יש גם רמה נמוכה מאוד של RNA, ואילו להקת tpfc תערוכות לא מעט על מנת עיכוב ומציגה את אותה עוצמה היחסית כשליטה.

RNA תמלול לכמת ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis

מדידות UV-Vis נלקחו עבור כל דגימה לאחר שעברה שעתוק RNA במשך 4 שעות וטהרו עם כרומטוגרפיה בעמודת ספין RNA. הספקטרום של אורכי גל 220 ננומטר ל -350 ננומטר מוצגים באיור 4, עם מקסימום λ מתרחש ב 260 ננומטר, המקביל לקליטת RNA, ומקדם הכחדה של 0.025 (מיקרוגרם / מיליליטר) -1 -1 סנטימטר. הספיגה ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר, מדווחת בטבלה 3. 260 קריאה של 1.0 היא שווה ערך לכ -40 מיקרוגרם / מיליליטר של RNA, ו- RNA הטהור יש 260/280 יחס של 2.1, המאפשר לחישובים כמותיים של RNA הופק במהלך טרנסתגובת cription והערכה של טוהר RNA לאחר השימוש בעמודת ספין RNA. 44 שלוש מתוך ארבע תגובות השעתוק שטופל במעכבי הניבו פחות מ RNA השליטה, עם Ga (tpfc) DNA -treated תעתוק רק 0.07 פעמים כמו RNA כDNA שלא טופל. DNA שטופל tpfc לא הראה שום עכבות נראות לעין. כל דגימות יחס 260/280 בסך של כ 2.2, המצביע על דגימות טהורות יחסית. טיהור על ידי עמודות ספין RNA מסירה RNA קצר קווצות ארוכים פחות או 20 נוקלאוטידים. DNA או גדילים ארוכים יותר מ -20 נוקלאוטידים שיורי עשוי להיות נוכח במה שנחשב לדגימות המטוהרים. זיהומים קלים אלה יביאו 260/280 יחס מעט יותר מ -2.1.

איור 1
איור 1. מבנים מולקולריים של גליום (III) 5,10,15- (טריס) pentafluorophenylcorrole (Ga (tPFC)) והאנלוגי Freebase 5,10,15- (טריס) pentafluorophenylcorrole (tpfc). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. עקומות Cytotoxicity וGI 50 ערכים של corroles בערמונית (DU-145) (אפור), שד (MDA-MB-231) (כחול), עור (SK-MEL-28) (כתום), ושחלות (OVCAR -3) (ירוק) שורות תאי סרטן. תאים הודגרו עם () Ga (tpfc) ו- (tpfc) B, ואחריו קביעת הכדאיות באמצעות MTS מבוסס assay כדאיות תא colorimetric פי הפרוטוקול של היצרן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זהדמות.

איור 3
ג'ל איור 3. ברומיד Ethidium המוכתם agarose (1%) של תגובות שעתוק לאחר 4 שעות של דגירה. מסלול 1 הוא סולם DNA 1,000 נ"ב כסטנדרט. Lanes 2-6 להראות RNA עיבד בין 0.43 DNA pmol וטופל ב4.3 fmol של כל מעכב ([מורכב]: היחס [בסיס תבנית ה- DNA] של 0.01): השליטה (מסלול 2), actinomycin D (מסלול 3), triptolide (מסלול 4), tpfc (מסלול 5), וGa (מסלול 6) (tpfc).

איור 4
איור 4. ספקטרום UV-Vis של 1:. 200 דילול של RNA עיבד בלאחר 4 שעות של דגירה תבנית ה- DNA לתגובת השעתוק טופל ללא מורכב, או עם actinomycin D, triptolide, tpfc, או Ga (tpfc) ב [מורכב]: [בסיס תבנית ה- DNA] יחס של 0.01: 1. ריכוז RNA נמדד על ידי OD ב 260 ננומטר.

להפשיר ריאגנטים קפוא על קרח:
75 מ"מ של פתרונות אדנוזין טריפוספט, אדנוזין guanosine, אדנוזין cytidine, ואדנוזין uridine (ATP, CTP, GTP, UTP)
Nuclease ללא מים
(Buffer התגובה 1x: 40 מ"מ טריס-HCl, 6 מ"מ MgCl 2, 2 spermidine מ"מ, 10 מ"מ dithiothreitol, pH 7.9) מאגר 10x תגובה
תבנית ה- DNA לינארית (0.5 מיקרוגרם / מיליליטר, 1.85 kb)
RNA פולימראז אנזים (20 U / μl)

רשימת 1. טבלה של חומרים כימיים קפוא.

