Vurdering av Dendritic arborization i Dentate Gyrus av hippocampus regionen i Mus

1VA Palo Alto Health Care System, 2Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 3Department of Physical Therapy, Arkansas State University
Published 3/31/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Das, D., Phillips, C., Lin, B., Mojabi, F., Akif Baktir, M., Dang, V., et al. Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52371, doi:10.3791/52371 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Dynamiske endringer i antall og struktur av synapser er kjennetegn for utvikling, aldring, og mange nevrodegenerative lidelser 1-3. Evnen av neuroner for å motta og integrere synaptiske informasjon er avhengig av dendrittiske morfologi og dynamiske forandringer i synaptiske forbindelser. Faktisk viser en klar positiv sammenheng mellom dendrittiske ryggrad og synapse nummer, som både påvirker kognitiv funksjon 4. Dermed er det ikke overraskende at innskrenkninger i dendrittiske ryggrad nummer har blitt assosiert med kognitiv dysfunksjon i en rekke nevrologiske lidelser 5-7, spørre stor interesse i dendrittiske ryggrad kvantifisering. Likevel kvantifisering av ryggraden tetthet forblir en tidkrevende og kjedelig oppgave som ikke klarer å generere nyttig informasjon angående topografi og fordeling av synapser på tvers av dendrittiske treet. Heldigvis fargemetoder (f.eks Golgi-Cox og doublecortin (DCX)) i forbindelsemed avanserte imaging teknikker kan brukes til å overvinne dagens barrierer og produsere høyoppløselige bilder av dendrittiske arborization i en pålitelig og rask måte. Mens Golgi-Cox farging metoden kan bli utplassert for å vurdere tilstanden av dendrittiske arborization i alle nevroner 8, kan DCX bli deployert til å merke nyfødte nerveceller spesielt i dentate gyrus og subventricular sone ni, en viktig faktor gitt at neurogenesis oppstår i både disse regionene i hele levetiden 10,11.

Etter farging ble to avbildningsmetoder utplassert for å vurdere dendrittiske kjennetegn: i) real-time imaging (RTI) og ii) utvidet dybdeskarphet imaging (EDFI). RTI teknikk gir et middel for å spore og kvantifisere lengden og rekkefølgen av arborization langs de enkelte dendrittiske segmenter og greiner. Således gjør det mulig å beregne det totale arealet og volumet som opptas av hvert dendrittiske treet. Flere specifically, i RTI fremgangsmåte brukeren identifiserer kontinuerlig segmentene og refocuses iterativt som neuron tracing programvare samler x-, y- og z-koordinatene for den dendrittiske struktur og rekonstruerer banen til dendrittiske struktur i 3D. Forholdsvis gir EDFI metoden en ganske enkel og fremskyndet midler for å vurdere dendrittiske tetthet i heller tykke vevsprøver ved å generere et sammensatt bilde, gi informasjon om hele z-aksen. For å gjøre dette, registrerer brukeren HD-videofiler gjennom hele tykkelsen på seksjonen og deretter bruker programvare for å søke i videobilder for å identifisere punkter hvor en piksel er helt i fokus. Deretter blir fokusert piksler fusjonert og integrert i en høy oppløsning, kompositt 2D-bilde. Dette sammensatte bildet inneholder alle piksler som var i fokus, uavhengig av deres posisjon i z-aksen. Kvalitativ og kvantitativ analyse av disse 2D-bilder kan deretter brukes til å bestemme tetthetenav dendrittiske forgrening i hvert felt.

Til slutt presenterer vi en panorama metode for generering av ekstremt høy oppløsning for analyse og vurdering av dendritter i en hel region av interesse. Denne teknikken kan distribueres til å overvinne mangelen på tilgang til svært høy oppløsning og dyre digitalkameraer. Ved hjelp av denne metoden, en fanger serie bilder på ulike steder langs x- og y-aksen og deretter automatisk setter dem sammen ved hjelp av en freeware (f.eks Bilde Composite Editor). Spesielt, kan denne fremgangsmåte benyttes for kvalitativ og kvantitativ vurdering av dendrittiske arborization i et ganske bredt område.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Forsøk ble utført i samsvar med de etiske standarder godkjent av komiteen for forsøksdyr ved Veterans Affairs Palo Alto Health Care System.

1. Golgi-Cox Farging

  1. Brain utvinning og farging
    1. På den første dagen, dypt bedøve musene med 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin før euthanizing via blodtapping.
    2. Fjern forsiktig calvarium og dissekere ut hjernen.
      1. Først fjerne hud på toppen av skallen, plassere en buet saks på toppen av lillehjernen og forsiktig skjære gjennom calvarium parallell til den sentrale sulcus med tuppen av sakse pekte utover, beveger seg i retning mot luktelappen. Gjenta denne prosessen på begge sider.
      2. Bruk en kirurgisk pincet å løfte calvarium mens du slår den mot olfactory pærer og bryte den av. Deretter snu skallen opp ned og bruke en hakke å skjære gjennom synsnerver og løsne hjernen. Til slutt bruker plukk å skille hjernen fra ryggmargen på nivået av foramen magnum.
    3. Umiddelbart fordype hjernen i 15 ml kommersielt tilgjengelig, ufortynnet Golgi-Cox løsning. Oppbevar hjernen i Golgi-løsning i en avkortet, 20 ml glassflaske ved romtemperatur i mørket.
    4. På den andre dagen, sakte helle ut løsningen og erstatte den med 15 ml frisk Golgi-Cox løsning. Lukk flasken inneholder hjernen og la uforstyrret i ytterligere ni dager i mørket.
  2. Seksjonering og embedment
    1. På den 11. dagen, legger hjernen i 30% sukrose løsning, utarbeidet i DDH 2 O for dehydrering. Endre løsningen med nylagde 30% sukrose etter 12 timer. Inkuber hjernene i en 30% sukroseoppløsning i 3 dager ved 4 ° C.
    2. På den 14. dag, fylle reservoaret på vibratome med en 30% sukroseløsning til kniven er dekket. Sette hastigheten til 1 mm / s med amplitude på 0,95 mm.
    3. Blot hjernen med en Kimwipe for å fjerne overflødig fuktighet og fjerne lillehjernen ved hjelp av et barberblad for å kutte coronally.
    4. Fast montere hele hjernen på vibratome plattformen ved hjelp av superlim og la den satt for 2-4 min. Sett plattformen med det adherte hjernen inn i reservoaret og justere bladet til toppen av hjernen.
    5. Bruke vibratome, skjære hjernen til 150 mikrometer tykke seksjoner ved romtemperatur, huske å bytte blad etter hver tredje hjernen.
    6. Plukk opp seksjoner fra reservoaret ved hjelp av en liten spiss pensel og dyppe dem i en petriskål som inneholder 0,3% gelatin laget i DDH 2 O. Mens seksjonene forbli i petriskålen, tilsett 0,5 ml av 0,3% gelatin på hvert lysbilde og bruke en pensel for å spre og frakk Superfrost + lysbilder.
    7. Forsiktig plukke opp de nedsenkede seksjoner fra petriskål og plassere dem på de gelatin lysbilder. Orientere hjernen seksjoner vedberøre dem bare på sine sider og ikke på toppene.
    8. Etter ca ti minutter, belegge seksjoner med 30% sukrose før vevet tørker helt. Deretter lufttørke oppkjørte lysbilder i et mørkt sted i en lysbildestativ for 3 dager.
    9. Fortynne kommersielt tilgjengelig 10x Utvikle løsning til 1x hjelp DDH 2 O. Fordype lysbildene i å utvikle løsning for 7-10 min. Skyll lysbildene 3 ganger i DDH 2 O.
  3. Dehydrering
    1. Forbered 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% og 95% etanol-løsninger med destillert DDH 2 O.
    2. Suge lysbildene i stadig høyere etanol løsninger for 10 min hver.
    3. Suge lysbildene i 100% etanol løsning 3 ganger i 10 minutter hver gang.
    4. Suge lysbildene i 100% xylen tre ganger på rad på fem minutter hver, holde seksjonene i den endelige løsningen til de er cover-sklei.
    5. Plasser en generøs mengde DPX (Di-n-butylftalat i xylen) monteringsmedium (abut 1-1,5 ml) på hvert lysbilde med en plast overføring pipette Nøye plassere Dekk å unngå bobler.
    6. Lufttørke dekselet gled-hjerne seksjoner horisontalt i 3 dager.

2. Doublecortin Farging

  1. Dypt bedøve (se trinn 1.1.1) dyrene.
  2. Utføre hjerte perfusjon med nylagde 4% paraformaldehyde gjort i fosfatbuffer 12.
  3. Pakk hjernen (se 1.1.2) og lagrer i 45 ml av 4% paraformaldehyde ved 4 ° C over natten på en gynge shaker
  4. Overfør hjernen til en 30% sukroseløsning og vente for fullstendig dehydratisering i 48 timer ved 4 ° C. Fjerne hjernen fra sukrose og plassere dem direkte på kobber blokker plassert på tørris.
  5. Fyll blokken med optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelsen og merke retningen av hjernen ved hjelp av luktelappen som et fjell.
  6. Ved hjelp av en kryostat, kuttet 70 mikron tykke seksjoner ved -20 ºC og legg demi cryobeskyttelsesmiddeloppløsning (25% etylenglykol, 25% glycerol, i 0,05 M natriumfosfatbuffer, pH 7,4) og holde ved -20 ° C inntil bruk.
  7. Foreta en oppløsning av 50% kryobeskyttende middel, og 50% metanol. Tilsett til denne oppløsning 0,5% hydrogenperoksyd (vol / vol). Inkuber flytende seksjoner i 30 minutter ved romtemperatur.
  8. Varme delene i 37 ºC i TBS (Tris-bufret saltvann) for 30-40 min ved å plassere dem i en histologisk ovn.
  9. Inkuber seksjoner med 0,3% triton og 3% normalt hesteserum i 45 minutter ved romtemperatur før farging. Inkuber seksjoner ved 4 ° C over natten i 3 ml løsning av DCX-antistoff fortynnet 1: 500 i TBS med 0,3% triton og 1% normalt hesteserum.
  10. Den følgende dag vaske seksjonene 3 påfølgende ganger i TBS (10 min hver).
  11. Inkuber seksjoner med biotinylert heste anti-geit (1: 200 i TBS) i to timer ved romtemperatur. Vask seksjoner 3 ganger på rad i TBS (10 min hver).
  12. Ruge them med ABC Lite (1: 1000) i 1,5 timer ved romtemperatur.
  13. Tilsett 5 ul av 30% H 2O 2 til en tablett av 10 mg DAB (3,3 "-Diaminobenzidine) løsning løst i 15 ml av 1 M Tris-HCl (pH 7,6). Inkuber seksjoner umiddelbart i denne oppløsning i 5 min.
  14. Avslutte reaksjonen ved å vaske dem med iskald TBS tre ganger, etterfulgt av en vask i TBS ved romtemperatur.
  15. Dehydrere seksjoner ved hjelp av en serie av etanolløsninger (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 min hver), klart i xylen, og deretter dekke slip ved hjelp DPX som i trinn 1.3.

3. Visualisering

  1. Etter fullstendig tørking av delene, fjerne overflødig DPX på toppen av lysbilder med en skarp kniv, og plassere dem på scanning stadium av mikroskop. Systemet er sammensatt av et mikroskop utstyrt med skannetrinn, en styrespak, og en 12-bits fargekameraet.
  2. Starte programmet. Åpne en ny datafil.
  3. Stedet referansepunkt på skjermen ved å klikke med musepekeren på ethvert sted. Dette vil aktivere alle ikonene fra verktøy panel av programvinduet.
  4. Klikk på "Joystick Free" -ikonet på verktøylinjen og deretter bruke styrespaken til å lokalisere dentate gyrus av hippocampus i den første delen.
  5. I "Tools" -kategorien av programvinduet, velg "Serial Seksjon Manager". Klikk på "Nytt kapittel" ikonet i nedre venstre hjørne av vinduet. Dette vil åpne "Serial Seksjon Setup" vinduet.
  6. Velg Serial Seksjon Setup vinduet og deretter angi det totale antall seksjoner som inneholder hippocampus regioner. Velge evalueringsintervall. Skriv inn delen kutt tykkelse (70 mikrometer for DCX og 150 mikrometer for Golgi-farget seksjoner).
  7. Begynn tracing dentate gyrus regionen ved å klikke på "Freehand Contour Drawing" -ikonet på verktøylinjen. Skissere dentate kornet cellelaget. </ Li>
  8. Velg "100X" fra "Forstørrelse" -menyen. Tilsett en dråpe av nedsenking olje på strekningen og slå målet å 100X. Finn dentate granule celle organer og dendritter under denne målsettingen.
  9. Fokusere på en valgt nevron og klikk på "Neuron Tracing" -ikonet på verktøylinjen. Spor omkretsen av dentate granule cellelegemet. Når du er ferdig med sporing, høyreklikk for å velge "Finish Cell Body".
  10. Begynn tracing dendritter manuelt i x-, y- og z-retningene og følge hver gren med joysticken og z-motor knott. På en todeling eller trifurcation node, velg den respektive alternativ fra rullegardinmenyen ved å høyreklikke. Spore hver av grenene som oppstår fra disse nodene. På slutten av hver gren høyreklikk og velg "Ending" fra rullegardinmenyen.
  11. Ved hjelp av piltasten ikonene i programvaren vinduet tilfeldig velge en annen dentate granule celle og følger samme prosedyre som descrIbed i trinn 03.09 til 03.10. Lagre hele sporing.
  12. Start nevronale sporing programvare.
  13. Åpne den første NRX datafil fra den første mus i forsøksgruppen. Tilføye NRX-fil av andre mus av den eksperimentelle gruppen. Fortsett til alle NRX-filer fra denne gruppen er vedlagt.
  14. Under fanen Analysis, velg "Fan In-diagram". Dette åpner Fan In-analyse vindu. Hake "dendritter" og klikk Display, som skildrer de lengder og forgreninger mønstre av dendritter for denne gruppe mus (figur 1).

4. EDFI

MERK: Denne metoden gjør det mulig å raskt ta opp et stort antall bilder gjennom z-aksen av hvert felt og generere et 2D-bilde som inneholder alle de fokuserte piksler hele z-aksen. Resultatet vil bli et komposittbilde som inneholder alle fokuserte piksler fra innsamlede bilder.

  1. Koble mikroskopet til en digital kamera. Plasser delene først på skanning scenen koblet til mikroskopet og deretter bytte til en 10X objektiv. Flytte scenen til området av interesse.
  2. Start en video fange program.
  3. Trykke på opptaksknappen. Så snart opptaksknappen trykkes inn, bruke makro-fokus knotten for å flytte fra toppen til bunnen av seksjonen for totalt 4 sek. Lagre videofilen.
  4. Bruk ImageJ freeware til å konvertere AVI videofiler til et ukomprimert format ved å åpne filen og lagre dem i ukomprimert filformat.
  5. Starte en bildeanalyse program og åpne AVI fil. Gå til "Process" -menyen og klikk på "Utvidet Depth of Field". Velg tilsvarende videofilen. I "Output" alternativer, velg "Generer Composite Best-Focus Image".
  6. I "Focus Analysis" alternativer, velg "Normalisert Illumination" og "Max Local Contrast" alternativer. Deretter velger du "Create ". Den resulterende bildet representerer alle de fokuserte piksler hele z-aksen (figur 2).
  7. Lagre den resulterende bildet.

5. Generere Ekstremt-bilder med høy oppløsning

MERK: Denne metoden gjør det mulig for brukeren å automatisk generere lav forstørrelse og ekstremt høyoppløselige bilder fra bilder med høy forstørrelse-høyoppløselige i en automatisert måte.

  1. Plassere seksjonene først på skannetrinn som er koplet til mikroskopet. Mikroskopet er koblet til et digitalt kamera. Flytte scenen til området av interesse.
  2. Starte et bilde anskaffelsesprogram.
  3. Bruk en 10X objektiv og erverve og lagre høy oppløsning (4076 x 3116) bilder fra regionen av interesse å sørge for å ha minst 10% overlapping.
  4. Kjør Bilde Composite Editor å sy bilder.
  5. Gå til Fil-menyen, og klikk på "New Panorama". Velg mappen der bildene er stELLER-behandlet. Velg bildene som tilhører samme region, og trykk "ok".
  6. Trykk på "Eksporter til disk" -knappen og lagre bildet. Dette bildet representerer en ekstremt høy oppløsning bilde av området av interesse som kan bli brukt for analyse og / eller demonstrasjon (figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Omfanget av arborization oppstår fra bevarte og nyfødte dentate granule celler ble analysert i villtype mus ved hjelp av enten Golgi-Cox eller DCX farging (figur 1). Dendrittiske segmenter av DCX-positive celler ble funnet å være 13 til 36 mikron lange. Den normale fordeling av dendritiske lengde ble testet ved hjelp av Kolmogorov-Smirnov-test (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; figur 4 og 5).

I analysen av lengden av segmenter pr orden arborization, ble den lengste segmenter som finnes i den første rekkefølge av arborization (38,38 + 1,45 um). Lignende mønster ble funnet for overflaten (111,98 + 3,93 kvadrat mikron) og volum (27,93 + 1,03 kubikk mikrometer). Den lineære korrelasjonen mellom lengden av segmenter og overflatearealet og / eller volumet som opptas av disse segmentene ble også testet. Både overflaten (p = 0,001, R2 = 0,873) og volumet (p = 0,001, R2 = 0,621) correlated betydelig med lengden av hvert segment dendrittisk.

Figur 1
Figur 1:. Her Fan diagram ble brukt til å vurdere den dendrittiske lengde dentate granule celler i hippocampus kan Denne visualiseringsverktøy brukes til å sammenligne effekten av ulike terapeutiske intervensjoner eller genotyper på dendrittiske lengde. Enheten for målingene er um.

Figur 2
Figur 2: Visualisering av dendrittiske arborization uten (A) og med EDFI (B) metoder. Den tradisjonelle metoden for å finne den beste fokusplanet ble sammenlignet med EDFI (data ikke vist) og funnet betydelig høyere verdier av dendrittiske område ved hjelp av EDFI metode (p = 0,02). Målestokk= 100 um.

Figur 3
Figur 3:. En høyoppløselig bilde av hippocampus regionen i en mus Denne ekstremt høy oppløsning automatisk konstruert fra sy 10 (4076 x 3116) -pixel bilder. Skalere bart = 100 mikrometer.

Figur 4
Fig. 4: Kvantifisering av lengden og volumet som opptas av dendritter i forskjellige ordrer av forgrening Den maksimale lengde og volum ble oppnådd i rekkefølgen 1.

Figur 5
Fig. 5: histogram av dendrittiske lengde dentate granule celler Flertallet av dendrittiske segmenter av DCX-farget dendritter var 13-26 i lengde. Den røde stiplede linjen viser normalfordeling av de presenterte data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her, to metoder ble beskrevet å kvantifisere omfanget av dendrittiske arborization i modne og nyfødte nerveceller ved hjelp av konvensjonelle fargemetoder i forbindelse med RTI og EDFI. Oppkjøpet av høyoppløselige bilder av nevroner gir en svært nyttig metode for å teste de skadelige effektene av nevrodegenerative lidelser og i sin tur gir et middel for å vurdere terapeutiske strategier som er rettet mot hippocampus nevroner.

Mens RTI metoden ble brukt til å fange grundige data knyttet til omfanget av arborization og topografi, mislykkes EDFI metode for å gi informasjon knyttet til kompleksiteten av individer segmenter eller trær. Ikke desto mindre, er fordelene ved den EDFI metoden ligger i det faktum at den ikke krever innkjøp av kostbart metall, og er mindre tidkrevende.

Et bildeanalyseprogram ble brukt til å utføre EDFI i videofiler. Å ha tilgang til høy oppløsning og raskkameraer tillater innsamling av et stort antall bilder i hele tykkelsen av hvert felt og frembringer bilder som virkelig representerer x-, y-, og z-dimensjoner. En av ulempene med EDFI fremgangsmåte vedrører det faktum at det kan være mer enn en piksel (samme x- og y) fokusert i forskjellige plan gjennom z-aksen. En metode er tenkt å tildele forskjellige farger til disse pikslene nøyaktig representerer omfanget av 3D-profiler i 2D-bilder. Det bør bemerkes at EDFI metoden kan også benyttes for analyse av cellulære profiler (f.eks synapser, microglia og astrocytter). Videre kan denne fremgangsmåten brukes til å analysere omfanget av microglial fordeling gjennom hele tykkelsen av en seksjon 7. De to metoder som er beskrevet her kan brukes på en komplementær måte. Mens RTI metoden gir kontinuerlig informasjon om topografi av forgreningsmønster, den EDFI gir oss en ganske enkel og rask metode for å vurdere densiteten av dendritter i et område av iinteressen. Spesielt, tykkelsen på seksjoner som kan erverves med EDFI er svært variabel som omfanget av z fokus på mikroskopet scenen i kombinasjon med optisk fokus av mikroskopet mål diktere grensene for EDFI.

Fremgangsmåtene beskrevet heri har potensial til å bli utplassert i flere sammenhenger. I denne studien forutsatt vi et middel til å vurdere endringer i dendrittiske arborization før og etter intervensjon, mens EDFI ble brukt til å kvantifisere microglial aktivering 7. Dermed er denne teknikken mottagelig for enhver applikasjon der det endelige målet er å vurdere endringer i små profiler som kan bli funnet i flere lag.

Endelig kan disse teknikkene vinne mangel på tilgang til svært høy oppløsning og dyre digitalkameraer. I hovedsak ble en metode vist på hvordan å fange seriebilder på ulike steder av steder innenfor et eksemplar og deretter sy dem sammen ved hjelp av et freeware, til slutt yielding bilder med høy oppløsning på en måte som er langt mer pålitelig og rask enn konvensjonelle metoder.

Kritiske trinn

Golgi farging

Foto mengder Golgi og utvikle løsninger er oppbevart ved 4 ° C for oppbevaring og ennå farging og inkubering protokoller krever løsningen som skal anvendes ved romtemperatur. Kjøling Golgi og utvikle løsninger på is eller i kjøleskapet negativt påvirker kvaliteten på dendrittiske flekker. Videre bør det legges merke til at vi brukte raskt voksende Golgi løsninger. Selv om den nøyaktige sammensetningen av Golgi-Cox-løsning anvendt i denne studien er proprietære, er det flere kilder som har lagret i detalj protokoll som kan brukes til å utføre Golgi-Cox farging 13. Imidlertid vil bruk av andre Golgi-løsninger vesentlig endre flekker varigheter og modifikasjoner for disse trinnene bør gjøres tilsvarende. Også vi sammen med andre har ossed 150 mikrometer tykke seksjoner å analysere DGC nevroner 14,15 som det er generelt enige om at å kutte deler av denne tykkelse coronally og parallelt med dentate granulat celle arborizations minimerer risikoen for å kutte dendrittiske grener.

DCX farging

DCX farging protokollen krever eksplisitt oppmerksomhet til temperatur. Unnlatelse av å oppvarme oppløsningen til 37 ° C i løpet av forinkuberingsperiode vil vesentlig svekke flekker og resultere i tap av dendrittiske visualisering. Videre er oppmerksomhet § tykkelse berettiget. I denne studien brukte vi 70 mikrometer tykke seksjoner for å fange opp den maksimale omfanget av DGCs dendrittiske arborization. Etter vår erfaring er bruken av 0,3% triton en nødvendighet som det i betydelig grad letter penetrering av antistoffet gjennom hele tykkelsen av de flytende seksjoner. Faktisk har tidligere studier brukt triton til å trenge 70 mikrometer tykk 16 eller enda tykkere (120 mikrometer) 17seksjoner når label DGC dendritter. Vennligst se Hussaini for alle detaljer om DCX farging 18.

Til slutt bør det nevnes at alternative åpen kildekode-programmer (f.eks flNeuronTool eller Simple_Neurite_Tracer) eksisterer med evnen til å registrere bevegelse av scenen i x-, y- og z-retningene. Slike programmer kan brukes til dendrittiske tracing, så lenge de er i stand til å kommunisere med skannetrinn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Publiserings avgifter for denne artikkelen er sponset av MBF Bioscience.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Modified Golgi-cox staining solution  Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x) Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
30% Sucrose, Sigma CAS # 57-50-1 make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin Sigma CAS # 9000-70-8 NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) Sigma CAS 603-003-00-5 NA
Xylene Sigma CAS # 1330-20-7 NA
DPX Medium EMS  #13510 NA
Superfrost (+) white Electron Microscopy Sciences 71869-10 NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) VWR  #4811-703 NA
DCX Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-8066 4 C
DAB Sigma CAS Number 91-95-2   -20
OCT Tissue-tek 4583 NA
Tris Sigma CAS Number 77-86-1   NA
ABC Lite Vector PK4000 NA
Microscope Nikon Eclipse 80i
Digital Camera Nikon DS-Ri1
12 bit Camera  QImaging  01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System MBF Bioscience V.10
Image Composite Editor Microsoft 1.4.4.0
NIS Elements Nikon F 3.0
Image Pro Plus Mediacy Versin 7.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22, (3), 383-388 (2012).
  2. Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587, (4), 727-729 (2009).
  3. Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. Synapses and Alzheimer’s disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. a005777 (2012).
  4. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
  5. Huttenlocher, P. R. Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms. Neurology. 24, (3), 203-210 (1974).
  6. Marin-Padilla, M. Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study. Brain Res. 38, (1), 1-12 (1972).
  7. Dang, V., et al. Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome. Biol Psychiatry. 75, (3), 179-188 (2014).
  8. Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study. Coll Antropol. 35, (Suppl 1), 25-30 (2011).
  9. Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10, (1), 32-46 (2010).
  10. Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis. Anat Rec. 296, (9), 1364-1382 (2013).
  11. Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis. Cell Mol Life Sci. 70, (12), 2045-2057 (2013).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).
  13. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
  14. Juraska, J. M. Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus. Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).
  15. Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus. PLoS One. 6, (9), e24566 (2011).
  16. Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche. J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).
  17. Merz, K., Lie, D. C. Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice. PLoS One. 8, (5), e62693 (2013).
  18. Hussaini, S. M., et al. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. (78), (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats