マラリア蚊。送信のためのマルチ検出分析

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Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).

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Abstract

ハマダラカ種複合体は、アフリカの蚊を送信する主要なマラリアが含まれています。これらの種は、そのような医学的に重要であるので、いくつかの特徴は、典型的には、疫学的研究を支援するために、分子アッセイを使用して特徴づけられる。これらの特性は、種の同定、殺虫剤抵抗、寄生虫感染状況、およびホストの好みが含まれています。 ハマダラカ複合体集団は、形態学的に区別できないので、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、伝統的に種を識別するために使用される。種が分かると、いくつかの下流のアッセイは、日常的にさらなる特性を解明するために行われる。例えば、パラ遺伝子におけるKDRとしても知られている突然変異は、DDTおよびピレスロイド殺虫剤に対する耐性を付与する。さらに、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)またはマラリア原虫DNAの検出PCRアッセイは、蚊の組織に存在する寄生虫を検出するために使用される。最後に、combinatioPCRおよび制限酵素消化物のnは、ホスト固有のDNAのための蚊吸血をスクリーニングすることによって、ホスト·プ(動物の血液対例えば 、ヒト)を解明するために使用することができる。私たちは、一度に96または384のサンプルについて、単一の多重反応ジェノタイピング33SNPsに上記アッセイの全てを兼ね備えたマルチ検出アッセイ(MDA)を開発した。 MDAは、種、 プラスモディウム検出、およびホスト血液を識別するための複数のマーカーが含まれているので、偽陽性または陰性の発生の可能性が大幅に形質ごとに1つのマーカーを含む、前のアッセイから減少する。この堅牢でシンプルなアッセイは、コスト効率と既存のアッセイの時間の割合は、これらの重要な蚊の特性を検出することができます。

Introduction

ハマダラカarabiensis、ハマダラカcoluzziiハマダラカは、アフリカ1におけるマラリア伝送に関与する主要なベクトルです。これら3種は2形態学的に区別できないとだけ分子アッセイ3-9で区別することができます。また、日常的疫学的および集団遺伝学研究を支援するために行われ、多くの下流のアッセイが存在する。これらには、(1)分化アイランド10-12のための遺伝子型決定アッセイを、 パラ遺伝子のアミノ酸コドン位置番目 1014で非同義SNPを認識する(2)遺伝子型決定アッセイ( ノックダウン抵抗 、又はkdrの 、SNP)13含む-18、(3)寄生虫の検出PCR 19-23、及び(4)蚊の中腸24,25にホスト固有のDNAをスクリーニングする。

私たちは、の目標を持つ単一の多重反応にすべてのこれらのアッセイを組み合わせたマルチ検出アッセイ(MDA)を開発アフリカのマラリアベクトルの疫学的に重要な特性をalyzing。 MDAアッセイは、(1)種を検出するための複数のマーカー(A.のarabiensis、A.のハマダラカ、A.のcoluzzii、または3つの他の(なし))kdrの SNPの中で示される、(2)殺虫剤抵抗性(L1014F とL1014S両方を含む二つの主要なマラリア原虫の、(3)存在下、熱帯熱マラリア原虫およびP.三日熱マラリア原虫 、一鳥類六哺乳類宿主から(4)血液源。

伝統的に、これらのアッセイは、別個のポリメラーゼ連鎖反応を行った。すべてのこれらのアッセイは、従来のPCRプラットフォームを使用して行われている場合には、8-10 PCR反応アッセイを実施し、ゲル電気泳動工程を伴う必要があります。ここで紹介するMDA法は全体で約5時間かかりますしながら、文書化の結果への準備から、個々のPCR反応は、4-5時間かかります。これだけで人件費の90%の節約と等価である。 MDAはここで紹介する5ドルの費用すべての33のSNPの遺伝子型を決定するためにサンプルあたり。これはサンプルあたり約1.50ドルのコスト、これシングルアガロースゲルベースアッセイよりもかなり安価である。 MDAがカバーするすべての特性を検出するアッセイは、サンプルあたり$ 12〜15の費用で8-10別々のアガロースゲルに基づくアッセイの最小値を必要とするであろう。また、MDAは大幅に各寄生虫またはホストソースを検出するための少なくとも3つのマーカーを利用することにより、偽陽性または陰性のを発生させる可能性を低減します。

我々が利用プラットフォームはマラリアベクトルに限定されるものではなく、医学、獣医学、および基本的な生物学26-28など、多種多様な用途で使用することができる。深い関連研究または集団遺伝学サンプル(数百程度)を多数同時に複数のマーカーのための費用対効果のアッセイスクリーニングが必要含む研究。 2つ以上の別々のPCRアッセイを利用するほとんどの研究は、低コストで迅速な結果を得るために、MDAを実装することができます。

Protocol

1. PCR増幅

  1. 1.5ミリリットルのマイクロチューブに(補足表S1を参照してください)​​すべてのPCRプライマーを混ぜる。各SNPは、2つのプライマー(順方向および逆方向)を有している。各PCRプライマーのストック濃度を100μmに保たれていることを確認します。 (補足表S2を参照してください)​​ベンチでのピペッティング誤差と時間を削減するために500〜1,000の反応のための十分なプライマーミックスを作成します。必要に応じて、-20℃でチューブや店舗あたり100〜200の反応のためのアリコートを準備します。
  2. 製造業者のプロトコル(表1)で説明したようにPCRカクテルを準備します。 96の反応のためのボリュームは、20パーセントのオーバーハングが含まれています。渦2000×gで30秒間のPCRカクテル軽く遠心を含むチューブ。
  3. 非スカート96ウェルプレートの各ウェルにPCRカクテルの3μLを分注する。リピーターピペットは、このプロセスのための時間を節約することができる。
  4. 各ウェルに蚊の適切なゲノムDNAの2を添加する。
    注記:メートルからゲノムDNAを得る工程 osquito組織(頭部/胸部、腹部または全身)は、他の文献29-32に記載されている。感染蚊(頭部/胸部におけるマラリア原虫 )から血液(腹部)でマラリア原虫を持つものを区別するための適切なDNA抽出プロトコルを選択します。私たちは、一般的に蚊のボディパーツ(頭部/胸部または腹部)から抽出したDNAを使用するため、DNA濃度は0.05-2ng /μLごとに異なります。トータルDNA入力が製造者の推奨(5-10ng / rxnの)未満であるが、ここでは一般的に堅固なSNPは、全ゲノム増幅なしでDNAサンプルの98%か​​ら呼び出し得る。
  5. プレートをシール、穏やかに混合またはボルテックスし、370×gで1分間遠心する。
  6. PCR増幅を行うために、以下のサーモサイクラープロトコルを使用して:(1)94℃で2分間、(2)94℃30秒間、(3)56℃で30秒間、(4)72℃で1分間(5)繰り返し工程(2) - (4)45サイクルについて、(6)1分、4℃保持72℃。
_title "> 2。SAPトリートメント

  1. 96ウェルプレート中のSAP酵素溶液を調製した(表2参照)。プレート内の96サンプルを処理する。 96の反応のためのボリュームは、20パーセントのオーバーハングが含まれています。
  2. ボルテックス軽くSAP酵素溶液のチューブと2000 X gで30秒間遠心する。各ウェルに、SAP酵素溶液2μlを分注する。ここでも、リピーターピペットは、このプロセスのための時間を節約することができます。
  3. プレートをシール、穏やかに混合またはボルテックスし、370×gで1分間遠心する。 (1)37℃で40分間酵素を失活させ、5分間(2)85℃、(3)4℃の保持:次のようにプレートをインキュベートする。このステップが完了すると、続行する前に-20℃でプレートを保存する。 2週間内に格納されているプレートを処理します。

3. SNP拡張

  1. サンプルプレートは、SAP処理後に凍結している場合、それは続行する前に室温に解凍することを可能にする。
  2. エクステンションプライマーミックス(補足表S2)を準備します。各SNPは1エクステを持ってnsionプライマー。 500μMの各伸長プライマーのストック濃度にしてください。必要に応じて、-20℃でチューブや店舗あたり100〜200の反応のためのアリコート。
  3. 96反応容量が20%のオーバーハングを含み、表3に記載されているように拡張ミックスを調製する。
  4. ボルテックス軽く延長カクテルのチューブと2000×gで30秒間遠心する。各ウェルに延長カクテル2μLを分注する。ここでも、リピーターピペットは、このプロセスのための時間を節約することができます。
  5. プレートをシール、穏やかに混合またはボルテックスし、370×gで1分間遠心する。 図1に示すように、プレート熱サイクル。この時点で、質量分析に進むか、または2週間Cまで-20℃でプレートを格納する。

質量分析を最適化するため4.エアコンSNP拡張製品

  1. サンプルプレートは、SNPの拡張後に冷凍される場合は、続行する前に室温に解凍することを可能にする。
  2. そのコンタから樹脂の15mgのを転送細長いスプーンを使用したディンプルプレートにINER。ディンプルプレートのウェル内に樹脂を広めるためにスクレーパーを使用してください。樹脂を広めるためにディンプルプレート間で左右にスクレーパーをスイープ。樹脂は、各ウェルに存在していることを確認します。
  3. スクレーパーを使用してディンプルプレートから余分な樹脂をこすり。樹脂は、少なくとも20分間、ディンプル板に放置。樹脂せながらディンプル板に立って、サンプルプレートの各ウェルにHPLC等級の水41μlを添加する。
  4. 静かにディンプルプレートに、サンプルプレート逆さまに置きます。ディンプルプレートのウェルを有するサンプルプレートのウェルを整列ディンプルプレートの小さな丸みを帯びた後、に対してサンプルプレートのリセットを確認してください。
  5. 樹脂は、サンプルプレートのウェルにディンプル板から外れるようにして裏返して優しく、一緒にサンプルプレートとディンプル板を保持する。樹脂がサンプルプレートに出て落ちるようにディンプルプレートをタップします。ディ内のすべての樹脂を確認してくださいmpleプレートは試料プレートのウェルに抜け落ちる。 30秒間3200×gでプレートを遠心。
  6. RTで5分間回転器上のサンプルプレートを回転させます。回転子は、サンプルプレートの長軸約360°回転しなければならない。
  7. 5分間3200×gでサンプルプレートを遠心します。このステップの後、次のステップに進む前に、最大2週間まで-20℃でのサンプルプレートを保存する。

5. MALDI-TOF質量分析

  1. 製造業者の指示に従ってなどSpectroCHIPとしてバイオアレイ上にエアコンのSNP伸長産物を転送します。我々は、このステップのためMASSARRAYナノディスペンサーを使用しています。
  2. 転送が完了した後、アッセイプレートをアッセイデータベースに設定される方法を定義する。各プレートは、特定のアッセイデザイン(補足表S3)にリンクする一意の識別子を有するように、アッセイプレートに名前を付けます。
  3. アッセイプレートを定義した後、質量分析計を用いてスペクトルを取得する。

  1. そのようなタイパーアナライザやTyperViewer(シーケノム)などのリアルタイムPCR解析データ解釈ソフトウェアを使用してデータ分析を実行。サンプルレイアウトを含む.xml形式のデータを、各ウェルについての質量スペクトログラム、名を含むマーカー情報、対応するSNPの各バリアント、およびそれぞれの反応に関連するすべてのエラーや警告のメッセージのマスを取得します。得られる質量スペクトル写真については、図2を参照してください。
  2. 検出閾値(対雑音比の大きさまたは信号)と、各遺伝子型に対して許可耐性/分散を設定することにより、SNP遺伝子型クラスタリング解析を行う。 図3は、04707-KDR位例2 SNP遺伝子型クラスターを示す。
  3. 表計算プログラムに生じたSNPの遺伝子型コールをエクスポートします。

Representative Results

種の同定:

サンプルは3種の一つではない場合は、次の5個のSNPは、一緒に、3個のSNP(01073から213、04679から157と10313の3種(A.のarabiensis、AをcoluzziiとA.ハマダラカ )( 4)。識別する-052)を増幅することができない。

殺虫剤抵抗性を推測するためのKDR遺伝子型:

パラ電位依存性ナトリウムチャネルの1014 番目のコドン、KDRに対応している。 1014 番目のコドン 2 および第 3ベース上の2つのSNPは、3つの可能なアミノ酸を決定する。遺伝子型の可能な組み合わせを表5に記載されています。このSNPはアフリカのマラリアベクトルの3種のために働く:。A. arabiensis、のA. coluzziiA.ハマダラカ。これらのSNPは、Aに増幅するために失敗するdarlingi、ブラジルのマラリアベクトル。これではありませんA.間のミトコンドリアゲノム配列類似ことを考えると驚くべきdarlingiA. 3アフリカマラリアベクトルのうち、ミトコンドリアゲノムの配列類似性は98%を超えている一方ハマダラカは 88.9%である。他の種は、テストされていません。私たちは、マリ、カメルーン、タンザニア、ザンビアで収集したサンプルからの増幅に成功した。

マラリア原虫検出:

無傷原虫 DNA蚊組織中に存在する場合、我々は、Pを検出することを期待熱帯熱またはP.蚊から抽出したDNA試料のうち、 三日熱マラリア特異的DNA。種特異的SNPは、123 Pのシトクロムbの配列の配列アラインメントから同定された熱帯熱マラリア 、97 P.三日熱マラリア 、11 P.マラリアと18 P.卵円ジェンバンクで利用可能なアフリカからの配列を単離する。私たちは、Pを区別するためにユニークなSNPの遺伝子型を生産する6個のSNPを設計しました熱帯熱またはP.六 vaxの他のマラリア原虫種から( 表6)。私たちは、マリ、カメルーン、タンザニア、ザンビア、ブラジルに集め蚊サンプルにこのアッセイをテストし、マーカーのこの特定のセットに関係なく、蚊種の動作する​​ことを確認した。

吸血検出PCR:

7宿主種(ヒト、ニワトリ、ウシ、イヌ、ヤギ、ブタおよびヒツジ)からのシトクロムbの配列は、Genbankから回収し、コンセンサス配列を生成した。各ホストの有益なSNPはその後ジェノタイピングのために選択した。私たちは、7種類の動物( 表7)からの血液源でこれをテストした。

PCR断片(80〜120 bp)のショートであるため、これは多少劣化したDNAまたは蚊組織から上の部分的に消化bloodmealsをオンに動作します。偽陽性の呼び出しの確率が大幅にホストのタイプごとに複数のマーカーを持っていることによって削減される。

S "> 図1
SNPの伸長工程のために、図1サーモサイクラープログラムは、増幅サイクルは、200(5x40)の合計である。

図2
MDA図2.マススペクトログラムは、X軸は、SNPの伸長産物の質量(Da)であり、Y軸は信号強度である。レッドラインは、選択されたマーカーのために取り込まれなかった伸長プライマー、SNP対立遺伝子1および対立遺伝子2の予想される質量を示している。灰色の線は、MDAにおける他のマーカーの期待質量を示している。このプロットは、ステップ5の後に出力データファイルからのデータ解析ソフトウェア(タイパーアナライザまたはタイパービューア)から生成されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

E = "常に"> 図3
図3.個々のSNP遺伝子型クラスタは、X軸を表示する SNP対立遺伝子1の信号強度の(「角度」と表記)の逆正接値であり、Y軸の2 SNP対立遺伝子は、遺伝子型の呼び出し信号の大きさである。このプロットは、データ解析ソフトウェア(タイパーアナライザまたはタイパービューア)が設けられている。任意の特定のデータは、マウスボタンをクリックするだけで選択することができ、選択されたサンプルデータは円で示されている。ソフトウェアクラスタユーザ定義分散閾値と遺伝子型と自動的に色対立遺伝子のSNPの3つの遺伝子型に設けられたクラスタリング解析。ここに示した例では、緑の正方形とオレンジの逆三角形のようなホモ接合A(AA)個人としてのヘテロ接合体(TA)、青の三角形としてホモ接合T(TT)個人を示している。レッド円はなしコール(増幅なし)を表していない。T = "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

試薬 5μlの濃度 ボリューム ボリューム
(1 RXN) (96 rxns)
水(HPLCグレード) NA 0.8μL 92.2μL
20のMgCl 2と10倍のPCRバッファー 1X(2のMgCl 2) 0.5μL 57.6μL
のMgCl 2(25 mM)の** 2 mMの 0.4μL 46.​​1μL
dNTPミックス(25 mMのそれぞれ)*** 500μM 0.1μL 11.5μL
プライマーミックス(500 nMの各) 100 nMの 1.0μL 115.2μL
PCR酵素(5 U /μL) 1.0 U / RXN 0.2μL 23.0μL
総容積: 3.0μL 345.6μL

表1.マルチプレックスPCRカクテルレシピ一反応と20%のオーバーハングを有する96の反応のためのPCR伸長工程のために、各試薬の量。

全容積
試薬 巻(1 RXN) ボリューム(96 RXN)
水(HPLCグレード) 1.53μL 176.3μL
SAPバッファ(10倍) 0.17μL 19.6μL
SAP酵素(1.7 U /μL) 0.30μL 34.6μL
2.00μL 230.4μL

表2. SAP酵素溶液。つの反応と、20%のオーバーハングを持つ96の反応のためのエビアルカリホスファターゼ処理のための各試薬の量。

試薬 コンク。 9μlの ボリューム(1rxn) ボリューム(96 rxns)
水(HPLCグレード) NA 0.6190μL 71.3μL
のiPLEXバッファープラス(10倍) 0.222x 0.2000μL 23.0μL
のiPLEXターミネーションミックス 1X 0.2000μL 23.0μL
エクステンションプライマーミックス 0.9400μL 108。3μL
のiPLEX酵素 1X 0.0410μL 4.7μL
全容積 2.0000μL 230.4μL

表3. SNP拡張カクテルつの反応と20%オーバーハングを有する96の反応のためのSNPの伸長工程のために、各試薬の量。

表4
それぞれの種のために、表4のSNPの遺伝子型。28S IGS-540、28S IGS-649および01073-213 X染色体上に位置している、04679から157は第2染色体上にあり、10313から052染色体3.ハイブリッド遺伝子型にある(ヘテロ接合体)黄色で強調表示されます。 A.で修正されたバリアントcoluzziiはAの水色と固定バリアントにマークされているハマダラカは、暗闇の中でマークされている青。

表5
KDR表5. SNP遺伝子型。2つのSNP KDR#1、KDR#2パラ遺伝子のコドン番目の 1014年のための遺伝子型を構成している。最初のベースは不変であるので、それはアッセイに含まれていません。感受性ホモ接合遺伝子型は青色でマークされています。最も耐性L1014Fホモ接合体遺伝子型は濃い青色でマークされている。黄色はヘテロ接合体を示している。 L1014 S、中間抵抗性の遺伝子型は、オレンジ色で表示されます。

表6
P.表6. SNP遺伝子型熱帯熱マラリアP.三日熱 >。合計6個のSNPは、マラリア原虫の存在を決定するために使用される。 PL-0041、PL-1269とPL-1549は、Pが含まれている熱帯熱マラリア特定の対立遺伝子(それぞれG、TおよびT)。 3対立遺伝子の同時増幅は、比較的無傷のPの存在を示すサンプルDNA中の熱帯熱マラリア原虫 DNA。代替対立遺伝子(PL-0041とPL-1269用A)の増幅は、サンプル中の他のマラリア原虫種例えば三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫またはP.マラリア )の存在を示す。 PF-1549は、より多くのPと地域に位置していますしたがって、このSNPを隣接領域熱帯熱特定の場合にのみPを増幅され、 熱帯熱マラリアが存在する。 PL-0071、PL-1245とPL-0157は、Pが含まれている三日熱マラリア原虫特定の対立遺伝子(それぞれG、GおよびT)。代替対立遺伝子(A、それぞれAおよびC)の増幅は、試料中の他のマラリア原虫 DNAの存在を示す。非感染蚊は、すべて6のマーカーには増幅がありません。 表7
7ホスト表7. SNP遺伝子型:ヒト、鶏、牛、犬、ヤギ、豚と羊 「NC」は以下の表の「いいえコール」(増幅なし)の略です。いくつかの非特異的増幅は、いくつかの遺伝子座ではなく、特定のホストのすべてのSNPについて発生する可能性があることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

飛行時間(MALDI-TOF)質量分析法33-37 - PCR増幅、エビアルカリホスファターゼ(SAP)反応、SNP拡張、伸長産物の調節、およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化:MDAは、5つの主要なステップから構成されている。最初のPCR増幅工程は、十分な鋳型DNAがSNP伸長工程で使用できるように各SNPに隣接するDNAを増幅する。 SAPの反応は以下のSNP伸長工程を妨害する可能性が使用されていないdNTPを中和する。 SNP拡張は、SNP遺伝子座と質量修飾ターミネーターヌクレオチドごとに単一の伸長プライマーを伴う。 3 '末端修飾ヌクレオチドは、伸長プライマーに組み込まれることから、その後のヌクレオチドを​​防ぐ。このように、単一塩基の質量は、対応するSNPの遺伝子型を示している。

このアプローチの成功を確保する上で最も重要なステップは、標的生物に存在する多型の良いデータセットをしているS。私たちは、種の同定(N> 900)10,12,38-40及びKDR(N> 1,000)15,18のためのよく特徴付けSNPを使用。 マラリアのための種特異的SNPは、123 Pのシトクロムbの配列の配列アラインメントから同定された熱帯熱マラリア 、97 P.三日熱マラリア 、11 P.マラリアと18 P.卵円ジェンバンクで利用可能であったアフリカからの配列を単離する。 7宿主種(ヒト、ニワトリ、ウシ、イヌ、ヤギ、ブタおよびヒツジ)からのシトクロムbの配列は、宿主特異的SNPの同定のためのGenbankから収集した。配列データのこの大きな体に基づいて、我々は、アッセイ設計ソフトウェアを使用して堅牢な診断アッセイを設計することができた。

各反応が収容できるマーカーの数は、二量体電位(0-1スケールの0.9)をプライマーに対する耐性を与えられたプライマー混合物の生化学的適合性によって決定される。偽プライミングの可能性のために、著者は、デフォルト値(最も厳しい1)を使用した。 Rこのパラメータのelaxationは、潜在的SNPがこの研究に含まれるのに加えて、単一の反応でアッセイすることができるSNPの数を増加させることができる。

PCR増幅ステップは、堅牢であり、典型的には最初のアッセイの設計からの調整を必要としない。 SNP拡張ミックス( 表3)が、各プライマーについて達成される雑音比に十分な信号を確保するための質量分析法を用いて、各プライマーの相対量の変更を必要とするかもしれない。提供SNP伸長プライマーのレシピは、これらの調整の結果である。伸長プライマー間の互換性は、単一の反応において多重することができるSNPの総数を制限することができる。反応体積は(5-8μl)を小さいため、サンプルプレートが適切に増幅工程中の蒸発を防ぐために密封される必要がある。

他のSNPジェノタイピングプラットフォームはaccommodatできますがこのプラットフォームは、同時に、反応あたり35個のSNPまで得点することができます反応41あたり千個のSNPの上、E。ゲノム配列決定技術の進歩により、人は次世代シーケンサー29,42,43を用いたSNPの数百万人を獲得することができる。しかし、ここで使用される技術は、多くの(100S-1,000s)個人のためのマーカーの比較的少数の遺伝子型を必要とする研究のための理想的なアプリケーションを提供しています。別のSNPジェノタイピングプラットフォームの設計上の制約の追加の議論は、これまでの研究41で覆われている。

MDAはマラリアベクトルの疫学的に重要な形質を特徴づけることを目的とし、自然集団から集めた蚊の数千人を分析する中スループットSNPジェノタイピングアッセイのための理想的なプロトコルを提供している。 MDAは、試薬コストの(2)60%の減少、及び複数のマーカーを利用することによって、偽陽性/陰性(3)削減、労働時間の90%の減少を介してここに提示(1)を提供する。提案されたアッセイにより、疫学的研究を強化することができる大幅にデータ収集を容易にする。また、人口の起源、殺虫剤抵抗性、寄生虫感受性とホスト選択に関して蚊サンプルを特徴付けることによって、ゲノムワイド関連解析を改善することができる。最後に、このMDAは、吸気及びMALDI-TOFベースのSNP遺伝子型決定プラットフォームを用いて、他の多重アッセイを設計するためのテンプレートを提供してもよい。

Acknowledgments

私たちは、博士に感謝。タンザニアから蚊の標本を提供するためのグラスゴー大学のUCデービス博士カタリーナKreppelでアンソニー·コーネルとローラ·ノリス。私たちは、ザンビアから蚊のサンプルを共有するための公衆衛生のジョンズホプキンススクールさんスミタ·ダス博士ダグラスノリスに感謝。我々はまた、アッセイデザインのトレーニングのために獣医遺伝学研究所の李氏V.ミロンに感謝。この作品はR01AI 078183とR21AI062929を付与国立衛生研究所によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.

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