Um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores

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Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).

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Abstract

O complexo de espécies Anopheles gambiae inclui a maior mosquitos transmissores da malária na África. Porque estas espécies são de tal importância médica, várias características são tipicamente caracterizados por meio de ensaios moleculares para auxiliar em estudos epidemiológicos. Essas características incluem a identificação das espécies, resistência a inseticidas, estado de infecção do parasita, e preferência de acolhimento. Dado que as populações do complexo Anopheles gambiae são morfologicamente indistinguíveis, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) é tradicionalmente usado para identificar as espécies. Uma vez que a espécie é conhecida, vários ensaios a jusante são rotineiramente realizados para elucidar outras características. Por exemplo, as mutações conhecidas como KDR em um gene par conferir resistência contra o DDT e piretróides. Além disso, ensaios de imunoabsorção ligados a enzima (ELISA) ou Plasmodium ensaios de PCR de detecção do DNA do parasita são usados ​​para detectar parasitas presentes nos tecidos de mosquito. Por último, uma combinaçãn de PCR e digeridos com enzimas de restrição pode ser utilizado para elucidar preferência hospedeira (por exemplo, humano versus animais de sangue) por rastreio de farinha de sangue para mosquitos de ADN específico do anfitrião. Nós desenvolvemos um ensaio de detecção de múltiplos (MDA) que combina todos os ensaios acima mencionados numa única multiplex 33SNPs genotipagem reacção durante 96 ou 384 amostras de cada vez. Porque o MDA inclui vários marcadores para as espécies, a detecção de Plasmodium, e identificação sanguíneo hospedeiro, a probabilidade de gerar falsos positivos ou negativos é muito reduzida a partir de ensaios anteriores que incluem apenas um marcador por traço. Este ensaio robusto e simples pode detectar essas características-chave do mosquito de forma rentável e em uma fração do tempo de ensaios existentes.

Introduction

Arabiensis Anopheles, Anopheles coluzzii e Anopheles gambiae são os principais vetores responsáveis ​​pela transmissão da malária na África 1. Estas três espécies são morfologicamente indistinguíveis 2 e só pode ser distinguido por testes moleculares 3-9. Além disso, existem muitos ensaios a jusante rotineiramente realizados para auxiliar genética epidemiológicos e populacionais estudos. Estas incluem: (1) um ensaio de genotipagem para ilhas de especiação 10-12, (2) um ensaio de genotipagem reconhecendo SNPs não sinônimas no 1014 th posição do aminoácido códon do gene para (a resistência knock-down, ou kdr, SNP) 13 -18, (3) a detecção de parasitas PCR 19-23, e (4) de triagem para DNA específica do host no intestino médio do mosquito 24,25.

Foi desenvolvido um ensaio de detecção de múltiplos (MDA) que combina todos estes ensaios numa única reacção multiplex com o objetivo de umalyzing características epidemiologicamente importantes de vetores da malária em África. O ensaio MDA inclui múltiplos marcadores para a detecção (1) espécie (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, ou outro (nenhum dos três)), (2) a resistência aos inseticidas representada em kdr SNPs (ambos L1014F e L1014S) , (3) a presença de dois grandes parasitas da malária, Plasmodium falciparum e P. vivax, e (4) a partir de uma fonte de sangue aviária e seis hospedeiros mamíferos.

Tradicionalmente, estes ensaios foram realizados em reacções em cadeia de polimerase separadas. Quando todos esses ensaios são feitos usando uma plataforma PCR convencional, requer a realização de ensaios de reacção de PCR 10/08 e acompanha os passos de eletroforese em gel. Cada reação individual PCR de preparação para resultados documentando leva 4-5 horas, enquanto o método aqui apresentado MDA leva cerca de 5 horas em sua totalidade. Isto é equivalente a uma economia de 90% em custos de trabalho sozinho. O MDA apresentou aqui custa US $ 5por amostra de genotipagem de todos os 33 SNPs. Isto é consideravelmente mais barato do que as solteiras ensaios baseados em gel de agarose, que custa cerca de US $ 1,50 por amostra. Ensaios que detectam todas as características abrangidas pelo MDA requereria um mínimo de 8-10 ensaios separados baseadas em gel de agarose a um custo de $ 12-15 por amostra. Além disso, o MDA reduz grandemente a possibilidade de gerar uma falsa positiva ou negativa através da utilização de pelo menos três marcadores para cada parasita ou fonte de acolhimento de detecção.

