Un ensayo multi-detección para los mosquitos transmisores de la malaria

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Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).

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Abstract

El complejo de especies de Anopheles gambiae incluye el principal transmisores de la malaria mosquitos en África. Debido a que estas especies son de tal importancia médica, varios rasgos se caracterizan típicamente utilizando ensayos moleculares para ayudar en los estudios epidemiológicos. Estos rasgos incluyen la identificación de especies, resistencia a los insecticidas, el estado de infección del parásito, y la preferencia de acogida. Dado que las poblaciones del complejo Anopheles gambiae son morfológicamente indistinguibles, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza tradicionalmente para identificar las especies. Una vez que se conoce la especie, varios ensayos posteriores se realizan rutinariamente Para aclarar aún más características. Por ejemplo, mutaciones conocidas como KDR en un gen párrafo confieren resistencia contra el DDT y los insecticidas piretroides. Además, los ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o ensayos de PCR de detección de ADN del parásito Plasmodium se utilizan para detectar parásitos presentes en los tejidos de mosquitos. Por último, una combinación de PCR y digestiones con enzimas de restricción se puede utilizar para dilucidar preferencia host (por ejemplo, humano frente a sangre animal) mediante el cribado de la harina de sangre de mosquitos para el ADN-host específico. Hemos desarrollado un ensayo de detección múltiple (MDA) que combina todos los ensayos mencionados anteriormente en un único 33SNPs de genotipado multiplex de reacción durante 96 o 384 muestras a la vez. Debido a que la MDA incluye múltiples marcadores para las especies, detección de Plasmodium, y la identificación de sangre anfitrión, la probabilidad de generar falsos positivos o negativos se reduce en gran medida a partir de ensayos anteriores que incluyen sólo un marcador por rasgo. Este ensayo robusto y simple puede detectar estos rasgos clave de mosquitos de manera rentable y en una fracción del tiempo de los ensayos existentes.

Introduction

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii y Anopheles gambiae son los principales vectores responsables de la transmisión de la malaria en África 1. Estas tres especies son morfológicamente indistinguibles 2 y sólo se pueden distinguir por ensayos moleculares 3-9. Además, hay muchos ensayos posteriores realizados rutinariamente para ayudar a los estudios epidemiológicos y de genética de población. Estos incluyen (1) un ensayo de genotipado para las islas de especiación 10-12, (2) un ensayo de genotipado reconocimiento no es sinónimo SNPs en el 1014 ª posición del aminoácido codón del gen para (la resistencia knock-down, o kdr, SNP) 13 -18, (3) la detección de parásitos PCR 19-23, y (4) la detección de ADN-host específico en midguts de mosquitos 24,25.

Hemos desarrollado un ensayo de detección múltiple (MDA) que combina todos estos ensayos en una reacción multiplex individual con el objetivo de unaalyzing características epidemiológicamente importantes de vectores de la malaria en África. El ensayo MDA incluye múltiples marcadores para la detección de (1) especies (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, u otro (ninguno de los tres)), (2) resistencia a los insecticidas representado en kdr SNPs (tanto L1014F y L1014S) , (3) la presencia de dos importantes parásitos de la malaria, Plasmodium falciparum y P. vivax, y (4) fuente de sangre de uno aviar y seis huéspedes mamíferos.

Tradicionalmente, estos ensayos se llevaron a cabo en reacciones en cadena de la polimerasa por separado. Cuando todos estos ensayos se realizaron utilizando una plataforma PCR convencional, se requiere la realización de 8-10 ensayos de reacción de PCR y acompañar los pasos de electroforesis en gel. Cada reacción individual PCR desde la preparación hasta que documentan los resultados toma 4-5 horas, mientras que el método de MDA se presenta aquí toma aproximadamente 5 horas en su totalidad. Esto es equivalente a un 90% de ahorro en costos de mano de obra solamente. La MDA presentó aquí cuesta $ 5por muestra para determinar el genotipo de los 33 SNPs. Esto es considerablemente menos costoso que los ensayos individuales basados ​​en gel de agarosa, que cuesta alrededor de $ 1.50 por muestra. Los ensayos que detectan todas las características cubiertas por la MDA requeriría un mínimo de 8-10 ensayos basados ​​en gel de agarosa separadas por un costo de $ 15.12 por cada muestra. Además, la MDA reduce enormemente la posibilidad de generar un falso positivo o negativo mediante la utilización de al menos tres marcadores para cada parásito o fuente de acogida de detección.

