Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi

Neuroscience

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Das, D., Phillips, C., Lin, B., Mojabi, F., Akif Baktir, M., Dang, V., Ponnusamy, R., Salehi, A. Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52371, doi:10.3791/52371 (2015).

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Abstract

Introduction

Alterazioni dinamiche nel numero e la struttura delle sinapsi sono le caratteristiche distintive di sviluppo, l'invecchiamento, e numerose malattie neurodegenerative 1-3. La capacità dei neuroni di ricevere e integrare le informazioni sinaptica dipende morfologia dendritica e alterazioni dinamiche connessioni sinaptiche. Infatti, esiste una correlazione positiva tra spine dendritiche e il numero di sinapsi, che sia un impatto funzione cognitiva 4. Quindi, non è sorprendente che decrementi in numero spine dendritiche sono stati associati a disfunzioni cognitive in una serie di disturbi neurologici 5-7, spingendo grande interesse spine dendritiche quantificazione. Tuttavia, la quantificazione della densità delle spine rimane un lungo e noioso compito che non riesce a generare informazioni utili per quanto riguarda la topografia e la distribuzione delle sinapsi in tutto il albero dendritiche. Fortunatamente, metodi di colorazione (ad esempio, Golgi-Cox e doublecortin (DCX)), in combinatocon tecniche di imaging sofisticate può essere utilizzata per superare gli attuali ostacoli e di produrre immagini ad alta risoluzione di dendritica in modo affidabile e rapido. Mentre metodo di colorazione Golgi-Cox può essere implementato per valutare lo stato di dendritica in tutti i neuroni 8, DCX può essere implementato di etichettare i neuroni appena nati in particolare nel giro dentato e zona subventricolare 9, una considerazione importante dato che la neurogenesi si verifica in entrambi queste regioni in tutto il ciclo di vita 10,11.

Dopo la colorazione, due metodi di imaging sono stati dispiegati per valutare caratteristiche dendritiche: i) l'imaging in tempo reale (RTI) e ii) ha esteso la profondità di campo dell'imaging (EDFI). La tecnica RTI fornisce un mezzo per rintracciare e quantificare la lunghezza e ordine delle arborization lungo i singoli segmenti dendritiche e rami. Così permette di stimare la superficie totale e volume occupato da ciascun albero dendritico. Più specifically, nel metodo RTI l'utente identifica continuamente i segmenti e riorienta iterativamente il neurone tracciamento software raccoglie x, y, z e le coordinate della struttura dendritica e ricostruisce la traiettoria della struttura dendritica in 3D. Comparativamente, il metodo EDFI fornisce un mezzo piuttosto semplici e accelerate per valutare la densità dendritica in campioni di tessuto piuttosto spesse generando un'immagine composita, fornendo informazioni sull'intero asse z. Per fare ciò, l'utente registra file video ad alta definizione in tutto lo spessore della sezione e quindi utilizza il software per cercare i fotogrammi video per identificare i punti in cui un pixel è completamente a fuoco. Successivamente, i pixel mirati sono fusi e integrati in un ad alta risoluzione, immagini 2D composita. Questa immagine composita contiene tutti i pixel che sono stati in-fuoco indipendentemente dalla loro posizione nell'asse z. Analisi qualitativa e quantitativa di queste immagini 2D può essere utilizzato successivamente per determinare la densitàdi ramificazione dendritica in ogni campo.

Infine, vi presentiamo un metodo per la generazione di immagini panoramiche estremamente ad alta risoluzione per l'analisi e la valutazione dei dendriti in un'intera regione di interesse. Questa tecnica può essere impiegata per superare la mancanza di accesso a molto ad alta risoluzione e fotocamere digitali costose. Utilizzando questo metodo, si cattura immagini seriali in diverse località lungo la xey assi e quindi automaticamente punti insieme con un freeware (per esempio, immagine Composite Editor). In particolare, questo metodo può essere utilizzato per la valutazione qualitativa e quantitativa di dendritica in piuttosto ampio spazio.

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Protocol

NOTA: Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con gli standard etici approvati dalla commissione per la ricerca degli animali presso il sistema sanitario Veterans Affairs Palo Alto.

