לימפה Duct cannulated עכברוש דגם mesenteric: בקשה להערכה של המעיים הלימפה תרופות תחבורה

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trevaskis, N. L., Hu, L., Caliph, S. M., Han, S., Porter, C. J. The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport. J. Vis. Exp. (97), e52389, doi:10.3791/52389 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מערכת הלימפה המעיים משחקת תפקידי מפתח בהובלת נוזלים, קליטת שומנים ותפקוד מערכת חיסון. הלימפה זורמת ישירות למעי הדק באמצעות סדרה של כלי הלימפה ובלוטות שיתכנסו לצינור לימפה mesenteric מעולה. Cannulation של הצינור לימפה mesenteric כך מאפשר האיסוף של הלימפה mesenteric זורמת מהמעי. לימפה mesenteric מורכבת מחלק תאי של תאי מערכת חיסון (לימפוציטים 99%), חלק המימי (נוזל, פפטידים וחלבונים כגון ציטוקינים והורמוני בטן) וחלק קטן ליפופרוטאין (שומנים, מולקולות lipophilic וapo-חלבונים). מודל cannulation הצינור לימפה mesenteric לכן יכול לשמש למדידת הריכוז ושיעור התחבורה של מגוון רחב של גורמים מהמעי באמצעות מערכת הלימפה. שינויים בגורמים אלה בתגובה לאתגרים שונים (לדוגמא, דיאטות, אנטיגנים, סמים) ובמחלה (למשל, מחלת מעי דלקתית, HIV, סוכרת) יכולה גם סעיף ב 'דואר נקבע. אזור של הרחבת עניין תפקידה של תחבורת הלימפה בספיגה של תרופות אוראליות lipophilic וprodrugs שמקשרות עם מסלולי קליטת שומנים במעי. כאן אנו מתארים, בפירוט, מודל חולדה cannulated צינור לימפה mesenteric המאפשר הערכה של השיעור ושל שומנים בדם ותחבורה סמים המידה באמצעות מערכת הלימפה במשך כמה שעות לאחר לידה במערכת העיכול. השיטה היא להתאמה בקלות למדידת פרמטרים אחרים לימפה. אנו מספקים תיאורים מפורטים של הקשיים שעלולים להיוצר בעת הקמת שיטה כירורגית מורכבת זו, כמו גם נתוני נציג מניסויים כושלים ומוצלחים כדי לספק הדרכה על איך לאשר הצלחת ניסוי ולפרש את הנתונים שהתקבלו.

Introduction

הלימפה זורמת מהמעי הדק באמצעות תהליך חד-כיווני שמקורו בlacteals היחיד שנמצאים בתוך כל אחד villi מעיים הקטן 1. Lacteals יחסית חדירים לנוזלים, מקרו-מולקולות ותאים והיווצרות הלימפה ובכך מתחיל עם כנסתם של הגורמים הללו בlacteals. לימפה הראשונית בlacteals זורמת לאחר מכן מהמעי באמצעות רשת של microvessels הלימפה, איסוף (מביא) כלי הלימפה, סדרה של בלוטות לימפה mesenteric וסופו של דבר כלי הלימפה הודעה קטרי (efferent). בתוך צמתים, הלימפה עוברת דרך סדרה של הסינוסים לשדיים בי חילופי מתרחש בתאי תושב צומת חיסוניים וכן כחומר הזנת הצומת מהדם. כל הלימפה זורמת מהמעי הדק מתכנסת סופו של דבר לצינור לימפה mesenteric מעולה efferent ולאחר מכן ציסטרנה כילי. ציסטרנה כילי גם אוספת לימפה ניקוז הרקמות היקפי הזנב, intestINAL, אזורים וכבדים והמותני מצטרף הצינור לימפה בבית החזה יחד עם הלימפה מחלל החזה וחלקי גולגולת של הגוף. הצינור לימפה בבית החזה מרוקן הלימפה ישירות למערכת הוורידים בצומת של ורידי הצוואר וsubclavian הפנימיים השמאלי. הפרוטוקול המתואר כאן, המאפשר לאוסף של הלימפה ישירות מהצינור לימפה mesenteric מעולה, ובכך מקל על הניתוח של גורמים שונים העוברים ישירות מהמעי למחזור הדם המערכתי (הכללי) באמצעות מערכת הלימפה המעיים.

הפונקציות הפיזיולוגיות הגדולות שהוקצו למערכת הלימפה המעיים הן לשמור על מאזן נוזלים, כדי להקל על שומנים בדם וקליטת מולקולת lipophilic, ולאפשר לתגובות חיסוניים מתאימות 1. תאי גידול ווירוסים גם להפיץ באמצעות lymphatics המעיים 2-4 ומפתח שינויים להתרחש בתוך lymphatics בכמה פתולוגיות דלקתיות וחילוף חומרים 5-7. יכולnulation של הצינור לימפה mesenteric לאסוף הלימפה בתוך לפדר מאפשר ניתוח של זרימת נוזל בתפזורת באמצעות lymphatics המעיים כמו גם כימות של שיעור הריכוז והובלה של תאים ומולקולות שונים. שינויים בריכוז או המעבר של גורמים אלה בתגובה לאתגרים שונים (לדוגמא, דיאטות, אנטיגנים, סמים) ובמודלי מחלה (למשל, דלקת המעי הגס, HIV, סוכרת) יכול גם להיות מוערכת. בעוד שזה אי אפשר לתאר כל רכיב לימפה שניתן לנתח ולהשוות כאן בהרחבה, לימפה mesenteric פשטנית מורכבת ממימי, שומנים בדם ושלבים סלולריים. רכיבים של עניין בשלב המימי כוללים פפטידים וחלבונים כגון אנטיגנים או tolerogens 8, שליחים חיסוניים כגון ציטוקינים ותא פיטום מתווכים 9, ומתווכי חילוף חומרים כגון incretins 10. החלק הסלולרי של הלימפה mesenteric פוסט-קטרי מורכב כמעט כולו (מעל 99%) של lymphocytes 11. תאים חיסוניים שונים (תאים דנדריטיים, תאי פיטום, וכו ') להיכנס לlymphatics mesenteric מראש קטרי אבל להישאר בצומת 12. אם התאים בתוך הלימפה מביא הם עניין, ניתן לאסוף תאים אלה באמצעות הסרת הלימפה mesenteric צומת כמה ימים לפני cannulation של הצינור לימפה mesenteric 12. בדרך זו צינוריות הלימפה מביא וefferent מחוברות ישירות ותאי הלימפה בהלימפה מביא לעבור ישירות לתוך הצינור לימפה mesenteric. כך ניתן לבחון את המעבר והפנוטיפ של תאי חיסון שונים עוברים דרך lymphatics המעיים. אולי הסיבה השכיחה ביותר שצוינה עבור איסוף הלימפה mesenteric עד כה, עם זאת, היא ללמוד את העיבוד, קליטה והובלה של שומנים בתזונה ובמולקולות lipophilic 10 מעיים.

בעקבות בליעה, שומנים תזונתיים מתעכלים (למשל, מהטריגליצרידים לחומצות שומן ומונוגליצריד, phospholipid לחומצות שומן וlysophospholipid, ואסתר כולסטרול לחומצות שומן וכולסטרול, וכו ') והתפזרו בתוך חלל המעי לmicelle קטנה ומבני לפוחי באמצעות התוספת של amphiphiles ממרה (פוספוליפידים, מלחי מרה וכולסטרול) והפעולה של אנזימי לבלב 10,13. מכאן שהם נספגים לתוך enterocytes. חלקם של הרכיבים נספגים מחדש אסטרי ליצירת הטריגליצרידים, פוספוליפידים ואסטרים כולסטרול בתוך תאי הקליטה (enterocytes). שומנים-אסטרי מחדש אלה מורכבים משילוב של מרכיבים שומניים אקסוגני בלע ומרכיבים שומניים אנדוגני מהמרה המופרשת, בריכות שומנים ריריות או אספקת הדם במעיים 13. מכאן שומני אסטרי מאוחסנים או בתוך enterocytes או התאספו לתוך יפופרוטאינים מעיים (chylomicrons, ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL)) יחד עם apoproteins השונים ומולקולות lipophilic אחרות ( 10,13. לאחר יציאת enterocytes, ליפופרוטאין באופן ספציפי מועבר מהמעי למחזור המערכתי באמצעות מערכת הלימפה mesenteric כlacteals המעיים הם יותר חדיר לכניסתם מנימי הדם במעיים. חלקם של מרכיבים שומניים נספגים גם מועבר מהמעי למחזור המערכתי באמצעות נימי הדם ווריד שער כלא-lipoprotein היחיד, קשורים, מולקולות 14. באופן כללי, לעומת זאת, מסלול תחבורת וריד השער הוא שחקן משמעותי היחיד בקליטת שומני אורך שרשרת קצרים ובינוניים.

האוסף של הלימפה mesenteric כך מאפשר ההערכה של התחבורה של ליפופרוטאין וברכיבים נלווים (שומנים, מולקולות lipophilic, apo-חלבונים) מהמעי. ניתן ונרשמת ליפופרוטאינים ומתאפיינים ביתרון שיפופרוטאינים לימפה mesenteric, באופן כללי, נמצאים בnascenמדינה לא מכיוון שהם לא שונו באופן נרחב על ידי אנזימים מערכתיים כגון lipase ליפופרוטאין 15. בעוד מודל החולדה cannulated הלימפה mesenteric יש אולי מבחינה היסטורית תואר בצורה נרחבת ביותר לניתוח תחבורת השומנים / ליפופרוטאין מהמעי, על שטח של הרחבת העניין הוא התפקיד של lymphatics בהובלה של תרופות lipophilic, prodrugs וxenobiotics האחר 13,16 המהווה את המוקד של המודל שתואר כאן. תרופות lipophilic (בדרך כלל אלה עם P יומן> 5 ומסיסות בהטריגליצרידים> 50 מ"ג / g ארוכת שרשרת למרות שהיוצאים מן הכלל לכאורה) 17,18, prodrugs 19 וxenobiotics האחר 13,16 יכולים לקבל גישה לlymphatics המעיים או באופן פסיבי או על ידי פעיל להשתלב במסלולי תחבורה ליפופרוטאין במעיים 19.