La plataforma se utilizó no se limita a vectores de la malaria, pero se puede utilizar en una amplia variedad de aplicaciones tales como la medicina, medicina veterinaria, y la biología básica 26-28. Estudios en profundidad de asociación o de genética de poblaciones estudios con un gran número (con el fin de 100s) de muestras requieren ensayos de cribado rentables para varios marcadores simultáneamente. La mayoría de los estudios que utilizan dos o más ensayos de PCR separadas podrían implementar el MDA para resultados más rápidos a un costo menor.

Protocol

1. Amplificación por PCR

  1. Mezclar todos los cebadores de PCR (Ver Tabla S1 complementario) en un microtubo de 1,5 ml. Cada SNP tiene dos primers (adelante y atrás). Asegúrese de que la concentración de reserva de cada cebador de PCR se mantiene a 100 mM. Hacer suficiente mezcla de cebadores de 500-1.000 reacciones para reducir el error y el tiempo de pipeteo en el banco (Ver Tabla S2 complementario). Si lo desea, preparar alícuotas de 100-200 reacciones por tubo y se almacena a -20 ° C.
  2. Preparar cóctel de PCR como se describe en el protocolo del fabricante (Tabla 1). El volumen para 96 ​​reacciones incluye un voladizo de 20%. Vortex el tubo que contiene el cóctel de PCR ligeramente y centrifugar durante 30 segundos a 2.000 x g.
  3. Dispensar 3 l de cóctel de PCR en cada pocillo de un no-bordeado placa de 96 pocillos. Una pipeta repetidor puede ahorrar tiempo para este proceso.
  4. Añadir 2 l de ADN genómico adecuada de los mosquitos en cada pocillo.
    NOTA: Proceso de obtención de ADN genómico a partir de m tejidos osquito (cabeza / tórax, abdomen o del cuerpo entero) se describe en otras literaturas 29-32. Elige un protocolo de extracción de ADN apropiada para diferenciar aquellos con Plasmodium en la sangre (abdomen) de los mosquitos infecciosos (Plasmodium en la cabeza / tórax). Utilizamos típicamente ADN extraído de las partes del cuerpo (cabeza / tórax o abdomen) de mosquitos, por lo que la concentración de ADN varía de 0.05-2ng / l. Aunque la entrada de ADN total es inferior a la recomendación del fabricante (5-10ng / reacción), típicamente obtenemos robusta SNP llama desde el 98% de las muestras de ADN sin amplificación de todo el genoma.
  5. Sellar la placa, mezclar suavemente o vórtice, y centrifugar durante 1 min a 370 x g.
  6. Utilice el siguiente protocolo termociclador para llevar a cabo la amplificación por PCR: (1) 94 ° C durante 2 min, (2) 94 ° C durante 30 seg, (3) 56 ° C durante 30 seg, (4) 72 ° C durante 1 min , (5) repetir la etapa (2) - (4) para 45 ciclos, (6) 72 ° C durante 1 min, y 4 ° C espera.
_title "> 2. Tratamiento SAP

  1. Prepare la solución de enzima SAP en una placa de 96 pocillos (Ver Tabla 2). Procesar 96 muestras en una placa. El volumen para 96 ​​reacciones incluye un voladizo de 20%.
  2. Vortex el tubo de solución de enzima SAP suavemente y centrifugar durante 30 segundos a 2000 x g. Dispensar 2 l de la solución de enzima SAP en cada pocillo. Una vez más, una pipeta repetidor puede ahorrar tiempo para este proceso.
  3. Sellar la placa, mezclar suavemente o vórtice, y centrifugar durante 1 min a 370 x g. Incubar la placa de la siguiente manera: (1) 37 ° C durante 40 min, (2) 85 ° C durante 5 min para inactivar la enzima, (3) 4 ° C espera. Al finalizar este paso, la placa de almacenar a -20 ° C antes de continuar. Procese la plancha almacenado dentro de 2 semanas.

3. Extensión SNP

  1. Si la placa de muestra se congela después del tratamiento SAP, deje que se descongele a temperatura ambiente antes de proceder.
  2. Preparar la mezcla de cebador de extensión (complementario el cuadro S2). Cada SNP tiene una exteimprimación nsion. Mantener la concentración de reserva de cada cebador de extensión a 500 mM. Opcionalmente, alícuota de 100 a 200 reacciones por tubo y almacenar a -20 ° C.
  3. Preparar la mezcla de extensión como se describe en la Tabla 3. El volumen de reacción 96 incluye un saliente de 20%.
  4. Vortex el tubo de cóctel de extensión a la ligera y se centrifuga durante 30 segundos a 2000 x g. Dispensar 2 l de cóctel de extensión en cada pocillo. Una vez más, una pipeta repetidor puede ahorrar tiempo para este proceso.
  5. Sellar la placa, mezclar suavemente o vórtice, y centrifugar durante 1 min a 370 x g. Termociclo la placa como se muestra en la Figura 1. En este punto, proceda a espectrometría de masas o almacenar la placa a -20 ° C hasta 2 semanas.

4. Acondicionamiento de la extensión del producto SNP para optimizar el análisis de Espectrometría de Masas

  1. Si la placa de muestra se congela después de la extensión SNP, deje que se descongele a temperatura ambiente antes de proceder.
  2. Transferir 15 mg de resina de su contaINER sobre la placa de depresión utilizando una cuchara alargada. Utilice el rascador para difundir la resina en los pocillos de la placa de depresión. Barra el raspador de lado a lado a través de la placa de depresión para difundir la resina. Asegúrese de que hay resina en cada pocillo.
  3. Raspe el exceso de resina de la placa de depresión con la rasqueta. Deje que la resina de pie en la placa de hoyuelo durante al menos 20 min. Mientras que deja la resina de pie en la placa de hoyuelo, añadir 41 l de agua de grado HPLC a cada pocillo de la placa de muestra.
  4. Con cuidado, coloque la placa de muestra al revés, sobre la placa de depresión. Asegúrese de que se restablezca el plato de muestras contra el pequeño puesto redondeado de la placa de depresión, que alinea los pozos de la placa de la muestra con los pozos de la placa de depresión.
  5. La celebración de la placa de la muestra y la placa de depresión juntos, dar la vuelta suavemente sobre lo que la resina se cae de la placa de depresión en los pocillos de la placa de la muestra. Toque en la placa de depresión por lo que la resina se cae en la placa de muestra. Asegúrese de que toda la resina en la diplaca mple cae en los pocillos de la placa de la muestra. Centrifugar la placa a 3200 xg durante 30 seg.
  6. Girar la placa de muestra en un aparato rotatorio durante 5 min a RT. Rotador debe girar la placa de muestra de 360 ​​° alrededor del eje largo.
  7. Centrifugar la placa de muestras a 3.200 g durante 5 min. Después de este paso, almacenar la placa de muestra a -20 ° C hasta 2 semanas antes de proceder al siguiente paso.

5. MALDI-TOF espectrometría de masas

  1. Transferir el producto de extensión del SNP acondicionado en un BioArray tales como SpectroCHIP según las instrucciones del fabricante. Utilizamos MassArray Nanodispenser para este paso.
  2. Una vez que se complete la transferencia, definir cómo los ensayos y las placas se van a establecer en la base de datos de ensayo. Nombre del ensayo y placas de tal manera que cada placa tiene identificador único que une al diseño específico de ensayo (Suplementario Tabla S3).
  3. Después de ensayo y la placa se han definido, adquirir espectros utilizando un espectrómetro de masas.

  1. Realizar análisis de datos utilizando un análisis en tiempo real PCR software de interpretación de datos, como Typer analizador o TyperViewer (Sequenom). Obtener datos en formato .xml que contiene el diseño de la muestra, espectrograma de masas para cada pozo, la información de marcadores incluyendo nombre, masa esperada para cada variante del SNP correspondiente, y cualquier error o mensajes de advertencia relacionados con cada reacción. Vea la Figura 2 para el espectrograma de masas resultante.
  2. Llevar a cabo el análisis de agrupamiento SNP genotipo estableciendo el umbral de detección (magnitud o relación señal a ruido) y la tolerancia / varianza permitido para cada genotipo. La Figura 3 muestra un ejemplo de un 04707-KDR # 2 grupos de genotipo de SNP.
  3. Exportar los resultantes llamadas SNP genotipo en un programa de hoja de cálculo.

Representative Results

La identificación de especies:

Los 5 SNPs siguientes juntos identifican tres especies (A. arabiensis, A. y A. gambiae coluzzii) (Tabla 4). Si una muestra no es una de las tres especies, los tres SNPs (01073-213, 04679-157 y 10313 -052) no amplifican.

kdr genotipo para inferir resistencia a los insecticidas:

El codón de 1014 º del canal de sodio gated-tensión párrafo corresponde a KDR. Dos SNPs en el 2 y 3 de la base de los 1014 º codón determinan los tres posibles aminoácidos. . Las combinaciones posibles de los genotipos se enumeran en la Tabla 5 Este SNP funciona para tres especies de vectores de la malaria de África: A. arabiensis, A. y A. coluzzii gambiae. Estos SNPs fallan para amplificar en A. darlingi, un vector de la malaria en Brasil. Esto no essorprendente dado que la secuencia del genoma mitocondrial similitud entre A. darlingi y A. gambiae es sólo el 88,9%, mientras mitocondrial similitud de secuencia del genoma de los tres vectores de la malaria africanos son más del 98%. Otras especies no han sido probados. Tuvimos éxito en la amplificación de las muestras recogidas en Malí, Camerún, Tanzania y Zambia.

Detección de Plasmodium:

Si el ADN Plasmodium intacta está presente en el tejido mosquito, esperamos para detectar P. falciparum o P. vivax ADN específica entre la muestra de ADN extraída del mosquito. Las especies SNPs específicos fueron identificados a partir de la alineación de secuencias de la secuencia de citocromo b de 123 P. falciparum, P. 97 vivax, P. 11 malariae y P. 18 ovale aislar secuencias de África disponibles en GenBank. Hemos diseñado 6 SNPs que producen genotipos únicos SNP para distinguir P. falciparum o P. vi vax de otras especies de Plasmodium (Tabla 6). Hemos probado este ensayo en muestras de mosquitos recolectados en Malí, Camerún, Tanzania, Zambia y Brasil y confirmó que este conjunto particular de marcadores funciona independientemente de la especie de mosquito.

Harina de sangre PCR de detección:

Citocromo b secuencias de 7 especies huésped (humanos, de pollo, vaca, perro, cabra, cerdo y ovejas) se obtuvieron de GenBank y se generaron las secuencias de consenso. SNPs informativos para cada host luego fueron seleccionados para el genotipado. Pusimos a prueba esta con las fuentes de sangre de 7 animales diferentes (Tabla 7).

Debido a que los fragmentos de PCR son cortos (80 a 120 pb), esto funciona en el ADN un tanto degradada o bloodmeals en digeridas parcialmente a partir de tejido de mosquitos. La probabilidad de llamadas falsos positivos se reduce considerablemente al tener múltiples marcadores por tipo de host.

s "> Figura 1
Figura 1. programa termociclador para paso de extensión SNP. El ciclo de amplificación es total de 200 (5x40).

Figura 2
Figura 2. Mass-espectrograma para la MDA. El eje X es la masa (Da) de productos de extensión de SNP y el eje Y es la intensidad de la señal. Las líneas rojas indican la masa esperada de imprimación no incorporado de Extensión, SNP alelo 1 y alelo 2 del marcador seleccionado. Líneas grises indican espera que la masa de otros marcadores de la MDA. Esta parcela se genera a partir de software de análisis de datos (Typer analizador o Typer Viewer) del archivo de datos de salida después del paso 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

e = "always"> Figura 3
Ver Figura 3. individual SNP grupo genotipo El eje X es el valor del arco tangente (etiquetado como "Angle") de las intensidades de señal de SNP alelo 1 y SNP alelo 2. El eje Y es la magnitud de la señal de llamada genotipo. Esta parcela se proporciona en el software de análisis de datos (Typer analizador o Typer Viewer). Cualquier dato particulares se pueden seleccionar con un clic de un botón del ratón y los datos de la muestra seleccionada se indica por el círculo. La agrupación de análisis previsto en los clusters de software genotipos con un umbral de varianza definida por el usuario y los colores de forma automática tres genotipos de un SNP bialélicas. El ejemplo mostrado aquí indica individuos homocigotos T (TT) como triángulos azules, heterocigoto (TA) como cuadrados verdes y los individuos homocigotos A (AA) como naranja invertida triángulos. Los círculos rojos representan Ninguna llamada (sin amplificación).t = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Reactivo Concentración en 5 l Volumen Volumen
(1 rxn) (96) rxns
Agua (grado HPLC) N / A 0,8 l 92,2 l
10x PCR Buffer con mM MgCl2 20 1x (2 mM MgCl2) 0,5 l 57,6 l
MgCl2 (25 mM) ** 2 mM 0,4 l 46,1 l
mezcla de dNTP (25 mM cada uno) *** 500 mM 0,1 l 11,5 l
Mezcla de cebadores (500 nM cada uno) 100 nM 1,0 l 115.2 l
PCR Enzyme (5 U / l) 1,0 U / reacción 0,2 l 23,0 l
Volumen total: 3,0 l 345.6 l

Tabla 1. Multiplex PCR receta de cóctel. El volumen de cada reactivo para la etapa de extensión de PCR para una reacción y 96 reacciones con un voladizo 20%.

Volumen Total
Reactivo Volumen (1 rxn) Volumen (96 rxn)
Agua (grado HPLC) 1,53 l 176.3 l
SAP Buffer (10x) 0,17 l 19,6 l
Enzima SAP (1,7 U / l) 0,30 l 34,6 l
2,00 l 230.4 l

Tabla 2. solución de enzima SAP. El volumen de cada reactivo para el tratamiento de fosfatasa alcalina de camarón para una reacción y 96 reacciones con un voladizo 20%.

Reactivo Conc. En 9 l Volumen (1rxn) Volumen (96 rxns)
Agua (grado HPLC) N / A 0,6190 l 71,3 l
IPLEX Buffer Plus (10x) 0.222x 0,2000 l 23,0 l
mezcla Terminación IPLEX 1x 0,2000 l 23,0 l
Mezcla de extensión del cebador 0,9400 l 108.3 l
enzima IPLEX 1x 0,0410 l 4,7 l
Volumen Total 2,0000 l 230.4 l

Tabla 3. Extensión SNP cóctel El volumen de cada reactivo para la etapa de extensión de SNP para una reacción y 96 reacciones con un voladizo 20%.

Tabla 4
Tabla 4. genotipos SNP para cada especie. 28S IGS-540, 28S IGS-649 y 01.073 a 213 están situados en el cromosoma X, 04679-157 está en el cromosoma 2 y 10313-052 está en el cromosoma 3. híbrido genotipo (heterocigoto) se resalta en amarillo. Variante fija en A. coluzzii está marcado en luz variante azul y fija en A. gambiae está marcado en la oscuridadazul.

Tabla 5
Tabla 5. genotipos SNP para kdr. Dos SNPs KDR # 1 y # 2 KDR constituyen un genotipo para el 1014 ª codón del gen párr. La primera base es invariable por lo que no está incluido en el ensayo. Genotipos homocigotos susceptibles están marcados en azul. El más resistente genotipo homocigoto L1014F está marcada en azul oscuro. El color amarillo indica heterocigoto. El L1014 S, genotipo resistencia intermedia, se muestra en naranja.

Tabla 6
Tabla 6. SNP genotipos de P. falciparum y P. vivax ong>. Total de 6 SNPs se utilizan para determinar la presencia de parásito de la malaria. Pl-0041, Pl-1269 y PL-1549 contienen P. falciparum alelos específicos (G, T y T respectivamente). Amplificación simultánea de los tres alelos indica la presencia de P. relativamente intacto ADN falciparum en el ADN de la muestra. La amplificación de alelos alternativos (A para Pl-0041 y PL-1269) indica la presencia de otras especies de Plasmodium (por ejemplo, P. vivax, P. ovale o P. malariae) en la muestra. Pf-1549 se encuentra en regiones con muchos más P. falciparum específica regiones flanqueantes por lo que este SNP sólo se amplifica cuando P. falciparum está presente. Pl-0071, Pl-1245 y PL-0157 contienen P. vivax alelos específicos (G, G y T respectivamente). La amplificación de alelos alternativos (A, A y C, respectivamente) indica la presencia de otro ADN Plasmodium en la muestra. Mosquitos no infectados no tendrán la amplificación en los 6 marcadores. Tabla 7
Tabla 7. SNP genotipos de 7 anfitriones:. Humano, pollo, vaca, perro, cabra, cerdo y oveja "NC" es sinónimo de "No Llame" (sin amplificación) en la siguiente tabla. Tenga en cuenta que algunos de amplificación no específica puede ocurrir en algunos loci, pero no para todos los SNPs de un host en particular. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La MDA se compone de cinco pasos principales: la amplificación por PCR, la fosfatasa alcalina de gamba (SAP) de reacción, de extensión SNP, producto de extensión de acondicionamiento, y la matriz con ayuda de láser desorción / ionización - tiempo de vuelo (MALDI-TOF) 33-37. La primera etapa de amplificación PCR amplifica ADN que flanquea cada SNP de manera que la plantilla de ADN lo suficientemente estará disponible en la etapa de extensión de SNP. La reacción SAP neutraliza dNTPs no utilizados que pueden interferir con la siguiente etapa de extensión SNP. Extensión SNP implica una sola cebador de extensión por locus SNP y nucleótidos terminadores modificado en masa. Los nucleótidos modificados 3'-end impiden nucleótidos subsiguientes de ser incorporado en el cebador de extensión. Por lo tanto la masa de la base de solo indica el genotipo del SNP correspondiente.

El paso más crítico para asegurar el éxito de este enfoque es tener un buen conjunto de datos de polimorfismos existentes en el organismo objetivos. Utilizamos SNPs bien caracterizados para la identificación de especies (N> 900) 10,12,38-40 y kdr (N> 1000) 15,18. Las especies SNPs específicos para Plasmodium se identificaron a partir de alineación de secuencias de las secuencias de citocromo b de 123 P. falciparum, P. 97 vivax, P. 11 malariae y P. 18 ovale aislar secuencias de África que estaban disponibles en GenBank. Citocromo b secuencias de 7 especies huésped (humanos, de pollo, vaca, perro, cabra, cerdo y ovejas) se obtuvieron de GenBank para la identificación SNP-host específico. Sobre la base de esta gran cantidad de datos de secuencias, hemos sido capaces de diseñar un ensayo de diagnóstico robusto utilizando un software de diseño de ensayo.

El número de marcadores de cada reacción puede acomodar está determinada por la compatibilidad bioquímica de la mezcla de cebadores dado una tolerancia al cebador dímero potencial (0,9 0-1 de escala). Autores utilizan el valor por defecto (1; más estricto) para el potencial de cebado falso. Relaxation de este parámetro puede aumentar potencialmente el número de SNPs que se pueden ensayar en una sola reacción, además de la SNPs incluidos en este estudio.

Los pasos de amplificación por PCR son robustos y normalmente no requieren un ajuste del diseño del ensayo inicial. La mezcla extensión SNP (Tabla 3), sin embargo, puede necesitar modificaciones en la cantidad relativa de cada cebador usando espectrometría de masas para asegurar una señal suficiente para la relación de ruido se consigue para cada cebador. La receta cebador de extensión SNP siempre es el resultado de estos ajustes. Compatibilidad entre los cebadores de extensión puede limitar el número total de SNPs que puede ser multiplex en una sola reacción. Dado que el volumen de reacción es pequeño (5-8 l), la placa de muestra tiene que ser sellado adecuadamente para evitar la evaporación durante los pasos de amplificación.

Esta plataforma puede anotar simultáneamente hasta 35 SNPs por reacción, mientras que otras plataformas de genotipado de SNP pueden ALOJAMIENTOe más de mil SNPs por reacción 41. Con los avances en la tecnología de secuenciación del genoma, se puede adquirir a millones de SNPs utilizando 29,42,43 secuenciación de próxima generación. Sin embargo, la técnica utilizada aquí proporciona una aplicación ideal para estudios que requieren el genotipado de un número relativamente pequeño de marcadores para muchos (100s-1.000 s) particulares. Discusión adicional de las restricciones de diseño de diferentes plataformas de genotipado SNP está cubierto en estudios previos 41.

La MDA está dirigido a la caracterización de los rasgos de importancia epidemiológica de los vectores del paludismo y proporciona un protocolo ideal para la genotipificación de SNP medio rendimiento que analizan miles de mosquitos recolectados de las poblaciones naturales. La MDA presenta aquí ofrece (1) en un 90% de reducción en el tiempo de trabajo, (2) una reducción del 60% en los costos de reactivos, y (3) la reducción de falsos positivos / negativos mediante la utilización de múltiples marcadores. El ensayo propuesto puede mejorar por estudios epidemiológicosfacilitando enormemente la recogida de datos. Además, puede mejorar los estudios de asociación del genoma mediante la caracterización de las muestras de mosquitos con respecto al origen de la población, resistencia a los insecticidas, la susceptibilidad del parásito y la elección de acogida. Finalmente, este MDA puede proporcionar inspiración y una plantilla para el diseño de otros ensayos multiplex usando una plataforma de genotipado SNP basado en MALDI-TOF.

Acknowledgments

Agradecemos a los Dres. Anthony Cornel y Laura Norris en la UC Davis y el Dr. Katharina Kreppel en la Universidad de Glasgow para proporcionar muestras de mosquitos de Tanzania. Damos las gracias a la Sra Smita Das y el Dr. Douglas Norris de la Escuela Johns Hopkins de Salud Pública para el intercambio de muestras de mosquitos de Zambia. También damos las gracias al Sr. Lee V. Millon en el Laboratorio de Genética Veterinaria para la formación en diseño de ensayo. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud de subvención R01AI 078.183 y R21AI062929.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.

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References

  1. Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
  2. Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
  3. Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
  4. Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
  5. Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
  6. Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
  7. Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
  8. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. (2013).
  9. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
  10. White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
  11. Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
  12. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
  13. Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
  14. Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
  15. Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
  16. Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
  17. Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
  18. Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
  19. Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
  20. Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
  21. Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
  22. Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
  23. Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
  24. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
  25. Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
  26. Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
  27. Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
  28. Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
  29. Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
  30. Methods in Anopheles Research. Second edition, MR4. Available from: http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx 1725-1732 (2010).
  31. Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
  32. Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
  33. Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. (2011).
  34. Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
  35. Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2, (Unit 2.12), (2009).
  36. Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
  37. Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
  38. Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
  39. Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
  40. Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
  41. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
  42. Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
  43. Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).

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