1. Golgi-Cox colorazione

  1. Estrazione del cervello e colorazione
    1. Il 1 ° giorno, anestetizzare profondamente topi con 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xylazina prima eutanasia via dissanguamento.
    2. Rimuovere con cautela la calotta cranica e sezionare il cervello.
      1. Prima rimuovere la pelle sulla parte superiore del cranio, ponendo una forbice curva sulla parte superiore del cervelletto e delicatamente tagliare il cranica parallelo al solco centrale con la punta della forbice rilevato verso l'esterno, si muove nella direzione verso il bulbo olfattivo. Ripetere questa operazione su entrambi i lati.
      2. Utilizzare un pincet chirurgica per sollevare il cranica mentre si gira verso i bulbi olfattivi e troncare. Quindi, capovolgere il cranio a testa in giù e utilizzare un plettro per tagliare attraverso l'otticanervi e allentare il cervello. Infine, utilizzare il pick per separare il cervello dal midollo spinale a livello del foro occipitale.
    3. Immergere immediatamente il cervello in 15 ml di disponibile in commercio, diluito soluzione Golgi-Cox. Conservare il cervello in soluzione Golgi in una bottiglia di vetro da 20 ml con tappo a temperatura ambiente al buio.
    4. Il giorno 2, versare lentamente la soluzione e sostituirla con 15 ml di soluzione fresca Golgi-Cox. Richiudere il flacone contenente il cervello e lasciare riposare per altri 9 giorni al buio.
  2. Sezioni e embedment
    1. Il giorno 11, mettere il cervello in soluzione di saccarosio del 30%, preparati in DDH 2 O per disidratazione. Cambiare la soluzione appena preparata con 30% di saccarosio dopo 12 ore. Incubare i cervelli in una soluzione di saccarosio al 30% per 3 giorni a 4 ° C.
    2. Il giorno 14, riempire il serbatoio del vibratome con una soluzione di saccarosio al 30% fino a che la lama è coperto. Impostare la velocità di 1 mm / s con un'ampiezza di 0,95 mm.
    3. Asciugare il cervello con un Kimwipe per eliminare l'umidità in eccesso e rimuovere il cervelletto con una lama di rasoio per tagliare coronale.
    4. Saldamente montare l'intero cervello sulla piattaforma vibratome utilizzando colla e lasciare riposare per 2-4 minuti. Inserire la piattaforma con il cervello aderito nel serbatoio e regolare la lama all'inizio del cervello.
    5. Utilizzando vibratome, la fetta di cervello in 150 micron sezioni spesse a temperatura ambiente, ricordandosi di cambiare la lama dopo ogni 3 cervello.
    6. Raccogliete le sezioni dal serbatoio con uno spazzolino capovolto e immergerli in una capsula di Petri contenente 0,3% di gelatina fatta in DDH 2 O. Mentre le sezioni rimangono nella capsula di Petri, aggiungere 0,5 ml di 0,3% di gelatina in ogni diapositiva e utilizzare un pennello per diffondere e rivestire le SuperFrost + diapositive.
    7. Raccogliere delicatamente le sezioni immerse dalla capsula di Petri e metterli sulle diapositive gelatinizzati. Orientare le sezioni di cervello datoccarli solo sui loro lati e non sulle parti superiori.
    8. Dopo circa dieci minuti, ricoprire le sezioni con il 30% di saccarosio prima il tessuto asciuga completamente. Poi asciugare i vetrini preparati in un luogo buio in un rack scorrevole per 3 giorni.
    9. Diluire disponibile in commercio 10x soluzione di sviluppo a 1x con DDH 2 O. Immergere i vetrini in soluzione di sviluppo per 7-10 min. Sciacquare i vetrini 3 volte in DDH 2 O.
  3. Disidratazione
    1. Preparare 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, e 95% di etanolo usando soluzioni distillata DDH 2 O.
    2. Immergere i vetrini in etanolo soluzioni sempre più elevati per 10 minuti ciascuna.
    3. Immergere i vetrini in soluzione di etanolo al 100% per 3 volte per 10 minuti ogni volta.
    4. Immergere i vetrini in 100% xilene 3 volte consecutive per 5 min ciascuna, mantenendo le sezioni nella soluzione finale fino a quando sono copertura scivolato.
    5. Mettere una generosa quantità di DPX (Di-n-butil ftalato in xilene) mezzo di montaggio (about 1-1,5 ml) su ogni diapositiva con una pipetta di plastica. Posizionare con cura coprioggetto per evitare le bolle.
    6. Coperchio a secco Air scivolato-cervello sezioni orizzontali per 3 giorni.

2. Doublecortin colorazione

  1. Profondamente anestetizzare (vedi punto 1.1.1) gli animali.
  2. Eseguire perfusione cardiaca con appena preparato 4% paraformaldeide fatto in tampone fosfato 12.
  3. Estrarre il cervello (vedi 1.1.2) e conservare in 45 ml di paraformaldeide 4% a 4 ° C durante la notte su un agitatore a dondolo.
  4. Trasferire il cervello per una soluzione di saccarosio al 30% e attendere la completa disidratazione per 48 ore a 4 ° C. Togliere il cervello dal saccarosio e metterli direttamente su blocchi di rame poste in ghiaccio secco.
  5. Riempire il blocco con temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e segnare l'orientamento del cervello utilizzando il bulbo olfattivo come punto di riferimento.
  6. Utilizzando un criostato, tagliare 70 sezioni micron di spessore a -20 ° C e collocarliin soluzione crioprotettore (25% di glicole etilenico, glicerolo 25%, in tampone fosfato 0,05 M di sodio, pH 7,4) e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
  7. Effettuare una soluzione di 50% crioprotettore e 50% di metanolo. A questa soluzione aggiungere 0,5% di perossido di idrogeno (vol / vol). Incubare sezioni galleggianti per 30 minuti a temperatura ambiente.
  8. Sezioni caldi in 37 ºC a TBS (soluzione fisiologica tamponata con Tris) per 30-40 min mettendoli in un forno a istologico.
  9. Incubare le sezioni con lo 0,3% tritone e siero di cavallo normale 3% per 45 minuti a temperatura ambiente prima della colorazione. Incubare sezioni a 4 ° C durante la notte in 3 ml di soluzione di anticorpo DCX diluito 1: 500 in TBS con 0,3% Triton e siero di cavallo normale 1%.
  10. Il giorno seguente lavare sezioni 3 volte consecutive in TBS (10 min ciascuna).
  11. Incubare sezioni con un anti-capra biotinilato cavallo (1: 200 in TBS) per due ore a temperatura ambiente. Lavare le sezioni 3 volte consecutive in TBS (10 min ciascuna).
  12. Incubare torlo con ABC Lite (1: 1.000) per 1,5 ore a temperatura ambiente.
  13. Aggiungere 5 ml di 30% H 2 O 2 ad una compressa di 10 mg di soluzione di DAB (3,3 "-Diaminobenzidine) sciolti in 15 ml di 1 M Tris-HCl (pH 7,6). Incubare immediatamente sezioni in questa soluzione per 5 min.
  14. Terminare la reazione mediante lavaggio con TBS ghiacciata tre volte seguito da un lavaggio in TBS a temperatura ambiente.
  15. Disidratare sezioni utilizzando una serie di soluzioni di etanolo (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 min ciascuna), xilene, e quindi coprire slittamento usando DPX come al punto 1.3.

3. Visualizzazione

  1. Dopo completa asciugatura delle sezioni, rimuovere l'eccesso DPX sopra i vetrini con una lama affilata, e metterli in fase di scansione del microscopio. Il sistema è composto da un microscopio dotato di fase scansione, joystick, e una telecamera a colori 12 bit.
  2. Avviare il programma. Aprire un nuovo file di dati.
  3. Luogoun punto di riferimento sullo schermo cliccando con il puntatore del mouse in qualsiasi luogo. Questo attiverà tutte le icone dal pannello degli strumenti di finestra del programma.
  4. Fare clic sull'icona "Joystick Free" sulla barra degli strumenti e quindi utilizzare il joystick per individuare giro dentato dell'ippocampo nella prima sezione.
  5. Nella scheda "Tools" della finestra del programma, selezionare "Gestione Sezioni seriale". Fare clic sull'icona "Nuova sezione" nell'angolo in basso a sinistra della finestra. Si aprirà la finestra "Setup Serial Sezione".
  6. Selezionare la finestra Serial Setup sezione e poi inserire il numero totale di sezioni che contengono regioni dell'ippocampo. Selezionare l'intervallo di valutazione. Inserire lo spessore della sezione di taglio (70 micron per DCX e 150 micron per le sezioni Golgi-colorate).
  7. Avviare tracciando la regione giro dentato, cliccando sull'icona "Freehand Disegno a contorno" nella barra degli strumenti. Delineare lo strato di cellule granulari dentate. </ Li>
  8. Selezionare "100X" dal menu "Ingrandimento". Aggiungere una goccia di olio di immersione sulla sezione e passare l'obiettivo di 100X. Individuare i corpi cellulari granuli dentate e dendriti nell'ambito di tale obiettivo.
  9. Concentrarsi su un neurone selezionato e fare clic sull'icona "Neuron Tracing" sulla barra degli strumenti. Tracciare la circonferenza del corpo cellulare dei granuli dentate. Al termine l'analisi, fare clic destro per selezionare "Finish cellulare Body".
  10. Avviare rintracciare i dendriti manualmente in x, y, e Z e seguire ogni ramo con la manopola joystick ez-motore. In un nodo biforcazione o triforcazione, selezionare la relativa opzione dal menu a discesa sulla destra del mouse. Tracciare ciascuno dei comparti che nascono da questi nodi. Al termine di ciascun ramo destro del mouse e selezionare "Ending" dal menu a discesa.
  11. Utilizzando le icone dei tasti freccia nella finestra del software seleziona a caso un altro cellulare dei granuli dentate e seguire la stessa procedura described in fase 3,9-3,10. Salvare l'intero tracciato.
  12. Avviare il software tracciato neuronale.
  13. Aprire il primo file di dati NRX dal primo mouse del gruppo sperimentale. Aggiunge il file NRX del secondo mouse del gruppo sperimentale. Continuare fino a quando tutti i file NRX di questo gruppo vengono aggiunti.
  14. Nella scheda Analisi, selezionare "Fan In-schema". Questo apre la In-analisi finestra Fan. Segno di spunta "dendriti" e fare clic su Visualizza, che raffigura le lunghezze e modelli di ramificazione di dendriti per questo gruppo di topi (figura 1).

4. EDFI

NOTA: Questo metodo permette all'utente di registrare rapidamente un gran numero di immagini attraverso l'asse z di ciascun campo e generare un'immagine 2D che contiene tutti i pixel focalizzato durante l'asse z. Il risultato sarà un'immagine composita che contiene tutti i pixel focalizzato da immagini raccolte.

  1. Collegare il microscopio ad una camma digitaleera. Collocare le sezioni prima sulla scena scansione collegato al microscopio e poi passare ad un obiettivo 10X. Spostare il palco per l'area di interesse.
  2. Avviare un programma di cattura video.
  3. Premere il pulsante di registrazione. Non appena viene premuto il pulsante di registrazione, usare la manopola macro-focus per passare dalla parte superiore alla parte inferiore della sezione per un totale di 4 sec. Salvare il file video risultante.
  4. Utilizzare ImageJ freeware per convertire i file video AVI in un formato non compresso aprendo il file e salvarli in formato non compresso.
  5. Avviare un programma di analisi di immagine e aprire il file AVI. Vai al menu "Azione" e fare clic su "profondità di campo estesa". Selezionare il file video corrispondente. In opzioni "uscita", selezionare "Genera Composite Best-Focus Immagine".
  6. In Opzioni "Analisi Focus", selezionare "normalizzato Illumination" e le opzioni "Contrasto Locale Max". Quindi, selezionare "Cremangiato ". L'immagine risultante rappresenta tutti i pixel focalizzato durante l'asse z (Figura 2).
  7. Salvare l'immagine risultante.

5. Generare Estremamente ad alta risoluzione Immagini

NOTA: Questo metodo consente all'utente di generare automaticamente basso ingrandimento e immagini estremamente alta risoluzione di immagini ad alto ingrandimento ad alta risoluzione in modo automatizzato.

  1. Collocare le sezioni prima sulla scena scansione collegato al microscopio. Il microscopio è collegato ad una fotocamera digitale. Spostare il palco per l'area di interesse.
  2. Avviare un programma di acquisizione delle immagini.
  3. Utilizzare un obiettivo 10X e di acquisire e salvare ad alta risoluzione (4076 x 3116), immagini dalla regione di interesse fare in modo di avere almeno il 10% di sovrapposizione.
  4. Immagine Eseguire Composite Editor di unire immagini.
  5. Vai al menu File, e cliccare su "New Panorama". Selezionare la cartella in cui le immagini sono stORed. Selezionare le immagini che appartengono alla stessa regione e premere "OK".
  6. Premere il pulsante "Esporta su disco" e salvare l'immagine. Questa immagine rappresenta un'immagine ad alta risoluzione estremamente dell'area di interesse che potrebbero essere utilizzati per l'analisi e / o dimostrazione (Figura 3).

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Representative Results

L'entità del arborization derivanti da granuli dentati esistenti e appena nati è stato analizzato in topi wild type utilizzando Golgi-Cox o DCX colorazione (Figura 1). Segmenti di cellule dendritiche DCX-positivi sono stati trovati per essere lunga 13-36 micron. La distribuzione normale di lunghezza dendritiche è stata testata utilizzando il test Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; figure 4 e 5).

Nell'analisi della lunghezza dei segmenti per ordine di arborization, i segmenti più lunghi sono stati trovati nel primo ordine di arborization (38.38 + 1,45 micron). Modelli simili sono stati trovati per la superficie (111.98 + 3,93 micron quadrati) e il volume (27.93 + 1.03 micron cubo). La correlazione lineare tra la lunghezza dei segmenti e l'area di superficie e / o volume occupato da questi segmenti sono stati anche testati. Sia di superficie (p = 0,001, r 2 = 0,873) e il volume (p = 0,001, r 2 = 0,621) correlated significativamente con la lunghezza di ciascun segmento dendritica.

Figura 1
Figura 1:. Qui schema Fan è stato utilizzato per valutare la lunghezza dendritiche di granuli dentato dell'ippocampo Questo strumento di visualizzazione può essere utilizzato per confrontare gli effetti di diversi interventi terapeutici o genotipi di lunghezza dendritiche. L'unità di misura è micron.

Figura 2
Figura 2: Visualizzazione dei dendritica senza (A) e (B) EDFI metodi. Il metodo tradizionale di trovare il miglior piano di fuoco è stato confrontato con EDFI (dati non mostrati) e trovarono valori significativamente più elevati di superficie dendritica con il metodo EDFI (p = 0,02). Bar Scala= 100 micron.

Figura 3
Figura 3:. Un'immagine ad alta risoluzione della regione dell'ippocampo in un topo di immagini ad altissima risoluzione è costruito automaticamente da cucitura 10 (4.076 x 3.116) immagini -pixel. Scala nudo = 100 micron.

Figura 4
Figura 4:. La quantificazione di lunghezza e volume occupato da dendriti in diversi ordini di ramificazione La lunghezza massima e il volume sono stati raggiunti nell'ordine 1.

Figura 5
Figura 5:. Istogramma lunghezza dendritiche di cellule granulari dentate La maggior parte dei segmenti di dendritiche DDendriti CX-macchiati erano 13-26 lunghezza. La linea tratteggiata rossa rappresenta il normale distribuzione dei dati presentati.

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Discussion

Qui, due metodi sono stati descritti per quantificare l'entità del dendritica in neuroni maturi e appena nati con metodi di colorazione convenzionali in collaborazione con RTI e EDFI. L'acquisizione di immagini ad alta risoluzione di neuroni fornisce un metodo estremamente utile per testare gli effetti deleteri di malattie neurodegenerative e, a sua volta, fornisce un mezzo per valutare strategie terapeutiche che colpiscono i neuroni ippocampali.

Mentre il metodo RTI stato utilizzato per acquisire i dati approfonditi riguardanti l'entità della arborization e la topografia, il metodo EDFI non fornisce informazioni relative alla complessità dei singoli segmenti o alberi. Tuttavia, i vantaggi del metodo EDFI stanno nel fatto che essa non richiede l'acquisto di hardware costoso e richiede meno tempo.

Un programma di analisi di immagine è stato utilizzato per eseguire EDFI in file video. Avere accesso a alta risoluzione e velocetelecamere consente la raccolta di un gran numero di immagini in tutto lo spessore di ciascun campo e genera immagini che rappresentano veramente le dimensioni x, ye z. Uno svantaggio del metodo EDFI riguarda il fatto che ci potrebbe essere più di un pixel (stessa xey) concentrata in differenti piani tutto l'asse z. Un metodo è previsto di assegnare colori diversi per questi pixel che rappresentano esattamente la portata degli profili 3D in immagini 2D. Va notato che il metodo EDFI potrebbe essere utilizzato anche per l'analisi dei profili cellulari (ad esempio, sinapsi microglia, e astrociti). Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per analizzare la misura della distribuzione microglia tutto lo spessore di una sezione 7. I due metodi qui descritti possono essere utilizzati in modo complementare. Mentre il metodo RTI fornisce informazioni precise sulla topografia della ramificazione, l'EDFI ci dà un metodo piuttosto semplice e accelerato per valutare la densità di dendriti in un'area inINTERESSE. In particolare, lo spessore delle sezioni che possono essere acquisite con EDFI sono altamente variabili come la gamma di z concentrarsi sulla fase microscopio in combinazione con il fuoco ottico degli obiettivi del microscopio dettano i confini EDFI.

I metodi qui descritti hanno il potenziale per essere distribuito in più contesti. In questo studio abbiamo fornito uno strumento per valutare i cambiamenti in dendritiche pre arborization e post intervento, mentre EDFI è stato utilizzato per quantificare microglia attivazione 7. Così, questa tecnica è suscettibile a qualsiasi applicazione in cui l'obiettivo finale è quello di valutare i cambiamenti in piccoli profili che si possono trovare in più strati.

Infine, queste tecniche possono superare la mancanza di accesso alle macchine fotografiche digitali costosi molto alta risoluzione e. In sostanza, un metodo è stato mostrato su come catturare immagini seriali in diversi punti di posizioni all'interno di un esemplare e poi cucire insieme utilizzando un freeware, in ultima analisi, yielding immagini ad alta risoluzione in un modo che è molto più affidabile e rapido rispetto ai metodi convenzionali.

Passaggi critici

Colorazione di Golgi

Quantità fotografici di Golgi e soluzioni di sviluppo sono mantenuti a 4 ° C per la conservazione e tuttavia i protocolli di colorazione e di incubazione richiedono la soluzione per essere utilizzata a temperatura ambiente. Raffreddamento del Golgi e Sviluppo di soluzioni su ghiaccio o nel frigorifero negativamente influisce sulla qualità della colorazione dendritiche. Inoltre, va notato che abbiamo usato soluzioni Golgi rapido sviluppo. Mentre la composizione esatta della soluzione Golgi-Cox utilizzato in questo studio è proprietario, ci sono molteplici fonti che elenco in dettaglio protocollo che può essere utilizzato per eseguire Golgi-Cox colorazione 13. Tuttavia, l'uso di altre Golgi-solutions sarà alterare significativamente colorazione durate e modifiche di tali operazioni devono essere effettuate conseguenza. Inoltre, abbiamo insieme ad altri ci hannoed 150 micron sezioni spesse per analizzare neuroni DGC 14,15 in quanto è generalmente accettato che il taglio di sezioni di questo spessore coronale e in parallelo ai arborizzazioni cellule dei granuli dentate minimizza il rischio di tagliare rami dendritiche.

DCX colorazione

Il protocollo di colorazione DCX richiede esplicita attenzione alla temperatura. La mancata riscaldare la soluzione a 37 ° C durante il periodo di preincubazione sarà significativamente alterare la colorazione e causare perdite di visualizzazione dendritica. Inoltre, attenzione a spessore di taglio è giustificato. In questo studio abbiamo utilizzato 70 sezioni micron di spessore per catturare nella misura massima di DGCS dendritica. Nella nostra esperienza, l'uso di 0,3% triton è una necessità in quanto facilita notevolmente la penetrazione dell'anticorpo tutto lo spessore delle sezioni galleggianti. In effetti, studi precedenti hanno usato tritone a penetrare 70 micron di spessore 16 o anche più spesso (120 micron) 17sezioni quando etichetta DGC dendriti. Si prega di consultare Hussaini per tutti i dettagli di DCX colorazione 18.

Infine, occorre notare che esistono programmi open source alternativi (ad esempio flNeuronTool o Simple_Neurite_Tracer) con la possibilità di registrare il movimento della fase x, ye z direzioni. Tali programmi possono essere utilizzati per il tracciamento dendritica purché sono abilitati a comunicare con la fase di scansione.

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Disclosures

Spese di pubblicazione di questo articolo sono sponsorizzati da MBF Bioscience.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Modified Golgi-cox staining solution  Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x) Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
30% Sucrose, Sigma CAS # 57-50-1 make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin Sigma CAS # 9000-70-8 NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) Sigma CAS 603-003-00-5 NA
Xylene Sigma CAS # 1330-20-7 NA
DPX Medium EMS  #13510 NA
Superfrost (+) white Electron Microscopy Sciences 71869-10 NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) VWR  #4811-703 NA
DCX Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-8066 4 C
DAB Sigma CAS Number 91-95-2   -20
OCT Tissue-tek 4583 NA
Tris Sigma CAS Number 77-86-1   NA
ABC Lite Vector PK4000 NA
Microscope Nikon Eclipse 80i
Digital Camera Nikon DS-Ri1
12 bit Camera  QImaging  01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System MBF Bioscience V.10
Image Composite Editor Microsoft 1.4.4.0
NIS Elements Nikon F 3.0
Image Pro Plus Mediacy Versin 7.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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