Vurdering af dendritiske arborization i gyrus dentatus i hippocampus-regionen i mus

1VA Palo Alto Health Care System, 2Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 3Department of Physical Therapy, Arkansas State University
Published 3/31/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Das, D., Phillips, C., Lin, B., Mojabi, F., Akif Baktir, M., Dang, V., et al. Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52371, doi:10.3791/52371 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Dynamiske ændringer i antallet og sammensætningen af synapser er kendetegnende for udvikling, aldring, og mange neurodegenerative sygdomme 1-3. Evnen af ​​neuroner til at modtage og integrere synaptisk information afhænger dendritisk morfologi og dynamiske ændringer i synaptiske forbindelser. Faktisk findes der en positiv korrelation mellem dendritiske rygsøjlen og synapse nummer, som både påvirker kognitive funktion 4. Således er det ikke overraskende, at formindskelser i dendritisk rygsøjlen nummer er blevet forbundet med kognitiv dysfunktion i en række neurologiske lidelser 5-7, hvilket fik stor interesse i dendritiske rygsøjlen kvantificering. Ikke desto mindre er en kvantificering af rygsøjlen tæthed fortsat en tidskrævende og kedelig opgave, der undlader at generere nyttige oplysninger om topografien og distribution af synapser på tværs af dendritiske træ. Heldigvis farvningsmetoder (f.eks Golgi-Cox og doublecortin (DCX)), sammenholdtmed avancerede billeddiagnostiske teknikker kan anvendes til at overvinde de nuværende hindringer og producere billeder af dendritiske arborization høj opløsning på en pålidelig og hurtig måde. Mens Golgi-Cox farvning metode kan anvendes til at vurdere tilstanden af dendritiske arborization i alle neuroner 8, kan DCX sættes ind til at mærke nyfødte neuroner især i den tandede gyrus og subventrikulære zone 9, en vigtig overvejelse, da neurogenese forekommer både disse regioner i hele levetiden 10,11.

Efter farvning blev to billeddannende metoder anvendes til at vurdere dendritiske egenskaber: i) real-time imaging (RTI) og ii) forlænget dybdeskarphed imaging (EDFI). RTI teknik giver et middel til at spore og kvantificere længde og rækkefølge af arborization langs de enkelte dendritiske segmenter og grene. Således gør det muligt at estimere det samlede areal og volumen, der optages af hver dendritisk træ. Flepecifically i RTI metoden brugeren kontinuerligt identificerer segmenterne og genfokuserer iterativt som neuron sporing software indsamler x, y og z-koordinaterne for den dendritiske struktur og rekonstruerer bane af dendritiske struktur i 3D. Forholdsvis, det EDFI metode giver en ret simpel og hurtige midler til vurdering af dendritiske tæthed i temmelig tykke vævsprøver ved at generere et sammensat billede, der giver information om hele z-aksen. For at gøre dette, at brugeren registrerer high definition video filer i hele tykkelsen af ​​sektionen, og derefter bruger software til at søge i videobilleder til at identificere punkter, hvor en pixel er helt i fokus. Efterfølgende fokuserede pixels sammen og integreret i en høj opløsning, sammensat 2D-billede. Dette sammensatte billede indeholder alle pixels, der var i fokus, uanset deres position i z-aksen. Kvalitativ og kvantitativ analyse af disse 2D-billeder kan derefter anvendes til at bestemme densitetenaf dendritiske forgrening i hvert felt.

Endelig præsenterer vi en panoramisk metode til at generere billeder af meget til analyse og vurdering af dendritter i en hel region af interesse høj opløsning. Denne teknik kan anvendes til at afhjælpe manglen på adgang til meget høj opløsning og dyre digitale kameraer. Ved hjælp af denne metode, man fanger serielle billeder på forskellige steder langs x- og y-akserne og derefter automatisk syr dem sammen ved hjælp af et freeware (f.eks Billede Composite Editor). Især kan denne fremgangsmåde anvendes til kvalitativ og kvantitativ vurdering af dendritiske arborization i en temmelig bredt område.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Forsøg blev gennemført i overensstemmelse med de etiske normer, der er godkendt af Udvalget for Dyrs Forskning ved Veterans Affairs Palo Alto sundhedssystem.