כדי להתחיל את תגובות השעתוק, להוסיף את הסכום של כל מגיב הבא ב0.2 מיליליטר צינורות PCR דק דופן:
2 μlפתרון ה- ATP (75 מ"מ)
פתרון 2 μl CTP (75 מ"מ)
פתרון 2 μl GTP (75 מ"מ)
פתרון 2 μl UTP (75 מ"מ)
nuclease ללא מים μl 1
2 μl 10x התגובה Buffer
2 μl של תבנית ה- DNA ליניארי 0.5 מיקרוגרם / μl
5 (ללא מים גרעין כריק, actinomycin D, triptolide, tpfc, Ga (tpfc)) μl מורכבים
2 μl RNA פולימראז (20 U / μl)

רשימת 2. טבלה של חומרים כימיים לתגובת שעתוק.

נקודת זמן (שעות) מורכב 260 280 </ Strong> 260/280 דילול פקטור [RNA]: 260
(מיקרוגרם / מיליליטר)
[RNA] (מ"ג / מיליליטר)
4 בקרה 7.583 3.516 2.16 200 40 60.67
4 Actinomycin D .955 .438 2.18 200 40 7.638
4 triptolide 1.794 .816 2.2 200 40 14.35
4 tpfc 7.858 3.631 2.16 200 40 62.87
4 Ga (tpfc) .554 0.232 2.39 200 40 4.434

שולחן ריכוז 3. וטוהר RNA עיבד אחרי 4 שעות שנמדדו על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis. מקדם ההכחדה של RNA חד-גדילים הוא 0.025 (מיקרוגרם / מיליליטר) -1 -1 סנטימטר, קריאת 260 של 1.0 היא שווה ערך לכ 40 מיקרוגרם / מיליליטר של RNA, ו- RNA הטהור יש 260/280 יחס של 2.1. 45

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

assay זה מוכיח כי התוספת של Ga (tpfc) מעכבת שעתוק RNA דומה ל- המתחמים נגד הסרטן מחייב DNA הידוע actinomycin D וtriptolide. ציטוטוקסיות ההתנהגות של Ga (tpfc) (GI 50 = 58.1-154.7 מיקרומטר) עשויה בשל המאפיינים המעכבים שלה. מאחר שלא עיכוב שעתוק נצפה בtpfc, cytotoxicity של tpfc היא לא בשל עיכוב שעתוק RNA אבל נגרמת על ידי אמצעים אחרים שעדיין לא למדו.

בארבע תגובות השעתוק מבוצעות, DNA טופל בactinomycin D, triptolide, tpfc, או Ga (tpfc), ב[ מורכב]: [בסיס תבנית ה- DNA] יחס של 0.01, בהתאמה, או שליטה שלא טופלה. ריאגנטים תגובת השעתוק אוחדו ותגובת השעתוק הורשה להמשיך במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס. RNA עיבד היה מטוהר באמצעות טור ספין RNA והתשואה נותחה על ידי UV-Vis וג'ל אלקטרופורזה. הטבע של עיכוב שעתוק ניתן furtנחקר באמצעותה אותה טכניקה זו עם שינויים שונים, או יכולות להיות נתונה לתרכובות חלופיות במבחנה במחקרי vivo. ניסויים נוספים אשר עשוי לסייע לקבוע את האופי המולקולרי של העיכוב כוללים קריסטלוגרפיה רנטגן של adducts corrole-DNA האפשרי או מודלים חישוביים של תגובת השעתוק. מטרת ניסוי זה הייתה לקבוע האם התרכובות לעכב שעתוק כדי לאסוף מידע על המאפיינים אנטי סרטני הפוטנציאליים שלהם. המטרה שהושגה: tpfc הציג שום עיכוב, בעוד Ga (tpfc) הציג עיכוב ברור וראויים למחקר נוסף.