A plataforma que utilizado não está limitado a vetores da malária, mas pode ser utilizado numa ampla variedade de aplicações, tais como a medicina, e medicina veterinária, e biologia de base 26-28. Em profundidade estudos de associação ou de genética de populações estudos envolvendo um grande número (em ordem de 100s) das amostras exigem ensaios rentáveis ​​triagem para múltiplos marcadores simultaneamente. A maioria dos estudos que utilizam dois ou mais ensaios de PCR separadas poderia implementar o MDA para resultados mais rápidos a um custo menor.

Protocol

1. Amplificação por PCR

  1. Misturar todos os iniciadores de PCR (Ver Tabela S1 suplementar) em um microtubo de 1,5 mL. Cada SNP tem dois iniciadores (directo e inverso). Certifique-se de que a concentração de estoque de cada um dos iniciadores de PCR é mantida a 100 uM. Faça a mistura de iniciadores suficiente para 500-1.000 reações para reduzir pipetagem erro e tempo no banco (ver Tabela S2 suplementar). Se desejado, preparar alíquotas de 100-200 reacções por tubo, e armazenar a -20 ° C.
  2. Prepare PCR cocktail como descrito no protocolo do fabricante (Tabela 1). O volume para 96 ​​reacções inclui um excesso de 20%. Vortex o tubo contendo o cocktail de PCR ligeiramente e centrifugar durante 30 segundos a 2000 x g.
  3. Dispensar 3 ul do cocktail de PCR em cada poço de um não-contornado placa de 96 poços. A pipeta repetidora pode economizar tempo para este processo.
  4. Adicionar 2 ul de DNA genómico adequada de mosquitos em cada poço.
    NOTA: Processo de obtenção de ADN genómico a partir de m tecidos osquito (cabeça / tórax, abdômen ou do corpo inteiro) é descrito em outras literaturas 29-32. Escolha um protocolo de extração de DNA adequado para diferenciar aqueles com Plasmodium no sangue (abdómen) de mosquitos infecciosos (Plasmodium na cabeça / tórax). Normalmente usamos DNA extraído de partes do corpo (cabeça / tórax ou abdômen) de mosquitos, por isso, concentração de DNA varia de 0.05-2ng / l. Embora a entrada de DNA total é menor do que a recomendação do fabricante (5-10ng / rxn), que costuma ter robusto SNP chamadas de 98% das amostras de DNA sem amplificação do genoma inteiro.
  5. Selar a placa, misture delicadamente ou vortex, e centrifugar por 1 min a 370 x g.
  6. Usar o seguinte protocolo termociclador para realizar a amplificação por PCR: (1) 94 ° C durante 2 minutos, (2) 94 ° C durante 30 segundos, (3) 56 ° C durante 30 segundos, (4) 72 ° C durante 1 min , (5) repetir o passo (2) - (4) por 45 ciclos, (6) 72 ° C durante 1 min, 4 ° C e preensão.
_title "> 2. O tratamento da SAP

  1. Preparar a solução de enzima SAP em uma placa de 96 poços (Ver Tabela 2). Processar 96 amostras em uma placa. O volume para 96 ​​reacções inclui um excesso de 20%.
  2. Vortex o tubo de solução de enzima SAP levemente e centrifugar por 30 segundos a 2.000 x g. Dispensar 2 ul da solução de enzima SAP em cada poço. Mais uma vez, um repetidor pipeta pode economizar tempo para este processo.
  3. Selar a placa, misture delicadamente ou vortex, e centrifugar por 1 min a 370 x g. Incubar a placa como se segue: (1) 37 ° C durante 40 minutos, (2) 85 ° C durante 5 min, para inactivar a enzima, (3) a 4 ° C preensão. Ao terminar este passo, a placa de armazenar a -20 ° C antes de continuar. Processar a placa armazenado dentro de 2 semanas.

3. SNP Extension

  1. Se a placa de amostra é congelado após o tratamento SAP, deixe-o descongelar à temperatura ambiente antes de prosseguir.
  2. Preparar a mistura de extensão do primer (Tabela Suplementar S2). Cada SNP tem uma extension iniciador. Manter a concentração estoque de cada iniciador de extensão em 500 M. Opcionalmente, alíquota de 100-200 reacções por tubo e armazenar a -20 ° C.
  3. Preparar a mistura de extensão como descrito na Tabela 3. O volume de reacção 96 inclui uma saliência de 20%.
  4. Vortex o tubo de extensão cocktail levemente e centrifugar por 30 segundos a 2.000 x g. Dispensar 2 ul do cocktail de extensão em cada poço. Mais uma vez, um repetidor pipeta pode economizar tempo para este processo.
  5. Selar a placa, misture delicadamente ou vortex, e centrifugar por 1 min a 370 x g. Thermocycle da placa, como mostrado na Figura 1. Neste momento, proceder à espectrometria de massa ou armazenar a placa à temperatura de -20 ° C até 2 semanas.

4. Condicionado o SNP extensão do produto para otimizar Análise Espectrometria de Massa

  1. Se a placa de amostra é congelado após a extensão SNP, deixe-o descongelar à temperatura ambiente antes de prosseguir.
  2. Transferir 15 mg de resina a partir da sua Container na placa covinha usando uma colher alongada. Use o raspador para espalhar resina para os poços da placa de covinha. Varrer o raspador de lado a lado ao longo da placa para espalhar a covinha resina. Verifique se há resina em cada poço.
  3. Raspe o excesso de resina da placa covinha usando o raspador. Deixe que a resina de suporte na placa de ondulação para a, pelo menos, 20 min. Enquanto a resina deixando ficar na placa de ondulação, adicionar 41 ul de água para HPLC a cada poço da placa de amostra.
  4. Delicadamente, coloque a placa de amostra de cabeça para baixo, sobre a placa covinha. Certifique-se de repor a placa de amostra contra o pequeno posto arredondada da placa covinha, que alinha os poços na placa de amostra com os poços da placa covinha.
  5. Segurando a placa de amostra ea placa covinha juntos, lançá-los suavemente sobre modo a resina cai para fora da placa covinha nas cavidades da placa de amostra. Toque na placa covinha de modo a resina cai na placa de amostra. Certifique-se de toda a resina no diplaca mple cai nos poços da placa de amostra. Centrifugar a placa a 3200 xg durante 30 seg.
  6. Girar a placa de amostras num rotor durante 5 min à TA. Rotator deve girar a placa de amostra de 360 ​​° sobre o eixo longitudinal.
  7. Centrifuga-se a amostra na placa de 3.200 xg durante 5 min. Após este passo, armazenar a placa de amostra a -20 ° C até 2 semanas antes de prosseguir para o próximo passo.

5. MALDI-TOF Espectrometria de Massa

  1. Transferir o produto da extensão do SNP condicionado para um bioarray tais como SpectroCHIP conforme as instruções do fabricante. Usamos MassARRAY Nanodispenser para este passo.
  2. Assim que a transferência for concluída, definir a forma como os ensaios e as placas estão a ser criado no banco de dados do ensaio. Nome do ensaio e placas de tal forma que cada placa tem identificador único que liga ao design ensaio específico (Tabela Suplementar S3).
  3. Depois de ensaio e placa foram definidos, adquirir espectros usando um espectrômetro de massa.

  1. Realizar análise de dados utilizando uma análise em tempo real PCR software de interpretação de dados, como Tipos Analyzer ou TyperViewer (Sequenom). Obter dados em formato .xml que contém o layout da amostra, espectrograma de massa para cada bem, as informações marcador incluindo nome, massa esperada para cada variante do SNP correspondente, e qualquer erro ou mensagens de aviso associado a cada reação. Ver Figura 2 para o espectrograma de massa resultante.
  2. Realizar análise do genótipo SNP agrupamento, definindo o limite de detecção (magnitude ou sinal-ruído) e tolerância / variação permitida para cada genótipo. A Figura 3 mostra um exemplo de uma 04707-KDR # 2 clusters genótipo SNP.
  3. Exportar os resultantes chamadas genótipo SNP em um programa de planilha.

Representative Results

A identificação das espécies:

Os cinco SNPs seguintes juntos identificar três espécies (A. arabiensis coluzzii A. e A. gambiae) (Tabela 4). Se a amostra não é uma das três espécies, os três SNPs (01073-213, 04.679-157 e 10313 -052) não conseguem amplificar.

genótipo kdr para inferir resistência a inseticidas:

A 1014 ° codão do canal de sódio parágrafo tensão-gated corresponde a KDR. Dois SNPs no 2 º e 3 º base dos 1014 th códon determinar os três aminoácidos possíveis. . As combinações possíveis dos genótipos estão listados na Tabela 5 Este SNP funciona para três espécies de vectores africanos malária: A. arabiensis, A. coluzzii e A. gambiae. Estes SNPs não conseguem amplificar em A. darlingi, vetor da malária no Brasil. Este não ésurpreendente, dado que mitocondrial semelhança seqüência do genoma entre A. darlingi e A. gambiae é de apenas 88,9%, enquanto mitocondrial semelhança seqüência do genoma entre três vetores africanos malária são mais de 98%. Outras espécies não foram testados. Fomos bem sucedidos na amplificação de amostras coletadas em Mali, Camarões, Tanzânia e Zâmbia.

Detecção de Plasmodium:

Se o DNA intacto Plasmodium está presente no tecido de mosquito, esperamos detectar P. falciparum ou P. vivax ADN específica entre a amostra de ADN extraído a partir do mosquito. As espécies específicas de SNPs foram identificados a partir de alinhamento de sequências da sequência do citocromo b de 123 P. falciparum, P. 97 vivax, P. 11 malariae e 18 P. ovale isolar sequências de África disponíveis no GenBank. Concebemos 6 SNPs que produzem originais genótipos SNP para distinguir P. falciparum ou P. vi vax de outras espécies de Plasmodium (Tabela 6). Nós testamos este ensaio em amostras de mosquitos coletados em Mali, Camarões, Tanzânia, Zâmbia e Brasil e confirmou que este conjunto particular de marcadores funciona independentemente da espécie de mosquito.

Farinha de sangue de PCR de detecção:

B seqüências do citocromo de 7 espécies hospedeiras (humanos, galinha, vaca, cães, caprinos, suínos e ovinos) foram obtidas no GenBank e sequências de consenso foram gerados. SNPs informativos para cada host foram selecionados para genotipagem. Nós testamos isso com fontes de sangue de 7 animais diferentes (Tabela 7).

Porque fragmentos de PCR são curtos (80-120 bp), que funciona no DNA pouco degradado ou em repastos parcialmente digeridos do tecido mosquito. A probabilidade de chamadas de falsos positivos é muito reduzida por ter vários marcadores por tipo de host.

s "> Figura 1
Figura 1. programa Thermocycler para SNP extensão passo. O ciclo de amplificação é total de 200 (5X40).

Figura 2
Figura 2. Massa para o espectrograma-MDA. O eixo X representa a massa (Da) de produtos de extensão do SNP e o eixo Y representa a intensidade do sinal. As linhas a vermelho indicam a massa esperada de extensão de primer não incorporado, o alelo SNP 1 e alelo 2 do marcador seleccionado. Linhas cinza indicam a massa de outros marcadores do MDA esperado. Este lote é gerado a partir de um software de análise de dados (Tipos Analyzer ou Tipos Viewer) a partir do arquivo de dados de saída após o Passo 5. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

e = "always"> Figura 3
Figura 3. Pessoa SNP aglomerado genótipo ver o eixo X é o valor de arco de tangente (rotulado como "Ângulo") das intensidades de sinal de um alelo de SNP e SNP alelo 2. O eixo Y representa a grandeza do sinal de chamada genótipo. Este lote é fornecido no software de análise de dados (Tipos Analyzer ou Tipos Viewer). Quaisquer dados particulares podem ser selecionadas com um clique de um botão do mouse e os dados da amostra selecionada é indicada pelo círculo. A análise de agrupamento fornecida nos clusters de software genótipos com um limiar de variação definida pelo usuário e as cores automaticamente três genótipos de um SNP bial�ico. Exemplo mostrado aqui indica T (TT) homozigotos como triângulos azuis, heterozigoto (TA) como quadrados verdes e homozigotos A (AA) indivíduos como triângulos laranja invertido. Os círculos vermelhos representam Nenhuma chamada (sem amplificação).t = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Reagente Concentração em 5 ul Volume Volume
(1 rxn) (96) rxns
Água (grau HPLC) N / D 0,8 l 92,2 ul
10x PCR buffer com MgCl2 20 mM 1x (MgCl2 2 mM) 0,5 ul 57,6 ul
MgCl2 (25 mM) ** 2 mM 0,4 l 46,1 ul
mistura de dNTP (25 mM cada) *** 500 uM 0,1 l 11,5 ul
Mistura de iniciadores (500 nM cada) 100 nM 1.0 ul 115,2 ul
Enzima de PCR (5 U / uL) 1,0 U / rxn 0,2 l 23.0 ul
Volume Total: 3,0 l 345,6 ul

Tabela 1. PCR Multiplex receita coquetel. O volume de cada um dos reagentes para o passo de extensão do PCR, para uma reacção e 96 reacções com um excesso de 20%.

Volume Total
Reagente Volume (1 rxn) Volume (96 rxn)
Água (grau HPLC) 1,53 mL 176,3 ul
Tampão SAP (10x) 0,17 mL 19,6 ul
Enzima SAP (1,7 U / ul) 0,30 mL 34,6 ul
2,00 mL 230,4 ul

Solução de enzima SAP 2. Tabela. O volume de cada reagente para o tratamento de fosfatase alcalina de camarão para uma reacção e 96 reacções com um excesso de 20%.

Reagente Conc. Em 9 ul Volume (1rxn) Volume (96 rxns)
Água (grau HPLC) N / D 0,6190 ul 71,3 ul
Iplex Tampão Plus (10x) 0.222x 0,2000 ul 23.0 ul
Iplex mix Rescisão 1x 0,2000 ul 23.0 ul
Mistura da extensão do iniciador 0,9400 ul 108.3 ul
enzima Iplex 1x 0,0410 ul 4.7 ul
Volume Total 2,0000 ul 230,4 ul

Tabela 3. SNP Extensão cocktail O volume de cada um dos reagentes para o passo de extensão do SNP para uma reacção e 96 reacções com um excesso de 20%.

Tabela 4
Tabela 4. genótipos SNP para cada espécie. 28S IGS-540, 28S IGS-649 e 01.073-213 estão localizados no cromossoma X, 04.679-157 é no cromossoma 2 e 10.313-052 é no cromossoma 3. genótipo híbrido (heterozigoto) é destacada em amarelo. Variante fixo em A. coluzzii está marcado na luz variante azul e fixo em A. gambiae é marcado no escuroazul.

Tabela 5
Tabela 5. genótipos SNP para kdr. Dois SNPs KDR # 1 e # 2 KDR constituem um genótipo para o 1014 th códon do gene para. A primeira base é invariável de modo que não está incluído no ensaio. Genótipos homozigotos sensíveis estão marcados em azul. O genótipo homozigoto L1014F mais resistentes é marcada em azul escuro. A cor amarela indica heterozigoto. O L1014 S, intermediária genótipo resistente, é mostrado em laranja.

Tabela 6
Tabela 6. genótipos SNP para P. falciparum e P. vivax ong>. Total de 6 SNPs são usados ​​para determinar a presença de parasita da malária. Pl-0041, Pl-1269 e PL-1549 contêm P. falciparum alelos específicos (G, T e T, respectivamente). Amplificação simultânea dos três alelos indica a presença de relativamente intacto P. ADN falciparum no ADN da amostra. Amplificação de alelos alternativos (A para Pl-0041 e Pl-1269) indica a presença de outras espécies de Plasmodium (por exemplo, P. vivax, P. ovale ou P. malariae) presentes na amostra. Pf-1549 está localizada em regiões com muitos mais P. falciparum específica flanqueando regiões, assim, este SNP só é amplificada quando P. falciparum está presente. Pl-0071, Pl-1245 e PL-0157 contêm P. vivax alelos específicos (G, G e T, respectivamente). Amplificação de alelos alternativos (A, A e C, respectivamente) indica a presença de outro DNA de Plasmodium na amostra. Mosquitos não infectados não terá amplificação em todos os seis marcadores. Tabela 7
Tabela 7. genótipos SNP para 7 anfitriões:. Humana, galinha, vaca, cão, cabra, porco e ovelha "NC" significa "Não Call" (sem amplificação) na tabela a seguir. Note-se que alguns amplificação não específica pode ocorrer em algum loci, mas não para todos os SNPs de um determinado host. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O MDA é composto por cinco etapas principais: amplificação de PCR, fosfatase alcalina de camarão (SAP) de reacção, de extensão SNP, o produto de extensão condicionado, e de matriz assistida por laser de dessorção / ionização - tempo de voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa de 33-37. O primeiro passo de amplificação de PCR amplifica ADN que flanqueia cada SNP, de modo que o ADN molde suficiente estará disponível no passo de extensão de SNP. A reação SAP neutraliza dNTPs não utilizados que possam interferir com o seguinte passo de extensão SNP. Extensão SNP envolve um único iniciador extensão por locus de SNP e nucleótidos terminadores modificados em massa. Os nucleótidos 3'-finais subsequentes nucleótidos modificados impedir de serem incorporados no iniciador extensão. Assim, a massa de base única indica o genótipo do SNP correspondente.

O passo mais crítico para garantir o sucesso desta abordagem é ter um bom conjunto de dados de polimorfismos existentes no organismo alvos. Usamos SNPs bem caracterizados para a identificação de espécies (N> 900) 10,12,38-40 e kdr (N> 1000) 15,18. As espécies SNPs específicos para Plasmodium foram identificados a partir de alinhamento de sequências das seqüências do citocromo b de 123 P. falciparum, P. 97 vivax, P. 11 malariae e 18 P. ovale isolar sequências da África que estavam disponíveis no GenBank. B seqüências do citocromo de 7 espécies hospedeiras (humanos, galinha, vaca, cães, caprinos, suínos e ovinos) foram obtidas no GenBank para identificação SNP específico do host. Com base nessa grande massa de dados de seqüência, fomos capazes de projetar um teste de diagnóstico robusto usando um software designer de ensaio.

O número de marcadores de cada reacção pode acomodar é determinada pelo grau de compatibilidade bioquímica da mistura de iniciadores dada uma tolerância ao iniciador potencial dímero (0,9 escala de 0-1). Autores utilizado o valor padrão (1; mais estrito) para o potencial priming falsa. Relaxation deste parâmetro pode potencialmente aumentar o número de SNPs que podem ser doseadas em uma única reacção, em adição à SNPs incluídos neste estudo.

As etapas de amplificação de PCR são robustos e, normalmente, não necessitam de ajuste desde o desenho inicial do ensaio. O SNP extensão mistura (Tabela 3), contudo, podem necessitar de modificação na quantidade relativa de cada primer usando a espectrometria de massa para garantir uma suficiente sinal-ruído é obtida para cada iniciador. A receita SNP extensão cartilha fornecida é o resultado desses ajustes. Compatibilidade entre os iniciadores de extensão podem limitar o número total de SNPs que pode ser multiplex numa única reacção. Uma vez que o volume de reacção é pequeno (5-8 ul), a placa de amostra tem de ser devidamente selado para evitar a evaporação durante as etapas de amplificação.

Esta plataforma pode marcar simultaneamente até 35 SNPs por reação, enquanto que outras plataformas de genotipagem pode accommodate mais de mil SNPs por reação 41. Com os avanços na tecnologia de sequenciamento do genoma, pode-se adquirir milhões de SNPs usando a próxima geração 29,42,43 seqüenciamento. No entanto, a técnica usada aqui fornece uma aplicação ideal para os estudos que exigem a genotipagem de um número relativamente pequeno de marcadores para muitos (100s-1,000s) indivíduos. Discussão adicional das restrições de design de plataforma diferente genotipagem SNP é coberto em estudos anteriores 41.

O MDA tem como objetivo caracterizar epidemiologicamente importantes traços de vetores da malária e fornece um protocolo ideal para testes de genotipagem de médio rendimento SNP analisando milhares de mosquitos coletados de populações naturais. O MDA apresentado aqui fornece (1) sobre uma redução de 90% no tempo de trabalho, (2) uma redução de 60% nos custos de reagentes, e (3) a redução em falsos positivos / negativos, utilizando múltiplos marcadores. O ensaio proposto pode melhorar estudos epidemiológicos porfacilitando bastante a coleta de dados. Além disso, ele pode melhorar os estudos de associação genômica ampla ao caracterizar as amostras de mosquitos com relação à origem da população, a resistência aos inseticidas, parasita suscetibilidade e escolha host. Finalmente, este MDA pode fornecer inspiração e um modelo para a concepção de outros ensaios multiplex, utilizando uma plataforma de genotipagem de SNP com base MALDI-TOF.

Acknowledgments

Agradecemos Drs. Anthony Cornel e Laura Norris na UC Davis e Dr. Katharina Kreppel na Universidade de Glasgow para a prestação de espécimes de mosquitos da Tanzânia. Agradecemos Ms. Smita Das e Dr. Douglas Norris da Johns Hopkins School of Public Health para a partilha de amostras de mosquitos da Zâmbia. Agradecemos também o Sr. Lee V. Millon do Laboratório de Genética Veterinária para o treinamento no projeto ensaio. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde conceder R01AI 078.183 e R21AI062929.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.

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