טכניקת cannulation הלימפה mesenteric העכברוש לכן יש יישומים רבים. Bollman et al. תאר techniq הראשוןue לcannulate הצינור לימפה mesenteric בחולדות בשנת 1948 20. מאז מספר הווריאציות על המודל שתואר. לדוגמא, אוסף יכול להתרחש כאשר החולדה מורדמת עם הרדמה שונות 21,22, או במדינה המודעת תוך מאופק 15 או באופן חופשי לנוע 23,24. יכולות להינתן חולדות פתרונות להחזרה נוזלים שונים וחומרים אחרים כגון שומנים וניסוחי סמים בשיעורים שונים לקיבה, המעי או parenterally (בדרך כלל 0-5 מיליליטר / hr) 25. בחלק ממחקרי הצינור לימפה בבית החזה ולא דביקה לימפה mesenteric הוא cannulated להעריך הובלה מהמעי באמצעות lymphatics אם כי זה עשוי להפריז בהערכת מעבר מהמעי הדק, תלוי בגורם של עניין, כצינור לימפה בבית החזה גם מקבל הלימפה מאחרת אזורי 22,26. מודלים cannulation הלימפה גם תוארו בכמה מינים אחרים, כוללים עכברים 15,27, מיני-pi12 GS, הכבשים 28,29, 30 חזירים וכלבים 31. עם זאת, מודל החולדה הוא נרחב ועקבי ביותר שצוטט. פרוטוקולים מפורטים לcannulation של הצינור לימפה mesenteric אחריה אוסף של הלימפה במודעת או 25 מורדמים 22 חולדות ועכברים 15,27 כבר פורסמו בעבר והקורא המעוניין מופנה לפרוטוקולים אלה. פרוטוקול זה הוא ראשון כדי להדגים את הטכניקה בפורמט דמיין.

יש מודל העכברים לימפה cannulated יתרונות על פני מודלים של בעלי חיים גדולים יותר במונחים של הוצאה, את הקלות של הניתוח ושיקולים אתיים. בהשוואה למודל של העכברים, ניתוח cannulation לימפה mesenteric הוא גם קל יותר בחולדה למרות מודל העכבר מאפשר מחקרים מפורטים יותר בבעלי חיים מהונדסים 27. יחד עם זאת, יש כמה מגבלות מודל החולדה, במיוחד אלה הקשורים להבדלים בפיזיולוגיה, שextrapolat הגבוליון למצבים פרה-קליניים וקליניים אחרים. לדוגמא, בזרימת המרה החולדה הוא קבוע ובלתי תלוי של צריכת מזון ואילו במזון מינים גבוה או שומנים לעורר את זרימת מרה 32. זה יוצר אתגרים להשגת סביבות לפני ואחרי ארוחת נציג בחולדה שמשקפות את מה שראה במינים ובני אדם גדולים יותר. ללימודי משלוח סמים, מין גדול יותר יכול להיות גם העדיף בעת הערכת תחבורת הלימפה לאחר שהממשל של מינון אנושי מציאותי מהווה 25. במחקר שנערך לאחרונה, שיעורי תחבורת שומנים בהלימפה mesenteric נמצאו דומה בין מינים (עכבר, חולדה, כלב) לאחר מתן של מסה שווה ערך וסוג של שומנים בדם המספק קצת ביטחון באקסטרפולציה של נתונים תחבורת שומנים על פני מינים 27. עם זאת, ההובלה של מודל lipophilic סמים, halofantrine, מדורגת לפי סדר הגודל של בעלי חיים (כלומר, כלב> חולדה> עכבר). גורם קנה מידה ניתן אפוא נדרש לשעברtrapolate נתוני תחבורת סמים הלימפה מחולדה למינים אחרים.

הגבלה של דגמי cannulation לימפה, באופן כללי, היא שאוסף פסיבי הלימפה ישירות מצינור הלימפה רשאי לשנות זרימת הלימפה ותחבורה מאז כלי הלימפה לעבוד נגד פרש לחצים שמשתנה ברגע שהספינה היא cannulated 33. מודל cannulation הלימפה יכול להיות גם קשה לקבוע במעבדות שאינן מכיר את הטכניקה. מודלים חלופיים וכך תוארו. לדוגמא, המעבר של גורמים באמצעות מערכת הלימפה המעיים, כגון יפופרוטאינים ומולקולות lipophilic, נחקר באופן עקיף באמצעות אוסף של דם. מודל כזה כרוך השוואת ריכוזי שומנים ו / או סמים דם לאחר נטילה דרך פה בנוכחות והיעדרות של מעכבים (למשל, קולכיצין, pluronic L81, cycloheximide) של ייצור ליפופרוטאין במעיים, החוסמים תחבורת הלימפה 34. יתרוןדגמים שלכמת תחבורת הלימפה בעקיפין באמצעות איסוף דגימות דם הוא שהיא מאפשרת כמה הערכה של תחבורת הלימפה בבני אדם כניתוח פולשני לא נדרש 35. עם זאת, מעכבי תחבורת הלימפה אינם ספציפיים וגורמים המועברים באמצעות lymphatics הם בדילול ושינוי במחזור המערכתי אשר מסבך הערכות אלה. חלופות במבחנה גם תוארו. לדוגמא, תרבויות קאקו-2 תאים או אנתרוציט המבודדת כבר נוצלו כדי ללמוד ביתר פירוט את הפרשת המעיים של מולקולות שנכנסות lymphatics 36-38. מודל במבחנה מתקדם שמייצגים יותר ממייקרו-סביבת המעיים האנושי גם תאר לאחרונה את 39. במודל זה שכבת תאי האנדותל הלימפה היא שיתוף תרבותי עם קאקו-2 תאים המאפשרים ניתוח מפורט יותר של העברת חומרים מהמעי לlymphatics. עם זאת, בvitro מערכות תא חסרות זרימת חליפין ולהעביר כלומר חיבור עם חלל מעי ודם בסיסי ואספקת דם לימפטי. בגישה חלופית, קסיס et al. הוקם ערוץ כפול (וידאו במהירות גבוהה בהיר שדה וקרינה) במערכת הדמיה באתר המאפשרת השוואות כמותיות בין התכווצות כלי דם, זרימת הלימפה וריכוזי שומנים ניאון בכלי הלימפה mesenteric 33. יתרון של מודל זה על האמור במערכות חוץ גופית הוא שזה מאפשר מעקב מדויק של המעבר של תאי מערכת חיסון באמצעות lymphatics. מדידות מוחלטות של שומנים בדם המוניים (או סמים) תחבורה, לעומת זאת, עדיין לא הוקמו תוך שימוש בשיטות הדמיה. במבחנה ובסיליקון ומתקרבים לחזות באופן ספציפי את היקף תחבורת סמים lipophilic באמצעות lymphatics המעיים פורסמו גם 40-42. לדוגמא, את הזיקה vivo לשעבר של מספר גompounds לchylomicrons פלזמה נמצא לתאם בצורה סבירה עם תחבורת הלימפה שלהם in vivo 41. בהמשך לכך, אותה הקבוצה שהוקמה במודל סיליקו לחזות זיקת תרופה לchylomicrons מבוסס על מאפייני physicochemical מרובים 40. Holm et al. גם הוקם מורכב יחסית במודל סיליקו לחזות הסף תחבורת הלימפה של תרכובות lipophilic על בסיס מתארים מולקולריים 42. מודלים אלה עשויים לספק גישה שימושית לחזות את היקף תחבורת הלימפה של תרופות לא ידועות. אימות של המודלים עם מגוון רחב של תרופות ועל פני מעבדות שונות, עם זאת, תידרש לאשר את הדיוק ושחזורם.

Cannulation של הצינור לימפה mesenteric כך נשאר רק האמצעי כדי לבחון את התוכן של ימפה ניקוז המעי הדק ושיעור המעבר של המערך המורכב של גורמים (תאים, חלבונים ישירות,פפטידים, שומנים, תרופות) לימפה במצב in vivo. במסמך זה אנו מתארים פרוטוקול לcannulation של עורק התרדמה והצינור לימפה mesenteric שמאפשר האיסוף של הלימפה mesenteric ודם מערכתי מחולדות מורדמות. נציגי נתונים להדגים כיצד המודל יכול לשמש כדי לבחון שומנים ותחבורה סמים מהמעי דרך מערכת הלימפה mesenteric. זה ואחריו דיון בקשיים שניתן נתקלו בהקמת המודל ומדריך לפתרון בעיות. ברגע שהקים את המודל הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור תחבורת הלימפה מעיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המחקרים שתוארו בכתב היד הזה אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המקומיות ונערכו בהתאם למועצת אוסטרליה וניו זילנד לטיפול בבעלי חיים בהנחיות מחקר והוראה. לפני תחילת כל הליך של בעלי חיים, להבטיח כי את ההרשאה המתאימה מתקבלת באמצעות מוסד / הארגון המקומי. כמו בכל הניתוחים בבעלי החיים, להבטיח שהניתוח מבוצע על ידי מפעילי הכשרה מתאימה, בתנאים אספטיים וכי הרדמה, משככי כאבים ואנטיביוטיקה מנוהלים כאשר נדרשים על מנת להבטיח תוצאה אתית ומוצלחת.

1. הכנות היום לפני ההליך כירורגי

  1. לצום העכברוש בלילה שלפני הניתוח במידת הצורך. יש להבטיח את עכברוש גישה חופשית למים.
  2. הפתרונות להכין להינתן לחולדה.
    1. הכן פתרון להחזרת נוזלים כגון תמיסת מלח סטרילית או פתרון Ringers.
    2. הכןפתרונות אסתטיים כנדרש. ההרדמה המשמשת בניסויים שתוארו כאן כללה "קוקטייל 1" שהוכן על ידי שילוב של 1.9 מיליליטר של קטמין 100 מ"ג / מיליליטר, 0.5 מיליליטר של Xylazine מ"ג 100 / מיליליטר, 0.2 מיליליטר של acepromazine 10 מ"ג / מיליליטר ו 2.5 מיליליטר של תמיסת מלח ו" קוקטייל 2 "בהיקף של 1 מיליליטר של קטמין 100 מ"ג / מיליליטר ו 0.1 מיליליטר acepromazine 10 מ"ג / מיליליטר. הערה: isoflurane בשאיפה או sevoflurane עשוי להיות מועדף כפי שהוא יכול לספק מטוס של הרדמה כירורגית לתקופה ארוכה יותר של זמן.
    3. לחלופין להכין ניסוח המכיל את התרופה ב, למשל, תחליב שומנים. לבצע מחקרי יציבות מתאימים כדי להבטיח את היציבות של הניסוח על פני תקופת האחסון וניהול.
      הערה: הטבע של הניסוח והתרופה המדויק ללהינתן תשתנה עם כל מחקר כמטרת מחקרי תחבורת סמים הלימפה היא לרוב כדי להעריך את היעילות של תחבורת סמים הלימפה כפונקציה של admini הניסוח והסמיםstered.
      1. הניסוח מנוצל בניסויי הנציג באיור 4 ו -5 כאן מוכן, כפי שתואר לעיל 43. בקצרה, לשלב 14 חומצה אולאית C (2-5 μCi) וhalofantrine (200 מיקרוגרם) לחומצה אולאית 40 מ"ג לפני פיזור ב5.6 מיליליטר של שלב מימי בהיקף של taurocholate נתרן 5 מ"מ בופר פוספט (pH 6.9).
      2. לניסוחים המכילים 2-monoolein, להוסיף 7.1 מ"ג של 2-monoolein יחד עם רכיבים אחרים, לשלב המימי באותו הזמן כhalofantrine שלב המכיל חומצה אולאית. הכן את הניסוחים המכילים 2-monoolein מייד לפני ממשל לחולדה כ2-monoolein אינה יציב יחסית וisomerises ל1-monoolein.
      3. בהמשך לכך חלב את הניסוחים ידי ultrasonication 2 דקות בRT.
        הערה: כפי שכבר תיארו בעבר 43, לפקח על היציבות של הניסוחים ידי i) בדיקה ויזואלית של emulשיאון תחת אור המקוטב על מנת להבטיח כי התחליב אינו שלב מופרד, ii) גודל חלקיקי ניתוח מייד לאחר ההכנה והבאה מינון באמצעות פיזור אור דינאמי כדי לספק אינדיקציה על כל שינויים בשלב ו / או הפרדה, וiii) ניתוח של ריכוזי halofantrine באמצעות assay HPLC תוקף.
  3. הכן פתרון נוגד קרישה המכיל 10 מ"ג / מיליליטר EDTA במים סטריליים או 10 IU / ml הפרין במלח כדי לשטוף את הצינורית לימפה. כמו כן להכין פתרון נוגד קרישה המכיל 2.5-10 IU הפרין מיליליטר / במלח כדי לשטוף את צינורית העורק הראשי.
  4. הכן את קנולות פוליאתילן להכנסה לתוך צינור הלימפה mesenteric (OD 0.8 מ"מ, 0.5 מ"מ ID), עורק התרדמה (OD 0.96 מ"מ, 0.58 OD מזהה מ"מ או 0.8 מ"מ, מזהה 0.5 מ"מ) והתריסריון (OD 0.96 מ"מ, 0.58 מ"מ ID )
    1. חותך את קנולות לאורך הנדרש (בדרך כלל 25 - 30 סנטימטר לעורק הראשי וצינורית התריסריון ו10-15 סנטימטר לCann הלימפהאולא) והמקום שפוע בקצה קנולות באמצעות סכין כירורגית סטרילי (ראה איור 1).
      הערה: זה מגדיל את הקלות של הכנסת צינורית ומפחית את השכיחות של חסימת צינורית לאחר החדרה.
    2. הנח נקודת עוגן צורת J בצינורית intraduodenal ידי לולאות חלק קטן של הצינורית חזרה על עצמה, מחמם אותו עם צלחת קלה או חמה ולאחר מכן חיתוך לגודל (ראה איור 1).
  5. צרף את צינורית הלימפה למחט 25 G ומזרק המכיל פתרון נוגד קרישה (מוכן בשלב 1.3). מלא את הצינורית לימפה עם הפתרון נוגד קרישה ולהשאיר את הפתרון בO הצינורית / N כדי להפחית את השכיחות של היווצרות קריש דם בצינורית הלימפה במהלך איסוף הלימפה.
  6. הכן צינורות לאיסוף לימפה ודגימת דם. טרום לשקול צינורות איסוף הלימפה, צינורות תווית לאוסף הלימפה ודגימת דם ולהוסיף פתרון נוגד קרישה. להוסיף solut נוגד קרישה המספיקיון כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר EDTA במים סטריליים או 10 - 20 IU / ml הפרין בהלימפה או דם שנאסף.

2. תכשירים מייד לפני תחילת ההליך הכירורגי

  1. סמנו את כל קנולות על ידי שטיפה עם תמיסת מלח סטרילית או פתרון נוגד קרישה על מנת להבטיח שהם פטנט.
  2. הכן את העכברוש להליך כירורגי.
    הערה: הצינור לימפה mesenteric הוא גלוי יותר בחולדות שאכלו או היה להזריק מנה של שמן כהלימפה mesenteric הופכת חלבית ואטומה עם טעינת שומנים גבוהה יותר. מפעילים מסוימים, במיוחד אלה חדשים לניתוח, ולכן קלים יותר לcannulate הצינור לימפה mesenteric כאשר חולדות הם מראש במינון-עם שמן (סביב 0.1-1 מיליליטר) כגון זית או סויה שמן 0.5-2 שעות לפני ניתוח החל . עם זאת, לפני מינון הנפט משפיע על תחבורת הלימפה של שומנים, תרופות lipophilic וגורמים אחרים בהלימפה כך שזה לא יכול להיות אידיאלי מראש מנת שמןבהתאם למטרת הניסוי.
    1. להרדים את העכברוש בכל תקופת איסוף הניתוח ודגימה.
      1. לדוגמא, ליזום ההרדמה באמצעות הזרקה תת עורית של 1.5 מיליליטר / קילוגרם של קוקטייל אני (מצעד 1.2.2) לקפל עור בחלק האחורי של צוואר החולדות באמצעות מזרק 1 מיליליטר מצורף מחט 25 G. לשמור על ההרדמה באמצעות הזרקת intraperitoneal של 0.44 מיליליטר / קילוגרם של קוקטייל 2 (מצעד 1.2.2) כ כל שעה כנדרש, באמצעות מזרק 1 מיליליטר מצורף מחט 25 G.
      2. לפני תחילת הניתוח להבטיח שעומק ההרדמה מספיק על ידי התבוננות קצב נשימה, תנועת זיף, טונוס שרירים ותגובות לגירויים כגון צביטה של ​​רגל. לנהל הרדמה נוספת כנדרש.
    2. לגלח את הפרווה מאזורי כירורגים, הכוללים את צד ימין של הבטן לימפה וcannulation תריסריון, וצוואר ואזור עצם הבריח יצא לצינורית עורק התרדמהtion.
    3. נקה את האזורים כירורגית סביבה נקיה מחיידקים באמצעות פתרון פתרון או chlorhexidine povidine-יוד ולשפשף אתנול 70%. חזור 3 פעמים עבור כל אזור, שסיימתי עם טיהור סופית עם אתנול 70%.
  3. מניחים את החיה בrecumbence גב בסדין נקי מעל משטח מחומם כירורגית (37 ° C).

3. Cannulation של mesenteric לימפה Duct

  1. מניחים את החיה עם הצד הימני שלה פונה כלפי המפעיל. לבצע את הניתוח עם או בלי הסיוע של מיקרוסקופ כירורגי כפי שנדרש.
  2. פתח את השכבה העליונה של קיר השרירים הבטן עם חתך 4 סנטימטר ישר משתרע מקו האמצע (תהליך xyphoid) לאגף הימני של כ -2 סנטימטרים מתחת לבית החזה (שולי costal) באמצעות סכין אזמל סטרילי (ראה איור 2).
  3. פתח את השכבות הנותרות של קיר שרירים בטן 4-5 מ"מ לרוחב קו האמצע למסירת מאגף ימין עם זוג קטןשל מספריים כירורגיות (ראה איור 2).
  4. לחזור בו מהמעי הדק מתחת לקיר שרירי הבטן השמאלי ולשמור אותו במקום באמצעות 2-3 חתיכות של גזה סטרילית רוויות עם מלח רגיל.
  5. לגשר על העכברוש על מזרק פלסטיק 10 מיליליטר בצורה אופקי מתחת לגבו של העכברוש ברמה של כליה ימנית כדי להקל הדמיה של הצינור לימפה mesenteric.
  6. אתר את הצינור מעולה mesenteric לימפה: כלי כ 0.5-1 מ"מ בקוטר שניצבת לכליה הימנית ומייד מקורי ומקביל לעורק mesenteric (כלי דם אדום כהים פועמים; ראה איור 2 ג).
    הערה: בחולדות מראש במינון-לא-צמו או שמן הכלי לבן, אטום וקל יותר לדמיין מאשר בחולדות צמו בו היא די שקוף.
  7. בדוק את האזור מייד הזנב לצינור הגדול מעולה mesenteric הלימפה ועורק mesenteric כדי לקבוע אם צינור שני, קטן יותר אבזר לימפה הואהווה. אם קיימים, לחסום את זרימת הלימפה דרך הצינור על ידי ניתוק הצינור וחוסם עם דבק מגע, או קשירת תפר סביב הצינור, על מנת להבטיח כי כל הנפח של הלימפה זורמת מהמעי נאסף מהצינור לימפה mesenteric מעולה.
  8. עובר זוג מלקחיים ישר דרך מיטת שומן פרי כליות בשוליים התחתונים של הכליה הימנית, ודרך שכבות רקמת חיבור באופן מיידי מתחת לווריד הנבוב, במקביל כיוון עם הצינור לימפה mesenteric מעולה.
  9. באמצעות הקצה של המלקחיים לאחוז את צינורית הלימפה ולמשוך אותו דרך מיטת שומן פרי כליות עם קצה אחד מייד בסמוך לצינור לימפה mesenteric והאחר exteriorised מהחיה ברמה של הכליה הימנית.
  10. לבודד את הצינור לימפה mesenteric ממעל השכבות של רקמת חיבור ושומן על ידי נתיחה בוטה. הקפד לא לנקב או לפגוע בצינור לימפה.
  11. לאחר בידוד הצינור לימפה, לעשות הו קטןle בצינור לימפה גם עם מיקרו מספריים, הקצה החד של המלקחיים של צורף או מחט 25 G. הקפד לא לנתק את הכלי לחלוטין.
  12. ודא שצינורית הלימפה היא מלאה לחלוטין עם פתרון נוגד קרישה (באמצעות מזרק ומחט 25 G) ללא פערי אוויר. הכנס את הצינורית לימפה כ 2-4 מ"מ בתוך הצינור לימפה mesenteric באמצעות החור הקטן בעזרת זוג קטן של מלקחיים.
  13. שים לב לצינורית הלימפה במשך כמה דקות. שים לב זרימה הדרגתית של ימפה במעי מסוף האיסוף החופשי של הצינורית אם cannulation הוא מוצלח. אם cannulation הוא לא מוצלח, חזור על שלבים 3.8-3.12.
  14. אם cannulation הוא מוצלח, לאבטח את הצינורית על ידי הצבת טיפה קטנה של דבק וטרינרים מעל חור הכניסה לצינור לימפה. יש להיזהר שלא לחסום את כלי באמצעות היישום של דבק וטרינרים עודף.
  15. בזמן שחיכה לדבק הוטרינרים להגדיר, observe את זרימת הלימפה במשך כמה דקות על מנת להבטיח כי הליך cannulation היה מוצלח. ברגע מסוים של ההצלחה של cannulation, להסיר את חתיכות הגזה שהונחו בחלל הבטן בזהירות ומניח את המעי הדק במיקום המקורי שלה.
  16. מניחים צינור איסוף הלימפה המכיל נוגדת קרישה (ראה שלב 1.6) בסוף הצינורית כדי לאסוף את הלימפה זורמת חופשית.
  17. בשלב הבא, cannulate תריסריון לעירוי של פתרונות להחזרת נוזלים ו / או ניסוחים.

4. Cannulation של התריסריון

  1. צרף את צינורית תריסריון למזרק (למשל, 10 מיליליטר) מלאים בפתרון להחזרת הנוזלים.
  2. זהה את תריסריון כורוד הבהיר (עם יותר כלי דם) סעיף של המעי הדק, שעל ירידה עדינה מושכת חושף את הבטן.
  3. לעשות חור קטן לנקב בתריסריון כ -2 סנטימטרים מתחת לצומת של הקיבה והתריסריון (השוער) באמצעותמחט סטרילית 23 G.
  4. הכנס את קצה מכור J בצורה של צינורית התריסריון דרך החור לנקב. Secure במקום עם ירידה של דבק cyanoacrylate.
  5. להתחיל הידרציה של החולדה על ידי הצמדת הצינורית למזרק להחזרת הנוזלים שנטען במשאבת עירוי. על פי ספרות שיעורי החזרת נוזלים נעים 0.5-3 מיליליטר / שעה 15,25.
  6. לאחר השלמת הלימפה וcannulation תריסריון, לסגור את החתך בקיר שרירי הבטן עם תפרים. ואז לסגור את החתך בעור על ידי יישום כמה טיפות של דבק רקמות (cyanoacrylate) בצד של החתך וצובט את העור משני צידי החתך יחד.

5. Cannulation של עורק התרדמה

Cannulation העורק הראשי ניתן לבצע לפני או אחרי cannulation של הצינור לימפה mesenteric. מפעילים מסוימים מעדיפים cannulate עורק התרדמה לפני cannulating צינור הלימפה כדי להפחית potentially פירוק צינורית הלימפה בעת מעבר לבעלי החיים.

  1. מציב סימן על צינורית עורק התרדמה 2.5 סנטימטר מהקצה שפוע לזהות את החלק של הצינור להכניס לתוך העורק. חבר את הקצה השני של הצינורית (כלומר, בלי שפוע) לG מחט 23 או 25 מצורפת מזרק מלא בפתרון נוגד קרישה ולמלא את הצינורית עם הפתרון נוגד קרישה כדי לוודא שאין פערי אוויר נוכחים.
  2. כדי להקל על cannulation, למקם את העכברוש הרדים שכיבה על גב עם הצוואר המתוח והראש מופנה כלפי המפעיל. שים לב שחלק מהמפעילים מעדיפים לבצע בטכניקה זו עם הזנב של החולדה מצביע לכיוון המפעיל.
  3. הנח 1 - חתך אורכי 1.5 סנטימטרים דרך שכבת העור מעל השמאלי של קנה הנשימה במטוס sagittal.
  4. לנתח את רקמת חיבור תת עורית באמצעות מלקחיים קצה קהים לחשוף את שרירי צוואר לזווג בסיס.
  5. לחזור בו לא שרירי צווארo לחשוף את העורק השמאלי הראשי (הממוקם ~ 1 סנטימטר מתחת לפני השטח של העור והפועם). נקה את רקמת החיבור שמעליה מהעורק על ידי נתיחה בוטה.
  6. לבודד סעיף סנטימטר ~ 1 של העורק באמצעות זהירות מלקחיים רקמות בוטות, נזהר שלא לפגוע במסלול עצב המחנק הסמוך. לבצע זאת על ידי פתיחה וסגירת המלקחיים קצה הקהים אנכית לאורך כל צד של העורק כדי לשחרר אותו מהרקמות הסובבות ועצב התועה.
  7. בעזרת מלקחיים טיפ נאה, חוט שני תפרי משי מתחת לעורק הראשי ולמקם אותם בכל קצה של סעיף העורק הבודד. לקשור את התפר הקרוב ביותר למפעיל ורחוק מהלב ועצם הבריח (איור 3 א) של החולדה.
  8. לחסום את זרימת דם דרך העורק על ידי הנחת זוג מלקחיים טיפ נאה ישר מתחת לעורק (איור 3).
  9. בעזרת המספריים איריס טיפ הנאה, למקם את חתך קטן על פני השטח העליונים של העורק (כ 1/3 מדרך למטה מהחלק העליון של האזור המבודד). לשטוף כל דם שנשפך על פני השטח של העורק עם מי מלח heparinised ולנגב בעדינות באמצעות טיפים כותנה.
  10. הכנס את הקצה של הצינורית לתוך העורק עם זוג מלקחיים קצה מעוגלים. הוכנס ברגע, להסיר את המלקחיים טיפ נאה ישר חוסמים את זרימת הדם ולקדם את הצינורית 2.5 סנטימטרים לתוך העורק באמצעות שני זוגות מלקחיים, אחד להחזיק את הצינורית בתוך העורק לעצור דם דליפת גב ואחר להכניס את הצינורית.
  11. השתמש במהדק עורק קטן להחזיק את הצינורית בתוך העורק ולהסיר את המלקחיים טיפ הנאה ישר שהונחו מתחת לעורק בשלב 5.8 כדי לחסום את זרימת הדם.
  12. לאשר את patency של הצינורית על ידי הזרקת תמיסה נוגדת קרישה לצינורית וציור בחזרה כמות קטנה של דם (איור 3 ג). לאחר מכן לשטוף את הצינורית עם פתרון נוגד קרישה ולאטום את סוף השימוש בלהבה של מצית או תקע צינורית.
  13. לקשור הצינורית דואר במקום עם שני התפרים ממוקמים מתחת לעורק בשלב 5.8.
  14. הסר את מהדק העורק ולהבטיח תפר שלישי סביב העורק והצינורית. סגור את צוואר פצע עם תפרים.

תקופת 6. לאחר ניתוח וגיבוש עירוי

  1. תמשיך לשמור על החולדה בהרדמה ועל משטח הלוהט.
  2. רעננות העכברוש באמצעות עירוי של פתרון להחזרת נוזלים לתריסריון לפחות 0.5 שעות לאחר סיום cannulations. שים לב לירידת קצב זרימת הלימפה (~ 0.1-0.5 מיליליטר / שעה) בתקופה הראשונה לאחר cannulation ולהגדיל בקרוב לבסיס יציב (0.4-2.5 מיליליטר / שעה בהתאם לשיעור החזרת נוזלים).
  3. לאחר תקופת ההתאוששות, להחדיר הניסוח של עניין (המכיל שומנים, תרופות, וכו ') לתריסריון באמצעות הצינורית. לחלופין, להשתמש במשאבת עירוי כדי להסדיר את קצב הזרימה של ניסוח. הערה: בפרוטוקול מתואר כאן בעלי החיים יישארו anaesthetised לאורך כל תקופת הניתוח ואיסוף הלימפה וeuthanised בהרדמה כך ששיכוך כאבים נוספים לא נדרש. אם הפרוטוקול הוא שונה ובעלי החיים אפשרו להחזיר לעצמו את ההכרה ואז שיכוך כאבים מתאימים וטיפול שלאחר ניתוח יהיו צורך.
  4. בסיום עירוי ניסוח ימשיך רעננות העכברוש בשיעור של 1.5-3 מיליליטר / שעה עם מלח רגיל לתריסריון על מנת למנוע התייבשות.
  5. תמשיך לשמור על החולדה על הכרית כירורגית המחוממת 37 ˚ C כדי לשמור על טמפרטורה (כמו לכל שלב 2.3), שתן מפורש משלפוחית ​​השתן באמצעות דחיפה כלפי מטה עדינה על הבטן התחתונה כנדרש ולהחיל מחדש משחת עיניים בכל שעה (לפי שלב 2.2. 3). שינויי תנוחת גוף רגילים מומלצים אם בעל החיים הוא להחזיר לעצמו את ההכרה לאחר ההליך.

7. אוסף של ימפה ודגימות דם להערכת שומנים וספיגת תרופה

  1. לאסוף הלימפה ברציפות לצינורות המכילים נוגדת קרישה. צינורות שינוי במרווחי הזמן הנדרשים (לדוגמא, לשעה).
  2. לאסוף דגימות דם בנקודות זמן שנקבע.
    1. לחסום את זרימת דם דרך הצינורית על ידי כיפוף הצינורית בחזרה כ 2 סנטימטר מהקצה האטום. לפרוץ דרך הצינורית ידי ניתוק הסוף האטום או ניתוק תקע חשמל הצינורית.
    2. שימוש במזרק ריק, לסגת מלוח heparinised מהצינורית עד דם ממלא את כל הצינורית.
    3. באמצעות מזרק ריק חדש, למשוך את הנפח הרצוי של דם ומקום בצינור המכיל נוגדת קרישה.
    4. שימוש במזרק הראשון, להחליף את הדם שנלקח לפני הדגימה כדי לצמצם את אובדן דם מיותר. לפני ההזרקה, קפיצי המזרק בעוד מחזיק אותו הזקוף, כדי להבטיח שאין בועות אוויר להיכנס לצינורית.
    5. באמצעות מזרק, להחליף את נפח דם הוסר מהעכברוש עם פתרון נוגד קרישה. ודא שאין דם שייר גלוי בצינורית ככל שנותרו עלולה להיקרשולחסום את הצינורית.
    6. בנד הצינורית כ 2 סנטימטר מקצה unsealed לחסום את זרימת דם ולהסיר את המזרק. שימוש בלהבה של מצית או תקע צינורית, לחתום מחדש את הצינורית.
  3. בסיום איסוף דם והלימפה מהעכברוש, להרדים את העכברוש באמצעות ממשל intraperitoneal של> 100 מ"ג / קילוגרם pentobarbitone נתרן.
  4. לקבוע קצב זרימת הלימפה על ידי מדידת המסה של הלימפה שנאסף במהלך כל תקופת זמן.
  5. למדוד את הריכוז של תרופה ושומנים בדם באמצעות הלימפה ו, למשל, HPLC, HPLC-MS או באמצעות ערכות מסחריות, על מנת להעריך את יעילות שומנים וספיגת תרופה.
  6. לחשב תחבורה המונית של סמים ושומנים בהלימפה מהמוצר של הריכוזים שנמדדו והנפח של הלימפה שנאספו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאותיו של ניסוי נציג לכמת את המידה המצטברת ושיעור של שומנים בדם ותחבורה סמים באמצעות מערכת הלימפה לאחר לידת מעיים באמצעות מודל cannulation הלימפה mesenteric מוצגות באיור 4 ואיור 5. בניסוי זה, 200 מיקרוגרם של lipophilic המודל halofantrine תרופה מוחדר לתריסריון של חולדות על שעה 2 בניסוח המכיל חומצה אולאית 40 מ"ג (כולל 2-5 חומצה אולאית C-μCi 14) ו -7.1 מ"ג 2-monoolein המפוזרת בtaurocholate 5.6 נתרן מיליליטר של 5 מ"מ בפוספט שנאגרו pH 6.9 מלוח. בעקבות ממשל ניסוח החולדות rehydrated בשיעור של 2.8 מיליליטר / שעה עם מלח רגיל החדיר לתוך תריסריון. הלימפה נאספה ברציפות לתוך צינורות השתנו כל שעה במשך 10 שעות. הניסוח היה מוכן, והניסוי שבוצע, על פי פרוטוקול שתואר קודם לכן לניסוח המכיל את כל אותו componמציג רק שזה לא כולל 2-monoolein 43.

כפי שניתן לראות באיור 4, בתנאי ניסוי אלה זרימת הלימפה השיעור הממוצע של חולדות cannulated הצלחה היה בין 0.4-1.3 מיליליטר / שעה. בחלק מחולדות קצב זרימת הלימפה היה מעט נמוך יותר ב1 הראשונה - 3 שעות הבאות cannulation ולאחר מכן עלה. זה נראה לרוב הבא cannulation הלימפה. כמו כן מוצג באיור 4 הוא קצב זרימת הלימפה לניסוי מוצלח. במקרה זה קצב הזרימה נותר נמוך משמעותי מזו שנצפתה בניסויים המוצלחים בכל תקופת האוסף. באופן דומה, תחבורת הלימפה המצטברת של טריגליצרידים וhalofantrine הייתה נמוכה באופן משמעותי בניסוי מוצלח (איור 5 א 'וב'). תחבורת halofantrine המצטברת הממוצעת בקבוצה המוצלחת הייתה 15.1% מהמינון, תחבורת הטריגליצרידים המצטברת היה 61 מ"ג במשך 10 שעות וחלקם של r מנוהלמנת שומנים אקסוגניים adiolabelled מועבר בהלימפה הייתה 54% (איור 5 ג). ערכים אלה אינם שונים באופן משמעותי לזו שנצפתה בעבר לניסוח דומה שהכיל את אותם רכיבים, פרט להיעדרות של 2-monoolein 43 (טבלת 1). הדבר מצביע על כך ניסוחים המכילים חומצות שומן בהיעדר מקור מונוגליצריד יכולים לתמוך שומנים דומים ותחבורה סמים בהלימפה לאלה שעושים להכיל מונוגליצריד. תוצאה זו מתוארת נוספת בסעיף הדיון.

איור 5D מציג נתונים נציג לשיעור של halofantrine ותחבורה הטריגליצרידים בהלימפה לאורך זמן לאחר נטילה. שיעור התחבורה של שני הטריגליצרידים והתרופה לימפה פסגות כמה שעות הבאות שומנים ומתן תרופה ולאחר מכן חוזר לרמות בסיס. כפי שהמקובל בניסויי שומנים ותחבורה סמים הלימפה מעיים, שיעור סירות, ספינות סמיםt לימפה בכל מראות תקופת זמן שראו לתחבורת הטריגליצרידים כתרופה מועבר לימפה בשיתוף עם יפופרוטאינים הטריגליצרידים עשירים.

איור 1
איור 1. ייצוג תרשים של הצורה של הקצה המשופע של צינורית עורק הראשי או לימפה, וצורת J הקצה המשופעת של צינורית התריסריון.

איור 2
איור 2. תמונות של () הבטן המגולחת בהכנה לcannulate הצינור לימפה, (ב) קיר שרירי הבטן נפתח בחתך 4 סנטימטר ישר משתרע מקו האמצע לאגף הימני כדי לגשת לצינור לימפה, ו( C ) הצינור מעולה mesenteric לימפה (בעיגול צהוב) בניצב לכליה הימנית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. תצלומים של (A) בעורק התרדמה מבודד עם שני תפרי משי עם אחד הקרוב ביותר לעורק הראשי מבודד המפעיל קשר את, (ב) וזרימת דם occluded עם זוג מלקחיים טיפ נאה ישר הניח מתחת לעורק, ונבדק בעורק התרדמה עם צינורית במקום וpatency (C) על ידי הציור בחזרה כמות קטנה של דם. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Src =" איור 4 "/> / קבצים / ftp_upload / 52,389 / 52389fig4highres.jpg
איור 4. נציגי נתונים לקצב זרימת הלימפה mesenteric (μl / hr) לאורך זמן. חולדות ניתנו ניסוח המכיל 200 מיקרוגרם halofantrine, חומצה אולאית 40 מ"ג (עם 2 חומצת μCi 14 C-אולאית) ו -7.1 מ"ג 2-monoolein ב5.6 מיליליטר של 5 מ"מ taurocholate נתרן שבנאגר מלוח פוספט (pH 6.9) 0-2 שעות. הנתונים המוצגים הם ממוצעים ± SEM עבור n = 3 ניסויים מוצלחים (חוגים סגורים, ●) וn = 1 תוצאה לא מוצלחת (משולשים פתוחים, Δ).

איור 5
נתוני איור 5. נציגים לשומנים בדם ותחבורה תרופה לימפה mesenteric. תחבורה מצטברת של halofantrine תרופת מודל (Hf, מינון%), טריגליצרידים (B) (TG, מ"ג) וחומצת שומן אקסוגניים (ג) (א) (דוס%ה), ושיעור ההובלה (D) TG (מ"ג / hr) וHf (% מינון / hr) לימפה mesenteric לאורך זמן לאחר נטילה של ניסוח המכיל 200 מיקרוגרם halofantrine, חומצה אולאית 40 מ"ג (עם 2 14 μCi חומצה אולאית C-) ו -7.1 מ"ג 2-monoolein ב5.6 מיליליטר של 5 taurocholate נתרן מ"מ בופר פוספט (pH 6.9) 0-2 שעות. הנתונים המוצגים הם ממוצעים ± SEM עבור n = 4 ניסויים מוצלחים (חוגים סגורים, ●) וn = 1 תוצאה לא מוצלחת (משולשים פתוחים, Δ). תחבורת חומצת שומן אקסוגני לא נמדדה בניסוי מוצלח אבל הוא בדרך כלל נמוך בניסויים נכשלו. נתונים עבור הניסוי מוצלח מושמט מהלוח D לבהירות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ללא מ 'onoolein עם 2-monolein
אומר SEM אומר SEM
Halofantrine (מינון%) 15.1 0.8 15 1.6
הטריגליצרידים (מ"ג) 67 4 61 6
חומצת שומן סה"כ (μmol) 261 16 248 23
חומצה אולאית אקסוגניים (μmol) 82 5 65 6
חומצת שומן אנדוגני (μmol) 180 17 183 28

השוואת טבלת 1. נתוני תחבורת הלימפה מצטברים של מעל 10 שעות לאחר נטילה של 200 מיקרוגרם halofantrine לmesenteric חולדות cannulated צינור לימפה בניסוחים המכילים חומצה אולאית 40 מ"ג (containinחומצה אולאית 14 C-ז μCi 1) לתחליב בtaurocholate נתרן 5 מ"מ שבנאגרו מלוח פוספט (pH 6.9) עם ובלי 7.1 מ"ג 2-monoolein. הנתונים מייצגת ממוצע ± SEM עבור n = 4 חולדות. אין הבדלים משמעותיים סטטיסטי נתפסים בין 2 הקבוצות.

בקבוצת מינון עם 2-monoolein זה לא מדד מדויק של תחבורת חומצת שומן אנדוגני כחומצה אולאית המצורפת לשדרה 2-monoolein לא היוותה בתחבורה נמדדה אקסוגניים אולאית החומצה לימפה.

ב נתונים לhalofantrine וכוללת הובלה של חומצות שומן בקבוצת מינון בלי 2-monoolein פורסמו בעבר באיור 5 של התייחסות 43 ומשועתק כאן בפורמט שולחן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודל cannulation הלימפה mesenteric העכברוש מאפשר כימות ישירה של הריכוז ושיעור התחבורה של תאים ומולקולות (כגון שומנים ותרופות) מהמעי לימפה ושינויים אלה המתרחשים בתגובה שונים לאתגר של חומרים שונים (תזונה , אנטיגן, תרופות, ניסוחים, וכו ') 10,27 ומחלה (סרטן, וירוסים, קוליטיס, עמידות לאינסולין, וכו') 5-7. גם הרכיבים שנאספו בהלימפה עשויים לשמש נוסף בניסויים נוספים. לדוגמא, תאים יכולים להיות מתורבתים 44, ליפופרוטאין מופרד והלימפה או מרכיביו כגון ליפופרוטאינים או תאים, עמוסים בסמנים כוללים תרופות, radiolabels ובדיקות ניאון. אז יכולים להיות מחדש החדירו אלה לבעלי חיים נמען להעריך התפקוד, חילוף החומרים, האישור ו / או דפוסי 45-47 נטיית רקמה שלהם באופן ישיר יותר. יש מודל cannulation הלימפה עכברוש מספר יתרונות על פני othאה במבחנה, באתר, בסיליקון ו, ובמודלי vivo שתוארו במבוא. והכי חשוב, cannulation הוא השיטה היחידה המאפשרת גישה ישירה לכל הנפח של רכיבים בנוזל הלימפה. כאשר היא מבוצעת בידיו של מפעיל מנוסה המודל הוא שיעורי הצלחה איתנים, לשחזור וניסיוני של> 80% ניתן להשיג. עם זאת, הטכניקה הניתוחית יכולה להיות קשה בהתחלה להשתלט, במיוחד במעבדה שאינה מכיר את הטכניקה.

כמה צעדים הם קריטיים להצלחה של מודל cannulation הלימפה mesenteric. הראשון הוא הבחירה הנכונה של מכשירי ניתוח וסוג הצינורית והכנה. המעבדה שלנו משתמשת קנולות PE עם 0.8 ממדים OD x 0.5 מ"מ ID. עם זאת, מעבדות אחרות שחוו הצלחה עם קנולה PVC של אותו הממד 15. Bevelling הקצה של הצינורית ומראש השרייה בנוגדת קרישה גם מסייע במניעהחסימה של, והיווצרות קרישים בתוך, פוסט-הכנסת הצינורית (שלב 3.13). הצעד הראשון של ההליך כירורגי שכמה מפעילים למצוא קריטיים במיוחד דואג לנקות את השכבות של רקמת חיבור ושומן מעל הצינור לימפה (שלב 3.10). זה עוזר למנוע את ההחדרה של הצינורית בין צינור רקמת הלימפה ולא לצינור לימפה. עם זאת, צעד ניקוי זה קשה כצינור לימפה הוא שביר וקל לנזק. עבור חלק, על שלב זה וההחדרה של הצינורית הושלמו בהצלחה ביותר בעזרת מיקרוסקופ ניתוחי אף לאחרים למצוא את המיקרוסקופ אינו הכרחי. כאשר מכניסים את הצינורית לתוך צינור הכיוון והעומק של הכנסה ביחס לקצה המשופע דורש קצת התחשבות על מנת למנוע את הצינורית שהאפילה על ידי קיר הכלי (שלב 3.12). כל מפעיל נוטה למצוא ההעדפה האישית שלהם. כמו כן חשוב היא ההימנעות מהיווצרות בועת האוויר בתוך ca nnula במהלך ההחדרה כפערי אוויר להחיל בחזרה לחץ לזרימה החופשית של ימפה (שלב 3.12). לבסוף, היישום של דבק וטרינרים כדי לאבטח את הצינורית במקום צריך להיות מתחת לנקודת הכניסה לתוך הצינור כדבק ממוקם ישירות על גבי הצינור יכול לגרום לכלי להתמוטט ולחסום את קצה הצינורית (שלב 3.14).

המדריך הראשוני הקל ביותר באשר לשאלה האם ניתוח הוא מוצלח הוא קצב זרימת הלימפה. ברגע שהצינורית היא בהלימפה מקום בדרך כלל מתחיל לזרום לאט ב -30 דקות הראשונות ולאחר מכן מגדיל. בדרך כלל, ספיקות לcannulations מוצלחת בעכברים> 250 גרם הם> 0.1 מיליליטר / שעה בשעה הראשונה ולאחר מכן להגדיל ל> 0.4 מיליליטר / שעה במצב יציב כפי שמוצג באיור 4. למרות שכמובן עשוי להשתנות בהתאם ל . תנאי ניסוי במונחים של פתרון בעיות, אם לא לימפה זורמת דרך הצינורית או קצב הזרימה הוא נמוכים זה יכול להיות בגלל:

    ype = "i">
  1. הצינורית לא הוכנסה בצורה נכונה לצינור
  2. הצינורית היא בצינור אבל האפילה על ידי הצד השני של קיר הכלי
  3. הצינורית היא בצינור אבל האפילה על ידי דבק שיושם בעמדה שגויה
  4. הצינורית היא בצינור ובועת אוויר בצינורית האטת הזרימה
  5. קריש נוצר בתוך הצינורית

בדיקה זהירה בדרך כלל חושפת את הגורם הבסיסי. אם המפעיל סבור הצינורית לא מונחת בצורה נכונה במקום הראשון (כלומר, לימפה מעולם לא זורמת) אז מחדש ההכנסה היא הכרחית. אם הצינורית נראית במקום הנכון אז הגורם הראשון שיש לבדוק הוא אם בועת אוויר או קריש הוא הווה. בועות אוויר בדרך כלל יעברו דרך הצינורית כתזרימי הלימפה וזרימה באופן זמני איטית. לפעמים זה אפשרי כדי להסיר בועות אוויר או קרישים ידי הציור בחזרה על הצינורית באמצעות מחט 25 G מצורפת ל, למשל, מזרק 1 מיליליטר. אם אין בועת אוויר או קריש זה יכול להיות שימושי כדי לנסות מיצוב מחדש את העכברוש ו / או הפיכה או מושך את הצינורית מעט. לפעמים זה יכול ליישר מחדש את הצינורית כך שהיא אינה חסומה בקיר הספינה. לפעמים הסרת הדבק עם או בלי תנועה קטנה של הצינורית מאפשרת לימפה לזרום שוב גם. עם זאת, אם כל השאר נכשל הצינורית צריכה להיות לרחם. מניסיוננו ניסויים הם פחות מוצלחים כאשר הצינורית לא הוכנסו בצורה נכונה בניסיון הראשון. עם זאת, הצלה כירורגית אפשרית. סיבוך נוסף שיכול להתעורר הוא קושי בcannulation בשל שונות אנטומיים בין חולדות. לדוגמא, את הצינור לימפה mesenteric לעתים עובר בכיוון מביך או שיש צינור הלימפה אבזר בצד השני של עורק mesenteric לצינור לימפה mesenteric מעולה הגדול יותר. בניסויים הדורשים איסוף של כל הנפח של הלימפה זורמת מהמעי הדק (כמו במקרה שלבעת הערכת שומנים כולל ותחבורה סמים מהמעי באמצעות lymphatics), הצינור לימפה אבזר צריך להיות כזה שיחסום את כל הלימפה מופנה לצינור לימפה מעולה. זה קשה להשגה, אבל יכול להיות ניסיון על ידי קשירת תפר סביב צינור האבזר או ניתוק צינור האבזר וחוסם אותו עם דבק וטרינרים (שלב 3.6). הנוכחות של צינור לימפה אבזר היא אחד מהגורמים העיקריים שגורמים לכישלון ניסוי בתרופת ניסויי תחבורת הלימפה. אם כלי האבזר אינו האפיל לחלוטין, זרימת הלימפה ושומנים בדם ותחבורה תרופה נמוכות משמעותי מהצפוי.

בפרוטוקול המובא כאן שרידי בעלי החיים הרדים לאורך כל תקופת אוסף הלימפה. מודל העכברים המורדם (ולא מודלים מודעים המתוארים להלן) מגביר את התפוקה ניסיונית כניתוח וניסוי יכול להתנהל על אחד ולא כמה ימים וr ההצלחה כירורגיתאכלתי גדול כפי שהוא קל יותר לתחזוקת patency צינורית בבעלי חיים משותקים. אלחוש יכול באופן תיאורטי להפחית את ריקון קיבה, עיבוד שומנים במעי וזרימת הלימפה ותחבורה. מניסיוננו, לעומת זאת, שומנים בדם והלימפה תחבורת תרופה דומים בחולדות מורדמות מנוהלות התרופה ישירות לתריסריון (לריקון קיבה עוקפת) בתוך כלי רכב-מעוכל מראש ופיזור מראש (למשל מערכות, חומצת השומן וmicellar מונוגליצריד התפזרו עם פעילי שטח ) בהשוואה לחולדות מודעת מנוהלות באמצעות התרופה gavage פה אל הקיבה ב21,23,27 הטריגליצרידים שווי ערך. ואכן, רוב ניסויי מעיים הלימפה תחבורת סמים במעבדה שלנו ב- 10 השנים האחרונות נערכו במודל בהרדמה בשל התפוקה גבוהה יותר שניתן להשיג. בניסויים אלו שלרוב מנוהלים סמים בניסוחים המכילים חומצת שומן (למשל, חומצה אולאית) ופעיל שטח 43.חומצות שומן מסונתזות לטריגליצרידים לפני שילובם יפופרוטאינים לימפה במעי וזה דורש המקור של רכיבים למהווה את עמוד השדרה של גליצרול הטריגליצרידים (כלומר 2-מונוגליצריד או גליצרול-3-פוספט). הדבר מצביע על כך שטיפול בחומצות שומן בהיעדר מקור גליצרול עלול להוביל לתחבורה הלימפה מופחתת. מנהל של חומצות שומן, לעומת זאת, מאפשר חישוב הישיר של התרומה של חומצת השומן אקסוגניים מנוהל ושומני אנדוגני לשומני הלימפה ותחבורה סמים 43. בנוסף, 2-מונוגליצריד הוא יקר ובדרך כלל לא יציב כפי שבקלות isomerises ל1-מונוגליצריד שמתעכל לגליצרול בחלל המעי. במחקרים שדווחו כאן בנוסף, אנו מראים כי שומנים הלימפה ותחבורה סמים ניסוח היא שווה ערך הבא של ממשל halofantrine תרופת המודל עם חומצת שומן (למשל, חומצה אולאית) ופעיל שטח (מלח מרה) באו יחסי הציבורesence או היעדריו של מקור גליצרול 2-monoolein (טבלת 1). מקורות אנדוגני של גליצרול וכך מופיעים מספיק כדי לתמוך זרימה שווה ערך לימפה ושומנים בדם ותחבורה תרופה לאחר מתן של תרופת מודל זה עם חומצות שומן (למשל, חומצה אולאית) בהעדר מקור גליצרול. זה מספק ביטחון שניתן לקבל נתונים תחבורת הלימפה נציג עם ניסוחים חומצת שומן פשוטים.

המודל הרדים הוארך בקלות למודל מודע בעת צורך. בדגמים המודעים יכולים להיות gavaged ניסוחים ישירות לתוך הקיבה או תריסריון החדירו לתוך הווריד או, השוואה ישירה יכולה להתבצע ללימודי pharmacokinetic שנערכו בבעלי חיים שאינן מודעים לימפה cannulated ותוצאות עשויים להיחשב יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. פרק הזמן הארוך יותר אפשר בבעלי חיים מודעים גם יש את היתרון של המאפשר את איסוף פרופילי pharmacokinetic מלאים יותר לרריכוזי UG בדם, ואילו בניסויים בהרדמה, פרופילי דם הם לעתים קרובות לא שלמים, במיוחד לתרופות מחצית חיים ארוכות. כפי שתואר לעיל, עם זאת, שיעור ההצלחה בלימודים לימפה cannulated מודעים הוא נמוך וניסויים להימשך זמן רב יותר כדי להשלים. ישנם שני סוגים של מודלים cannulation הלימפה מודעים תוארו בספרות. בדגמים מודעים מאופקים 15, לאחר ניתוח cannulation הלימפה, בעלי החיים הוא פשוט פנו לחזית והניחו באיפוק ראוי לשארית הניסוי עם צינורית הלימפה externalised ומוכנסת לתוך צינור איסוף. בעלי החיים מותר אז להחזיר לעצמו את ההכרה ולהתאושש מO ההליך / N כירורגית. שיעור ההצלחה של המודל הזה הוא טוב מאוד בידיהם של מפעילים מנוסים אבל זה יכול להיות קשה על מנת להשיג אישור אתיקה לרסן את בעלי חיים לתקופה הממושכת של הזמן הנדרש לאיסוף לימפה. מודל חלופי שבו נאספת לימפהמחולדות מודעים ולנוע בחופשיות. מודל זה כבר פורט לעיל 25. במודל זה קנולות ארוכות מוכנסות לתוך עורק הצינור לימפה, תריסריון ותרדמת mesenteric. אז cannulas מחילות מתחת לעור, exteriorized בחלק האחורי של הצוואר ומבוצע באמצעות מערכת מסתובבת. החולדה ממוקמת ברתמה מצורף לסיבוב ואיפשר להחזיר לעצמו את ההכרה ולהתאושש מO ההליך כירורגי / N. בעלי החיים יש תנועה חופשית בתוך כלוב מטבולים ודגימות דם לימפה וניתן לאסוף מקנולות externalised מחוץ לכלוב.

cannulation הלימפה mesenteric נשאר הכלי היחיד המאפשר הערכה הישירה של רכיבים לימפה במדינת שבדרך. cannulation הלימפה לרוב מתואר בחולדות כניתוח הוא פחות מורכב מבעלי חיים קטנים וגדולים, המודל זול יותר מאשר בעלי חיים ותוצאות גדולים מופיעים השוואה סבירה בין מיני 27. מצב העכברושאני יכול להיות שונה בהתאם לצורך ניסוי ואת שיעור ההצלחה הוא גבוה בידיהם של מפעילים מנוסים. המודל יכול להיות גם בשילוב עם אחרים במבחנה או במחקרי vivo לבחון, בפירוט, חילוף החומרים או התפקוד של רכיבים לימפה במעי. ברגע שהקים את מודל החולדה cannulated לימפה mesenteric הוא אפוא כלי רב עוצמה כדי להעריך את הריכוז, תחבורה, פונקציה ואת חילוף חומרים של פרמטרים שונים שעוברים ישירות מהמעי למערכת הלימפה (ובמקרים רבים לזרום סופו של דבר למחזור המערכתי).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile saline Baxter healthcare AHB 1307 Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50
70 % ethanol in water Any Any brand can be used
Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4) Livingstone International JJ60243L Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=JJ60243L
Betadine solution Livingstone International BU0510 Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=BU0510
Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  KETA I 1 http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  TRO-3828 http://www.provet.com.au/
ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml) PROVET VICTORIA  VTG-DACP010020 http://www.provet.com.au/
Sodium pentobarbitone PROVET VICTORIA  24529 Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparin (35000I.U. in 35 mL) Sigma Pharmaceuticals 337220 http://sigmaco.com.au/
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E1644 Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma. 
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm Microtube extensions PE8050 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96 x0.58 mm, 30 m
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm Microtube extensions PE9658 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8 x0.5 mm, 30 m
Ruler Any Any brand can be used
Markers Any Any brand can be used
Cigarette lighter Any Any brand can be used
Veterinary adhesive Any Any brand can be used
23 gauge needles Livingstone International DN23GX0.75LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=
6&search=DN23GX0.75LV
25 gauge needles Livingstone International DN25GX1.0LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=
DN25GX1.0LV
1 ml syringe Livingstone International T3SS01TA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS01TA
10 ml syringe Livingstone International T3SS10SA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS10SA
Gauze swabs Livingstone International GSC075 Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=GSC075
Cotton buds Livingstone International CTAST075DP Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=CTAST075DP
Heating pad Ratek WT1 Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray.
Surgical light Harvard Apparatus 72-0215 with 72-0267 Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
-1_HAI_ProductDetail and  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_
-1_HAI_ProductDetail___
Surgical microscope Zeiss 495005-0014-000 Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Silk suture Livingstone International DTSK163019F4 Any brand can be used. Example here is  

3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=DTSK163019F4
Scalpel blades Fine Science Tools (FST) 10020-00 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Scalpel handle Fine Science Tools (FST) 10004-13 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Small surgical scissors Fine Science Tools (FST) 14060-09 Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Forceps with serrated curved tip Fine Science Tools (FST) 11001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x Iridectomy scissors Fine Science Tools (FST) 15000-08 Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 
1 x Forceps with straight serated tip Fine Science Tools (FST) 11650-10 Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-10 Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Forceps with smooth fine curved forceps Fine Science Tools (FST) 11063-07 Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x Hemostats Fine Science Tools (FST) 13010-12 Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Suture needle holder Fine Science Tools (FST) 12001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x Artery clamp Fine Science Tools (FST) 18050-28 Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Oleic acid Sigma Aldrich O1008 When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU
14C-oleic acid Perkin  NEC317050UC  Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Sodium taurocholate Sigma Aldrich T4009 Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU
Halofantrine Glaxo Smith Kline Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich 71507 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich 71643 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barrowman, J. A., Tso, P. Gastrointestinal lymphatics. Comprehensive Physiology. 1733-1777 (2010).
  2. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124, (3), 922-928 (2014).
  3. Mossel, E. C., Ramig, R. F. A lymphatic mechanism of rotavirus extraintestinal spread in the neonatal mouse. J Virol. 77, (22), 12352-12356 (2003).
  4. Pantaleo, G., et al. Hiv-Infection Is Active and Progressive in Lymphoid-Tissue during the Clinically Latent Stage of Disease. Nature. 362, (6418), 355-358 (1993).
  5. Chakraborty, S., Zawieja, S., Wang, W., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, R94-R102 (2010).
  6. Dixon, J. B. Lymphatic lipid transport: sewer or subway. Trends Endocrinol Metab. 21, (8), 480-487 (2010).
  7. Weid, P. -Y., Rehal, S., Ferraz, J. G. Role of the lymphatic system in the pathogenesis of Crohn's disease. Current Opinion in Gastroenterology. 27, (4), 335-341 (2011).
  8. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PloS one. 4, (12), e8442 (2009).
  9. Ji, Y., et al. Activation of rat intestinal mucosal mast cells by fat absorption. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, (11), G1292-G1300 (2012).
  10. Kohan, A., Yoder, S., Tso, P. Lymphatics in intestinal transport of nutrients and gastrointestinal hormones. Ann N Y Acad Sci. 1207, Suppl 1. E44-E51 (2010).
  11. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Targeted drug delivery to lymphocytes: a route to site-specific immunomodulation. Mol Pharm. 7, (6), 2297-2309 (2010).
  12. Rothkotter, H. J., Huber, T., Barman, N. N., Pabst, R. Lymphoid cells in afferent and efferent intestinal lymph: lymphocyte subpopulations and cell migration. Clin Exp Immunol. 92, (2), 317-322 (1993).
  13. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Lipid-based delivery systems and intestinal lymphatic drug transport: a mechanistic update. Adv Drug Deliv Rev. 60, (6), 702-716 (2008).
  14. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. Am J Physiol. 261, (3 Pt 1), G530-G538 (1991).
  15. Kohan, A. B., Howles, P. N., Tso, P. Methods for studying rodent intestinal lipoprotein production and metabolism. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 219-230 (2012).
  16. Porter, C. J., Trevaskis, N. L., Charman, W. N. Lipids and lipid-based formulations: optimizing the oral delivery of lipophilic drugs. Nat Rev Drug Discov. 6, (3), 231-248 (2007).
  17. Trevaskis, N. L., et al. The role of the intestinal lymphatics in the absorption of two highly lipophilic cholesterol ester transfer protein inhibitors (CP524,515 and CP532,623). Pharm Res. 27, (5), 878-893 (2010).
  18. Choo, E. F., et al. The Role of Lymphatic Transport on the. Systemic Bioavailability of the Bcl-2 Protein Family Inhibitors Navitoclax (ABT-263) and ABT-199. Drug Metabolism and Disposition. 42, (2), 207-212 (2014).
  19. Han, S., et al. Targeted delivery of a model immunomodulator to the lymphatic system: comparison of alkyl ester versus triglyceride mimetic lipid prodrug strategies. J Control Release. 177, 1-10 (2014).
  20. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. J Lab Clin Med. 33, (10), 1349-1352 (1948).
  21. Porter, C. J., Charman, S. A., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the triple-cannulated anesthetized rat model: effect of lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85, (4), 351-356 (1996).
  22. Boyd, M., Risovic, V., Jull, P., Choo, E., Wasan, K. M. A stepwise surgical procedure to investigate the lymphatic transport of lipid-based oral drug formulations: Cannulation of the mesenteric and thoracic lymph ducts within the rat. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49, (2), 115-120 (2004).
  23. Porter, C. J., Charman, S. A., Humberstone, A. J., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the conscious rat when administered as either the free base or the hydrochloride salt: effect of lipid class and lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85, (4), 357-361 (1996).
  24. Caliph, S. M., Charman, W. N., Porter, C. J. Effect of short-, medium-, and long-chain fatty acid-based vehicles on the absolute oral bioavailability and intestinal lymphatic transport of halofantrine and assessment of mass balance in lymph-cannulated and non-cannulated rats. J Pharm Sci. 89, (8), 1073-1084 (2000).
  25. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Adv Drug Deliv Rev. 50, (1-2), 45-60 (2001).
  26. Noguchi, T., Charman, W. N. A., Stella, V. J. Lymphatic Appearance of Ddt in Thoracic or Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rats. International Journal of Pharmaceutics. 24, (2-3), 185-192 (1985).
  27. Trevaskis, N. L., et al. A mouse model to evaluate the impact of species, sex, and lipid load on lymphatic drug transport. Pharm Res. 30, (12), 3254-3270 (2013).
  28. Kota, J., et al. Lymphatic absorption of subcutaneously administered proteins: influence of different injection sites on the absorption of darbepoetin alfa using a sheep model. Drug Metab Dispos. 35, (12), 2211-2217 (2007).
  29. McHale, N. G., Adair, T. H. Reflex modulation of lymphatic pumping in sheep. Circ Res. 64, (6), 1165-1171 (1989).
  30. White, D. G., Story, M. J., Barnwell, S. G. An Experimental Animal-Model for Studying the Effects of a Novel Lymphatic Drug Delivery System for Propranolol. International Journal of Pharmaceutics. 69, (2), 169-174 (1991).
  31. Khoo, S. M., Edwards, G. A., Porter, C. J., Charman, W. N. A conscious dog model for assessing the absorption, enterocyte-based metabolism, and intestinal lymphatic transport of halofantrine. J Pharm Sci. 90, (10), 1599-1607 (2001).
  32. Kararli, T. T. Comparison of the gastrointestinal anatomy, physiology, and biochemistry of humans and commonly used laboratory animals. Biopharm Drug Dispos. 16, (5), 351-380 (1995).
  33. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. J Biomed Opt. 17, (8), 086005 (2012).
  34. Dahan, A., Hoffman, A. Evaluation of a chylomicron flow blocking approach to investigate the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs. Eur J Pharm Sci. 24, (4), 381-388 (2005).
  35. Xiao, C., Lewis, G. F. Regulation of chylomicron production in humans. Biochim Biophys Acta. 1821, (5), 736-746 (2012).
  36. Seeballuck, F., Ashford, M., O'Driscoll, C. The Effects of Pluronic® Block Copolymers and Cremophor EL on Intestinal Lipoprotein Processing and the Potential Link with P-Glycoprotein in Caco-2 Cells. Pharmaceutical Research. 20, (7), 1085-1092 (2003).
  37. Levy, E., Mehran, M., Seidman, E. Caco-2 cells as a model for intestinal lipoprotein synthesis and secretion. The FASEB Journal. 9, (8), 626-635 (1995).
  38. Cartwright, I. J., Higgins, J. A. Isolated rabbit enterocytes as a model cell system for investigations of chylomicron assembly and secretion. Journal of Lipid Research. 40, (7), 1357-1365 (1999).
  39. Dixon, J. B., Raghunathan, S., Swartz, M. A. A Tissue-Engineered Model of the Intestinal Lacteal for Evaluating Lipid Transport by Lymphatics. Biotechnology and Bioengineering. 103, (6), 1224-1235 (2009).
  40. Gershkovich, P., et al. The role of molecular physicochemical properties and apolipoproteins in association of drugs with triglyceride-rich lipoproteins: in-silico prediction of uptake by chylomicrons. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 61, (1), 31-39 (2009).
  41. Gershkovich, P., Hoffman, A. Uptake of lipophilic drugs by plasma derived isolated chylomicrons: Linear correlation with intestinal lymphatic bioavailability. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 26, (5), 394-404 (2005).
  42. Holm, R., Hoest, J. Successful in silico predicting of intestinal lymphatic transfer. International Journal of Pharmaceutics. 272, (1-2), 189-193 (2004).
  43. Trevaskis, N. L., Porter, C. J., Charman, W. N. Bile increases intestinal lymphatic drug transport in the fasted rat. Pharm Res. 22, (11), 1863-1870 (2005).
  44. Miura, S., et al. Increased proliferative response of lymphocytes from intestinal lymph during long chain fatty acid absorption. Immunology. 78, (1), 142-146 (1993).
  45. Caliph, S. M., et al. The impact of lymphatic transport on the systemic disposition of lipophilic drugs. J Pharm Sci. 102, (7), 2395-2408 (2013).
  46. Caliph, S. M., Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Intravenous dosing conditions may affect systemic clearance for highly lipophilic drugs: implications for lymphatic transport and absolute bioavailability studies. J Pharm Sci. 101, (9), 3540-3546 (2012).
  47. Trevaskis, N. L., et al. Tissue uptake of DDT is independent of chylomicron metabolism. Arch Toxicol. 80, (4), 196-200 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics