Un test multi-rilevamento per la malaria Trasmissione Zanzare

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Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).

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Abstract

Il complesso di specie Anopheles gambiae include il principale malaria trasmissione zanzare in Africa. Poiché queste specie sono di tale importanza medica, alcuni tratti sono tipicamente caratterizzati mediante saggi molecolari per aiutare negli studi epidemiologici. Queste caratteristiche includono l'identificazione delle specie, resistenza agli insetticidi, lo stato di infezione del parassita, e la preferenza di accoglienza. Dal momento che le popolazioni del complesso Anopheles gambiae sono morfologicamente indistinguibili, una reazione a catena della polimerasi (PCR) è tradizionalmente utilizzato per identificare le specie. Una volta che la specie è nota, alcuni saggi a valle sono regolarmente eseguiti per chiarire ulteriori caratteristiche. Ad esempio, le mutazioni note come KDR in un gene para conferiscono resistenza contro DDT e insetticidi piretroidi. Inoltre, saggi immunoenzimatici (ELISA) o Plasmodium rilevazione del DNA del parassita PCR sono utilizzati per rilevare i parassiti presenti nei tessuti di zanzara. Infine, un combination di PCR e di restrizione con enzimi può essere usato per spiegare la preferenza host (ad esempio, umano contro sangue animale) per lo screening le farine di sangue di zanzara per DNA specifiche dell'host. Abbiamo sviluppato un saggio multi-rilevamento (MDA) che unisce tutti i saggi suddetti in un singolo multiplex 33SNPs reazione genotipizzazione per 96 o 384 campioni per volta. Perché il MDA include più marcatori per le specie, il rilevamento Plasmodium, e l'identificazione del sangue di accoglienza, la possibilità di generare falsi positivi o negativi è notevolmente ridotto da saggi precedenti che comprendono un solo marcatore per tratto. Questo test robusto e semplice può rilevare questi tratti zanzara chiave conveniente e in una frazione del tempo di saggi esistenti.

Introduction

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii e Anopheles gambiae sono i vettori principali responsabili della trasmissione della malaria in Africa 1. Queste tre specie sono morfologicamente indistinguibili 2 e si distinguono solo per saggi molecolari 3-9. In aggiunta, ci sono molti saggi a valle di routine condotte per aiutare genetica epidemiologici e demografici studi. Questi includono (1) un test di genotipizzazione per le isole di speciazione 10-12, (2) un test di genotipizzazione riconoscere SNP non sinonimo del 1014 ° aminoacido posizione codone del gene para (la resistenza knock-down, o KDR, SNP) 13 -18, (3) l'individuazione dei parassiti PCR 19-23, e (4) di screening per il DNA specifiche dell'host in midguts zanzara 24,25.

Abbiamo sviluppato un saggio multi-rilevamento (MDA) che unisce tutti questi saggi in una singola reazione multiplex con l'obiettivo di unalyzing caratteristiche epidemiologicamente importanti vettori della malaria in Africa. Il saggio MDA include più marcatori per la rilevazione (1) specie (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, o altro (nessuno dei tre)), (2) resistenza agli insetticidi rappresentato in KDR SNPs (sia L1014F e L1014S) , (3) presenza di due importanti parassiti della malaria, Plasmodium falciparum e P. vivax, e (4) fonte di sangue da un aviaria e sei ospiti mammiferi.

Tradizionalmente, questi saggi sono stati condotti in reazioni a catena della polimerasi separati. Quando tutti questi test vengono effettuati utilizzando una piattaforma tradizionale PCR, che richiede lo svolgimento di 8-10 PCR test di reazione e di accompagnamento gel elettroforesi passi. Ogni individuo reazione PCR dalla preparazione alla documentazione dei risultati richiede 4-5 ore, mentre il metodo MDA presentato qui richiede circa 5 ore nella sua totalità. Ciò equivale a un risparmio del 90% del costo del lavoro da solo. La MDA presentata qui costa 5 dollariper campione al genotipo tutti i 33 SNP. Questo è molto meno costoso che i test singoli a base di gel di agarosio, che costa circa $ 1.50 per campione. Saggi di rivelazione tutte le caratteristiche oggetto della MDA richiederebbe un minimo di 8-10 saggi basati gel di agarosio separati ad un costo di $ 12-15 per campione. Inoltre, la MDA riduce notevolmente la possibilità di generare un falso positivo o negativo utilizzando almeno tre marcatori per ogni rilevazione parassita o fonte host.

La piattaforma abbiamo utilizzato non è limitata a vettori malaria ma può essere utilizzato in un'ampia varietà di applicazioni come medicina, medicina veterinaria e biologia di base 26-28. Approfondimenti di associazione o di genetica di popolazione studi che coinvolgono un grande (in ordine di 100s) numero di campioni richiedono analisi di costo-efficacia di screening per più marcatori contemporaneamente. La maggior parte degli studi che utilizzano due o più PCR separati potrebbero attuare la MDA per risultati più rapidi a un costo inferiore.

Protocol

1. PCR Amplificazione

  1. Mescolare tutti i primer PCR (Vedi Tabella supplementare S1) in una provetta 1,5 ml. Ogni SNP ha due primer (avanti e indietro). Assicurarsi che la concentrazione azione di ciascun primer PCR è mantenuta a 100 micron. Rendere abbastanza mix primer per 500-1.000 reazioni di ridurre il pipettaggio errore e il tempo al banco (Vedi Tabella supplementare S2). Se lo si desidera, preparare aliquote per 100-200 reazioni per tubo e conservare a -20 ° C.
  2. Preparare PCR cocktail come descritto nel protocollo del produttore (Tabella 1). Il volume per 96 reazioni include una sporgenza del 20%. Vortex la provetta contenente il cocktail PCR leggermente e centrifugare per 30 secondi a 2.000 x g.
  3. Dispensare 3 ml di cocktail PCR in ciascun pozzetto di una non-costeggiava 96 pozzetti. Una pipetta ripetitore può risparmiare tempo per questo processo.
  4. Aggiungere 2 ml di DNA genomico appropriato di zanzare in ciascun pozzetto.
    NOTA: Processo di ottenere DNA genomico da m tessuti osquito (testa / torace, addome o il corpo intero) vengono descritti in altre letterature 29-32. Scegli un protocollo di estrazione del DNA opportuno differenziare quelli con Plasmodium nel sangue (addome) da zanzare infettive (Plasmodium nella testa / torace). Usiamo tipicamente DNA estratto da parti del corpo (testa / torace o addome) di zanzare, quindi la concentrazione di DNA varia da 0.05-2ng / ml. Anche se l'ingresso DNA totale è inferiore a quella indicata dal produttore (5-10ng / rxn), di solito ottiene robusto SNP chiama dal 98% dei campioni di DNA, senza tutta l'amplificazione del genoma.
  5. Sigillare la piastra, delicatamente miscelare o vortex e centrifugare per 1 min a 370 x g.
  6. Utilizzare il seguente protocollo termociclatore di effettuare l'amplificazione PCR: (1) 94 ° C per 2 min, (2) 94 ° C per 30 sec, (3) 56 ° C per 30 sec, (4) 72 ° C per 1 min , (5) ripetere i (2) - (4) per 45 cicli, (6) 72 ° C per 1 min, e 4 ° C attesa.
_title "> 2. SAP Trattamento

  1. Preparare la soluzione enzimatica SAP in una piastra da 96 pozzetti (vedere Tabella 2). Processo 96 campioni in un piatto. Il volume per 96 reazioni include una sporgenza del 20%.
  2. Vortex la provetta di soluzione enzimatica SAP leggermente e centrifugare per 30 sec a 2.000 x g. Dispensare 2 ml di soluzione SAP enzima in ogni pozzetto. Ancora una volta, una pipetta ripetitore può risparmiare tempo per questo processo.
  3. Sigillare la piastra, delicatamente miscelare o vortex e centrifugare per 1 min a 370 x g. Incubare la piastra come segue: (1) 37 ° C per 40 min, (2) 85 ° C per 5 minuti per inattivare l'enzima, (3) 4 ° C attesa. Al termine di questa fase, conservare la piastra a -20 ° C prima di continuare. Elaborare il piatto memorizzato entro 2 settimane.

3. SNP Extension

  1. Se la piastra campione viene congelato dopo il trattamento SAP, consentirà di scongelare a RT prima di procedere.
  2. Preparare la miscela di primer extension (Supplemental Tabella S2). Ogni SNP ha uno extension primer. Mantenere la concentrazione azione di ciascun primer estensione a 500 micron. Facoltativamente, aliquota per 100-200 reazioni per tubo e conservare a -20 ° C.
  3. Preparare mix estensione, come descritto nella Tabella 3. Il volume di reazione 96 comprende una sporgenza di 20%.
  4. Vortex tubo di estensione cocktail leggermente e centrifugare per 30 sec a 2.000 x g. Dispensare 2 ml di cocktail estensione in ogni pozzetto. Ancora una volta, una pipetta ripetitore può risparmiare tempo per questo processo.
  5. Sigillare la piastra, delicatamente miscelare o vortex e centrifugare per 1 min a 370 x g. Thermocycle piastra come mostrato in Figura 1. A questo punto, procedere alla spettrometria di massa o conservare la piastra a -20 ° C fino a 2 settimane.