Assay שעתוק RNA יכול להיות שונה כדי לספק פירוט מכניסטית יותר. תוספת של הסוכנים אנטי-סרטניים (למשל, מתחמי corrole) לאחר תגובת השעתוק היא מלאה יכולה להראות אם המתחמים להשפיל או hydrolyze RNA. ניסוי מומלץ נוסף הוא לנהלתגובת השעתוק על כל המרכיבים למעט אנזים RNA פולימראז פי 10 נמוכה יותר, כדי לאפשר הבחנה בין מנגנון עיכוב מעורב DNA או האנזים. לבסוף, דגירה של DNA או פולימראז עם המתחמים לפני שעתוק RNA יאפשר מוגבר מחייב בין מורכב והיעד המתאים, לוודא האם האיכויות המעכבות המורכבות מעורבות בDNA פולימראז או מחייב, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנחנו מאוד מודים לד"ר סינדי נ 'צ'יו לעזרה עם ג'ל אלקטרופורזה, ואנדי ג'ואו ומיכאל Grodick לתרומתם הנדיבה של DNA ואנזים הגבלה. אנו בתודה להכיר פרופ 'ג' הית 'ופרופ' ד 'מגשש לגישה נדיבה לציוד וחומרים. אנו מודים לד"ר Karn Sorasaenee להצעות מועילות. אנו מודים מרי H. טאנג ליצירת האיור משמש בסקירה סכמטית בווידאו. מימון ניתן על ידי ג'ונסון אנד ג'ונסון וUSC Y86786.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actinomycin D Sigma-Aldrich A1410 Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide Sigma-Aldrich T3652 Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2 Life Technologies AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit Life Technologies AM1334 Store at –20 °C 
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate Sigma-Aldrich T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-100
mini Quick Spin RNA Columns Roche Life Science 11814427001 Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S Store at –20 °C 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. American Cancer Society. Atlanta. Available from: http://www.cancer.org (2014).
  2. Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
  3. Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41, (16), 2569-2576 (2005).
  4. Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17, (12), 7306-7316 (1997).
  5. Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3, (4), 4170-4190 (2011).
  6. Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2, (3), 103-108 (2011).
  7. Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11, (3), 377-383 (2011).
  8. Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15, (4), 738-746 (2004).
  9. Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25, (2), 400-409 (2012).
  10. Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39, (22), 4048-4051 (2000).
  11. Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16, (6), 1-6 (2011).
  12. Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (15), 6105-6110 (2009).
  13. Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163, (3), 368-373 (2012).
  14. Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17, (1), 11 (2012).
  15. Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8, (6), 2233-2243 (2011).
  16. Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124, (25), 7411-7420 (2002).
  17. Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46, (23), 4320-4324 (2007).
  18. Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42, (3), 878-884 (2003).
  19. Sorasaenee, K., Fu, P. K. -L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42, (4), 1267-1271 (2003).
  20. Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46, (18), 7494-7502 (2007).
  21. Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251, (1-3), 61-65 (2008).
  22. Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48, (13), 5599-5601 (2009).
  23. Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104, (5), 576-582 (2010).
  24. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378, (1), 140-147 (2011).
  25. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10, (3), 367-384 (2013).
  26. Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43, (3), 1175-1183 (2004).
  27. Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
  28. Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536, (1), 43-54 (2001).
  29. Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42, (3), 283-296 (2002).
  30. Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Cancer Research. 48, (11), 3014-3018 (1988).
  31. Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Cancer Research. 51, 6199-6201 (1991).
  32. Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
  33. Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7, (5), 2337-2361 (2010).
  34. Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4, (10), 1257-1272 (2012).
  35. Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, (5), 1417-1421 (1988).
  36. Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53, (7), 969-977 (1997).
  37. Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280, (10), 9586-9594 (2005).
  38. Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7, (3), 182-188 (2011).
  39. Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68, (13), 5257-5266 (2008).
  40. Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8, (10), 2780-2790 (2009).
  41. MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. Life Technologies. Carlsbad. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/1330M_G.pdf (2014).
  42. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27, (2-3), 126-139 (2006).
  43. Quick Spin Columns Protocol. Roche Diagnostics GmbH. Mannheim. Available from: https://pim-eservices.roche.com/LifeScience/Document/95c2b1f8-7cf1-e311-98a1-00215a9b0ba8 (2013).
  44. RNA quality control. KU Leuven: Biomedical Genomics. Leuven. Available from: http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html (2007).
  45. Sabris, R. W. Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. Wiley. Hoboken, NJ. (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics