Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Галлий (III), 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole и его свободное основание аналог обладают низкой микромолей цитотоксичность клеток. Эта рукопись описывает реакцию транскрипции РНК, РНК изображений с бромидом-окрашенных гел этидия, и количественной оценки РНК с помощью УФ-видимой спектроскопии, с тем чтобы оценить ингибирование транскрипции corroles и демонстрирует простой метод оценки свойств противораковое кандидатов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tang, G. Y., Pribisko, M. A., Henning, R. K., Lim, P., Termini, J., Gray, H. B., Grubbs, R. H. An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles. J. Vis. Exp. (97), e52355, doi:10.3791/52355 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Химиотерапия часто включает в себя широкий спектр средств цитостатики со многими побочными эффектами и ограниченный характер адресности. Corroles представляют собой класс тетрапиррольных макроциклов, которые обладают дифференциальные цитостатические и цитотоксические свойства в определенных клеточных линий, в зависимости от тождеств хелатного металла и функциональных групп. Уникальное поведение функционализированных corroles по отношению к конкретным клеточных линий предусматривает возможность целенаправленного химиотерапии.

Многие противораковые препараты оценивали по их способности ингибировать транскрипцию РНК. Здесь мы представляем шаг за шагом протокол для транскрипции РНК в присутствии известных и потенциальных ингибиторов. Оценка РНК продуктов реакции транскрипции с помощью гель-электрофореза и UV-VIS-спектроскопии дает информацию о ингибирующих свойств потенциальных кандидатов противоопухолевого препарата и, при изменениях в анализе, более об их механизмом действия.

Немногоизвестно о молекулярном механизме действия Коррол цитотоксичности. В этом эксперименте мы рассмотрим два Коррол соединения: галлия (III) 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) и свободное основание аналог 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Транскрипции РНК-анализ используется для изучения тормозящее свойства corroles. Пять реакции транскрипции готовили: ДНК обрабатывают актиномицином D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc на [сложной]: [шаблона оснований ДНК] соотношении 0,01, соответственно, и с необработанным контролем.

Реакции транскрипции анализировали после 4 ч с помощью электрофореза в агарозном геле и УФ-видимой спектроскопии. Существует ясно ингибирование Ga (tpfc), актиномицин D, и triptolide.

Эта РНК транскрипции анализ может быть изменен, чтобы обеспечить более подробно механистическую путем изменения концентрации противоракового комплекса, ДНК-полимеразы, или фермент, или путем инкубации ДНК-полимеразы или с КомплексыРЭС До транскрипции РНК; эти модификации будут отличать механизма ингибирования с участием ДНК или фермент. Добавление комплекс после транскрипции РНК может быть использована для проверки ухудшить комплексы или гидролиза РНК. Этот анализ также может быть использован для изучения дополнительных кандидатов противоопухолевые.

Introduction

Химиотерапия часто включает в себя широкий спектр средств цитостатики с нежелательными побочными эффектами и ограниченный характер адресности, но с большим пониманием биологии рака, есть постоянно растущий спрос на противораковых агентов с высшим рака таргетирования эффективности и меньшим количеством побочных эффектов. 1 Раковые клетки человека часто становятся зависит от одного или активированного онкогена сверхэкспрессируется за выживание. 2 Таким образом, многие противораковые препараты оценивали по их способности ингибировать транскрипцию РНК. Процедуры, которые блокируют экспрессию этих трансформирующих генов являются эффективными в устранении раковых клеток и привести к гибели клеток. 3 Трансформированные клетки более чувствительны к сбоям в транскрипции РНК, чем являются соответствующие нормальные клетки. 4 Противораковые лекарственные средства, которые ингибируют транскрипцию, как ожидается, что они избирательно ингибируют выражение онкогенов, которые необходимы для раковых клеток, чтобы выжить. 5 Следовательно, транскрипции РНК яnhibition является способом выявления потенциальных кандидатов противоопухолевого препарата и узнать больше об их механизмом действия. Этот протокол показывает, что Ga (tpfc) ингибирует РНК-транскрипцию на том же порядке, что и химиотерапевтических препаратов Актиномицин D и triptolide; Аналогичные сравнения могут быть сделаны с помощью этого протокола с другими кандидатами противоопухолевого препарата. Актиномицин D является РНК транскрипции ингибитора обычно используется для лечения гестационного трофобластическую железы, рак яичка, опухоль Вильмса, rhabdomyosacoma и Юинга саркома 6. Актиномицин D был использован в лечении рака в течение почти пятидесяти лет, поскольку он был впервые одобрен в FDA в 1964.Triptolide является селективным ингибитором транскрипции, который был исследован в лабораторных и в различных животных моделях с опухолями на 30 лет. 7

Амфифильный макроциклический характер corroles придает значительные преимущества по сравнению с другими классами наркотиков таких, как небольшие молекулы или биологическихс. 8-14 макроциклического символов позволяет клеточной проницаемости, который больше, чем ожидалось для таких больших молекул, и они являются достаточно большими, чтобы взаимодействовать с макромолекул поверхностей, таких как белки. 8 Corroles, как известно, образуют жесткие нековалентных комплексов с биомолекул и лекарственных средств. 10 В дополнение к присущей цитотоксичности Коррол рамках, мы показали, что сульфированного Коррол действует как молекулой-носителем для химиотерапевтических агентов, в частности, ДНК-интеркалирующую антрациклина доксорубицина наркотиков. Когда сульфированный Коррол было больных с доксорубицином, 3-кратное повышение в IC 50 доксорубицин наблюдалось DU-145 клеток. 9 Коррол база устойчива и имеет присущие абсорбции и флуоресценции свойства, которые, когда функционализированный, подвергаются уникальные абсорбции сдвиги , которые могут быть использованы для определения характеристик. 10 Функционализация эшафот по своей природе не затрагиваемт фотофизические свойства Коррол, 9-15, но, как видно с сульфонированной Коррол, выборочно модифицировать рамки Коррол может существенно изменить его биологические свойства. 16 Мы ранее оценивали шесть metallocorroles против семи линий раковых клеток человека. Результаты показывают, что токсичность по отношению к раковым клеткам человека зависит от конкретного иона металла, а также замещение функциональных групп. Например, сульфированные галлия corroles наблюдается высокий клеточное поглощение и проникли выборочно в ядре головного мозга раковых клеток метастатического простаты (DU-145); то же самое Коррол, хотя это не проникает в ядра других клеточных линий, показывает большую цитотоксичность для груди (MDA-MB-231), меланома (SK-MEL-28) и яичников (OVCAR-3) раковые клетки, чем на рак предстательной железы. 9

Первоначальные анализы на основе клеток показывают, что эти соединения перспективными в качестве противораковых терапевтических средств, которые существу Furthэ расследование механизмом действия. Ингибирование транскрипции наблюдается при некоторых металлоорганических комплексов 17-27, и мы стремились изучить этот процесс в качестве возможного механизма цитотоксического поведения Коррол семьи. Это транскрипция анализ обеспечивает простой, недорогой и легкое метод оценки транскрипции ингибирование, что приведет к более подробной информации о последствиях этих молекул в живых клетках.

Здесь транскрипция ингибирование галлия (III) 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) и его свободное основание аналог 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Рисунок 1) тестируются. В отличие от некоторых комплексов переходных металлов, галлия (III), является окислительно-восстановительный неактивным и, следовательно, непосредственно не участвует в процессе окислительно-восстановительного окислительно-восстановительных основе метаболических путей. 28 Несмотря на это, галлия (III) не обладают цитотоксическими свойствами и была исследована в терапевтических целях, Галлия является вторым наиболее перспективным металлом для противораковых терапевтических после платины и претерпела множество исследований и расследований; нитрата и хлорида галлия соли были оценены в клинических испытаниях против гепатомы, лимфомы, рака мочевого пузыря, и других заболеваний. 29-34 галлия (III), поэтому идеально подходит для противораковых Коррол исследований. Исходные данные показывают, Ga (tpfc) и tpfc имеют низкую GI 50, концентрация лекарственного средства, необходимую для ингибирования 50% максимальной пролиферации клеток, с различных линий раковых клеток (рисунок 2); Это подтверждает обоснованность дальнейших экспериментов на этих двух соединений, чтобы определить их тормозящее свойства. Мы сравниваем эти соединения с общей противоопухолевых препаратов Актиномицин D и triptolide. Актиномицин D встраивается ДНК, ингибирует РНК удлинение и индуцирует апоптоз в определенной клеточной линии на пикомолярных концентрации 6,35-37 Triptolide показал ингибировать рост опухоли.; он связывается с человеческим XPB / ERCC3, субъединицы Oфактором транскрипции F TFIIH, что приводит к ингибированию РНК-полимеразы II активности. 6-7,38-40

В то время как это широко известно, что corroles обладают цитотоксическими свойствами, существует мало информации о различных механизмах, связанных с функционализации. Коррол ингибирование транскрипции РНК бы предложить более полное представление об их взаимодействии с биомакромолекул. Другие комплексы, которые известны для связывания с ДНК, такие как dirhodium (II, II) комплексы, хром (III), комплексы рутени (II), polypyridyl комплексы, родий (III), комплексы и различные другие, были подвергнуты транскрипции РНК анализах, 18- 27 в результате более глубокого понимания их взаимодействия с биомакромолекул. Это легкое и широко доступны эксперимент также хорошо первоначального испытания для оценки цитотоксичности свойства данной молекулы и определить, действительно ли он заслуживает дальнейшего биологического тестирования. Анализ транскрипции РНК также позволяет в течение многих модификаций, таких как varyinг количество соединения или ферментов, используемых; Изменяя инкубационный период, время реакции и точек отбора проб времени; и изменения длины ДНК шаблона и последовательность, среди других переменных, представляющих интерес, таким образом, потенциально обеспечивая большое количество данных. Это транскрипция анализ также легко доступны также доступных комплектов со всеми необходимыми компонентами реакции обеспечены, хотя компоненты могут быть куплены и подбирается индивидуально. В этих экспериментах мы используем коммерчески доступного набора, как известно, имеют высокую урожайность. 41

Для оценки ингибирования транскрипции, мы используем два метода: электрофорез в агарозном геле и УФ-Vis спектроскопии. Электрофорез в агарозном геле является простым и эффективным способом для разделения, идентификации и очистки 0,5- до 25-кб ДНК и РНК фрагментов. 42 УФ-видимой спектроскопии может быть использован для определения концентрации и чистоты РНК. 43

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с РНК поддерживать чистоту рабочей среды, чтобы избежать загрязнения от ДНКазы и РНКазы ферментов, которые разрушают ДНК и РНК. Убедитесь, что наконечники и трубы ДНКазы и РНКазы. Это также полезно протереть лаборатории поверхностей и оборудования, таких как пипетки, держатели труб и т.д. с раствором обеззараживания.

1. транскрипции РНК с Коррол обращения

  1. Подготовка Коррол и ингибитора соединений в 0,01: 1 мольном соотношении [комплекс]: [ДНК].
    ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае, соотношение было 4,3 фмоль комплекс: 0,43 пмоль ДНК, где ДНК-матрицы использовали Апет-28с вектор с геном ЛИГА из E. палочка под контролем промотора Т7. Другое ДНК с Т7 промотора, также действительны кандидаты для запуска транскрипции анализа.
    1. Растворить Актиномицин D, triptolide, tpfc и Ga (tpfc) в диметилсульфоксиде (ДМСО) в чистых, отдельных контейнерах. Получение конечной концентрации 0,01: 1 мольном соотношении [Complex]: [ДНК] с помощью серийных разведений с нуклеазы без воды.
      1. Растворите 1 мг актиномицин D в 1,8 мл ДМСО. Алиготе 10 мкл в отдельную емкость и доводят до 1 мл с нуклеазы без воды, чтобы создать разбавление 1/100. Алиготе 1 мкл разведения в отдельном контейнере и разбавляют до 1 мл с нуклеазы без воды, чтобы создать разведении 1/1000.
        ПРИМЕЧАНИЕ: концентрация конечного раствора актиномицина D 4,3 фмоль.
      2. Растворите 1 мг triptolide в 0,64 мл ДМСО. Алиготе 1 мкл в отдельную емкость и доводят до 1 мл с нуклеазы без воды, чтобы создать разведении 1/1000. Алиготе 1 мкл разведения в отдельном контейнере и разбавляют до 1 мл с нуклеазы без воды, чтобы создать второй 1/1000 разведение.
        ПРИМЕЧАНИЕ: концентрация окончательного решения triptolide 4,3 фмоль.
      3. Растворите 1 мг tpfc в 2,9 мл ДМСО. Аликвоты 10 мкл в отдельную емкость и разбавьте до 1 мл нуклеазы без воды, чтобы создать 1/100 Dilution. Алиготе 1 мкл разведения в отдельном контейнере и разбавляют до 1 мл с нуклеазы без воды, чтобы создать разведении 1/1000.
        ПРИМЕЧАНИЕ: концентрация окончательного решения tpfc 4,3 фмоль.
      4. Растворите 1 мг Ga (tpfc) в 2,6 мл ДМСО. Алиготе 10 мкл в отдельную емкость и доводят до 1 мл с нуклеазы без воды, чтобы создать разбавление 1/100. Алиготе 1 мкл разведения в отдельном контейнере и разбавляют до 1 мл с нуклеазы без воды, чтобы создать разведении 1/1000.
        ПРИМЕЧАНИЕ: концентрация окончательного решения Ga (tpfc) составляет 4,3 фмоль.
        Примечание: эти corroles и ингибиторы не растворимы в воде и должны быть предварительно растворенного в ДМСО. Небольшие количества ДМСО (менее 1%) не вызывают цитотоксичность в клетках (неопубликованные данные).
  2. До начала реакции транскрипции, подготовить необходимые реагенты по отдельности или купить их с коммерческой поставщика.
    1. Оттепель на льду все заморозилиN реагенты (см таблице 1 приведен список замороженных реагентов).
    2. Разрешить реакционного буфера 10х и 4 рибонуклеотид (АТФ, ГТФ, CTP и UTP) решения время смешивать, пока они не будут полностью растворяется в растворе.
    3. Кратко центрифуги все реагенты, чтобы предотвратить потерю материала на оконечности трубки. После оттаивания, хранить рибонуклеотиды на льду при сохранении реакционного буфера 10х при комнатной температуре.
    4. Комбинат реагентов для реакции транскрипции при комнатной температуре (табл 2 для списка реагентов).
      Примечание: спермидин в 10x реакционного буфера может совместного осадка ДНК-матрицы, если реакцию собран на льду, а не при комнатной температуре.
    5. Тщательно перемешать, щелкая трубки или пипетки смесь вверх и вниз, осторожно. После смешивания, центрифуги кратко собрать реакционной смеси в нижней части трубки.
    6. Инкубируйте реакционной смеси при 37 ° С в течение в общей сложности 2-4 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимые времена реакции будет менятьсяс размером шаблона ДНК и последовательности. Этот шаг может потребовать оптимизации для конкретных последовательностей. Более короткие шаблоны могут потребовать более длительного времени реакции для высоким выходом из общей РНК.
    7. Удалить 4 мкл аликвоты из каждой реакции после каждого часа и хранят при -20 ° С. Изменить это необходимо для желаемых временных точках.

2. РНК Спин колонка

  1. После реакции транскрипции, очистить РНК с использованием микроцентрифужных-совместимый хроматографических колонок.
    Примечание:. Использование РНК спиновых столбцов для очистки РНК с более чем 20 оснований приводит к восстановлению более 80% 44
    Примечание: После колоночной хроматографии является общим и удобный способ для очистки РНК. Другие способы очистки также существовать, например, хлорида лития осадков, фенол: хлороформ экстракции, изопропанол осадков, а также других коммерчески доступных наборов.
    1. Равномерно ресуспендируйте матрицу Сефадекса в буфере столбца, по энергично переворачиваяколонка три или более раз. Сделайте это, щелкая столбец резко.
    2. Удалить верхнюю крышку с колонки. Там будут какие-то остаточную матрицу сефадексом в крышке; если крышка заполнена матрицы, заменить крышку на колонку и повторить предыдущий шаг, пока большинство матрицы не в колонке.
    3. Обрывать Нижний конец колонны.
      Примечание: Некоторые жидкости из колонны.
    4. Пакет колонку.
      1. Столбец Место в стерильной (РНКазы и ДНКазы) 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
      2. Центрифуга трубки в настольной центрифуге при 1000 мкг в течение 1 мин.
    5. Отменить 1,5 трубки микроцентрифужных мл буфера с элюированного из колонки.
    6. Сразу же место колонку в новой стерильной 1,5 мл микроцентрифужных трубки и пипетки образца в центр кровати колонки. Используйте 20-50 мкл образца, чтобы избежать перегрузки колонки.
    7. Центрифуга трубки в настольной центрифуге при 1000 мкгв течение 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: элюента очищенный образец РНК.

3. Электрофорез в агарозном геле (1% агарозном геле) 42

Примечание: этидия бромида флуоресцирует при связывании с ДНК и РНК, поэтому эти биомолекулы могут быть визуализированы с помощью УФ-света путем инкубации их с 0,5 мкг мл этидий бромида раствор /.

  1. Подготовка 1,000x исходного раствора этидий бромида (0,5 мг / мл) растворением 5 мг этидий бромида в 10 мл воды.
  2. Подготовка Трис ацетата ЭДТА (TAE) Летние буфер для электрофореза в геле. Для того, чтобы буфер 50x ТАЕ объединить 2,0 М Трис-ацетат 0,05 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и доведения рН до 8,5.
  3. Подготовка 1% (вес / объем) агарозном геле путем растворения 10 г сверхчистого агарозы в 1 л 1x TAE буфер и плавление агарозы с обычной микроволновой печи. После охлаждения до 50 ° С, добавить 1 мл 1,000x этидийбромид в 1% агарозном геле Солуции, смешать осторожно закрученной или путем обращения в закрытом контейнере, а затем залить раствора агарозы в платформу гель-литье и позволяют гель затвердеть при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: бромистый этидий является мутагенным и потенциальным канцерогеном. Надевайте перчатки и тщательно обрабатывать решений. Для надлежащими рабочими процедурами этилиденбромида, пожалуйста, см: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 .
  4. После гель затвердевает, устанавливайте гель в электрофореза бак. Добавьте достаточно буфера ТАЕ, чтобы покрыть гелем до лунки не погружены. Убедитесь, что уровень буфера ТАЕ составляет приблизительно 1 мм над уровнем геля. Удалить гель расческой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление гребень после скважины погружен предотвращает воздушные карманы из оказаться в ловушке в скважинах.
  5. Подготовка образцов РНК. Комбинат 1 мкл каждого очищенного образца аликвоты с 1 мкл гель загрузки буфера (или с 1 мкл 10х буфера для загрузки и dilutред до 10 мкл с нуклеазы без воды) и тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз с помощью микропипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 10x Буфер содержит 20% Ficoll 400, 0,1 М Na 2 ЭДТА, рН 8,0, 1,0% SDS, 0,25% бромфенола синий. 0,25% ксиленцианол также могут быть добавлены к загрузочным буфером, как он работает ~ 50% быстрее, чем бромфенола синего и может быть полезным для мониторинга очень длинные пробеги. 42
  6. Загрузка гель с каждого образца осторожно пипеткой раствора в нижней части каждой лунки. Будьте осторожны, не оставляйте воздушных пузырей или микшировать между скважинами.
    Примечание: РНК лестница также может быть использован для определения размера транскрипта.
  7. Присоединить провода так, что ДНК будет проникать в гель в направлении положительного свинца. Установка напряжение до желаемого уровня, обычно от 1 до 10 В / см геля. Запустите гель для однако долго достаточно для значительного разделения между фрагментами РНК, используя миграции красителей для мониторинга прогресса разделения.
    NПРИМЕЧАНИЕ: 23 см х 25 см геля на 250 V займет около 1 ч, в то время как 8 см х 8 см гель на 150 V займет около 20 мин. Небольшие фрагменты РНК-лучшее разрешение, когда работать на более высоких напряжениях.
  8. Выключите электропитание, когда краситель из загрузочного буфера перекочевал расстояние адекватными для разделения между фрагментами РНК.
  9. Изображение РНК под действием УФ-света, как бромид этидия высветится.
  10. Сфотографируйте изображения и сравнить интенсивность флуоресценции очищенного РНК из каждого состояния.

4. количественного определения РНК с помощью UV-VIS-спектроскопии

  1. Поместите 2 мкл H 2 O на NanoDrop 2000 или аналогичную машину, и измерьте Blank.
  2. Затем поместите 2 мкл каждого образца РНК, следующие очистки, на спектрофотометре и измерения УФ-Вид из диапазоне длин волн от 200 нм до 800 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: +260 чтение 1,0 эквивалентно около 40 мкг / мл РНК,и чистый РНК имеет 260/280 соотношение 2,1. 45
  3. В случае, когда поглощение выше 1 OD, разбавленных образцов в нуклеазы без воды, чтобы получить ОД менее 1.
  4. Используйте графическое программное обеспечение для построения различных образцов и сравнить ОП при 260 нм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Транскрипции РНК Качественно оценены электрофореза в агарозном геле

Электрофорез в агарозном геле используется для изображения в транскрипции РНК. Бромистый этидий флуоресцирует при связывании (λ ет = 605 нм, λ экс = 210 нм, 285 нм) 46, позволяющий визуализации РНК. Темные полосы в геле соответствуют более высокой концентрации РНК. Если Актиномицин D, triptolide, или любой Коррол комплекс ингибирует транскрипцию РНК, производство РНК уменьшается, и группа будет светлее. Используя эту концепцию, относительное ингибирование может быть оценена.

Фиг.3 показывает окрашенные бромистым этидием агарозный гель (1%) реакций транскрипции РНК предварительно обрабатывают не комплекса, актиномицин D, triptolide, tpfc или Ga (tpfc) в комплексной []: [шаблона оснований ДНК] соотношении 0,01 : 1. Актиномицин D и triptolide показывают четкое снижение по сравнению с РНК, что в контроле, как и ожидалось изэти давно изучены ингибиторы. Ga (tpfc) группа также имеет очень низкий уровень РНК, в то время как группа tpfc показывает практически нет торможения и имеет ту же относительную интенсивность в качестве контроля.

Транскрипции РНК количественно UV-VIS-спектроскопии

Измерения UV-VIS были приняты для каждого образца после прохождения транскрипции РНК в течение 4 ч и очищают с РНК спин колоночной хроматографией. Спектры длин волн 220 нм до 350 нм, показаны на рисунке 4, с λ макс происходит при 260 нм, что соответствует абсорбции РНК, а коэффициент экстинкции 0,025 (мкг / мл) -1 см -1. Поглощение при 260 нм и 280 нм, приведены в таблице 3. 260 чтение 1,0 эквивалентно примерно 40 мкг / мл РНК, РНК и чистый имеет 260/280 соотношение 2,1, что позволяет количественных расчетов РНК производится в течение трансРеакционную cription и оценка чистоты РНК после использования столбец РНК отжима. 44 Три из четырех, обработанных ингибитором реакций транскрипции РНК получали меньше, чем в контроле, при Ga (tpfc) -обработанной ДНК транскрипции только 0,07 раз больше РНК в необработанной ДНК. tpfc обработке ДНК не показал никакого очевидного торможения. Все образцы имеют 260/280 соотношение примерно 2,2, что указывает на относительно чистых образцов. Очистка спиновых столбцов РНК удаляет короткие РНК нити длиной 20 или меньше нуклеотидов. Остаточный ДНК или нити длиной более 20 нуклеотидов может присутствовать в том, что считается очищенные образцы. Эти незначительные примеси приведет к 260 / A 280 отношение несколько большей, чем 2,1.

Рисунок 1
Рисунок 1. Молекулярные структуры галлия (III) 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole (Ga (TPFC)) и свободное основание аналог 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. Кривые цитотоксичности и GI 50 значения corroles в простате (DU-145) (серый), молочной железы (MDA-MB-231) (синий), кожи (SK-MEL-28) (оранжевый), и яичников (OVCAR -3) (зеленый) линии раковых клеток. Клетки инкубировали с (А) (Ga tpfc) и (б) tpfc, с последующим определением жизнеспособности с помощью MTS основе колориметрического анализа жизнеспособности клеток в соответствии с протоколом производителя. Пожалуйста, нажмите здесь для просмотра большего размера этофигура.

Рисунок 3
Рисунок 3. этидий бромид окрашенных агарозном геле (1%) реакций транскрипции после 4 ч инкубации. Дорожка 1 представляет собой 1000 п.н. ДНК лестницы в качестве стандарта. Дорожки 2-6 показывают РНК транскрибируется с 0,43 пмоль ДНК и обрабатывают 4,3 фмоль каждой ингибитора ([Комплексные]: [шаблон базы ДНК] отношение 0,01): контроль (дорожка 2), Актиномицин D (дорожка 3), triptolide (дорожка 4), tpfc (дорожка 5), и Ga (tpfc) (дорожка 6).

Рисунок 4
Рисунок 4. УФ-Вид спектр 1:. 200 разбавления транскрипции РНК в после 4 ч инкубации ДНК-матрицы в реакции транскрипции обрабатывали не комплекса, или актиномицином D, triptolide, tpfc или Ga (tpfc) в [комплекс]: [шаблон оснований ДНК] отношение 0,01: 1, Концентрация РНК измеряли по оптической плотности при 260 нм.

Размораживайте реагенты на льду:
75 мм решения аденозинтрифосфата, гуанозинтрифосфата, Цитидинтрифосфат и Уридинтрифосфат (АТФ, CTP, GTP, UTP)
Нуклеазы без воды
10x Реакционный буфер (1x Реакционный буфер: 40 мМ Трис-HCl, 6 мМ MgCl 2, 2 мМ спермидина, 10 мМ дитиотреитола, рН 7,9)
Матрице линеаризованной ДНК (0,5 мкг / мл, 1,85 Kb)
РНК-полимеразы (20 U / мкл)

Таблица 1. Список замороженных реагентов.

Для начала реакции транскрипции, добавить следующее количество каждого реагента в 0,2 мл тонкостенных пробирок для ПЦР:
2 мклРаствор АТФ (75 мМ)
2 мкл раствора CTP (75 мм)
2 мкл раствора GTP (75 мм)
2 мкл раствора UTP (75 мм)
1 мкл нуклеазы без воды
2 мкл 10х Реакционный буфер
2 мкл 0,5 мкг / мкл линейной ДНК шаблона
5 мкл комплекс (ядро без воды, пустой, актиномицин D, triptolide, tpfc, Ga (tpfc))
2 мкл РНК-полимеразы (20 U / мкл)

Таблица 2. Список реагентов для реакции транскрипции.

Время Point (ч) Комплекс 260 280 </ STRONG> 260/280 Разведение фактор [РНК]: 260
(Мкг / мл)
[РНК] (мг / мл)
4 Контроль 7,583 3,516 2.16 200 40 60.67
4 Актиномицин D 0,955 0,438 2.18 200 40 7,638
4 triptolide 1,794 0,816 2,2 200 40 14.35
4 tpfc 7,858 3,631 2.16 200 40 62.87
4 Ga (tpfc) 0,554 0.232 2.39 200 40 4,434

Таблица 3. Концентрация и чистота транскрипции РНК после 4 ч измерено УФ-видимой спектроскопии. Коэффициент экстинкции одноцепочечной РНК 0,025 (мкг / мл) -1 см -1, 260 считывания 1,0 эквивалентно примерно 40 мкг / мл РНК, РНК и чист имеет 260/280 соотношение 2,1. 45

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот анализ показывает, что добавление Ga (tpfc) ингибирует транскрипцию РНК сравнительно с известными ДНК-связывающих противоопухолевых комплексов Актиномицин D и triptolide. Цитотоксических поведение Ga (tpfc) (GI 50 = 58.1-154.7 мкм) может из-за его ингибирующих свойств. Поскольку ни ингибирование транскрипции не наблюдалось tpfc, цитотоксичность tpfc не из-за ингибирования транскрипции РНК, а вызвана другими средствами еще не изучены.

В четырех реакций транскрипции, выполненных, ДНК обрабатывали Актиномицин D, triptolide, tpfc или Ga (tpfc), в [комплекс]: [шаблона оснований ДНК] отношение 0,01, соответственно, или с необработанным контролем. Реакционные реагенты транскрипции были объединены, и реакционную транскрипции проводили в течение 4 ч при 37 ° С. Транскрибируется РНК очищали на колонке с РНК спиновой и выход анализируют с помощью UV-VIS и гель-электрофореза. Характер ингибирования транскрипции может быть Furtее исследовали с использованием этой же методики с различными модификациями, или соединения могут быть подвергнуты альтернативы в пробирке и в естественных условиях исследования. Дополнительные эксперименты, которые могут помочь определить молекулярную природу ингибирования включают рентгеновской кристаллографии возможных аддуктов Коррол-ДНК или численного моделирования реакции транскрипции. Целью этого эксперимента было определить, соединения ингибируют ли транскрипции для того, чтобы собрать информацию о своих потенциальных противораковыми свойствами. Эта цель была достигнута: tpfc не проявлял торможение, в то время как Ga (tpfc) выставлены четкие ингибирование и заслуживает дальнейшего изучения.

Анализ транскрипции РНК может быть изменен, чтобы обеспечить более механистическую деталь. Добавление противоопухолевых агентов (например, Коррол комплексов) после реакции транскрипции завершения может показать, является ли ухудшить или гидролиза РНК комплексы. Еще один рекомендуемый эксперимент провестиРеакционную транскрипции со всеми компонентами, за исключением РНК-полимеразы в 10 раз ниже, чтобы обеспечить дифференциацию между механизмом ингибирования с участием ДНК или фермент. Наконец, инкубация ДНК-полимеразы или с комплексами предшествующих транскрипции РНК позволит увеличилось связывание между сложным и соответствующей цели, удостовериться в том, что сложные препятствующей качества участвуют в ДНК-полимераза или связывания, соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы искренне благодарим доктора Синди Н. Чиу за помощь гель-электрофореза, и Энди Чжоу и Майкл Grodick их щедрое пожертвование ДНК и рестриктазы. Мы выражаем глубокую признательность профессору Дж Хит и профессор Д. Prober щедрую доступа к оборудованию и материалам. Мы благодарим доктора Карн Sorasaenee за полезные предложения. Мы благодарим Мэри H. Tang для создания иллюстраций, используемых в схематический обзор в видео. Финансирование было предоставлено Джонсон & Джонсон и USC Y86786.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actinomycin D Sigma-Aldrich A1410 Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide Sigma-Aldrich T3652 Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2 Life Technologies AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit Life Technologies AM1334 Store at –20 °C 
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate Sigma-Aldrich T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-100
mini Quick Spin RNA Columns Roche Life Science 11814427001 Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S Store at –20 °C 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. American Cancer Society. Atlanta. Available from: http://www.cancer.org (2014).
  2. Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
  3. Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41, (16), 2569-2576 (2005).
  4. Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17, (12), 7306-7316 (1997).
  5. Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3, (4), 4170-4190 (2011).
  6. Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2, (3), 103-108 (2011).
  7. Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11, (3), 377-383 (2011).
  8. Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15, (4), 738-746 (2004).
  9. Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25, (2), 400-409 (2012).
  10. Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39, (22), 4048-4051 (2000).
  11. Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16, (6), 1-6 (2011).
  12. Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (15), 6105-6110 (2009).
  13. Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163, (3), 368-373 (2012).
  14. Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17, (1), 11 (2012).
  15. Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8, (6), 2233-2243 (2011).
  16. Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124, (25), 7411-7420 (2002).
  17. Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46, (23), 4320-4324 (2007).
  18. Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42, (3), 878-884 (2003).
  19. Sorasaenee, K., Fu, P. K. -L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42, (4), 1267-1271 (2003).
  20. Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46, (18), 7494-7502 (2007).
  21. Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251, (1-3), 61-65 (2008).
  22. Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48, (13), 5599-5601 (2009).
  23. Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104, (5), 576-582 (2010).
  24. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378, (1), 140-147 (2011).
  25. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10, (3), 367-384 (2013).
  26. Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43, (3), 1175-1183 (2004).
  27. Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
  28. Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536, (1), 43-54 (2001).
  29. Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42, (3), 283-296 (2002).
  30. Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Cancer Research. 48, (11), 3014-3018 (1988).
  31. Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Cancer Research. 51, 6199-6201 (1991).
  32. Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
  33. Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7, (5), 2337-2361 (2010).
  34. Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4, (10), 1257-1272 (2012).
  35. Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, (5), 1417-1421 (1988).
  36. Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53, (7), 969-977 (1997).
  37. Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280, (10), 9586-9594 (2005).
  38. Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7, (3), 182-188 (2011).
  39. Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68, (13), 5257-5266 (2008).
  40. Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8, (10), 2780-2790 (2009).
  41. MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. Life Technologies. Carlsbad. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/1330M_G.pdf (2014).
  42. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27, (2-3), 126-139 (2006).
  43. Quick Spin Columns Protocol. Roche Diagnostics GmbH. Mannheim. Available from: https://pim-eservices.roche.com/LifeScience/Document/95c2b1f8-7cf1-e311-98a1-00215a9b0ba8 (2013).
  44. RNA quality control. KU Leuven: Biomedical Genomics. Leuven. Available from: http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html (2007).
  45. Sabris, R. W. Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. Wiley. Hoboken, NJ. (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics