एक

Bioengineering

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Summary

गैलियम (तृतीय) 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole और उसके Freebase अनुरूप कम micromolar सेल cytotoxicity दिखा रहे हैं। इस पांडुलिपि corroles द्वारा प्रतिलेखन निषेध का आकलन करने के क्रम में, यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ एक आरएनए प्रतिलेखन प्रतिक्रिया, एक ethidium ब्रोमाइड दाग जेल के साथ इमेजिंग शाही सेना, और बढ़ाता शाही सेना का वर्णन करता है और कैंसर विरोधी उम्मीदवार गुणों का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल तरीका दर्शाता है।

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Tang, G. Y., Pribisko, M. A., Henning, R. K., Lim, P., Termini, J., Gray, H. B., Grubbs, R. H. An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles. J. Vis. Exp. (97), e52355, doi:10.3791/52355 (2015).

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Abstract

कीमोथेरेपी अक्सर कई दुष्प्रभाव और सीमित लक्ष्य-निर्धारण के साथ व्यापक स्पेक्ट्रम साइटोटोक्सिक एजेंट शामिल है। Corroles chelated धातु और कार्य समूहों की पहचान के आधार पर विशेष सेल लाइनों में अंतर cytostatic और साइटोटोक्सिक गुण, कि प्रदर्शन tetrapyrrolic macrocycles के एक वर्ग के हैं। विशेष सेल लाइनों के प्रति क्रियाशील corroles की अद्वितीय व्यवहार लक्षित कीमोथेरेपी की संभावना का परिचय।

कई विरोधी दवाओं आरएनए प्रतिलेखन को बाधित करने के लिए अपनी क्षमता से मूल्यांकन कर रहे हैं। यहाँ हम जानते हैं और संभावित अवरोधकों की मौजूदगी में आरएनए प्रतिलेखन के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल उपस्थित थे। जेल वैद्युतकणसंचलन और यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्रतिलेखन प्रतिक्रिया की शाही सेना के उत्पादों के मूल्यांकन कार्रवाई के अपने तंत्र के बारे में अधिक परख करने के लिए संशोधन के साथ, संभावित कैंसर विरोधी दवा उम्मीदवारों की inhibitive संपत्तियों के बारे में जानकारी प्रदान करता है और।

थोड़ाcorrole cytotoxicity की कार्रवाई की आणविक तंत्र के बारे में जाना जाता है। गैलियम (तृतीय) 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole (गा (tpfc)) और Freebase एनालॉग 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc): इस प्रयोग में, हम दो corrole यौगिकों पर विचार करें। एक शाही सेना प्रतिलेखन परख corroles की inhibitive संपत्तियों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। पांच प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं तैयार थे: क्रमश: 0.01, की [टेम्पलेट डीएनए आधार] अनुपात, और एक अनुपचारित नियंत्रण: एक [जटिल] पर Actinomycin डी, triptolide, गा (tpfc), tpfc के साथ इलाज डीएनए।

प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं agarose जेल वैद्युतकणसंचलन और यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर चार घंटे के बाद विश्लेषण किया गया। गा (tpfc), Actinomycin डी, और triptolide द्वारा स्पष्ट निषेध नहीं है।

यह आरएनए प्रतिलेखन परख, या comple के साथ डीएनए या पोलीमर्स incubating द्वारा कैंसर विरोधी जटिल, डीएनए, या पोलीमर्स एंजाइम की सांद्रता अलग से अधिक यंत्रवत विस्तार प्रदान करने के लिए संशोधित किया जा सकता हैपूर्व शाही सेना प्रतिलेखन के लिए XES; इन संशोधनों के डीएनए या एंजाइम शामिल निषेध तंत्र के बीच अंतर होता है। आरएनए प्रतिलेखन परिसरों नीचा परीक्षण है कि क्या या आरएनए hydrolyze के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद परिसर में जोड़ना। यह परख भी अतिरिक्त कैंसर विरोधी उम्मीदवारों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

कीमोथेरेपी अक्सर अवांछित दुष्प्रभाव और सीमित लक्ष्य-निर्धारण के साथ व्यापक स्पेक्ट्रम साइटोटोक्सिक एजेंट शामिल है, अभी तक कैंसर जीव विज्ञान का अधिक से अधिक समझ के साथ, उच्च कैंसर को लक्षित प्रभावकारिता और कम साइड इफेक्ट के साथ कैंसर विरोधी एजेंट के लिए एक बढ़ती मांग है। एक मानव कैंसर की कोशिकाओं को अक्सर बन अस्तित्व के लिए एक भी सक्रिय या overexpressed ओंकोजीन पर निर्भर है। इस प्रकार दो, कई विरोधी दवाओं आरएनए प्रतिलेखन को बाधित करने के लिए अपनी क्षमता से मूल्यांकन कर रहे हैं। इन बदलने जीनों की अभिव्यक्ति है कि ब्लॉक उपचार कैंसर की कोशिकाओं को नष्ट करने में प्रभावी रहे हैं और कोशिका मृत्यु पैदा होती हैं। सामान्य कोशिकाओं संगत कर रहे हैं की तुलना में तीन बदल कोशिकाओं आरएनए प्रतिलेखन में अवरोधों को और अधिक संवेदनशील होते हैं। चुनिंदा बाधित करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं प्रतिलेखन रोकना है कि चार विरोधी दवाओं कैंसर कोशिका को जीवित रखने के लिए जरूरी हैं, जो ओंकोजीन की अभिव्यक्ति। 5 नतीजतन, आरएनए प्रतिलेखन मैंnhibition संभावित कैंसर विरोधी दवा उम्मीदवारों की पहचान करने और कार्रवाई के अपने तंत्र के बारे में अधिक जानने के लिए एक उपयोगी तरीका है। इस प्रोटोकॉल गा (tpfc) कीमोथेरेपी दवाओं Actinomycin डी और triptolide रूप में एक ही आदेश पर आरएनए प्रतिलेखन रोकता यह दर्शाता है कि; इसी तरह की तुलना अन्य औषध के विरोधी उम्मीदवारों के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। Actinomycin डी सामान्यतः गर्भावधि trophoblastic कैंसर, वृषण कैंसर, Wilm के ट्यूमर, rhabdomyosacoma इलाज के लिए इस्तेमाल एक आरएनए प्रतिलेखन अवरोध करनेवाला है, और इविंग सारकोमा 6। यह पहली बार 1964.Triptolide में एफडीए द्वारा इन विट्रो में और 30 साल के लिए विभिन्न ट्यूमर असर पशु मॉडल में जांच की गई है कि एक चयनात्मक प्रतिलेखन अवरोध करनेवाला है अनुमोदित किया गया था के बाद से Actinomycin डी लगभग पचास वर्षों के लिए कैंसर के उपचार में इस्तेमाल किया गया है। 7

corroles की amphiphilic macrocyclic प्रकृति इस तरह के छोटे अणुओं या जीवविज्ञान के रूप में अन्य दवा वर्गों से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता हैएस। 8-14 macrocyclic चरित्र इस तरह के बड़े अणुओं के लिए उम्मीद की तुलना में अधिक है कि सेलुलर पारगम्यता के लिए अनुमति देता है, और वे इस तरह के प्रोटीन के रूप में उन macromolecular सतहों के साथ बातचीत करने के लिए काफी बड़े हैं। 8 Corroles biomolecules के साथ तंग noncovalent परिसरों के लिए फार्म में जाना जाता है और दवाओं। corrole ढांचे के निहित cytotoxicity के अलावा 10, हम दिखा दिया एजेंटों के लिए एक वाहक अणु, विशेष रूप से डीएनए intercalating anthracycline दवा डॉक्सोरूबिसिन के रूप में एक sulfonated corrole कार्य करता है। Sulfonated corrole डॉक्सोरूबिसिन साथ coadministered गया था, डॉक्सोरूबिसिन के आईसी 50 में एक तीन गुना वृद्धि ड्यू-145 कोशिकाओं के लिए मनाया गया। 9 corrole ढांचा स्थिर है और क्रियाशील करते हैं, अद्वितीय absorbance के पारियों से गुजरना है कि निहित absorbance के और प्रतिदीप्ति गुण है कि लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पाड़ के 10 functionalization स्वाभाविक affec नहीं करताचुनिंदा काफी हद तक अपनी जैविक गुणों को बदल सकते हैं corrole के ढांचे को संशोधित करने, एक sulfonated corrole साथ देखा के रूप में, corrole, 9-15 की photophysical गुण टी लेकिन। 16 हम पहले सात मानव कैंसर कोशिका लाइनों के खिलाफ छह metallocorroles मूल्यांकन किया है। परिणाम मानव कैंसर की कोशिकाओं की ओर विषाक्तता विशिष्ट धातु आयन, साथ ही कार्यात्मक समूह प्रतिस्थापन पर निर्भर है कि संकेत मिलता है। उदाहरण के लिए, sulfonated गैलियम corroles उच्च सेलुलर तेज अनुभवी और मस्तिष्क मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं (ड्यू-145) के नाभिक में चुनिंदा प्रवेश कर; के लिए की तुलना में यह अन्य सेल लाइनों के नाभिक में घुसना नहीं करता है, हालांकि एक ही corrole, स्तन के लिए अधिक से अधिक cytotoxicity दर्शाती (एमडीए MB-231), मेलेनोमा (एस-एमईएल-28), और डिम्बग्रंथि (OVCAR-3) कैंसर कोशिकाओं प्रोस्टेट कैंसर। 9

प्रारंभिक सेल आधारित assays इन यौगिकों विरोधी कैंसर चिकित्सकीय एजेंटों, Furth जो योग्यता के आधार के रूप में वादा है कि शो का संकेतकार्रवाई के तंत्र में ईआर जांच। ट्रांसक्रिप्शन निषेध कुछ organometallic परिसरों 17-27 के साथ मनाया जाता है और हम corrole परिवार की साइटोटोक्सिक व्यवहार के लिए एक संभव तंत्र के रूप में इस प्रक्रिया की जांच करने की मांग की है। यह प्रतिलेखन परख जीवित कोशिकाओं में इन अणुओं के प्रभाव के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी के लिए नेतृत्व करेंगे जो प्रतिलेखन निषेध, आकलन करने के लिए एक, सरल, सस्ती और सुगम तरीका प्रदान करता है।

इधर, गैलियम का प्रतिलेखन निषेध (तृतीय) 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole (गा (tpfc)) और उसके Freebase एनालॉग 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (चित्रा 1) का परीक्षण कर रहे हैं। कुछ संक्रमण धातु परिसरों के विपरीत, गैलियम (तृतीय) रेडॉक्स निष्क्रिय है और इसलिए सीधे रेडॉक्स आधारित चयापचय मार्ग की रेडॉक्स प्रक्रिया में शामिल नहीं है। 28 भले ही, गैलियम (तृतीय) साइटोटोक्सिक गुणों को प्रदर्शित करता है और चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए जांच की गई है। गैलियम प्लैटिनम के बाद कैंसर विरोधी चिकित्सा विज्ञान के लिए दूसरा सबसे होनहार धातु है और कई अध्ययन और जांच आया है; नाइट्रेट और क्लोराइड गैलियम लवण hepatoma, लिंफोमा, मूत्राशय के कैंसर, और अन्य बीमारियों के खिलाफ क्लिनिकल परीक्षण में मूल्यांकन किया गया है। 29-34 गैलियम (तृतीय) कैंसर विरोधी corrole अध्ययन के लिए इसलिए आदर्श है। प्रारंभिक डेटा (चित्रा 2 देखें) गा (tpfc) और tpfc विभिन्न कैंसर कोशिका लाइनों के साथ कम सैनिक 50, अधिक से अधिक सेल प्रसार के 50% को बाधित करने के लिए आवश्यक दवा एकाग्रता, दिखाने; यह उनकी inhibitive गुण निर्धारित करने के लिए इन दो यौगिकों पर आगे के प्रयोगों की वैधता की पुष्टि की। हम आम विरोधी दवाओं Actinomycin डी और triptolide के साथ इन यौगिकों की तुलना करें। Actinomycin डी intercalates डीएनए, आरएनए बढ़ाव को रोकता है, और picomolar सांद्रता में कुछ सेल लाइन में apoptosis लाती 6,35-37 Triptolide ट्यूमर के विकास को बाधित करने के लिए दिखाया गया है। यह मानव XPB / ERCC3, एक सबयूनिट ओ को बांधताएफ प्रतिलेखन कारक TFIIH, शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय गतिविधि के निषेध के लिए अग्रणी। 6-7,38-40

यह आमतौर पर corroles साइटोटोक्सिक गुण है कि प्रदर्शन के नाम से जाना जाता है, functionalization से उत्पन्न होने वाली विभिन्न तंत्र के बारे में कम जानकारी मौजूद है। आरएनए प्रतिलेखन के Corrole निषेध Biomacromolecules के साथ उनकी बातचीत पर अधिक से अधिक जानकारी की पेशकश करेगा। ऐसे dirhodium के रूप में डीएनए के लिए बाध्य करने के लिए जाना जाता है अन्य परिसरों, (द्वितीय, द्वितीय) परिसरों, क्रोमियम (तृतीय) परिसरों, दयाता (द्वितीय) polypyridyl परिसरों, रोडियाम (तृतीय) परिसरों, और विभिन्न अन्य लोगों के, 18, ​​आरएनए प्रतिलेखन assays के लिए किए गए 27 Biomacromolecules के साथ उनकी बातचीत का अधिक से अधिक समझ में जिसके परिणामस्वरूप। यह सतही और व्यापक रूप से उपलब्ध प्रयोग भी एक दिया अणु की cytotoxicity संपत्तियों का आकलन और चाहे यह गुण आगे जैविक परीक्षण निर्धारित करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक परीक्षा है। आरएनए प्रतिलेखन परख भी ऐसे varyin के रूप में कई संशोधनों के लिए अनुमति देता हैछ इस्तेमाल किया यौगिक या एंजाइमों की मात्रा; ऊष्मायन अवधि, प्रतिक्रिया समय और नमूना समय बिंदुओं बदलती; और इस प्रकार संभावित डेटा की एक बड़ी राशि उपलब्ध कराने, हित के अन्य चर के बीच डीएनए टेम्पलेट लंबाई और अनुक्रम, बदलती। घटकों खरीदा है और व्यक्तिगत रूप से तैयार किया जा सकता है, हालांकि यह प्रतिलेखन परख, भी प्रदान की सभी आवश्यक प्रतिक्रिया घटकों के साथ सस्ती किट के रूप में आसानी से उपलब्ध है। इन प्रयोगों में, हम उच्च उपज के लिए जाना जाता है एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करें। 41

Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन और यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी: प्रतिलेखन निषेध का आकलन करने के लिए, हम दो तरीकों का उपयोग करें। Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन, अलग होने की पहचान है, और सफ़ाई 0.5- 25 केबी डीएनए और आरएनए के टुकड़े करने के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका है। 42 यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी एकाग्रता और आरएनए की शुद्धता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 43

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Protocol

नोट: शाही सेना के साथ काम करना डीएनए और आरएनए नीचा कि DNase और RNase एंजाइमों द्वारा संक्रमण से बचने के लिए एक साफ काम के माहौल को बनाए रखने। कि पिपेट सुझाव और ट्यूबों DNase और RNase मुक्त कर रहे हैं सुनिश्चित करें। यह एक ऐसी परिशोधन समाधान के साथ आदि pipettes, ट्यूब धारकों, के रूप में प्रयोगशाला सतहों और उपकरणों के नीचे साफ करने के लिए भी उपयोगी है।

Corrole उपचार के साथ 1. आरएनए प्रतिलेखन

  1. Corrole को तैयार है और एक .01 में यौगिकों अवरोध करनेवाला [डीएनए] [जटिल] की एक दाढ़ अनुपात।
    नोट: 0.43 pmol डीएनए, प्रयोग डीएनए टेम्पलेट से लिगा जीन के साथ APET-28C वेक्टर था जहाँ: हमारे मामले में, अनुपात 4.3 fmol जटिल था T7 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत कोलाई। T7 प्रमोटर के साथ अन्य डीएनए भी प्रतिलेखन परख चलाने के लिए मान्य उम्मीदवार हैं।
    1. Actinomycin विकास, स्वच्छ, अलग कंटेनर में triptolide, tpfc, और डाइमिथाइल sulfoxide में गा (tpfc) (DMSO) भंग। [ग की एक दाढ़ अनुपात: एक 0.01 का अंतिम एकाग्रता प्राप्तomplex]: Nuclease मुक्त पानी के साथ धारावाहिक dilutions का उपयोग करके [डीएनए]।
      1. 1.8 मिलीलीटर DMSO में 1 मिलीग्राम Actinomycin डी भंग। विभाज्य 10 एक अलग कंटेनर के लिए μl और एक 1/100 कमजोर पड़ने बनाने के लिए Nuclease मुक्त पानी के साथ एक मिलीलीटर पतला। विभाज्य एक एक अलग कंटेनर के कमजोर पड़ने के μl और एक 1/1000 कमजोर पड़ने बनाने के लिए Nuclease मुक्त पानी के साथ एक मिलीलीटर पतला।
        नोट: Actinomycin डी के अंतिम समाधान की एकाग्रता 4.3 fmol है।
      2. 0.64 मिलीलीटर DMSO में 1 मिलीग्राम triptolide भंग। विभाज्य एक एक अलग कंटेनर के लिए μl और एक 1/1000 कमजोर पड़ने बनाने के लिए Nuclease मुक्त पानी के साथ एक मिलीलीटर पतला। विभाज्य एक एक अलग कंटेनर के कमजोर पड़ने के μl और एक दूसरे 1 / 1,000 कमजोर पड़ने बनाने के लिए Nuclease मुक्त पानी के साथ एक मिलीलीटर पतला।
        नोट: triptolide के अंतिम समाधान की एकाग्रता 4.3 fmol है।
      3. 2.9 मिलीलीटर DMSO में 1 मिलीग्राम tpfc भंग। 10 μl एक अलग कंटेनर के लिए और nuclease मुक्त पानी के साथ एक मिलीलीटर पतला विभाज्य एक 1/100 डी बनाने के लिएilution। विभाज्य एक एक अलग कंटेनर के कमजोर पड़ने के μl और एक 1/1000 कमजोर पड़ने बनाने के लिए Nuclease मुक्त पानी के साथ एक मिलीलीटर पतला।
        नोट: tpfc के अंतिम समाधान की एकाग्रता 4.3 fmol है।
      4. 2.6 मिलीलीटर DMSO में 1 मिलीग्राम गा (tpfc) भंग। विभाज्य 10 एक अलग कंटेनर के लिए μl और एक 1/100 कमजोर पड़ने बनाने के लिए Nuclease मुक्त पानी के साथ एक मिलीलीटर पतला। विभाज्य एक एक अलग कंटेनर के कमजोर पड़ने के μl और एक 1/1000 कमजोर पड़ने बनाने के लिए Nuclease मुक्त पानी के साथ एक मिलीलीटर पतला।
        नोट: गा (tpfc) के अंतिम समाधान की एकाग्रता 4.3 fmol है।
        नोट: ये corroles और अवरोधकों पानी में घुलनशील नहीं कर रहे हैं और DMSO में पूर्व भंग किया जाना चाहिए। (1% से नीचे) DMSO के थोड़ी मात्रा कोशिकाओं (अप्रकाशित डेटा) में cytotoxicity प्रेरित नहीं करते।
  2. पहले प्रतिलेखन प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए व्यक्तिगत रूप से आवश्यक अभिकर्मकों तैयार है या एक वाणिज्यिक विक्रेता से खरीद।
    1. बर्फ सब जम पर पिघलनाएन अभिकर्मकों (फ्रोजन अभिकर्मकों की एक सूची के लिए 1 टेबल देखें)।
    2. वे पूरी तरह से समाधान में भंग कर रहे हैं जब तक मिश्रण करने के लिए 10x प्रतिक्रिया बफर और 4 ribonucleotide (एटीपी, CTP, जीटीपी, और UTP) समाधान समय की अनुमति दें।
    3. संक्षेप में ट्यूब के रिम पर माल की हानि को रोकने के लिए सभी अभिकर्मकों अपकेंद्रित्र। आरटी पर 10x प्रतिक्रिया बफर रखते हुए एक बार बर्फ पर, स्टोर ribonucleotides thawed।
    4. आरटी पर प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए अभिकर्मकों का मिश्रण (अभिकर्मकों की एक सूची के लिए 2 टेबल देखें)।
      नोट: प्रतिक्रिया बर्फ पर बजाय आरटी पर इकट्ठा किया है अगर 10x प्रतिक्रिया बफर में spermidine टेम्पलेट डीएनए coprecipitate कर सकते हैं।
    5. ट्यूब flicking या ऊपर और नीचे धीरे मिश्रण pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। मिश्रण के बाद, अपकेंद्रित्र संक्षिप्त ट्यूब के नीचे प्रतिक्रिया मिश्रण इकट्ठा करने के लिए।
    6. 2-4 घंटे की कुल के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं।
      नोट: आवश्यक प्रतिक्रिया बार अलग अलग होंगेडीएनए टेम्पलेट आकार और दृश्य के साथ। यह कदम विशिष्ट दृश्यों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। छोटा टेम्पलेट्स कुल शाही सेना के एक उच्च उपज के लिए लंबे समय तक प्रतिक्रिया समय की आवश्यकता हो सकती है।
    7. -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक घंटे और दुकान के बाद प्रत्येक प्रतिक्रिया से 4 μl aliquots निकालें। वांछित timepoints के लिए जरूरत के रूप में संशोधित करें।

2. शाही सेना स्पिन स्तंभ

  1. प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के बाद, microcentrifuge-संगत क्रोमैटोग्राफी स्तंभों का उपयोग शाही सेना शुद्ध।
    नोट:। आरएनए स्पिन स्तंभों का प्रयोग अधिक से अधिक 80% से वसूली में अधिक से अधिक से अधिक 20 ठिकानों परिणामों के साथ शाही सेना को शुद्ध करने के लिए 44
    नोट: कॉलम क्रोमैटोग्राफी शाही सेना को शुद्ध करने के लिए एक आम और सुविधाजनक तरीका है। क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण, isopropanol तेज़ी है, साथ ही अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट: अन्य शुद्धि तरीकों में भी इस तरह के लिथियम क्लोराइड तेज़ी, फिनोल के रूप में मौजूद हैं।
    1. समान रूप से सख्ती inverting द्वारा स्तंभ बफर में Sephadex मैट्रिक्स resuspendस्तंभ तीन या अधिक बार। तेजी से स्तंभ flicking द्वारा यह मत करो।
    2. स्तंभ से शीर्ष टोपी निकालें। टोपी में कुछ अवशिष्ट Sephadex मैट्रिक्स हो जाएगा; टोपी मैट्रिक्स से भर जाता है, तो स्तंभ पर टोपी की जगह और मैट्रिक्स के बहुमत के कॉलम में है जब तक पिछले चरण को दोहराएँ।
    3. स्तंभ के नीचे टिप बंद तस्वीर।
      नोट: कुछ तरल स्तंभ से बच सकते हैं।
    4. स्तंभ पैक।
      1. एक बाँझ (RNase और DNase मुक्त) 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में स्तंभ रखें।
      2. एक मिनट के लिए 1000 XG पर एक tabletop अपकेंद्रित्र में ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    5. स्तंभ से eluted बफर के साथ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब त्यागें।
    6. तुरंत एक नया बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में स्तंभ जगह और स्तंभ बिस्तर के केंद्र के लिए नमूना विंदुक। स्तंभ ओवरलोडिंग से बचने के लिए नमूने के 20-50 μl का प्रयोग करें।
    7. 1000 XG पर एक tabletop अपकेंद्रित्र में ट्यूब अपकेंद्रित्रएक मिनट के लिए।
      नोट: eluent शुद्ध शाही सेना नमूना है।

3. agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (1% agarose जेल) 42

नोट: ethidium ब्रोमाइड डीएनए और आरएनए के लिए बाध्य करने पर fluoresces, इसलिए इन biomolecules 0.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / ethidium ब्रोमाइड समाधान के साथ उन्हें incubating द्वारा यूवी प्रकाश के साथ देखे जा सकते हैं।

  1. पानी की 5 मिलीग्राम ethidium ब्रोमाइड 10 में मिलीग्राम भंग करके ethidium ब्रोमाइड (0.5 मिलीग्राम / एमएल) की एक 1,000x शेयर समाधान तैयार है।
  2. जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए Tris एसीटेट EDTA (TAE) चल रहा है बफर तैयार करें। एक 50x TAE बफर 2.0 एम Tris- एसीटेट 0.05 एम Ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ गठबंधन और 8.5 पीएच को समायोजित करने के लिए।
  3. बफर एक एल 1x TAE में 10 ग्राम ultrapure Agarose भंग और एक पारंपरिक माइक्रोवेव ओवन के साथ agarose पिघलने से एक 1% (वजन / मात्रा) agarose जेल तैयार करें। यह 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा है एक बार, 1% agarose जेल समाधान करने के लिए 1,000x ethidium ब्रोमाइड के 1 मिलीलीटर जोड़नेtion, धीरे घूमता द्वारा या एक बंद कंटेनर में inverting द्वारा मिश्रण है, तो एक जेल के कास्टिंग मंच में agarose समाधान डालना और जेल आरटी पर दृढ़ करने की अनुमति देते हैं।
    नोट: ethidium ब्रोमाइड एक उत्परिवर्तजन और संभावित कैसरजन है। दस्ताने पहनें और ध्यान से समाधान संभाल। Ethidium ब्रोमाइड के समुचित से निपटने प्रक्रियाओं के लिए, कृपया देखें: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
  4. जेल जम गया है के बाद, वैद्युतकणसंचलन टैंक में सेट जेल जगह है। कुओं जलमग्न कर रहे हैं जब तक जेल कवर करने के लिए पर्याप्त TAE बफर जोड़ें। TAE बफर का स्तर लगभग 1 मिमी जेल के स्तर से ऊपर है कि जाँच करें। जेल कंघी निकालें।
    नोट: कुओं जलमग्न होने के बाद कंघी निकाल रहा कुओं में फंस जाने से हवा जेब से बचाता है।
  5. शाही सेना के नमूने तैयार करें। 1 μl जेल लोड हो रहा बफर के साथ प्रत्येक शुद्ध नमूना विभाज्य की एक μl जुडा है (या एक μl 10x लोड हो रहा है बफर और dilut साथएड nuclease मुक्त पानी के साथ 10 μl) और करने के लिए एक micropipette के साथ और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से।
    नोट: 10x लोड हो रहा है बफर 20% Ficoll 400, 0.1 एम 2 ना EDTA, पीएच 8.0, 1.0% एसडीएस, नीले 0.25% bromophenol शामिल हैं। यह नीले bromophenol के रूप में उपवास के रूप में ~ 50% चलाता है और बहुत लंबे समय रनों की निगरानी के लिए उपयोगी हो सकता है के रूप में 0.25% xylene cyanol भी, लोडिंग बफर करने के लिए जोड़ा जा सकता है। 42
  6. ध्यान से अच्छी तरह से प्रत्येक के तल में समाधान pipetting द्वारा प्रत्येक नमूने के साथ जेल लोड करें। किसी भी हवाई बुलबुले छोड़ने के लिए या कुओं के बीच नमूने मिश्रण करने के लिए नहीं ख्याल रखना।
    ध्यान दें: एक शाही सेना सीढ़ी भी प्रतिलेख के आकार का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  7. डीएनए सकारात्मक नेतृत्व की ओर जेल में विस्थापित होगा कि इतना सुराग संलग्न। वांछित स्तर तक आम तौर पर 1 वी 10 / जेल के सेमी वोल्टेज सेट। लेकिन लंबे समय के लिए जेल जुदाई की प्रगति की निगरानी करने के लिए रंगों के माइग्रेशन का उपयोग करते हुए शाही सेना के टुकड़े के बीच महत्वपूर्ण जुदाई, के लिए पर्याप्त है चलाएँ।
    एनOTE: 150 वी पर लगभग 20 मिनट का समय लगेगा एक 8 सेमी x 8 सेमी जेल, जबकि 250 वी पर एक 23 सेमी x 25 सेमी जेल, लगभग एक घंटा लग जाएगा। उच्च voltages में चला जब छोटे आरएनए टुकड़े बेहतर संकल्प है।
  8. लोड हो रहा है बफर से डाई आरएनए के टुकड़ों के बीच अलगाव के लिए पर्याप्त न्याय दूरी चले गए है, जब बिजली की आपूर्ति बंद कर दें।
  9. Ethidium ब्रोमाइड के रूप में पराबैंगनी प्रकाश के तहत शाही सेना प्रतिदीप्ति छवि।
  10. छवि की एक तस्वीर ले लो और हर हालत से शुद्ध शाही सेना के प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना करें।

यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से 4. शाही सेना मात्रा

  1. एक NanoDrop 2000, या इसी तरह की मशीन पर दो μl एच 2 हे, जगह और खाली उपाय।
  2. अगला, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर, शुद्धि निम्नलिखित प्रत्येक शाही सेना के नमूने के 2 μl, जगह और 800 एनएम के लिए 200 एनएम के तरंग दैर्ध्य रेंज से यूवी विज़ उपाय।
    नोट: 1.0 का एक एक 260 पढ़ने शाही सेना के बारे में 40 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर के बराबर है,और शुद्ध शाही सेना एक ए 260 / 2.1 की एक 280 अनुपात है। 45
  3. मामले में कि absorbance के एक से एक आयुध डिपो कम प्राप्त करने के लिए Nuclease मुक्त पानी में नमूने पतला, एक आयुध डिपो से ऊपर है।
  4. विभिन्न नमूनों की साजिश और 260 एनएम पर आयुध डिपो तुलना करने के लिए रेखांकन सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।

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Representative Results

Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा मूल्यांकन आरएनए प्रतिलेखन गुणात्मक

Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन छवि को लिखित आरएनए प्रयोग किया जाता है। Ethidium ब्रोमाइड शाही सेना के 46 इजाजत दी इमेजिंग (λ उन्हें 605 एनएम, λ पूर्व = 210 एनएम, 285 एनएम =) बाध्यकारी पर fluoresces। जेल में गहरे रंग के बैंड शाही सेना के उच्च सांद्रता के अनुरूप हैं। Actinomycin डी, triptolide, या तो corrole जटिल आरएनए प्रतिलेखन को रोकता है, तो शाही सेना के उत्पादन कम हो जाता है और बैंड हल्का दिखाई देगा। इस अवधारणा का उपयोग करना, रिश्तेदार निषेध का आकलन किया जा सकता है।

0.01 [टेम्पलेट डीएनए आधार] अनुपात: चित्रा 3 एक [जटिल] में आरएनए प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं कोई जटिल, Actinomycin डी, triptolide, tpfc, या गा (tpfc) के साथ पूर्व इलाज के ethidium ब्रोमाइड दाग agarose जेल (1%) से पता चलता है : 1। के रूप में की उम्मीद Actinomycin डी और triptolide, नियंत्रण की तुलना में शाही सेना का एक स्पष्ट कमी दिखानेइन लंबे समय से अध्ययन किया अवरोधकों। Tpfc बैंड कोई निषेध करने के लिए छोटे से पता चलता है और नियंत्रण के रूप में एक ही रिश्तेदार तीव्रता दर्शाती है, जबकि गा (tpfc) बैंड भी, शाही सेना के एक बहुत कम स्तर है।

आरएनए प्रतिलेखन यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मात्रा

यूवी विज़ माप 4 घंटे के लिए आरएनए प्रतिलेखन के दौर से गुजर के बाद प्रत्येक नमूने के लिए ले लिया है और शाही सेना स्पिन स्तंभ क्रोमैटोग्राफी साथ शुद्ध किया गया। तरंग दैर्ध्य की स्पेक्ट्रा 350 एनएम के लिए 220 एनएम λ अधिकतम आरएनए अवशोषण करने के लिए इसी, 260 एनएम पर होने वाली के साथ, 4 चित्र में दिखाए जाते हैं, और 0.025 (g / एमएल) की एक विलुप्त होने के गुणांक -1 सेमी -1। 260 एनएम और 280 एनएम पर absorbance के एक एक 1.0 के 260 पढ़ने शाही सेना के बारे में 40 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर के बराबर है। तालिका 3 में सूचना दी, और शुद्ध शाही सेना के मात्रात्मक गणना के लिए अनुमति देता है, एक ए 260 / 2.1 की एक 280 अनुपात है कर रहे हैं ट्रांस के दौरान उत्पादन शाही सेनाcription प्रतिक्रिया और आरएनए स्पिन स्तंभ उपयोग करने के बाद शाही सेना की शुद्धता के एक आकलन। चार अवरोध करनेवाला इलाज प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं का 44 तीन केवल 0.07 गुना ज्यादा आरएनए transcribing गा (tpfc) -treated डीएनए के साथ, नियंत्रण की तुलना में कम आरएनए झुकेंगे अनुपचारित डीएनए के रूप में। tpfc इलाज डीएनए कोई स्पष्ट निषेध दिखाया। सभी नमूनों अपेक्षाकृत शुद्ध नमूने का संकेत है, लगभग 2.2 की एक ए 260 / ए 280 का अनुपात है। शाही सेना स्पिन कॉलम द्वारा शोधन कम आरएनए 20 या उससे कम न्यूक्लियोटाइड लंबे strands हटा। अवशिष्ट डीएनए या 20 न्यूक्लियोटाइड से अधिक समय किस्में शुद्ध नमूने माना जाता है में मौजूद हो सकता है। ये मामूली दोष 2.1 की तुलना में थोड़ा अधिक से अधिक एक ए 260/280 के अनुपात में परिणाम होगा।

चित्र 1
(तृतीय) 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole (गा (टी गैलियम की चित्रा 1. आणविक संरचनापीएफसी)) और Freebase एनालॉग 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. cytotoxicity घटता है और सैनिक प्रोस्टेट में corroles के 50 मूल्यों (ड्यू-145) (ग्रे), स्तन (एमडीए MB-231) (नीला), त्वचा (एस-एमईएल-28) (नारंगी), और डिम्बग्रंथि (OVCAR -3) (हरा) कैंसर कोशिका लाइनों। कोशिकाओं (ए) गा (tpfc) का उपयोग करने और व्यवहार्यता के निर्धारण के द्वारा पीछा (बी) tpfc, साथ incubated रहे थे निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार वर्णमिति सेल व्यवहार्यता परख एमटीएस आधारित। कृपया यहां क्लिक करें इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिएआंकड़ा।

चित्र तीन
ऊष्मायन के चार घंटे के बाद प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं की चित्रा 3. ethidium ब्रोमाइड दाग agarose जेल (1%)। लेन एक एक मानक के रूप में एक 1000 बीपी डीएनए सीढ़ी है। , नियंत्रण (2 लेन), Actinomycin डी (3 लेन): लेन 2-6 0.43 pmol डीएनए से लिखित और प्रत्येक अवरोध करनेवाला के 4.3 fmol के साथ इलाज आरएनए (: 0.01 की [टेम्पलेट डीएनए आधार] अनुपात एक [जटिल]) दिखाने triptolide (4 लेन), tpfc (लेन 5), और गा (tpfc) (6 लेन)।

चित्रा 4
1 चित्रा 4. यूवी विज़ स्पेक्ट्रम:। ऊष्मायन के 4 के बाद घंटा में लिखित शाही सेना के 200 कमजोर पड़ने प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए डीएनए टेम्पलेट कोई जटिल के साथ इलाज, या Actinomycin डी, triptolide, tpfc, या गा (tpfc) के साथ किया गया था एक [जटिल] [टेम्पलेट डीएनए आधार] 0.01 के अनुपात: 1। शाही सेना एकाग्रता 260 एनएम पर आयुध डिपो द्वारा मापा जाता है।

बर्फ पर जमे हुए अभिकर्मकों गला लें:
एडेनोसाइन ट्रायफ़ोस्फेट, ग्वानोसिन ट्रायफ़ोस्फेट, cytidine ट्रायफ़ोस्फेट, और uridine ट्रायफ़ोस्फेट की 75 मिमी समाधान (एटीपी, CTP, जीटीपी, UTP)
Nuclease मुक्त पानी
10x प्रतिक्रिया बफर (1x प्रतिक्रिया बफर: 40 मिमी Tris-एचसीएल, 6 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी spermidine, 10 मिमी dithiothreitol, पीएच 7.9)
Linearized टेम्पलेट डीएनए (0.5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल, 1.85 Kb)
शाही सेना पोलीमरेज़ एंजाइम (20 यू / μl)

जमे हुए अभिकर्मकों की तालिका 1. सूची।

प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं शुरू करने के लिए, 0.2 मिलीलीटर पतली दीवारों पीसीआर नलियों में प्रत्येक अभिकर्मक के निम्न राशि जोड़ें:
2 μlएटीपी समाधान (75 मिमी)
2 μl CTP के समाधान (75 मिमी)
2 μl जीटीपी समाधान (75 मिमी)
2 μl UTP समाधान (75 मिमी)
1 μl nuclease मुक्त पानी
2 μl 10x प्रतिक्रिया बफर
0.5 माइक्रोग्राम प्रति / μl रैखिक टेम्पलेट डीएनए के 2 μl
5 μl परिसर (के रूप में नाभिक मुक्त पानी खाली, डी, triptolide, tpfc actinomycin, गा (tpfc))
2 μl शाही सेना पोलीमरेज़ (20 यू / μl)

प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए अभिकर्मकों की तालिका 2. सूची।

समय बिंदु (मानव संसाधन) जटिल एक 260 280 <> / मजबूत एक 260 / ए 280 कमजोर पड़ने का कारक [आरएनए]: एक 260
(G / एमएल)
[आरएनए] (मिलीग्राम / एमएल)
4 नियंत्रण 7.583 3.516 2.16 200 40 60.67
4 Actinomycin डी 0.955 0.438 2.18 200 40 7.638
4 triptolide 1.794 0.816 2.2 200 40 14.35
4 tpfc 7.858 3.631 2.16 200 40 62.87
4 गा (tpfc) 0.554 0.232 2.39 200 40 4.434

तालिका 3. एकाग्रता और लिखित शाही सेना की पवित्रता 4 घंटा यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है के बाद। एकल असहाय शाही सेना के विलुप्त होने के गुणांक (g / एमएल) 0.025 है -1 सेमी -1, 1.0 का एक एक 260 पढ़ने के बारे में करने के लिए बराबर है 40 माइक्रोग्राम प्रति / शाही सेना के मिलीलीटर, और शुद्ध शाही सेना एक ए 260 / 2.1 की एक 280 अनुपात है। 45

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Discussion

यह परख गा (tpfc) के अलावा के नाम से जाना जाता डीएनए बाध्यकारी विरोधी परिसरों Actinomycin डी और triptolide को तुलनात्मक रूप आरएनए प्रतिलेखन रोकता यह दर्शाता है कि। गा (tpfc) (सैनिक 50 = 58.1-154.7 माइक्रोन) की साइटोटोक्सिक व्यवहार अपने inhibitive गुणों के कारण हो सकता है। कोई प्रतिलेखन निषेध tpfc में मनाया गया था, tpfc की cytotoxicity आरएनए प्रतिलेखन अवरोध के कारण नहीं है, लेकिन अभी तक अध्ययन नहीं अन्य साधनों के कारण होता है।

प्रदर्शन कर चार ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं में, डीएनए पर, Actinomycin डी, triptolide, tpfc, या गा (tpfc) के साथ इलाज किया गया था एक [जटिल] [टेम्पलेट डीएनए आधार] क्रमश: 0.01, या एक अनुपचारित नियंत्रण का अनुपात। प्रतिलेखन प्रतिक्रिया अभिकर्मकों संयुक्त थे और प्रतिलेखन प्रतिक्रिया 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति दी गई थी। लिखित शाही सेना एक शाही सेना स्पिन स्तंभ और यूवी विज़ और जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण उपज के माध्यम से शुद्ध किया गया था। प्रतिलेखन निषेध की प्रकृति furt किया जा सकता हैउसे विभिन्न संशोधनों के साथ ही इस तकनीक का उपयोग कर जांच की, या यौगिकों इन विट्रो में और vivo अध्ययन में वैकल्पिक अधीन करने के लिए किया जा सकता है। निषेध के आणविक प्रकृति का निर्धारण में मदद मिल सकती है, जो अतिरिक्त प्रयोगों संभव corrole-डीएनए adducts या प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग का एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी शामिल हैं। इस प्रयोग का उद्देश्य यौगिकों अपनी क्षमता विरोधी गुणों के बारे में जानकारी इकट्ठा करने के क्रम में प्रतिलेखन बाधित निर्धारित करने के लिए किया गया था। यही उद्देश्य हासिल की थी: गा (tpfc) स्पष्ट निषेध और गुण आगे के अध्ययन का प्रदर्शन करते हुए tpfc, कोई निषेध का प्रदर्शन किया।

आरएनए प्रतिलेखन परख अधिक यंत्रवत विस्तार प्रदान करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के बाद कैंसर विरोधी एजेंट (जैसे, corrole परिसरों) के अलावा परिसरों नीचा या आरएनए hydrolyze कि क्या दिखा सकते हैं पूरा हो गया है। एक और सिफारिश प्रयोग आचरण करने के लिए हैशाही सेना पोलीमरेज़ एंजाइम के अपवाद के साथ सभी घटकों के साथ प्रतिलेखन प्रतिक्रिया डीएनए या एंजाइम शामिल निषेध तंत्र के बीच भेदभाव के लिए अनुमति देने के लिए कम 10 गुना। अंत में, डीएनए या जटिल inhibitive गुणों डीएनए या पोलीमर्स क्रमशः, बंधन में शामिल कर रहे हैं कि क्या पता लगाने में वृद्धि हुई जटिल और संबंधित लक्ष्य के बीच बंधन के लिए अनुमति होगी आरएनए प्रतिलेखन करने से पहले परिसरों के साथ पोलीमर्स के ऊष्मायन।

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Acknowledgments

हम ईमानदारी से जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ मदद के लिए डॉ सिंडी एन चिऊ धन्यवाद, और डीएनए और प्रतिबंध एंजाइम के अपने उदार दान के लिए एंडी झोउ और माइकल Grodick। हम कृतज्ञता उपकरण और सामग्री को उदार पहुँच के लिए प्रोफेसर जे हीथ और प्रोफेसर डी Prober स्वीकार करते हैं। हम उपयोगी सुझाव के लिए डॉ कर्ण Sorasaenee धन्यवाद। हम वीडियो में योजनाबद्ध सिंहावलोकन में इस्तेमाल चित्रण बनाने के लिए मैरी एच तांग धन्यवाद। अनुदान जॉनसन एंड जॉनसन और यूएससी Y86786 द्वारा प्रदान की गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actinomycin D Sigma-Aldrich A1410 Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide Sigma-Aldrich T3652 Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2 Life Technologies AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit Life Technologies AM1334 Store at –20 °C 
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate Sigma-Aldrich T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-100
mini Quick Spin RNA Columns Roche Life Science 11814427001 Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S Store at –20 °C 

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References

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