1. Golgi-Cox Farvning

  1. Brain udvinding og farvning
    1. På 1. dagen, dybt bedøver mus med 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin før euthanizing via afblødning.
    2. Fjern forsigtigt calvarium og dissekere ud hjernen.
      1. Først fjerne huden på toppen af ​​kraniet, placerer en krum saks på toppen af ​​lillehjernen og forsigtigt skåret igennem hovedskallen parallelt med den centrale sulcus med spidsen af ​​saksen pegede udad, bevæger sig i retning mod lugtekolben. Gentag denne proces på begge sider.
      2. Brug en kirurgisk pincet til at løfte calvarium mens du drejer den mod de olfaktoriske pærer og bryde det. Derefter flip kraniet hovedet og bruge en pick at skære gennem optikkennerver og løsne hjernen. Endelig bruge pick at adskille hjernen fra rygmarven på niveau med foramen magnum.
    3. Umiddelbart fordybe hjernen i 15 ml kommercielt tilgængeligt, ufortyndet Golgi-Cox opløsning. Opbevar hjernen i Golgi opløsning i et loft, 20 ml glasflaske ved stuetemperatur i mørke.
    4. På 2. dagen, langsomt hæld ud løsningen og erstatte det med 15 ml frisk Golgi-Cox løsning. Rekapitulere flasken med hjerner og henstår i yderligere 9 dage i mørke.
  2. Sektionering og indlejring
    1. På den 11. dag, skal du placere hjerner i 30% saccharose løsning, tilberedt i Hedeselskabet 2 O for dehydrering. Skift opløsningen med frisk fremstillet 30% saccharose efter 12 timer. Inkubér hjernerne i en 30% saccharose-opløsning i 3 dage ved 4 ° C.
    2. På den 14. dag, fylde reservoir vibratome med en saccharoseopløsning 30% indtil kniven er dækket. Sæt hastigheden til 1 mm / s med amplitude på 0,95 mm.
    3. Dup hjerner med en Kimwipe at fjerne overskydende fugt og fjern cerebellum ved anvendelse af et barberblad til at skære coronalt.
    4. Fast montere hele hjernen på vibratome platformen ved hjælp superlim og lad det indstillet til 2-4 min. Sæt platform med klæbet hjerne i reservoiret og justere bladet til toppen af ​​hjernen.
    5. Ved hjælp af vibratome, slice hjernen til 150 um tykke sektioner ved stuetemperatur, huske at skifte bladet efter hver 3. hjerne.
    6. Saml afsnittene fra reservoiret med en lille spids pensel og fordybe dem i en petriskål indeholdende 0,3% gelatine fremstillet i Hedeselskabet 2 O. Mens sektionerne forbliver i petriskål, tilsættes 0,5 ml 0,3% gelatine på hvert dias og bruge en pensel til at sprede og pels SuperFrost + dias.
    7. Forsigtigt afhente fordybet sektioner fra petriskålen og placere dem på den gelatinerede dias. Orientere hjernesnit vedrøre dem kun på deres sider og ikke på toppen.
    8. Efter omkring ti minutter, coate sektioner med 30% saccharose før vævet fuldstændigt tørrer. Så lufttørre den forberedte dias i et mørkt sted i et dias rack i 3 dage.
    9. Kommercielt tilgængelig 10x Udvikling fortyndes til 1x hjælp Hedeselskabet 2 O. Fordyb dias i at udvikle løsning til 7-10 min. Skyl dias 3 gange i Hedeselskabet 2 O.
  3. Dehydrering
    1. Forbered anvendelse af destilleret ddH 2 O. 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% og 95% ethanolopløsninger
    2. Soak dias i stadigt højere ethanolopløsninger i 10 min hver.
    3. Soak objektglassene i 100% ethanol opløsning 3 gange i 10 minutter hver gang.
    4. Soak dias i 100% xylen 3 gange i træk i 5 minutter hver, holde afsnittene i den endelige løsning, indtil de er cover-smuttede.
    5. Placer en generøs mængde af DPX (Di-n-butyl phthalat i xylen) montering medium (abud 1-1,5 ml) på hvert dias ved hjælp af en plastik overførsel pipette Placer forsigtigt dækglas for at undgå bobler.
    6. Air tør cover gled-hjernesnit vandret i 3 dage.

2. Doublecortin Farvning

  1. Dybt bedøver (se trin 1.1.1) dyrene.
  2. Udfør hjerteperfusion med frisk fremstillet 4% paraformaldehyd fremstillet i phosphatpuffer 12.
  3. Uddrag hjerner (se 1.1.2) og gemmer på 45 ml 4% paraformaldehyd ved 4 ° C natten over på en vuggende ryster.
  4. Overfør hjerner til en saccharoseopløsning på 30%, og vent til fuldstændig dehydrering i 48 timer ved 4 ° C. Fjern hjerner fra saccharose og placere dem direkte på kobber blokke placeret på tøris.
  5. Fyld blok med optimal opskæring temperatur (OLT) forbindelse og markere orienteringen af ​​hjernen ved hjælp af lugtekolben som en milepæl.
  6. Ved hjælp af en kryostat, skåret 70 micron tykke sektioner ved -20 ºC og placere demi kryobeskyttende opløsning (25% ethylenglycol, 25% glycerol, i 0,05 M natriumphosphatpuffer, pH 7,4) og holde ved -20 ° C indtil anvendelse.
  7. Lav en opløsning af 50% kryobeskyttelsesmiddel og 50% methanol. Til denne opløsning tilsættes 0,5% hydrogenperoxid (vol / vol). Inkuber flydende sektioner i 30 minutter ved stuetemperatur.
  8. Varm sektioner i 37 ºC i TBS (Tris-saltvand) i 30-40 min ved at placere dem i en histologisk ovn.
  9. Inkubér sektioner med 0,3% Triton og 3% normalt hesteserum i 45 minutter ved stuetemperatur før immunfarvning. Inkuber afsnittene ved 4 ºC natten over i 3 ml opløsning af DCX antistof fortyndet 1: 500 i TBS med 0,3% Triton og 1% normal hesteserum.
  10. Den følgende dag vaskes sektionerne 3 på hinanden følgende gange i TBS (10 min hver).
  11. Inkuber sektioner med et biotinyleret heste-anti-ged (1: 200 i TBS) i to timer ved stuetemperatur. Vask afsnittene 3 på hinanden følgende gange i TBS (10 min hver).
  12. Inkuber them med ABC Lite (1: 1.000) i 1,5 time ved stuetemperatur.
  13. Tilsæt 5 pi 30% H 2 O 2 til en tablet på 10 mg DAB (3,3 "-Diaminobenzidine) opløsning opløst i 15 ml 1 M Tris-HCI (pH 7,6). Inkuber afsnittene umiddelbart i denne opløsning i 5 min.
  14. Afslut reaktionen ved at vaske dem med iskold TBS tre gange efterfulgt af en vask i TBS ved stuetemperatur.
  15. Dehydrer sektioner ved hjælp af en serie af ethanolopløsninger (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 minutter hver), klar i xylen, og derefter dække slip hjælp DPX som i trin 1.3.

3. Visualisering

  1. Efter fuldstændig tørring af sektionerne, fjerne overskydende DPX oven på dias med en skarp kniv, og placere dem på scanning etape af mikroskopet. Systemet består af et mikroskop udstyret med scanning fase, joystick, og en farve 12-bit kamera.
  2. Starte programmet. Åbn en ny datafil.
  3. Stedet referencepunkt på skærmen ved at klikke med musen på ethvert sted. Dette vil aktivere alle ikoner fra værktøjet panel af programvinduet.
  4. Klik på "Joystick Free" ikonet på værktøjslinjen og derefter bruge joysticket til at lokalisere den tandede gyrus i hippocampus i første afsnit.
  5. I "Funktioner" fanen i programvinduet, skal du vælge "Serial Section Manager". Klik på "Nyt kapitel" ikonet i nederste venstre hjørne af vinduet. Dette vil åbne "Serial afdeling Setup" vinduet.
  6. Vælg Serial afdeling Setup vinduet og derefter indtaste det samlede antal afsnit, der indeholder hippocampus regioner. Vælg evalueringen interval. Indtast sektion skære tykkelse (70 um for DCX og 150 um for Golgi-farvede sektioner).
  7. Begynd at spore den tandede gyrus region ved at klikke på "Freehand Contour Drawing" ikonet i værktøjslinjen. Skitsere tandede granulære cellelag. </ Li>
  8. Vælg "100X" fra "Forstørrelse" menuen. Tilføj en dråbe immersionsolie på strækningen, og skift det mål, der 100X. Find den tandede granula celle organer og dendritter under dette mål.
  9. Fokus på et valgt neuron og klik på "Neuron Tracing" ikonet på værktøjslinjen. Trace omkredsen af ​​gyrus granule cell krop. Når du er færdig opsporing, højreklik for at vælge "Finish Cell Body".
  10. Begynd at spore dendritter manuelt i x, y og z retninger og følge hver gren med joysticket og z-motor knop. Ved en forgrening eller trifurcation node, skal du vælge den pågældende indstilling i rullemenuen ved højreklik. Trace hver af de erhvervsgrene, der opstår fra disse knudepunkter. Ved afslutningen af ​​hver gren højreklikke og vælge "Ending" i rullemenuen.
  11. Brug piletasterne ikoner i softwaren vinduet tilfældigt vælge en anden tandet granula celle og følge samme procedure som descrIBED i trin 3,9-3,10. Gem hele sporing.
  12. Start neuronal sporing software.
  13. Åbne den første NRX datafil fra den første mus i forsøgsgruppen. Føj NRX fil i den anden mus af forsøgsgruppen. Fortsæt indtil alle NRX filer fra denne gruppe er vedlagt.
  14. Under fanen Analysis, skal du vælge "Fan In-diagram". Dette åbner Fan In-analyse vindue. Flueben "dendritter" og klik Display, der viser de længder og forgrenede mønstre af dendritter for denne gruppe af mus (figur 1).

4. EDFI

BEMÆRK: Denne metode gør det muligt for brugeren hurtigt at optage et stort antal billeder gennem z-aksen af ​​hvert felt og generere et 2D-billede, der indeholder alle de fokuserede pixels hele z-aksen. Resultatet vil være et sammensat billede, der indeholder alle fokuserede pixels fra indsamlede billeder.

  1. Slut mikroskopet til en digital camæra. Placer sektioner først på scannebordet forbundet til mikroskopet og derefter skifte til en 10X objektiv. Flyt scenen til området af interesse.
  2. Start en videooptagelse program.
  3. Tryk på optageknappen. Så snart der trykkes på optageknappen, skal du bruge makro-fokus knappen for at flytte fra toppen til bunden af ​​sektionen for i alt 4 sek. Gem den resulterende videofil.
  4. Brug ImageJ freeware til at konvertere AVI video filer til et ukomprimeret format ved at åbne filen og gemme dem i ukomprimeret filformat.
  5. Start en billedanalyse program og åbn AVI-fil. Gå til "Proces" menuen og klik på "Udvidet dybdeskarphed". Vælg den tilsvarende videofil. I "Output" indstillinger, skal du vælge "Generer Composite Bedste-Focus Image".
  6. I "Focus Analysis" indstillinger, skal du vælge "Normalized Illumination" og "Max Lokal kontrast" muligheder. Vælg derefter "Crespiste ". Det resulterende billede repræsenterer alle de fokuserede pixels hele Z-akse (figur 2).
  7. Gem det resulterende billede.

5. Generering Ekstremt høj opløsning billeder

BEMÆRK: Denne metode gør det muligt at automatisk at generere lav forstørrelse og ekstremt billeder i høj opløsning fra billeder i høj forstørrelse-høj opløsning på en automatiseret måde.

  1. Placer sektioner først på scannebordet forbundet til mikroskopet. Mikroskopet er forbundet til et digitalt kamera. Flyt scenen til området af interesse.
  2. Start en billedoptagelse program.
  3. Brug en 10X objektiv og erhverve og gemme høj opløsning (4076 x 3116) billeder fra området af interesse at sørge for at have mindst 10% overlap.
  4. Kør Billede Composite Editor at sy billeder.
  5. Gå til menuen Filer, og klik på "Ny Panorama". Vælg den mappe, hvor billederne er stORed. Vælg de billeder, der tilhører samme region, og tryk på "OK".
  6. Tryk på "Eksporter til disk" knappen og gemme billedet. Dette billede repræsenterer en ekstrem høj opløsning billede af området af interesse, der kan anvendes til analyse og / eller demonstration (figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Omfanget af arborization skyldes bevarede og nyfødte gyrus granula celler blev analyseret i vildtypemus ved anvendelse af enten Golgi-Cox eller DCX-farvning (figur 1). Dendritiske segmenter af DCX-positive celler blev fundet at være 13-36 mikrometer lange. Den normale fordeling af dendritiske længde blev testet under anvendelse Kolmogorov-Smirnov-test (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; figur 4 og 5).

I analysen af ​​længden af ​​segmenter pr rækkefølge arborization blev de længste segmenter findes i den første kendelse af arborization (38.38 + 1,45 um). Lignende mønstre blev fundet for overfladen (111,98 + 3,93 kvadrat mikron) og volumen (27,93 + 1,03 cubic um). Den lineære korrelation mellem længden af ​​segmenter og overfladearealet og / eller volumen, der optages af disse segmenter blev også testet. Både overflade (p = 0,001, R2 = 0,873) og volumen (p = 0,001, R2 = 0,621) correlated signifikant med længden af ​​hver dendritiske segment.

Figur 1
Figur 1:. Her Fan diagram blev anvendt til at vurdere den dendritiske længde gyrus granulceller i hippocampus kan Denne visualisering værktøj anvendes til at sammenligne virkningerne af forskellige terapeutiske indgreb eller genotyper på dendritiske længde. Enheden af ​​målinger er um.

Figur 2
Figur 2: Visualisering af dendritiske arborization uden (A) og med EDFI (B) metoder. Den traditionelle metode til at finde det bedste fokusplan blev sammenlignet med EDFI (data ikke vist) og fundet signifikant højere værdier af dendritiske område ved hjælp af EDFI metoden (p = 0,02). Scale bar= 100 um.

Figur 3
Figur 3:. En høj opløsning billede af hippocampus-regionen i en mus Denne ekstremt høj opløsning billede automatisk konstrueret af syning 10 (4076 x 3116) -pixel billeder. Skaler nøgne = 100 um.

Figur 4
Figur 4:. Den kvantificering af længde og volumen besat af dendritter i forskellige ordrer forgrening Den maksimale længde og volumen er opnået i rækkefølgen 1.

Figur 5
Figur 5:. Histogram af dendritiske længde gyrus granulceller Størstedelen af dendritiske segmenter af DCX-farvede dendritter var 13-26 i længden. Den røde stiplede linie viser normalfordeling af de fremlagte oplysninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her blev to metoder beskrevet at kvantificere omfanget af dendritiske arborization i modne og nyfødte neuroner ved anvendelse af traditionelle farvningsmetoder sammen med RTI og EDFI. Erhvervelse af billeder af neuroner høj opløsning giver en meget nyttig metode til at teste de skadelige virkninger af neurodegenerative lidelser og til gengæld giver mulighed for at vurdere terapeutiske strategier, der er målrettet hippocampale neuroner.

Mens RTI metode blev anvendt til at fange dybdegående data vedrørende omfanget af arborization og topografi, EDFI metode undlader at give oplysninger om de komplekse individer segmenter eller træer. Ikke desto mindre er fordelene ved EDFI metode ligger i det faktum, at det ikke kræver køb af dyrt hardware og mindre tidskrævende.

Et billede analyseprogram blev brugt til at udføre EDFI i videofiler. Har adgang til høj opløsning og hurtigtkameraer tillader samling af et stort antal billeder i hele tykkelsen af ​​hvert felt og genererer billeder, der virkelig repræsenterer x, y og z dimensioner. En ulempe ved EDFI metode vedrører den omstændighed, at der kunne være mere end én pixel (samme x og y) fokuserede i forskellige planer i hele Z-aksen. En fremgangsmåde forudses at tildele forskellige farver til disse pixels nøjagtigt repræsenterer omfanget af 3D profiler i 2D-billeder. Det skal bemærkes, at EDFI metoden også kan anvendes til analyse af cellulære profiler (f.eks synapser microglia og astrocytter). Desuden kan denne fremgangsmåde anvendes til at analysere omfanget af mikroglial distribution i hele tykkelsen af et afsnit 7. De to metoder er beskrevet her, kan anvendes på en komplementær måde. Mens RTI metode giver præcise oplysninger om topografi forgrening mønster og EDFI giver os en temmelig enkel og hurtigere metode til at vurdere tæthed af dendritter i et område af iresse. Især tykkelsen af ​​sektioner, der kan erhverves med EDFI er meget varierende, da rækken af ​​z fokus på mikroskopbordet i kombination med optisk fokus af mikroskopet mål diktere grænserne for EDFI.

De heri beskrevne fremgangsmåder har potentiale til at blive anvendt i flere sammenhænge. I denne undersøgelse forudsat at vi et middel til at vurdere ændringer i dendritiske arborization før og efter indgreb, mens EDFI blev anvendt til at kvantificere mikroglial aktivering 7. Således er denne teknik er modtagelig for enhver anvendelse, hvor det endelige mål er at vurdere ændringer i små profiler, der kan findes i flere lag.

Endelig kan disse teknikker overvinde manglende adgang til meget høj opløsning og dyre digitale kameraer. I det væsentlige, blev en metode vist, hvordan at fange serielle billeder på forskellige punkter af steder inden for en prøve, og derefter sy dem sammen ved hjælp af et freeware, i sidste ende yielding billeder i høj opløsning på en måde, der er langt mere pålidelig og hurtig end konventionelle metoder.

Kritiske trin

Golgi-farvning

Stock mængder Golgi og udviklingslande opløsninger opbevares ved 4 ° C til opbevaring og alligevel farvning og inkubation protokoller kræver den opløsning, der skal anvendes ved stuetemperatur. Køling Golgi og udvikle løsninger på is eller i køleskabet negativt påvirker kvaliteten af ​​dendritiske farvning. Desuden skal det bemærkes, at vi brugte hastig udvikling Golgi løsninger. Mens den nøjagtige sammensætning af Golgi-Cox opløsning, der anvendes i denne undersøgelse er lukket, der er flere kilder, liste detaljeret protokol, der kan anvendes til at udføre Golgi-Cox farvning 13. Dog vil brugen af ​​andre Golgi-løsninger væsentligt ændrer farvning varigheder og ændringer til disse trin bør gøres i overensstemmelse hermed. Også, vi sammen med andre har osed 150 um tykke snit til at analysere DGC neuroner 14,15, da det generelt er enighed om, at skære dele af denne tykkelse coronalt og parallelt med den tandede granulat celle arborizations minimerer risikoen for at skære dendritiske grene.

DCX farvning

The DCX farvningsprotokol kræver udtrykkeligt opmærksom på temperaturen. Manglende opvarme opløsningen til 37 ° C under præinkubationsperiode vil skade farvning og resultere i tab af dendritiske visualisering. Desuden er opmærksom på afsnit tykkelse berettiget. I denne undersøgelse brugte vi 70 um tykke snit til at fange det maksimale omfang af DGCs dendritiske arborization. Det er vores erfaring, at anvendelse af 0,3% Triton er en nødvendighed, da det i høj grad letter indtrængen af ​​antistoffet i hele tykkelsen af ​​det flydende sektioner. Faktisk har tidligere undersøgelser brugt triton at trænge 70 um tyk 16 eller endda tykkere (120 um) 17sektioner, når label DGC dendritter. Se Hussaini for detaljer om DCX farvning 18.

Endelig skal det bemærkes, at alternative programmer open source (f.eks flNeuronTool eller Simple_Neurite_Tracer) findes med mulighed for at optage bevægelsen af scenen i X, Y og Z-retning. Sådanne programmer kan anvendes til dendritiske sporing, så længe de er i stand til at kommunikere med scanning fase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bekendtgørelsesgebyrer til denne artikel er sponsoreret af MBF Bioscience.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Modified Golgi-cox staining solution  Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x) Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
30% Sucrose, Sigma CAS # 57-50-1 make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin Sigma CAS # 9000-70-8 NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) Sigma CAS 603-003-00-5 NA
Xylene Sigma CAS # 1330-20-7 NA
DPX Medium EMS  #13510 NA
Superfrost (+) white Electron Microscopy Sciences 71869-10 NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) VWR  #4811-703 NA
DCX Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-8066 4 C
DAB Sigma CAS Number 91-95-2   -20
OCT Tissue-tek 4583 NA
Tris Sigma CAS Number 77-86-1   NA
ABC Lite Vector PK4000 NA
Microscope Nikon Eclipse 80i
Digital Camera Nikon DS-Ri1
12 bit Camera  QImaging  01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System MBF Bioscience V.10
Image Composite Editor Microsoft 1.4.4.0
NIS Elements Nikon F 3.0
Image Pro Plus Mediacy Versin 7.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22, (3), 383-388 (2012).
  2. Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587, (4), 727-729 (2009).
  3. Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. Synapses and Alzheimer’s disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. a005777 (2012).
  4. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
  5. Huttenlocher, P. R. Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms. Neurology. 24, (3), 203-210 (1974).
  6. Marin-Padilla, M. Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study. Brain Res. 38, (1), 1-12 (1972).
  7. Dang, V., et al. Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome. Biol Psychiatry. 75, (3), 179-188 (2014).
  8. Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study. Coll Antropol. 35, (Suppl 1), 25-30 (2011).
  9. Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10, (1), 32-46 (2010).
  10. Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis. Anat Rec. 296, (9), 1364-1382 (2013).
  11. Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis. Cell Mol Life Sci. 70, (12), 2045-2057 (2013).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).
  13. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
  14. Juraska, J. M. Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus. Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).
  15. Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus. PLoS One. 6, (9), e24566 (2011).
  16. Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche. J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).
  17. Merz, K., Lie, D. C. Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice. PLoS One. 8, (5), e62693 (2013).
  18. Hussaini, S. M., et al. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. (78), (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats