一种多检测试验为疟疾蚊子发射

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Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).

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Abstract

冈比亚按蚊种类复杂,包括主要的疟疾在非洲发射蚊子。由于这些品种都是这样的医疗重要性,一些特质的典型特点采用分子检测的流行病学研究提供帮助。这些特征包括物种鉴定,抗药性,寄生虫感染状态,和主机偏好。由于冈比亚按蚊复杂的群体在形态上没有区别,聚合酶链式反应(PCR)是传统上用于识别物种。一旦种是已知的,一些下游的测定是进行例行阐明进一步的特点。例如,在一对位基因被称为KDR突变赋予对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性。此外,酶联免疫测定(ELISA)或疟原虫寄生虫的DNA检测的PCR测定法是用于检测存在于蚊子组织寄生虫。最后,一​​个combinatioÑPCR和限制酶消化的可用于阐明宿主偏好( 例如 ,人类与动物的血液)通过筛选蚊子吸血寄宿特异性DNA。我们已经开发了在一个时刻将所有的上述分析成单个多重反应的基因分型33SNPs为96或384个样品的多检测分析(MDA)。因为MDA包括多个标记的物种, 疟原虫的检测,和主机血液鉴定,产生假阳性或阴性的可能性大大从以前的测定法,其中包括每性状只有一个标记降低。这个强大而简单的分析可以经济高效地在现有的实验的一小部分时间检测到这些关键的蚊子特点。

Introduction

阿拉伯按蚊,按蚊coluzzii冈比亚按蚊负责非洲1疟疾传播的主要媒介。这三种物种在形态区分2,并且只能通过分子测定法3-9进行区分。此外,还有许多下游实验经常进行,以帮助流行病学和群体遗传学的研究。这些包括(1)为形态岛屿10-12基因分型测定法中,(2)一种基因分型测定法识别在1014的非同义的SNP 基因的氨基酸的密码子的位置( 击倒抗性KDR,SNP)13 -18,(3)的寄生虫检测的PCR 19-23,和(4)筛选在蚊子中肠24,25宿主特异的DNA。

我们开发了将所有这些测定与一个目标的单个多重反应的多检测分析(MDA)的alyzing在非洲疟疾向量的流行病学重要特征。 MDA的测定法包括:多个标记,用于检测(1)种(A.阿拉伯按蚊,冈比亚按蚊,A coluzzii,或其它(所有的3)的),(2)杀虫剂中KDR的SNP表示电阻(两者L1014F 和L1014S) ,(3)存在的两个主要的疟原虫,恶性疟原虫P.间日疟原虫 ,和(4)从一禽和六个哺乳动物宿主血液来源。

传统上,这些测定法在分开的聚合酶链式反应进行的。当使用常规PCR平台完成所有这些测定中,它需要进行8-10 PCR反应检测和伴随凝胶电泳步骤。从准备每个PCR反应,记录结果需要4-5小时,而MDA方法,这里介绍需要大约5小时的总和。这相当于节省了单独的劳动力成本的90%。在MDA这里介绍的价格为5美元每个样品基因型的所有33个SNP。这是相当便宜比单琼脂糖凝胶为基础的分析,其中的成本约为1.50美元样本。测定法检测所涵盖的所有的MDA的特性将需要至少8-10分开琼脂糖凝胶为基础的测定以$ 12-15每一个样品的成本。此外,MDA的大大减少产生假阳性或阴性通过利用至少三个标记为每个寄生虫或主机的源检测的机会。

我们所使用的平台不限于疟疾的载 ​​体,但可以在各种各样的应用,如医药,兽药和基础生物学26-28中使用。深入涉及的样品大(为了100S)的数量关联研究或群体遗传学研究需要经济高效的检测筛选同时为多个标记。利用两个或更多个单独的PCR测定大多数研究可以实现MDA的用于以较低的成本更快的结果。

Protocol

1. PCR扩增

  1. 混合所有的PCR引物(见补充表S1)的1.5ml离心管。每个SNP具有两个引物(正向和反向)。确保原料浓度每种PCR引物被保持在100微米。使足够引物混合物为500-1000的反应,以减少在工作台上移液误差和时间(参见补充表S2)。如果需要的话,制备等分试样,每管并储存100-200反应在-20℃。
  2. 制备的PCR鸡尾酒如生产商的方案(表1)中所描述。 96反应的体积包括20%的突出端。涡包含PCR鸡尾酒轻轻离心30秒,2000×g的管子。
  3. 分配3微升的PCR鸡尾酒成的每个孔中的非裙边96孔板中。中继器吸管可以节省时间,这个过程中。
  4. 添加2微升的蚊子的适当的基因组DNA中的每个孔中。
    注:获得从米的基因组DNA的方法 osquito组织(头部/胸部,腹部或全身),在其他文献29-32描述。选择一个合适的DNA提取方法来区分那些与疟原虫在血液(腹部)从受感染蚊子( 疟原虫的头部/胸部)。我们通常使用DNA从蚊子的身体部位(头部/胸部或腹部)中提取,因此从0.05-2ng /μl的DNA浓度变化。虽然总的DNA输入比制造商的建议(5-10ng / RXN)下,我们通常得自98%的DNA样本的没有全基因组扩增的SNP健壮呼叫。
  5. 封板,轻轻拌匀或涡流,并在370×g的1分钟离心机。
  6. 使用以下热循环协议来进行PCR扩增:(1)94℃2分钟,(2)94℃,30秒,(3)56℃,30秒,(4)72℃,1分钟,(5)重复步骤(2) - (4)45个循环,(6)72℃,1分钟,4℃保持。
_title“> 2。SAP治疗

  1. 准备在96孔板在SAP酶溶液(见表2)。处理在一个板96个样品。 96反应的体积包括20%的突出端。
  2. 涡SAP酶液轻轻离心管30秒,2000×g的。分配2微升的SAP酶溶液加入到每个孔中。再次,一个转发器移液管,可以节省时间用于此过程。
  3. 封板,轻轻拌匀或涡流,并在370×g的1分钟离心机。孵育板如下:(1)37℃下40分钟,(2)85℃下进行5分钟,以使酶失活,(3)4℃保持。在该步骤完成后,在-20存储板℃下再继续。 2个星期内处理存储的板块。

3. SNP扩展

  1. 如果样品板的SAP处理后冷冻,允许它继续之前解冻至室温。
  2. 制备所述延伸引物混合物(补充表S2)。每个SNP有一个EXTEnsion底漆。保持股票集中每个延伸引物在500微米。任选地,对等分试样每管并储存100-200反应在-20℃。
  3. 如表3中96的反应体积,包括20%的悬垂描述制备延伸组合。
  4. 涡延伸鸡尾酒轻轻离心管30秒,2000×g的。分配2微升的延伸鸡尾酒到每个孔中。再次,一个转发器移液管,可以节省时间用于此过程。
  5. 封板,轻轻拌匀或涡流,并在370×g的1分钟离心机。热循环, 如图1中的板。在这一点上,进行质谱法或板储存在-20℃达2周。

4.空调的SNP扩展产品优化质谱分析

  1. 如果样品板SNP后延冻结,允许它继续之前解冻到室温。
  2. 从CONTA转移树脂为15mg核能研究所使用上的长勺酒窝板。使用刮刀蔓延树脂进入凹坑板的孔中。从一边扫刮板跨越酒窝板到另一边蔓延树脂。确保有树脂每口井。
  3. 刮去多余的树脂脱使用刮板酒窝板。让树脂站在凹坑板为至少20分钟。同时让树脂站在凹坑板中,添加41微升的HPLC级水到样品板的各孔中。
  4. 轻轻将样品板倒置,到酒窝板。确保样品板复位靠在凹坑板的小圆形交,该对齐的孔中的样品板与孔中的凹坑板。
  5. 保持样品板和凹坑板一起,轻轻翻转它们在这样的树脂脱落凹坑板的进入样品板的孔中。点击酒窝板,使树脂脱落到样品板。确保所有的树脂在迪mple板脱落到样品板的孔中。离心板在3200 XG为30秒。
  6. 旋转旋转器上的样品板5分钟,在室温。旋转器必须旋转样品板约长轴360°。
  7. 离心样品板在3200×g离心5分钟。此步骤之后,进行到下一步骤之前,长达2周存储的样品板在-20℃下。

5. MALDI-TOF质谱

  1. 转移条件的SNP延伸产物到生物芯片诸如SpectroCHIP按照制造商的说明。我们使用MassArray纳米分配器用于此步骤。
  2. 一旦转移完成,确定测定法和板如何被设置在测定数据库中。命名法和板使得每个板块都有唯一的标识符,链接到特定的试验设计(参考表三)。
  3. 法和板已被定义后,获取利用质谱仪光谱。

  1. 使用实时PCR分析数据解释软件,如打字员分析器或TyperViewer(Sequenom公司)进行数据分析。在包含样本的布局,质谱图每个井.xml格式获得的数据,该标记信息包括名称,用于对应的SNP的每种变体预期质量,并且任何错误或与每个反应相关的警告消息。参见图2所产生的质谱图。
  2. 由该检测阈值设定(幅度或信噪比),并允许每个基因型公差/方差进行的SNP基因型的聚类分析。 图3示出了04707-KDR#2的SNP基因型簇的例子。
  3. 导出所得的SNP基因型的呼叫到电子表格程序。

Representative Results

物种鉴定:

以下5个SNP一起识别3种(A.阿拉伯按蚊,A coluzzii冈比亚按蚊 )( 见表4)。如果样品是不是3种之一,三个单核苷酸多态性(01073-213,04679-157和10313 -052)无法放大。

KDR基因型推断抗药性:

对位电压-门控钠通道的1014 密码子对应于KDR。两个单核苷酸多态性的1014 密码子的 2 和第3 底座确定的三个可能的氨基酸。 。基因型的可能的组合如表5本SNP工程三个品种的非洲疟疾媒介:A.阿拉伯按蚊,A. coluzziiA.冈比亚这些 SNP位点未能在A.放大darlingi,巴西疟蚊。这是不奇怪,因为A之间线粒体基因组序列相似性darlingiA.冈比亚只有88.9%,而在三个非洲疟疾病媒线粒体基因组序列相似性超过98%。其他品种没有经过测试。我们成功地放大,从收集到马里,喀麦隆,坦桑尼亚和赞比亚的样本。

疟原虫检测:

如果完整疟原虫的DNA存在于蚊子的组织,我们希望发现P.恶性P.从蚊子中提取的DNA样品中间日疟原虫特异性DNA。种特定的SNP是从123 P.的色素b序列的序列比对鉴定疟原虫 ,97 P.间日疟原虫 ,11 P.疟原虫和18 P.未闭隔离来自非洲的序列可在基因库。我们设计了独特的生产SNP基因型分辨P. 6个SNP 恶性P.六 VAX从其他疟原虫种( 表6)。我们已经测试了此法对收集到马里,喀麦隆,坦桑尼亚,赞比亚和巴西的蚊子样本,确认这组特定标记的作品,无论蚊种。

吸血PCR检测:

从7宿主物种(人类,鸡,牛,狗,羊,猪,羊等)的细胞色素b基因序列,从基因库收集,并产生一致序列。单核苷酸多态性信息为每个主机然后选择进行基因分型。我们与来自7个不同的动物( 表7)血源测试 ​​这一点。

由于PCR片段很短(80-120基点),该工程有所下降DNA或蚊子组织对部分消化bloodmeals。假阳性呼叫的概率在很大程度上受具有每主机类型多个标记降低。

的“> 图1
对于SNP ​​拓步图1.热循环程序。扩增周期共200(5x40)。

图2
图2.大众频谱的MDA,X轴是SNP延伸产品质量(DA)和Y轴的信号强度。红色线表示的非法人延伸引物的预期质量,SNP等位基因1和等位基因2所选择的标记。灰线表示预计在MDA等质量标志。该图是从第5步后的输出数据文件的数据分析软件(打字员分析器或打字员浏览器)产生的。 请点击此处查看该图的放大版本。

E =“总是”> 图3
图3.个体的SNP基因型簇视图 X轴是反正切值(标记为“角度”)的SNP等位基因1和SNP等位基因2的信号强度的Y轴是基因型呼叫信号的幅度。此图是在数据分析软件(打字员分析器或打字员浏览器)提供。任何特定的数据,可以选择与一个鼠标按钮点击和选定的样本数据由圆圈表示。在软件簇提供聚类分析基因型与用户定义的阈值的方差,并自动颜色双等位基因SNP的基因型。这里显示的例子表明纯合子T(TT)的个体为蓝色三角形,杂合子(TA)绿色广场和纯合子A(AA)的个体橙色倒三角形。红色圆圈表示没有呼​​叫(无放大)。T =“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。

试剂 于5μl浓度 音量 音量
(1 RXN) (96 rxns)
水(HPLC级) NA 0.8微升 92.2微升
10X PCR缓冲液20 mM的氯化镁 1个(2毫米氯化镁) 0.5微升 57.6微升
氯化镁(25毫米)** 2毫米 0.4微升 46.​​1微升
dNTP混合物(每25毫米)*** 500μM 0.1微升 11.5微升
引物混合物(各500纳米) 100纳米 1.0微升 115.2微升
PCR酶(5 U /微升) 1.0 U / RXN 0.2微升 23.0微升
总体积: 3.0微升 345.6微升

表1多重PCR鸡尾酒配方。每种试剂为一种反应和96的反应以20%的悬垂的PCR扩展步骤的体积。

总成交量
试剂 卷(1 RXN) 体积(96 RXN)
水(HPLC级) 1.53微升 176.3微升
SAP缓冲区(10X) 0.17微升 19.6微升
SAP酶(1.7 U /微升) 0.30微升 34.6微升
2.00微升 230.4微升

表2的SAP酶液。各试剂的虾碱性磷酸酶处理1反应和96的反应以20%的悬垂的体积。

试剂 浓。在9微升 体积(1rxn) 体积(96 rxns)
水(HPLC级) NA 0.6190微升 71.3微升
IPLEX缓冲加(10X) 0.222x 0.2000微升 23.0微升
IPLEX终止组合 1X 0.2000微升 23.0微升
延伸引物混合物 0.9400微升 108。3微升
IPLEX酶 1X 0.0410微升 4.7微升
总成交量 2.0000微升 230.4微升

表3的SNP扩展鸡尾酒各试剂为一种反应和96的反应以20%的悬垂的SNP延伸步骤的体积。

表4
表4的SNP的基因型对于每个物种。28S IGS-540,28S IGS-649和01073-213位于X染色体上,04679-157是2号染色体和10313-052是在染色体3.混合基因型(杂合子)以黄色突出显示。在A.固定变种coluzzii标记浅蓝色和固定在变体A.冈比亚被标记在黑暗蓝色。

表5
表5. SNP基因型KDR两个单核苷酸多态性KDR#1和#KDR 2构成基因型段基因的1014 密码子。第一基底不变,因此不包括在测定中。易感基因型的纯合子被标记为蓝色。最耐L10​​14F纯合子基因型被标记为深蓝色。黄色表示杂合子。的L1014 S,中等抗性基因型中,示出在橙色。

表6
表6. SNP基因型为P.疟原虫P.间日疟原虫 >。共计6个SNP被用来确定疟疾寄生虫的存在。 PL-0041,PL-1269和PI-1549包含P.恶性特定等位基因(G,T和T分别)。三个等位基因的同步放大显示相对完整P.存在疟原虫的DNA样本DNA。替代等位基因(一种PL-0041和PI-1269)放大表示其他疟原虫物种( 间日疟原虫,卵形疟原虫疟原虫 )在样品中的存在。 PF-1549位于地区更多的P.恶性具体侧翼区因此该SNP只放大时P.疟原虫存在。 PL-0071,PL-1245和PI-0157包含P.间日疟原虫特定的等位基因(G,G和T分别)。替代等位基因(A,分别为A和C)放大表示的其他疟原虫的DNA样品中的存在。未感染的蚊子会对所有6个指标没有放大。 表7
表7. SNP基因型7主机:人类,鸡,牛,狗,羊,猪和羊 “NC”代表“不来电”(无放大),如下表所示。需要注意的是,可能会出现一些位点的一些非特异性扩增,而不是某个特定主机的所有单核苷酸多态性。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

该MDA是由五个主要步骤:PCR扩增,虾碱性磷酸酶(SAP)的反应,SNP延伸,延伸产品的调理和基质辅助激光解吸/电离-飞行(MALDI-TOF)质谱33-37的时间。第一次PCR扩增步骤扩增的DNA的侧翼每个SNP,使得足够的模板DNA将是可利用的SNP的延伸步骤。在SAP反应中和未使用的dNTP其可以用下面的SNP延伸步骤干涉。 SNP扩展涉及每个​​SNP位点和大众修饰的核苷酸终止一个延伸引物。 3'-末端修饰的核苷酸防止随后的核苷酸被掺入到延伸引物。因此,单个碱基的质量表示对应的SNP的基因型。

在确保这种方法的成功的最关键的步骤是具有现有多态性的靶生物的好数据集秒。我们使用特点以及单核苷酸多态性的物种鉴定(N> 900)10,12,38-40KDR(N> 1000)15,18。疟原虫种特异性的SNP从123 P.细胞色素b基因序列的序列比对鉴定疟原虫 ,97 P.间日疟原虫 ,11 P.疟原虫和18 P.未闭隔离来自非洲的序列,其可用的基因库。从7宿主物种(人类,鸡,牛,狗,羊,猪,羊等)的细胞色素b基因序列,从基因库收集的主机特定SNP鉴定。在此基础上庞大的身躯序列数据,我们能够设计出使用实验设计软件强大的诊断检测。

标记每个反应可容纳的数目由下式给出一个耐受引物二聚体电位(0-1刻度0.9)的引物混合物的生化兼容性确定。作者使用的默认值(1;最严格的)的错误引发的潜力。 ř该参数的elaxation可以潜在地增加可测定在单一反应除了包括在此研究中的SNP的SNP的数目。

PCR扩增步骤是健壮和通常不需要从最初的分析设计调整。 SNP位扩展混合物( 表3),然而,可能需要修改用质谱各引物的相对量,以确保有足够的信噪比是可以实现的每种引物。所提供的SNP延伸引物的配方是这些调整的结果。间延伸的引物的相容性可能会限制SNP的总​​数,可以在一个单一的反应是多路复用。由于反应体积是小的(5-8微升),该样品板需要被适当地密封,以防止在扩增步骤的蒸发。

这个平台可以同时得分高达每反应35个SNP,而其他SNP基因分型平台可以accommodatE的千个SNP每反应41。随着基因组测序技术的进步,人们可以获取数百万采用新一代测序29,42,43的SNP。然而,这里使用的技术提供了用于需要基因分型一个相对小数目的标记为许多(100S-1000个)的个体研究的理想的应用程序。的不同SNP基因分型平台的设计约束附加讨论是覆盖在以前的研究中41。

在MDA的目的是疟疾特征向量的流行病学重要性状,并提供了一​​个理想的协议中通量SNP基因分型检测分析数以千计的自然种群收集到的蚊子。 MDA的介绍这里提供了(1)以上的劳动时间减少90%,(2)一种降低试剂成本的60%,和(3)的减少假阳性/阴性利用多个标记。所提出的分析可以增强通过流行病学研究大大促进数据收集。此外,它可以通过表征蚊子样本相对于人口的起源,抗药性,易患寄生虫与宿主的选择完善的全基因组关联研究。最后,MDA可以提供灵感和设计使用MALDI-TOF基于SNP基因分型平台等多重分析的模板。

Acknowledgments

我们感谢博士。安东尼山茱萸和劳拉·诺里斯在加州大学戴维斯分校和卡塔琳娜Kreppel博士在格拉斯哥大学从坦桑尼亚提供蚊子标本。我们感谢Smita达斯女士和道格拉斯·诺里斯博士公共卫生约翰霍普金斯学院分享蚊虫样本赞比亚。我们也感谢李五米永先生在兽医遗传学实验室对实验设计培训。这项工作是支持由美国国立卫生研究院授予R01AI 078183和R21AI062929。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.

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