4. Condizionamento della SNP Extension prodotto per ottimizzare l'analisi Spettrometria di Massa

  1. Se la piastra campione viene congelato dopo estensione SNP, consentirà di scongelare a RT prima di procedere.
  2. Trasferire 15mg di resina dalla sua container sulla piastra fossetta utilizzando un cucchiaio allungata. Utilizzare il raschietto per diffondere la resina nei pozzetti della piastra fossetta. Sweep il raschietto da parte a parte attraverso la piastra fossetta per diffondere la resina. Assicurarsi che ci sia la resina in ogni pozzetto.
  3. Raschiare resina in eccesso dal piatto fossetta con il raschietto. Lasciate riposare la resina nella piastra fossetta per almeno 20 min. Mentre la resina lasciando riposare nella piastra fossetta, aggiungere 41 ml di acqua per HPLC a ciascun pozzetto della piastra campione.
  4. Inserire delicatamente la piastra del campione capovolta, sulla piastra fossetta. Assicurarsi che il ripristino del campione piatto contro il piccolo posto arrotondata della piastra fossetta, che allinea i pozzi nella piastra campione con i pozzi nella piastra fossetta.
  5. Tenendo la piastra del campione e la piastra fossetta insieme, delicatamente capovolgere così la resina cade dalla piastra fossetta nei pozzetti della piastra del campione. Toccare la piastra fossetta così la resina cade nel piatto del campione. Assicurarsi che tutti la resina in diPiastra mple cade nei pozzetti della piastra del campione. Centrifugare la piastra a 3.200 g per 30 sec.
  6. Ruotare piatto del campione su un rotatore per 5 minuti a RT. Rotator deve ruotare il piatto del campione a 360 ° su l'asse lungo.
  7. Centrifugare la piastra campione a 3.200 g per 5 min. Dopo questa fase, la piastra di campione a -20 ° C fino a 2 settimane prima di procedere alla fase successiva.

5. MALDI-TOF spettrometria di massa

  1. Trasferire il prodotto estensione SNP condizionata su un bioarray come SpectroCHIP secondo le istruzioni del produttore. Usiamo MassARRAY Nanodispenser per questo passo.
  2. Una volta completato il trasferimento, definire come saggi e piatti sono da istituire nel database test. Assegnare un nome al test e le piastre in modo tale che ogni piatto ha identificatore univoco che collega a specifici test di progettazione (Supplemental Tabella S3).
  3. Dopo dosaggio e la piastra sono state definite, acquisire spettri utilizzando uno spettrometro di massa.

  1. Eseguire l'analisi dei dati utilizzando un software in tempo reale l'interpretazione dei dati di analisi PCR come Typer Analyzer o TyperViewer (Sequenom). Ottenere i dati in formato .xml che contiene il layout di esempio, spettrogramma di massa per ogni bene, le informazioni marcatore tra cui nome, di massa prevista per ogni variante del corrispondente SNP, e qualsiasi errore o messaggi di avviso associati a ogni reazione. Vedere la Figura 2 per la risultante spettrogramma di massa.
  2. Effettuare analisi SNP genotipo di clustering impostando la soglia di rilevazione (ampiezza o rapporto segnale rumore) e la tolleranza / varianza consentita per ciascun genotipo. La figura 3 mostra un esempio di un 04707-KDR # 2 SNP cluster genotipo.
  3. Esportare le conseguenti SNP chiamate genotipo in un foglio di calcolo.

Representative Results

Identificazione di specie:

I seguenti 5 SNPs identificano tre specie (A. arabiensis, A. coluzzii e A. gambiae) (Tabella 4). Se un campione non è una delle tre specie, i tre SNPs (01073-213, 04679-157 e 10313 -052) non riescono ad amplificare.

KDR genotipo per inferire resistenza agli insetticidi:

Il 1014 ° codone del canale del sodio voltaggio-dipendenti para corrisponde a KDR. Due SNPs sul 2 ° e 3 ° base del 1014 th codone determinano i tre possibili aminoacidi. . Le possibili combinazioni dei genotipi sono elencati nella Tabella 5 Questo SNP funziona per tre specie di vettori malaria africani: A. arabiensis, A. coluzzii e A. gambiae. Questi SNPs non riescono ad amplificare in A. darlingi, un vettore di malaria brasiliano. Questo non èsorprendente dato che mitocondriale somiglianza sequenza del genoma tra A. darlingi e A. gambiae è solo 88,9% mentre sequenza del genoma mitocondriale similarità tra tre vettori di malaria africani sono oltre il 98%. Altre specie non sono stati testati. Eravamo riusciti a amplificazione da campioni raccolti in Mali, Camerun, Tanzania e Zambia.

Rilevamento Plasmodium:

Se il DNA intatto Plasmodium è presente nel tessuto zanzare, ci aspettiamo di rilevare P. falciparum o P. vivax DNA specifico tra il campione di DNA estratto dalla zanzara. Le specie SNPs specifici sono stati identificati da allineamento di sequenze della sequenza citocromo b di 123 P. falciparum, P. 97 vivax, P. 11 malariae e 18 P. ovale isolare sequenze dall'Africa disponibili su Genbank. Abbiamo progettato 6 SNPs che producono uniche genotipi SNP distinguere P. falciparum o P. vi vax da altre specie di Plasmodium (Tabella 6). Abbiamo testato questo test su campioni di zanzare raccolti in Mali, Camerun, Tanzania, Zambia e Brasile e ha confermato che questo particolare insieme di marcatori funziona indipendentemente specie di zanzare.

PCR rilevamento farine di sangue:

Citocromo b sequenze da 7 specie ospite (umana, pollo, mucca, cane, capra, maiale e pecora) sono stati raccolti da Genbank e sono stati generati sequenze consenso. SNPs informativi per ogni host sono stati selezionati per la genotipizzazione. Abbiamo testato questo con le fonti di sangue provenienti da 7 diversi animali (Tabella 7).

Perché frammenti di PCR sono brevi (80-120 bp), questo funziona su DNA piuttosto degradato o bloodmeals sul parzialmente digerite dal tessuto zanzara. La probabilità di chiamate falsi positivi è notevolmente ridotto dalla presenza di più marcatori per tipo host.

s "> Figura 1
Figura programma 1. Thermocycler per SNP passo estensione. Il ciclo di amplificazione è totale di 200 (5x40).

Figura 2
Figura 2. Massa-spettrogramma per la MDA. L'asse X è la massa (Da) di prodotti di estensione SNP e l'asse Y è l'intensità del segnale. Le linee rosse indicano la massa prevista di primer Unincorporated Extension, SNP allele 1 e allele 2 per il marcatore selezionato. Linee grigie indicano attese di massa di altri marcatori della MDA. Questo terreno è generato da software di analisi dati (Typer Analyzer o Typer Viewer) del file dati di uscita dopo la fase 5. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

e = "always"> Figura 3
Vista Figura 3. Individual SNP genotipo gruppo L'asse X è il valore arcotangente (etichettato come "Angolo") delle intensità di SNP allele 1 e SNP allele 2. segnale L'asse Y è l'ampiezza del segnale di chiamata genotipo. Questo grafico è fornito nel software di analisi dati (Typer Analyzer o Typer Viewer). Tutti i dati particolari possono essere selezionati con un clic di un pulsante del mouse e dati campione selezionato è indicato dal cerchio. Analisi Clustering fornito negli ammassi software genotipi con una soglia varianza definita dall'utente e automaticamente i colori tre genotipi di SNP biallelic. Esempio qui mostrato indica omozigoti T (TT) individui come triangoli blu, eterozigote (TA) come quadrati verdi e omozigoti A (AA) individui come arancio invertito triangoli. Cerchi rossi rappresentano Nessuna chiamata (senza amplificazione).t = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Reagente Concentrazione in 5 ml Volume Volume
(1 rxn) (96 rxns)
Acqua (HPLC) N / A 0,8 ml 92.2 ml
10x PCR Buffer con 20 mM MgCl2 1x (2 MgCl2 mM) 0,5 microlitri 57,6 ml
MgCl2 (25 mm) ** 2 mm 0,4 ml 46.1 ml
mix dNTP (25 mM ciascuno) *** 500 micron 0,1 ml 11.5 ml
Mix Primer (500 nM ciascuno) 100 nM 1,0 ml 115,2 ml
PCR Enzyme (5 U / ml) 1.0 U / rxn 0,2 ml 23.0 ml
Volume totale: 3,0 ml 345,6 ml

Tabella 1. Multiplex PCR ricetta cocktail. Il volume di ciascun reagente per la fase di estensione per una reazione PCR e 96 reazioni con una sporgenza 20%.

Volume totale
Reagente Volume (1 rxn) Volume (96 rxn)
Acqua (HPLC) 1.53 microlitri 176,3 ml
SAP Buffer (10x) 0,17 ml 19,6 ml
SAP enzima (1,7 U / ml) 0,30 ml 34,6 ml
2.00 microlitri 230,4 ml

Tabella soluzione enzimatica 2. SAP. Il volume di ciascun reagente per il Gambero trattamento fosfatasi alcalina per una reazione e 96 reazioni con una sporgenza 20%.

Reagente Conc. In 9 microlitri Volume (1rxn) Volume (96 rxns)
Acqua (HPLC) N / A 0,6190 microlitri 71,3 ml
IPLEX Buffer più (10x) 0.222x 0,2000 microlitri 23.0 ml
IPLEX mix terminazione 1x 0,2000 microlitri 23.0 ml
Mix Extension Primer 0,9400 microlitri 108.3 ml
IPLEX enzima 1x 0,0410 microlitri 4,7 ml
Volume totale 2.0000 pl 230,4 ml

Tabella 3. SNP Extension cocktail Il volume di ogni reagente per la fase di estensione SNP per una reazione e 96 reazioni con una sporgenza 20%.

Tabella 4
Tabella 4. SNP genotipi per ogni specie. 28S IGS-540, 28S IGS-649 e 01.073-213 si trovano sul cromosoma X, 04.679-157 è sul cromosoma 2 e 10.313-052 è sul cromosoma 3. Hybrid genotipo (eterozigote) è evidenziato in giallo. Variante fissa in A. coluzzii è segnato in luce variante blu e fissa in A. gambiae è segnato nel buioblu.

Tabella 5
Tabella 5. genotipi SNP per kdr. Due SNPs KDR # 1 e KDR # 2 costituiscono un genotipo per il 1014 ° codone di gene para. La prima base è invariabile in modo che non è inclusa nel saggio. Genotipi omozigoti sensibili sono contrassegnati in blu. Il più resistente L1014F omozigote genotipo è segnato in blu scuro. Colore giallo indica eterozigote. Il LDN 1014 S, intermedia genotipo resistente, è indicato in arancione.

Tabella 6
Tabella 6. SNP genotipi di P. falciparum e P. vivax ong>. Trovati 6 SNPs sono utilizzati per determinare la presenza di parassita della malaria. Pl-0041, Pl-1269 e Pl-1549 contengono P. falciparum alleli specifici (G, rispettivamente, T e T). L'amplificazione simultanea di tre alleli indica la presenza di relativamente intatte P. DNA falciparum in campione di DNA. Amplificazione di alleli alternativi (A per Pl-0041 e Pl-1269) indica la presenza di altre specie di Plasmodium (ad esempio, P. vivax, P. ovale o P. malariae) nel campione. Pf-1549 si trova in regioni con molte altre P. falciparum specifiche regioni fiancheggianti quindi questo SNP è amplificato solo quando P. falciparum è presente. Pl-0071, Pl-1245 e Pl-0157 contengono P. vivax alleli specifici (G, G e T, rispettivamente). Amplificazione di alleli alternativi (A, A e C, rispettivamente) indica la presenza di altri DNA Plasmodium nel campione. Zanzare infette non avranno amplificazione su tutti e 6 i marcatori. Tabella 7
Tabella 7. genotipi SNP per 7 ospiti:. Umana, Pollo, Vacca, Cane, Capra, maiale e "NC" Sheep sta per "No chiamata" (senza amplificazione) nella tabella seguente. Si noti che alcuni di amplificazione non specifica può verificarsi in alcuni loci, ma non per tutti gli SNPs di un determinato host. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

La MDA è composto da cinque fasi principali: PCR amplificazione, fosfatasi alcalina gamberetti (SAP) di reazione, di estensione SNP, prodotto di estensione di condizionamento, e matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione - tempo di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa 33-37. Il primo passo di amplificazione PCR amplifica DNA che fiancheggia ogni SNP in modo che abbastanza DNA modello sarà disponibile al passo estensione SNP. La reazione SAP neutralizza dNTP inutilizzati che possono interferire con il passo successivo estensione SNP. Estensione SNP comporta un solo primer extension per SNP locus e nucleotidi terminator-modificato di massa. I nucleotidi modificati 3'-end impediscono nucleotidi successive venga incorporato nel primer estensione. Così la massa della singola base indica il genotipo del corrispondente SNP.

La fase più critica per garantire il successo di questo approccio sta avendo un buon set di dati di polimorfismi presenti in organismi bersaglios. Abbiamo usato SNPs ben caratterizzati per l'identificazione di specie (N> 900) 10,12,38-40 e KDR (N> 1000) 15,18. Le specie SNP specifici per Plasmodium sono stati identificati da allineamento di sequenze delle sequenze del citocromo b di 123 P. falciparum, P. 97 vivax, P. 11 malariae e 18 P. ovale isolare sequenze dall'Africa che erano disponibili sul Genbank. Citocromo b sequenze da 7 specie ospite (umana, pollo, mucca, cane, capra, maiale e pecora) sono stati raccolti da Genbank per l'identificazione SNP specifiche dell'host. Sulla base di questo grande corpo di dati di sequenza, siamo stati in grado di progettare un test diagnostico affidabile utilizzando un software di test designer.

Il numero di marcatori ciascuna reazione può ospitare è determinata dalla compatibilità biochimica della miscela di primer data una tolleranza di primer potenziale dimero (0,9 scala 0-1). Gli autori hanno utilizzato il valore di default (1; più rigorosa) per falso potenziale innesco. Relaxation di questo parametro può potenzialmente aumentare il numero di SNP che possono essere dosati in una singola reazione oltre al SNP inclusi in questo studio.

I passi di amplificazione PCR sono robusti e in genere non richiedono la regolazione dalla progettazione iniziale dosaggio. L'estensione mix SNP (Tabella 3), tuttavia, può essere necessario modificare in quantità relativa di ciascun primer utilizzando la spettrometria di massa per garantire un segnale sufficiente a rumore si ottiene per ciascun primer. La ricetta SNP primer extension disponibile è il risultato di queste regolazioni. La compatibilità tra primer estensione può limitare il numero totale di SNP che può essere multiplex in una singola reazione. Poiché il volume di reazione è piccola (5-8 ml), la piastra del campione deve essere correttamente chiuso, per evitare l'evaporazione durante fasi di amplificazione.

Questa piattaforma può contemporaneamente segnare fino a 35 SNPs per reazione, mentre altre piattaforme di genotipizzazione SNP possono Alloggie oltre un migliaio di SNPs per reazione 41. Con i progressi della tecnologia di sequenziamento del genoma, si possono acquisire milioni di SNPs mediante sequenziamento di prossima generazione 29,42,43. Tuttavia, la tecnica utilizzata prevede un'applicazione ideale per studi che richiedono genotipizzazione un numero relativamente piccolo di marcatori per vari (100s-1.000 s) individui. Ulteriori discussione dei vincoli di progettazione di diverse piattaforme di genotipizzazione SNP è coperto in studi precedenti 41.

La MDA è volto a caratterizzare epidemiologicamente importanti tratti di vettori della malaria e fornisce un protocollo ideale per le medie throughput SNP test di genotipizzazione che analizzano migliaia di zanzare raccolti da popolazioni naturali. La MDA qui presentata prevede (1) su una riduzione del 90% nel tempo di lavoro, (2) una riduzione del 60% dei costi di reagenti, e (3) la riduzione dei falsi positivi / negativi utilizzando più marcatori. Il test proposto può migliorare studi epidemiologici difacilitando notevolmente la raccolta dei dati. Inoltre, può migliorare gli studi di associazione sull'intero genoma caratterizzando i campioni di zanzara per l'origine della popolazione, resistenza agli insetticidi, parassiti suscettibilità e la scelta di accoglienza. Infine, questo MDA può fornire ispirazione e un modello per la progettazione di altri test multiplex utilizzando una piattaforma SNP genotipizzazione basata MALDI-TOF.

Acknowledgments

Ringraziamo Drs. Anthony Cornel e Laura Norris alla UC Davis e il Dr. Katharina Kreppel presso l'Università di Glasgow per la fornitura di esemplari di zanzara da Tanzania. Ringraziamo la signora Smita Das e il dottor Douglas Norris dalla Johns Hopkins School of Public Health per la condivisione di campioni di zanzara da Zambia. Ringraziamo anche il signor Lee V. Millon al Veterinary Genetics Laboratorio di formazione sulla progettazione del test. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health concedere R01AI 078.183 e R21AI062929.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.

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References

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