A linfa mesentérica Duct canulada Rat Modelo: Aplicação para a Avaliação de Intestinal Linfática transporte da droga

Immunology and Infection

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Trevaskis, N. L., Hu, L., Caliph, S. M., Han, S., Porter, C. J. The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport. J. Vis. Exp. (97), e52389, doi:10.3791/52389 (2015).

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Abstract

O sistema linfático intestinal desempenha um papel-chave no transporte de fluidos, a absorção de lipídios e função imunológica. A linfa flui directamente a partir do intestino delgado através de uma série de vasos linfáticos e dos nodos que convergem na conduta de linfa mesentérica superior. A canulação do canal linfático mesentérico permite assim a obtenção de linfa mesentéricos que flui a partir do intestino. Linfático mesentérico consiste de uma fracção celular de células imunitárias (99% de linfócitos), fracção aquosa (fluido, péptidos e proteínas, tais como as citoquinas e as hormonas do intestino) e fracção de lipoproteína (lípidos, moléculas lipofílicas e apo-proteínas). O modelo de canulação ducto linfático mesentérico pode, portanto, ser usadas para medir a concentração e velocidade de transporte de uma variedade de factores a partir do intestino, através do sistema linfático. Alterações a estes factores em resposta a desafios diferentes (por exemplo, dietas, antigénios, medicamentos) e na doença (por exemplo, doença inflamatória do intestino, HIV, diabetes) pode também be determinada. Uma área de interesse é expandir o papel do transporte linfático na absorção de drogas e pró-drogas lipofílicas administrados por via oral que se associam com as vias de absorção intestinal de lipídios. Descrevemos aqui, em detalhe, um modelo de rato canulado ducto linfático mesentérico, que permite a avaliação da taxa e extensão de lípido e o transporte da droga através do sistema linfático, durante várias horas, após a libertação intestinal. O método é facilmente adaptável para a medição de outros parâmetros de linfa. Nós fornecer descrições detalhadas das dificuldades que podem ser encontradas ao estabelecer esse método cirúrgico complexo, bem como dados representativos de experiências fracassadas e bem sucedidas para fornecer instruções sobre como confirmar o sucesso experimental e interpretar os dados obtidos.

Introduction

A linfa flui a partir do intestino delgado através de um processo unidireccional que se origina no lacteals únicos que estão contidos dentro de cada pequena vilosidades intestinais 1. Lacteals são relativamente permeáveis ​​a fluidos, macromoléculas e as células e, assim, a formação de linfa começa com a entrada destes factores em lacteals. A linfa inicial nos lacteals flui posteriormente a partir do intestino através de uma rede de microvasos linfáticos, coletando (aferentes) vasos linfáticos, uma série de linfonodos mesentéricos e, finalmente, os vasos linfáticos pós-nodal (eferente). Dentro dos nodos, linfa passa através de uma série de cavidades medulares onde a troca ocorre com as células imunitárias residentes nó assim como o material que entram no nó do sangue. Todos linfa flui do intestino delgado, eventualmente, converge para o ducto eferente linfa mesentérica superior e, posteriormente, a cisterna do quilo. A cisterna do quilo também recolhe drenagem linfática os tecidos periféricos caudais, intestinal, regiões hepáticas e lombar e junta-se o duto linfático torácico, juntamente com a linfa do mediastino e partes do crânio do corpo. O ducto linfático torácico esvazia linfa diretamente no sistema venoso na junção das veias jugular interna e subclávia esquerda. O protocolo aqui descrito, o que permite a recolha de linfa directamente a partir da conduta de linfa mesentérica superior, facilitando, assim, a análise de vários factores que transitam directamente a partir do intestino para a circulação sistémica (geral) através do sistema linfático intestinal.

As principais funções fisiológicas atribuídos ao sistema linfático intestinal são para manter o equilíbrio de fluidos, para facilitar a absorção de lípidos e molécula lipofílica, e para permitir que as respostas imunes adequadas 1. As células tumorais e vírus também se propagar através dos vasos linfáticos intestinais 2-4 e principais mudanças ocorrem dentro dos vasos linfáticos em várias patologias inflamatórias e metabólicas 5-7. Latanulation do ducto linfático mesentérico para recolher linfa dentro do mesentério permite uma análise de fluxo de fluido a granel através dos vasos linfáticos intestinais, bem como a quantificação da taxa de concentração e transporte de várias células e moléculas. Alterações na concentração ou o trânsito desses fatores na resposta a vários desafios (por exemplo: dietas, antígenos, drogas) e em modelos de doenças (por exemplo, colite, HIV, diabetes) podem também ser avaliadas. Embora seja impossível para descrever exaustivamente cada componente de linfa, que podem ser analisados ​​e comparados aqui, linfa mesentéricos simplista consiste aquosa, de lípidos e fases celulares. Os componentes de interesse na fase aquosa incluem péptidos e proteínas tais como antigénios ou tolerogénios 8, mensageiros imunes, tais como citocinas e mediadores de mastócitos, e mediadores 9 metabólicas tais como as incretinas 10. A fração celular da linfa mesentérica pós-nodal é composto quase inteiramente (mais de 99%) de lymphocytes 11. Várias células imunológicas (células dendríticas, mastócitos, etc.) penetram nos vasos linfáticos mesentéricos pré-nodais, mas permanecem dentro do nó 12. Se as células dentro da linfa aferente são de interesse, é possível recolher essas células por meio de remoção dos gânglios linfáticos mesentéricos de vários dias antes da canulação da conduta de linfa mesentéricos 12. Desta forma, as condutas linfáticos aferentes e eferentes são directamente ligados e as células linfáticas em linfa aferente passar directamente para o tubo linfático mesentérico. O trânsito e fenótipo de várias células do sistema imunológico que passam através dos vasos linfáticos intestinais podem, assim, ser examinado. Talvez a razão mais comum citada para a coleta de linfa mesentérica, até à data, no entanto, é estudar o processamento intestinal, absorção e transporte de lipídios na dieta e moléculas lipofílicas 10.

Após a ingestão, os lípidos da dieta são digeridos (por exemplo, a partir de triglicéridos de ácidos gordos e de monoglicérido, phospholipid de ácidos gordos e de lisofosfolípido, e éster de colesterol de ácido gordo e de colesterol, etc.) e dispersos no lúmen intestinal em pequena das micelas e vesículas através da adição de compostos anfifílicos de bílis (fosfolípidos, colesterol e sais biliares) e a acção de enzimas pancreáticas 10,13. De lá eles são absorvidos enterócitos. A proporção dos componentes absorvidos são re-esterificados para formar triglicéridos, fosfolípidos e ésteres de colesterol no interior das células de absorção (enterócitos). Estes lípidos re-esterificados são montados a partir de uma combinação de componentes lipídicos exogenamente ingerida e componentes lipídicos endógenos da bílis segregada, piscinas ou lípidos da mucosa intestinal o fornecimento de sangue 13. A partir daqui os lípidos estéril içados são armazenados dentro de enterócitos ou montados em lipoproteínas intestinais (quilomicrons, lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL)) em conjunto com várias outras apoproteínas e moléculas lipofílicas ( 10,13. Depois de sair enterócitos, lipoproteínas são especificamente transportados a partir do intestino para a circulação sistémica através do sistema linfático mesentérico como lacteals intestinais são mais permeáveis ​​a sua entrada do que os capilares sanguíneos intestinais. A proporção de componentes lipídicos são também absorvidos transportados a partir do intestino para o sistema circulatório através dos capilares sanguíneos e veia porta como, não só lipoproteína associados, 14 moléculas. Em geral, no entanto, a via de transporte da veia portal é apenas um actor importante na absorção de lípidos de comprimento de cadeia curto e médio prazo.

A recolha de linfa mesentéricos permite assim a avaliação do transporte de lipoproteínas e os componentes associados (lípidos, moléculas lipofílicas, apo-proteínas) a partir do intestino. As lipoproteínas podem ser quantificados e caracterizado com a vantagem de que as lipoproteínas linfáticos mesentéricos, em geral, estão em uma nascenestado t, uma vez que não foram extensivamente modificado por enzimas sistêmicas tais como lipoproteína lipase 15. Embora o modelo de rato canulada linfático mesentérico foi talvez historicamente sido mais extensivamente descrito para a análise de transporte de lípido / lipoproteína a partir do intestino, uma área de expansão interesse é o papel de vasos linfáticos no transporte de fármacos lipofílicos, pró-drogas e outros xenobióticos 13,16 que é o foco do modelo descrito aqui. Fármacos lipofílicos (geralmente aqueles com log P> 5 e solubilidade em cadeia longa triglicéridos> 50 mg / g, embora exceções são aparentes) 17,18, pró-drogas 19 e outros xenobióticos 13,16 pode ter acesso aos vasos linfáticos intestinais passivamente ou por integrar activamente em lipoproteínas intestinal vias de transporte 19.

O rato linfa mesentérica técnica de punção, portanto, tem muitas aplicações. Bollman et al. Descreveu pela primeira vez um technique para canular a conduta de linfa mesentéricos de ratos em 1948 20. Desde então um certo número de variantes do modelo foram descritos. Por exemplo, a coleta pode ocorrer quando o rato é anestesiados com vários anestésicos 21,22, ou no estado consciente enquanto conteve 15 ou mover livremente 23,24. Os ratos podem ser administrados diferentes soluções de reidratação e outras substâncias, tais como lípidos e de formulações de drogas em taxas diferentes no estômago, intestino ou parentérica (tipicamente 0-5 ml / h) 25. Em alguns estudos, o ducto torácico linfático em vez de ducto linfático mesentérico é canulada para estimar o transporte a partir do intestino através dos vasos linfáticos, embora isto possa subestimar o trânsito do intestino delgado, dependendo o factor de interesse, como a conduta de linfócito torácico recebe também a partir de linfa outra regiões 22,26. Modelos de canulação linfáticos também foram descritos em várias outras espécies, incluindo ratos 15,27, mini-pigs 12, 28,29 ovelhas, porcos e cães 30 31. No entanto, o modelo de rato é o mais amplamente e de forma consistente citados. Protocolos detalhados para canulação do ducto linfático mesentérica seguido da coleta de linfa no consciente 25 ou anestesiados 22 ratos e camundongos 15,27 foram publicados anteriormente e o leitor interessado é direcionado para estes protocolos. Este protocolo é o primeiro a demonstrar a técnica em um formato visualizado.

O modelo de rato linfa cânula tem vantagens sobre animais de grande porte em termos de despesa, a facilidade da cirurgia e considerações éticas. Quando comparado com o modelo do rato, mesentérica linfa cirurgia cannulation também é mais fácil no rato, embora o modelo de rato permite estudos mais detalhados em animais transgênicos 27. No entanto, existem algumas limitações do modelo de rato, particularmente aqueles associados com diferenças na fisiologia, esse limite extrapolatião positivo para outras situações pré-clínicos e clínicos. Por exemplo, o fluxo de bílis no rato é constante e independente da ingestão de alimentos enquanto que na maior comida lipídios espécies ou estimular o fluxo de bílis 32. Isso cria desafios para a obtenção de ambientes de pré e pós-prandial representativos no rato que refletem o que é visto em espécies e seres humanos maiores. Para os estudos de distribuição de drogas, espécies maiores também podem ser preferidos na avaliação dos transportes linfática após a administração da dose humana realista forma 25. Em um estudo recente, as taxas de transporte de lipídios na linfa mesentérica foram encontrados para ser comparáveis ​​entre espécies (rato, cão) após a administração de uma massa equivalente e tipo de lipídio que fornece alguma confiança na extrapolação de dados de transporte de lipídios entre espécies 27. No entanto, o transporte de um modelo lipofílico de drogas, halofantrina, classificados em ordem de tamanho do animal (ou seja, cão> rat> mouse). Um fator de escala pode, assim, ser obrigado a extrapolate dados de transporte de drogas linfáticos de rato a outras espécies.

Uma limitação dos modelos de canulação de linfa, em geral, é que a recolha de linfa passiva directamente a partir de uma conduta linfático pode modificar o fluxo linfático e de transporte uma vez que os vasos linfáticos trabalhar contra um gradiente de pressão que é alterada uma vez que o recipiente 33 é canulada. O modelo cannulation linfático também pode ser difícil de estabelecer, em laboratórios que não estão familiarizados com a técnica. Modelos alternativos têm sido assim descrito. Por exemplo, o transporte de factores através do sistema linfático intestinal, tais como lipoproteínas e moléculas lipofílicas, foi estudado indirectamente através de recolha do sangue. Um desses modelos envolve a comparação de concentrações de lípidos no sangue e / ou drogas, após a administração oral, na presença e na ausência de inibidores (por exemplo, colchicina, Pluronic L81, ciclo-heximida) produção de lipoproteína intestinal que bloqueie o transporte linfático 34. Uma vantagemde modelos que quantificam transporte linfático indiretamente por meio da coleta de amostras de sangue é que ele permite alguma avaliação do transporte linfático em humanos como cirurgia invasiva não é necessária 35. No entanto, os inibidores de transporte linfático não são específicas e factores que são transportados através dos vasos linfáticos são diluídos e modificado na circulação sistémica que complica estas avaliações. In vitro alternativas também têm sido descritos. Por exemplo, Caco-2 celulares ou isolado enterócitos culturas têm sido utilizados para estudar mais detalhadamente a secreção intestinal de moléculas que entram nos vasos linfáticos 36-38. Um modelo avançado in vitro que é mais representativo do microambiente intestinal humana também foi descrita recentemente 39. Neste modelo, uma camada de células endoteliais linfáticas é co-cultivadas com células Caco-2, que permite uma análise mais detalhada da transferência de substâncias a partir do intestino para o sistema linfático. No entanto, em vitro sistemas de células não possuem fluxo cambial e transferir ou seja, a interligação com um lúmen intestinal e sangue subjacente e suprimento vascular linfático. Em uma abordagem alternativa, Kassis et al. Estabeleceram um dual-channel (alta velocidade vídeo de campo brilhante e fluorescência), em sistema de imagem situ que permite comparações quantitativas entre contração dos vasos, o fluxo de linfa e concentrações de lipídios fluorescentes em vasos linfáticos mesentéricos 33. Uma vantagem deste modelo sobre o acima mencionado em sistemas in vitro é que ele permite a localização precisa da passagem de células do sistema imunológico através dos vasos linfáticos. Medições absolutas de massa de lípidos (ou medicamento) de transporte são, no entanto, ainda não está estabelecida utilizando métodos de imagem. Estudos in vitro e in silico abordagens especificamente para prever o grau de transporte da droga lipófila através dos vasos linfáticos intestinais foram também publicados 40-42. Por exemplo, a afinidade ex vivo de vários compounds para chylomicrons plasma correlacionou-se razoavelmente bem com o seu transporte linfático in vivo 41. Posteriormente, o mesmo grupo estabeleceu um modelo em silico para prever a afinidade da droga para chylomicrons com base em múltiplos de 40 propriedades físico-químicas. Holm et al., Também estabelecida uma relativamente complexo no modelo para prever silico imediato transporte linfático de compostos lipofílicos em função dos descritores moleculares 42. Estes modelos podem proporcionar uma abordagem útil para prever a extensão de transporte linfático de drogas desconhecidas. A validação dos modelos com uma grande variedade de drogas e em diferentes laboratórios, no entanto, ser necessário para confirmar a sua precisão e reprodutibilidade.

A canulação do canal linfático mesentérico permanece, assim, os únicos meios para examinar directamente o conteúdo de drenagem linfática do intestino delgado e a velocidade de trânsito do complexo conjunto de factores (células, proteínas,peptídeos, lipídios, medicamentos) a linfa em uma situação in vivo. Aqui nós descrevemos um protocolo para a canulação do ducto linfático e carótida artéria mesentérica, que permite a coleta de linfa mesentérica e arterial sistêmica de ratos anestesiados. Os dados representativos demonstram como o modelo pode ser usado para examinar o transporte de lípidos e de drogas a partir do intestino, através do sistema linfático mesentérico. Isto é seguido por uma discussão das dificuldades que podem ser encontradas no estabelecimento do modelo e um guia de resolução de problemas. Uma vez estabelecido o modelo é uma ferramenta poderosa para investigar transporte linfático intestinal.

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Protocol

Os estudos descritos neste manuscrito foram aprovados pelo comitê de ética animal local e foram conduzidos de acordo com a Austrália e Nova Zelândia Conselho para o tratamento de animais em diretrizes pesquisa e ensino. Antes de iniciar qualquer procedimento animal, garantir que a permissão adequada é obtida através do local de instituição / organização. Tal como acontece com todas as cirurgias de animais, assegurar que a cirurgia é realizada por operadores devidamente treinados, sob condições assépticas e que os anestésicos, analgésicos e antibióticos são administrados quando necessário para garantir um resultado ético e bem sucedida.

1. Preparações do dia antes do procedimento cirúrgico

  1. Velocidade com que o rato a noite antes da cirurgia, se necessário. Verifique se o rato tem livre acesso à água.
  2. Preparar as soluções a ser administrada ao rato.
    1. Prepare uma solução de reidratação, como solução de Ringer ou soro fisiológico estéril.
    2. Prepare umsoluções estéticas como requerido. O anestésico utilizado nas experiências descritas aqui consistiu em "Cocktail 1" preparado por combinação de 1,9 ml de cetamina 100 mg / ml, 0,5 ml de xilazina 100 mg / ml, 0,2 ml de acepromazina 10 mg / ml e 2,5 ml de solução salina e " 2 cocktail "que consiste em 1 ml de cetamina 100 mg / ml e 0,1 ml de acepromazina 10 mg / ml. NOTA: isoflurano inalado ou sevoflurano pode ser preferido, uma vez que pode fornecer um plano cirúrgico de anestesia durante um longo período de tempo.
    3. Opcionalmente preparar uma formulação que contém o fármaco, por exemplo, uma emulsão de lípidos. Realizar estudos de estabilidade adequados para garantir a estabilidade da formulação ao longo do período de armazenamento e administração.
      NOTA: A natureza exacta da formulação e da droga a ser administrada irá variar de acordo com cada um dos estudos, como o objectivo de estudos de transporte de fármacos linfáticos é mais frequentemente para avaliar a eficiência do transporte da droga linfático como uma função da formulação da droga e administered.
      1. A formulação utilizada nas experiências representativas na Figura 4 e 5 aqui é preparado, tal como descrito anteriormente 43. Resumidamente, incorporar o ácido oleico 14 C (2-5 uCi) e halofantrina (200 ug) em 40 mg de ácido oleico antes da dispersão em 5,6 ml de uma fase aquosa que consiste de taurocolato de sódio a 5 mM em tampão fosfato salino (pH 6,9).
      2. Para formulações contendo de 2-mono-oleína, adicionar 7,1 mg de 2-mono-oleína juntamente com outros componentes, para a fase aquosa, ao mesmo tempo que a fase de ácido oleico contendo halofantrina. Preparar as formulações que contêm 2-monooleína imediatamente antes da administração ao rato de 2-mono-oleína é relativamente instável e isomerises de 1-mono-oleína.
      3. Subsequentemente emulsionar as formulações por ultra-sons durante 2 minutos à temperatura ambiente.
        NOTA: Como tem sido descrita anteriormente 43, monitorar a estabilidade das formulações por i) inspecção visual da emulsion, sob luz polarizada para assegurar que a emulsão não é de fase separada, ii) análise do tamanho de partícula imediatamente após a preparação e após a dosagem utilizando dispersão de luz dinâmica para proporcionar uma indicação de quaisquer mudanças de fase e / ou a separação, e iii) análise de concentrações usando halofantrina um ensaio de HPLC validado.
  3. Preparar a solução de anti-coagulante contendo 10 mg / ml de EDTA em água estéril ou 10 UI / ml de heparina em solução salina para lavar a cânula linfa. Também preparar solução de anti-coagulante contendo 2,5-10 UI / ml de heparina em solução salina para expulsar da cânula da artéria carótida.
  4. Preparar as cânulas de polietileno para a inserção dentro da conduta de linfa mesentéricos (0,8 mm de diâmetro externo, 0,5 mm de DI), artéria carótida (0,96 mm de diâmetro externo, 0,58 mm de diâmetro ou 0,8 mm de diâmetro externo, 0,5 mm de diâmetro) e do duodeno (0,96 mm de diâmetro externo, 0,58 mm de DI )
    1. Corte as cânulas para o comprimento requerido (tipicamente 25 - 30 cm para a artéria carótida e a cânula duodenal e 10 - 15 cm, para a linfa cânula) e colocar um chanfro na ponta das cânulas utilizando uma lâmina cirúrgica estéril (ver Figura 1).
      NOTA: Isto aumenta a facilidade de inserção de cânula e reduz a incidência da cânula bloqueio pós-inserção.
    2. Coloque um ponto de ancoragem na forma J cânula intraduodenal passando uma pequena porção da cânula para trás sobre si mesma, aquecendo-o com uma placa mais leve ou a quente e, em seguida, o corte de tamanho (ver Figura 1).
  5. Anexar a cânula linfa para uma agulha de 25 G e seringa contendo uma solução de anti-coagulante (preparado no passo 1.3). Encher a cânula linfa com a solução de anti-coagulante e deixar a solução na cânula O / N para reduzir a incidência de formação de coágulo dentro da cânula durante a colheita de linfa linfa.
  6. Prepare tubos para coleta de linfa e amostra de sangue. Pré-pesar tubos de coleta de linfa, tubos de etiqueta para a coleta de linfa e amostra de sangue e adicionar solução anti-coagulante. Adicionar solut anti-coagulante suficientede iões para atingir uma concentração final de 1 mg / ml de EDTA em água estéril ou de 10 - 20 UI / ml de heparina no sangue ou linfa recolhida.

2. Preparações Imediatamente antes de iniciar o procedimento cirúrgico

  1. Verifique todas as cânulas por lavagem com solução anti-coagulante salina estéril ou para garantir que eles são patentes.
  2. Prepare o rato para o procedimento cirúrgico.
    NOTA: A conduta de linfa mesentérica é mais visível em ratos que comeram ou foram administrados uma dose de óleo como a linfa mesentérica torna-se leitoso e opaco com maior carga lipídica. Alguns operadores, particularmente aqueles que são novos para a cirurgia, portanto, acham mais fácil cannulate o duto de linfa mesentérica quando os ratos são pré-tratados com um óleo (cerca de 0,1-1 ml), tais como azeite ou óleo de soja 0,5-2 horas antes da cirurgia com início . No entanto, o óleo de pré-dosagem, afecta o transporte linfático de lípidos, drogas lipofílicas e de outros factores na linfa de tal modo que ele não pode ser ideal para pré-dose de petróleoconsoante o objectivo da experiência.
    1. Anestesiar o rato durante todo o período de coleta de cirurgia e amostra.
      1. Por exemplo, iniciar a anestesia por meio de injecção subcutânea de 1,5 ml / kg de cocktail I (a partir do passo 1.2.2) numa prega da pele na parte de trás do pescoço ratos utilizando uma seringa de 1 ml ligada a uma agulha G 25. Manter a anestesia por meio de injecção intraperitoneal de 0,44 ml / kg de cocktail 2 (a partir do passo 1.2.2) aproximadamente cada hora, conforme necessário, utilizando uma seringa de 1 ml ligada a uma agulha G 25.
      2. Antes de iniciar a cirurgia assegurar que a profundidade da anestesia é suficiente observando taxa respiratória, o movimento suiça, tónus muscular e respostas a estímulos, tais como comprimindo de pé. Administrar anestesia adicional conforme requerido.
    2. Raspar a pele das regiões cirúrgicas, que incluem o lado direito do abdómen para a linfa e canulação duodeno, e a região pescoço e clavícula esquerda para a cânula da artéria carótidação.
    3. Limpe as regiões cirúrgicos assepticamente utilizando solução solução de clorexidina ou povidine-iodo e um matagal etanol 70%. Repita 3 vezes para cada região, terminando com uma limpeza final com etanol 70%.
  3. Colocar o animal em decúbito dorsal numa folha limpa de cima de uma almofada cirúrgico aquecido (37 ° C).

3. A canulação da linfa mesentérica Duct

  1. Colocar o animal com o lado direito virado para o operador. Realizar a cirurgia, com ou sem o auxílio de um microscópio cirúrgico, conforme necessário.
  2. Abrir a camada superior da parede muscular abdominal com uma incisão de 4 cm linear se prolonga a partir da linha média (processo xifóide) para o flanco direito de aproximadamente 2 cm abaixo da caixa torácica (RCD) usando uma lâmina de bisturi estéril (ver Figura 2B).
  3. Abra as restantes camadas da parede muscular abdominal 4-5 mm lateral à linha média para o flanco direito com um pequeno parde tesouras cirúrgicas (ver Figura 2B).
  4. Recolha o intestino delgado sob a parede muscular abdominal esquerdo e mantê-lo no lugar usando 2-3 pedaços de gaze estéril saturadas com soro fisiológico normal.
  5. Ponte do rato ao longo de um seringa de 10 ml de plástico colocada horizontalmente por baixo das costas do rato ao nível de rim direito para facilitar a visualização do ducto linfático mesentérico.
  6. Localizar o ducto mesentérica superior linfa: um vaso aproximadamente 0,5-1 mm de diâmetro, que é perpendicular ao rim direito e imediatamente rostral e paralelo à artéria mesentérica (um vaso sanguíneo vermelho escuro pulsante; ver Figura 2C).
    NOTA: Em ratos pré-doseadas sem jejum ou oleosas do vaso é branco, opaco e mais fácil de visualizar do que em ratos em jejum em que é bastante transparente.
  7. Inspeccionar a área imediatamente caudal ao ducto linfa mesentérica superior e artéria mesentérica para determinar se uma segunda conduta de menor linfa, é acessóriopresente. Se estiver presente, bloquear o fluxo de linfa através da conduta por meio do corte da conduta e ocluir com supercola, ou atar um fio de sutura em torno da conduta, para garantir que todo o volume do fluxo de linfa do intestino é recolhido a partir da conduta de linfa mesentérica superior.
  8. Passar por um par de fórceps rectas através do leito de gordura peri- renal na margem inferior do rim direito, e através das camadas de tecido conjuntivo imediatamente abaixo da veia cava, numa direcção paralela com a conduta de linfa mesentérica superior.
  9. Com a ponta do fórceps, ter de segurar a cânula linfa e puxá-lo através do leito de gordura peri-renal com uma extremidade imediatamente adjacente à conduta de linfa mesentéricos e o outro exteriorizada do animal ao nível do rim direito.
  10. Isolar a conduta de linfa mesentérica de sobrepondo camadas de tecido conjuntivo e gordura por dissecção romba. Tome cuidado para não furar ou danificar o ducto linfático.
  11. Após o isolamento do duto linfático, faça um pequeno hole no duto linfático tanto com micro-tesoura, a ponta afiada de uma pinça de joalheiro ou uma agulha 25 G. Tome cuidado para não cortar completamente o vaso.
  12. Assegure-se que a cânula de linfa é completamente cheio com a solução de anti-coagulante (usando uma seringa e uma agulha de 25 G), sem lacunas de ar. Inserir a cânula linfa aproximadamente 2-4 mm para dentro da conduta de linfa mesentéricos, através do pequeno orifício com a ajuda de um pequeno par de fórceps.
  13. Observe a cânula de linfa por um par de minutos. Observar um fluxo gradual da linfa intestinal a partir do final de recolha livre da cânula se a punção é bem sucedida. Se a punção não é bem-sucedida, repita os passos 3,8-3,12.
  14. Se o punção é bem sucedido, segurar a cânula, colocando uma pequena gota de cola veterinária sobre o orifício de entrada para a conduta de linfa. Tome cuidado para não obstruir o vaso através da aplicação de excesso de adesivo veterinária.
  15. Enquanto espera para o adesivo veterinário para definir, observe o fluxo de linfa durante vários minutos para assegurar que o procedimento de canulação foi bem-sucedida. Uma vez determinado o sucesso da canulação, remover as peças de gaze que foram colocadas na cavidade abdominal cuidadosamente e colocar o intestino delgado na sua posição original.
  16. Coloque um tubo de recolha de linfa contendo anti-coagulante (ver passo 1.6) na extremidade da cânula para recolher a linfa de fluxo livre.
  17. Em seguida, canular o duodeno para a infusão de soluções de re-hidratação e / ou formulações.

4. A canulação do duodeno

  1. Anexar o duodeno cânula para uma seringa (por exemplo, 10 ml) cheio com a solução de re-hidratação.
  2. Identificar o duodeno como o rosa brilhante (com mais vasos sanguíneos) seção do intestino delgado, que após suave para baixo puxando revela o estômago.
  3. Fazer um pequeno orifício de punção no duodeno com aproximadamente 2 cm abaixo da junção do estômago e do duodeno (a piloro) usandoum estéril 23 G agulha.
  4. Insira a extremidade em forma de gancho J da cânula duodenal através do orifício da punção. Segura no lugar com uma gota de cola de cianoacrilato.
  5. Começando a hidratação do rato, anexando a cânula à seringa reidratação carregado na bomba de infusão. De acordo com a literatura as taxas de re-hidratação variam 0,5-3 ml / hr 15,25.
  6. Após a conclusão da linfa e canulação duodeno, fechar a incisão na parede muscular abdominal com sutura. Em seguida, fechar a incisão na pele por aplicação de algumas gotas de adesivo de tecido (cianoacrilato) ao longo do lado da incisão e comprimindo a pele de ambos os lados da incisão em conjunto.

5. A canulação da artéria carótida

A canulação da artéria carótida pode ser realizada antes ou após a canulação do canal linfático mesentérico. Alguns operadores preferem para canular a artéria carótida antes da canulação da conduta de linfa, de modo a reduzir pocialmente a retirada da cânula linfa ao mover o animal.

  1. Colocar uma marca na cânula na artéria carótida 2,5 cm da ponta cónica para identificar a porção da tubagem para inserir dentro da artéria. Ligar-se a outra extremidade da cânula (isto é, sem bisel) de uma agulha G 23 ou 25 ligada a uma seringa cheia com solução de anti-coagulante e encher a cânula com a solução de anti-coagulante para garantir que não há intervalos de ar estão presentes.
  2. Para facilitar a punção, coloque o rato anestesiado em decúbito dorsal com o pescoço esticado e cabeça apontando para o operador. Note-se que alguns operadores preferem realizar esta técnica com a cauda do rato apontando para o operador.
  3. Coloque um 1 - 1,5 centímetros incisão longitudinal através da camada de pele por cima da esquerda da traqueia no plano sagital.
  4. Dissecar o tecido conjuntivo subcutâneo usando uma pinça ponta romba para expor os músculos do pescoço emparelhados subjacentes.
  5. Retrair os músculos do pescoço to revelar a artéria carótida esquerda (localizado ~ 1 cm abaixo da superfície da pele e pulsação). Limpar o tecido conjuntivo sobrejacente da artéria por dissecação romba.
  6. Isolar um cm secção da artéria usando cuidadosamente uma pinça sem corte, tomando cuidado para não danificar a pista nervo vago ao lado ~ 1. Realize esta abrindo e fechando a pinça ponta romba verticalmente ao longo de ambos os lados da artéria para libertá-la a partir do tecido circundante e nervo vago.
  7. Utilizando uma pinça de ponta fina, passe duas suturas de seda por baixo da artéria carótida e colocá-los em cada extremidade da secção da artéria isolado. Amarrar a sutura mais próxima do operador e mais afastadas do coração e clavícula (Figura 3A) do rato.
  8. Oclusão do fluxo de sangue através da artéria, colocando um par de pinças de ponta fina rectas debaixo da artéria (Figura 3B).
  9. Usando as tesouras finas ponta da íris, colocar uma pequena incisão na superfície superior do vaso (cerca de 1/3 docaminho para baixo a partir do topo da área isolada). Lave todo o sangue derramado na superfície da artéria com solução salina heparinizada e limpe cuidadosamente usando cotonetes.
  10. Inserir a ponta da cânula na artéria com um par de pinças de ponta curva. Uma vez inserido, remover a pinça de ponta fina rectas oclusão o fluxo de sangue e fazer avançar a cânula de 2,5 centímetros na artéria utilizando dois pares de pinças, uma para manter a cânula no interior da artéria, para impedir fugas de sangue para trás e para a outra para inserir a cânula.
  11. Use uma pinça pequena artéria para segurar a cânula dentro da artéria e retirar a pinça de ponta fina retas que foram colocados abaixo da artéria no passo 5.8 para ocluir o fluxo de sangue.
  12. Confirme a desobstrução da cânula através da injeção de solução anti-coagulante na cânula e puxando para trás uma pequena quantidade de sangue (Figura 3C). Em seguida, o expulsar da cânula com solução anticoagulante e vedar a extremidade utilizando a chama de um isqueiro ou de um tampão cânula.
  13. Amarre the cânula no lugar com as duas suturas colocadas sob a artéria na etapa 5.8.
  14. Retire o grampo artéria e garantir uma terceira sutura em torno da artéria e cânula. Feche o pescoço enrolado com suturas.

Período 6. Pós-cirúrgico e Formulação Infusion

  1. Continuar a manter o rato sob anestesia e na almofada aquecida.
  2. Reidratar o rato via infusão de solução de reidratação para o duodeno, durante pelo menos 0,5 horas após a realização das cânulas. Observe a diminuição da taxa de fluxo de linfa (~ 0,1-0,5 ml / h) durante o período inicial após punção e em breve aumentar a uma linha de base estável (0,4-2,5 ml / h dependendo da taxa de reidratação).
  3. Após o período de recuperação, infundir a formulação de interesse (contendo lípidos, drogas, etc.) para o duodeno através da cânula. Opcionalmente, usar uma bomba de infusão para regular o caudal da formulação. NOTA: No protocolo descrito aqui os animais permanecem Anaesthetised durante todo o período de recolha de cirurgia e linfático e são sacrificados sob anestesia de tal modo que a analgesia adicional não é necessária. Se o protocolo é modificado e animais estão habilitadas a recuperar a consciência depois analgesia adequada e cuidados pós-operatórios serão necessários.
  4. Após a conclusão da infusão de formulação continuam a re-hidratar o rato a uma taxa de 1,5-3 ml / h com uma solução salina normal para o duodeno, para evitar a desidratação.
  5. Continue a manter o rato sobre o bloco cirúrgico aquecida 37˚C para manter a temperatura (como por passo 2.3), urina expressa da bexiga através de pressão descendente suave na parte inferior do abdômen, conforme necessário e reaplicar pomada oftálmica a cada hora (conforme passo 2.2. 3). Mudanças posturais, regulares são recomendados se o animal está a recuperar a consciência após o procedimento.

7. Recolha de linfa e amostras de sangue para avaliar Lipid e absorção da droga

  1. Recolha linfa continuamente emtubos contendo anti-coagulante. Mudança de tubos com os intervalos de tempo necessários (por exemplo, de hora em hora).
  2. Coletar amostras de sangue em pontos de tempo set.
    1. Oclusão do fluxo de sangue através da cânula, dobrando de volta a cânula aproximadamente a 2 cm da extremidade selada. Desselar a cânula cortando a extremidade selada ou retirar o tampão de uma cânula.
    2. Usando uma seringa vazia, retirar salina heparinizada a partir da cânula até o sangue enche toda a cânula.
    3. Usando uma nova seringa vazia, retirar o volume desejado de sangue e coloque em um tubo contendo anti-coagulante.
    4. Usando a primeira seringa, substitua o sangue colhida antes da amostragem para reduzir a perda de sangue desnecessário. Antes da injeção, passe rapidamente a seringa, mantendo-o na vertical para garantir que não há bolhas de ar entrar na cânula.
    5. Usando uma seringa, substituir o volume de sangue retirado do rato com uma solução de anti-coagulante. Certifique-se de que nenhum resíduo de sangue é visível na cânula como qualquer restante pode coagulare bloquear a cânula.
    6. Curvatura da cânula com aproximadamente 2 cm a partir da extremidade não selada para bloquear o fluxo de sangue e remover a seringa. Usando a chama de um isqueiro ou de um tampão cânula, selar a cânula.
  3. Após a conclusão do sangue e linfa coleção do rato, eutanásia do rato via intraperitoneal de> 100 mg / kg pentobarbital de sódio.
  4. Determinar a taxa de fluxo da linfa através da medição da massa de linfa recolhida durante cada período de tempo.
  5. Medir a concentração de droga e de lípido na linfa e sangue utilizando, por exemplo, HPLC, HPLC-MS ou utilizando kits comerciais, de lípidos e para avaliar a eficiência de absorção do fármaco.
  6. Calcule o transporte de massa da droga e lipídios na linfa a partir do produto das concentrações medidas e volume de linfa recolhidos.

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Representative Results

Os resultados de uma experiência representativa para quantificar a extensão cumulativa e taxa de lípido e o transporte da droga através do sistema linfático intestinal após o parto utilizando o modelo de canulação da linfa mesentéricos são mostrados na Figura 4 e na Figura 5. Nesta experiência, 200 ug do modelo lipofílico halofantrina fármaco foi administrado dentro do duodeno de ratos ao longo de 2 horas, em uma formulação contendo 40 mg de ácido oleico (incluindo 2-5 uCi de 14 C-ácido oleico) e 7,1 mg de 2-mono-oleína disperso em 5,6 ml de 5 mM de taurocolato de sódio em tampão fosfato pH 6,9 solução salina. Após a administração de formulação os ratos foram re-hidratadas, a uma taxa de 2,8 ml / h com uma solução salina normal infundida no duodeno. A linfa foi recolhido continuamente em tubos trocadas a cada hora, durante 10 horas. A formulação foi preparada, e a experiência realizada, de acordo com um protocolo descrito anteriormente para uma formulação contendo todos os mesmos CompOnentos, exceto que não incluem 2-monooleina 43.

Como mostrado na Figura 4, nestas condições experimentais a taxa de fluxo de linfa significativo para ratos canulados com sucesso foi entre 0,4-1,3 ml / h. Em alguns ratos, a taxa de fluxo de linfa foi ligeiramente inferior no primeiro 1-3 hr seguinte cannulation e depois aumentou. Isto é comumente visto seguinte cannulation linfa. Também mostrado na Figura 4 é a taxa de fluxo da linfa para uma experiência sem êxito. Neste caso, a taxa de fluxo manteve-se substancialmente menor do que a observada nas experiências com sucesso em todo o período de recolha. Do mesmo modo, o transporte linfático cumulativa de triglicéridos e halofantrina era substancialmente inferior na experiência sem êxito (Figura 5A e B). O transporte halofantrine cumulativa média no grupo de sucesso foi de 15,1% da dose, o transporte de triglicerídeos acumulada foi de 61 mg mais de 10 horas e a proporção da r administradosadiolabelled dose de lípido transportado exógeno na linfa foi de 54% (Figura 5C). Estes valores não são significativamente diferentes ao observado previamente para a formulação semelhante que continha os mesmos componentes, excepto para a ausência de mono-oleína 2-43 (Tabela 1). Isto sugere que as formulações que contêm os ácidos gordos na ausência de uma fonte de monoglicérido lípido semelhante pode suportar o transporte da droga e na linfa para aqueles que contêm monoglicérido. Este resultado é descrito adiante na seção de discussão.

A Figura 5D mostra os dados representativos para a taxa de transporte de triglicéridos e halofantrina na linfa ao longo do tempo após a administração. A taxa de transporte de ambos de triglicérides e de drogas para a linfa picos um par de horas após lipídico e administração de drogas e, em seguida, retorna aos níveis basais. Como é típico em lipídios e de transporte de drogas experimentos linfáticos intestinais, a taxa de transpor drogat na linfa durante cada tempo espelhos de época que vi para o transporte de triglicérides como droga é transportada para a linfa em associação com as lipoproteínas ricas em triglicérides.

Figura 1
Figura 1. Representação esquemática da forma da ponta chanfrada de uma cânula na artéria carótida ou linfa, e a ponta chanfrada em forma de J de uma cânula duodenal.

Figura 2
Figura 2. fotografias de (A) do abdômen raspada em preparação para canulação do ducto linfático, (B), a parede muscular abdominal aberto com uma reta incisão de 4 cm que se estende desde a linha média para o flanco direito para acessar o ducto linfático, e (c ) o duto de linfa mesentérica superior (em círculo amarelo) perpendicular ao rim direito. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Fotografias de (A), a artéria carótida isolado com duas suturas de seda com um a mais próxima do operador amarrado, (B), a artéria carótida e isolado o fluxo sanguíneo obstruído com uma pinça de ponta fina rectas se encontram por baixo da artéria, e (C) a artéria carótida com a cânula no lugar e a desobstrução sendo verificado, chamando de volta uma pequena quantidade de sangue. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 "src =" / files / ftp_upload / 52389 / 52389fig4highres.jpg "/>
Figura 4. Os dados representativos para a taxa de fluxo linfático mesentérico (l / h) ao longo do tempo. Os ratos foram administrados uma formulação contendo 200 ug halofantrina, 40 mg de ácido oleico (ácido com 2 uCi de 14 C-oleico) e 7,1 mg de 2-monooleina 5,6 ml de 5 mM de taurocolato de sódio em tampão fosfato salino (pH 6,9) 0-2 h. Os dados apresentados são a média ± D.P. para n = 3 experiências bem sucedidas (círculos fechados, ●) e n = um resultado sem sucesso (triângulos abertos), Δ.

Figura 5
Figura 5. Os dados representativos para lipídico e transporte da droga para a linfa mesentérica. Transporte cumulativo de (A) a halofantrine modelo de drogas (HF,% dose), (B) de triglicerídeos (TG, mg) e (C) de ácidos graxos exógena (% dose), e a taxa de transporte de (D) TG (mg / h) e Hf (% dose / h) em linfático mesentérico ao longo do tempo após administração de uma formulação contendo 200 ug halofantrina, 40 mg de ácido oleico (com 2 uCi 14 ácido C-oleico) e 7,1 mg de 2-mono-oleína em 5,6 ml de taurocolato de sódio 5 mM em tampão fosfato salino (pH 6,9) 0-2 h. Os dados apresentados são a média ± D.P. para n = 4 experiências bem sucedidas (círculos fechados, ●) e n = um resultado sem sucesso (triângulos abertos), Δ. Transporte de ácidos gordos exógena não foi medida na experiência sem êxito, mas é tipicamente baixa em experiências falhadas. Os dados para o experimento malsucedido é omitido do Painel D para maior clareza. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Sem monoolein Com 2-monoleína
Significar SEM Significar SEM
Halofantrina (% dose) 15.1 0,8 15 1.6
Triglicéridos (mg) 67 4 61 6
Ácido gordo total (pmol) 261 16 248 23
Ácido oleico exógena (imol) 82 5 65 6
Ácido gordo endógeno (imol) 180 17 183 28

Tabela 1. Comparação de dados de transporte linfático cumulativos ao longo de 10 horas após a administração de 200 mg halofantrine para mesentérica duto linfático ratos com cânulas em formulações contendo 40 mg de ácido oleico (containin1 g de ácido 14 ^ Ci-C oleico) emulsionado em taurocolato de sódio a 5 mM em tampão fosfato salino (pH 6,9) com ou sem 7,1 mg de 2-mono-oleína. Os dados representam a média ± D.P. para n = 4 ratos. Não houve diferenças estatisticamente significativas são vistos entre os dois grupos.

a No grupo doseado com 2-monooleina esta não é uma medida precisa do transporte do ácido graxo endógena como o ácido oleico ligadas à coluna vertebral 2 monooleina não é contabilizada no transporte de ácido oleico medida exógena para a linfa.

b Os dados para halofantrine e total do transporte de ácidos graxos no grupo dosado sem 2-monooleina foi publicado anteriormente na Figura 5 de referência 43 e é reproduzido aqui em formato de tabela.

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Discussion

O modelo de rato canulação linfático mesentérico permite a quantificação directa da concentração e da taxa de transporte de várias células e moléculas (tais como lipidos e medicamentos) a partir do intestino para a linfa e as modificações dos mesmos que ocorrem em resposta ao desafio de várias substâncias (dieta , antigénios, fármacos, formulações, etc.) e 10,27 doença (cancro, vírus, colite, resistência à insulina, etc) 5-7. Os componentes recolhidas na linfa também pode ser ainda utilizado em experiências suplementares. Por exemplo, as células podem ser cultivadas 44, lipoproteínas fraccionadas e linfa ou seus componentes, tais como as lipoproteínas ou células, carregada com marcadores de drogas, incluindo marcadores radioactivos e sondas fluorescentes. Estes, então, pode ser re-infundido em animais receptores para avaliar mais diretamente a sua função, metabolismo, eliminação e / ou padrões de disposição tecido 45-47. O modelo de canulação de linfa de rato tem várias vantagens sobre o other in vitro, in situ, in silico, e em modelos in vivo que foram descritos na introdução. Mais importante ainda, a canulação é o único método que permite o acesso directo a toda a quantidade de componentes no fluido linfático. Quando realizada nas mãos de um operador experiente o modelo é as taxas de sucesso robustos, reprodutíveis e experimentais de> 80% pode ser alcançado. No entanto, a técnica cirúrgica pode ser difícil de dominar inicialmente, particularmente num laboratório que não esteja familiarizado com a técnica.

Vários passos são fundamentais para o sucesso do modelo cannulation linfa mesentérica. O primeiro é a escolha correcta de instrumentos cirúrgicos e tipo cânula e preparação. Nosso laboratório utiliza cânulas PE com dimensões de 0,8 x OD ID de 0,5 mm. No entanto, outros laboratórios tiveram sucesso com cânulas de PVC da mesma dimensão 15. Biselagem da ponta da cânula e pré-imersão em um anti-coagulante, também ajuda a evitarde oclusão, e a formação de coágulos no interior, a cânula pós-inserção (passo 3.13). O primeiro passo do procedimento cirúrgico que alguns operadores encontrar particularmente crítico é tendo o cuidado de limpar as camadas de tecido conjuntivo e gordura acima do ducto linfa (passo 3.10). Isto ajuda a evitar a inserção da cânula entre o duto tecido linfático e, em vez de para dentro da conduta de linfa. No entanto, esta etapa de limpeza é difícil como a conduta de linfa é frágil e fácil de danos. Para alguns, esta etapa e a inserção da cânula são completadas com mais sucesso com o auxílio de um microscópio cirúrgico embora outros encontrar um microscópio não é necessário. Ao inserir a cânula no interior da conduta na direcção e profundidade de inserção em relação à ponta biselada requer alguma consideração, a fim de evitar que a cânula ser ocluída pela parede do vaso (passo 3.12). Cada operador tende a encontrar sua própria preferência individual. Também importante é a prevenção da formação de bolhas de ar no interior da cannula durante a inserção de espaços de ar aplicar a pressão de retorno para o livre fluxo de linfa (passo 3.12). Finalmente, a aplicação de adesivo veterinária para segurar a cânula no lugar deve ser inferior ao ponto de inserção no interior da conduta como adesivo colocadas directamente no topo da conduta pode fazer com que o recipiente para recolher e ocluir a ponta da cânula (passo 3.14).

O guia inicial mais fácil quanto ao facto de uma cirurgia é bem sucedida é a taxa de fluxo da linfa. Uma vez que a cânula no lugar linfa é geralmente começa a fluir lentamente nos primeiros 30 minutos e, em seguida, aumenta. Tipicamente, as taxas de fluxo para cânulas sucesso em ratos> 250 g são> 0,1 ml / h durante a primeira hora e, em seguida, aumentar a> 0,4 ml / hr no estado estacionário, como é mostrado na Figura 4. Embora seja óbvio que esta pode variar dependendo da . condição experimental Em termos de resolução de problemas, se não linfa flui através da cânula ou a taxa de fluxo é baixo isso pode ser porque:

    a cânula não foi inserida corretamente dentro do duto
  1. a cânula é na conduta, mas ocluído por o lado da parede do vaso
  2. a cânula é na conduta, mas ocluído por um adesivo aplicado na posição incorrecta
  3. a cânula é na conduta e uma bolha de ar na cânula está a abrandar o fluxo de
  4. um coágulo de sangue formado no interior da cânula

A inspeção cuidadosa revela geralmente o fator subjacente. Se o operador acredita que a cânula não foi colocado corretamente em primeiro lugar (ou seja, nunca foi linfa flui), em seguida, re-inserção é necessário. Se a cânula parece estar no lugar correto, em seguida, o primeiro fator a verificar é se uma bolha de ar ou coágulo está presente. As bolhas de ar geralmente passam através da cânula, como fluxos linfáticos e fluxo temporariamente lento. É possível, por vezes, para remover as bolhas de ar ou formação de coágulos através da elaboração de volta sobre a cânula usando uma agulha de 25 G ligada a, por exemplo, uma seringa de 1 ml. Se não houver nenhuma bolha de ar ou coágulo pode ser útil tentar reposicionar o rato e / ou tornear, puxar a cânula ligeiramente. Isto pode, por vezes, realinhar a cânula de tal modo que ela não é bloqueada contra a parede do vaso. Ocasionalmente remover o adesivo com ou sem pequeno movimento da cânula permite que a linfa flua novamente também. No entanto, se tudo o mais falhar a cânula precisa de ser reinserido. Na nossa experiência as experiências são menos bem-sucedida quando a cânula não foi correctamente inserida na primeira tentativa. No entanto, o resgate cirúrgico é possível. Outra complicação que pode surgir é a dificuldade de punção devido à variação anatômica entre ratos. Por exemplo, a conduta de linfa mesentéricos, ocasionalmente, passa numa direcção estranho ou existe uma conduta de linfa acessório no lado oposto da artéria mesentérica para a conduta de maior linfa mesentérica superior. Em experiências que requerem a recolha de todo o volume do fluxo de linfa do intestino delgado (como é o casoquando se avalia o total de lípido e o transporte da droga a partir do intestino através dos vasos linfáticos), a conduta de linfa acessório tem de ser tapado de modo a que toda a linfa é dirigido para a conduta de linfa superior. Isto é difícil de conseguir, mas pode ser tentada por amarrar uma sutura em torno do acessório de conduta ou cortando o ducto acessório e ocluir com adesivo veterinária (passo 3.6). A presença de uma conduta de linfa acessório é um dos principais factores que resulta em falha experimental nas experiências de transporte de fármacos linfáticos. Se o navio acessório não está completamente obstruído, o fluxo de linfa e lipídico e transporte de drogas são significativamente mais baixos do que o esperado.

No protocolo apresentado aqui o animal permanece anestesiado durante todo o período de coleta de linfa. O modelo de rato anestesiado (em vez de modelos conscientes a seguir descritos) aumenta o rendimento experimental como a cirurgia e experiência pode ser conduzida ao longo de um em vez de vários dias e o sucesso cirúrgico rComeram é maior, uma vez que é mais fácil de manter cânula patência em animais imobilizados. A anestesia pode, teoricamente, reduzir o esvaziamento gástrico, processamento lipídico intestinal e fluxo da linfa e dos transportes. Em nossa experiência, no entanto, lipídico linfática e transporte de drogas são semelhantes em ratos anestesiados administrou a droga diretamente para o duodeno (a cirurgia de esvaziamento do estômago) dentro de veículos pré-digeridas e pré-dispersos (sistemas, por exemplo, ácidos gordos e monoglyceride micelares dispersos com surfactantes ) quando comparado com ratos conscientes administrados a droga através de sonda oral no estômago num 21,23,27 triglicéridos equivalente. De facto, a maioria das experiências de transporte de fármacos linfáticos intestinais no nosso laboratório nos últimos 10 anos foram realizados no modelo anestesiado devido ao maior rendimento que pode ser alcançado. Nestas experiências, foram administrados mais frequentemente drogas em formulações que contêm ácido gordo (por exemplo, ácido oleico) e surfactante 43.Os ácidos gordos são sintetizados em triglicéridos antes da incorporação nas lipoproteínas linfáticos intestinais e este requer a fonte de componentes para formar a espinha dorsal de glicerol dos triglicéridos (isto é, 2-monoglicérido ou glicerol-3-fosfato). Isto sugere que a administração de ácidos graxos, na ausência de uma fonte de glicerol pode levar à redução transporte linfático. A administração de ácido gordo, no entanto, permite o cálculo directo da contribuição do ácido gordo exógena administrada e lípidos endógenos para lípido linfática e o transporte da droga 43. Adicionalmente, 2-monoglicérido é caro e geralmente instável, uma vez que facilmente isomerises 1-monoglicérido o qual é digerido com glicerol no lúmen intestinal. Nos estudos aqui relatados demonstram ainda que nós lipídico linfática e o transporte da droga é equivalente após a administração do fármaco modelo halofantrina com um ácido gordo (por exemplo, ácido oleico) e tensioactivo (sal biliar) formulação quer na presence ou ausência da fonte de glicerol 2-mono-oleína (Tabela 1). Fontes endógenas de glicerol, assim, parece ser suficiente para suportar o fluxo de linfa equivalente e lípido e o transporte da droga após a administração deste fármaco modelo com ácidos gordos (por exemplo, ácido oleico), na ausência de uma fonte de glicerol. Isso proporciona a confiança de que os dados de transporte linfático representativos podem ser obtidos com as formulações de ácidos gordos simples.

O modelo anestesiado é facilmente estendido para um modelo consciente, quando necessário. Nos modelos conscientes formulações podem ser tratadas por gavage directamente para o estômago ou infundida no duodeno, ou por via intravenosa, as comparações directas podem ser feitas para estudos farmacocinéticos realizados em não-linfáticos canulada animais conscientes e os resultados podem ser considerados mais fisiologicamente relevante. O período de tempo permitido em animais conscientes também tem a vantagem de permitir a recolha de perfis farmacocinéticos mais completas para drconcentrações ug no sangue, enquanto que em experimentos anestesiados, perfis sanguíneos são muitas vezes incompletos, especialmente para longas semi fármacos de vida. Como descrito acima, no entanto, a taxa de sucesso para estudos linfáticos canulada conscientes é inferior e experiências levam mais tempo para completar. Existem dois tipos de modelos de canulação linfa conscientes descritos na literatura. Em modelos contido conscientes 15, após a cirurgia canulação linfa, o animal é simplesmente colocado em decúbito frontal e colocados em um limite adequado para o restante da experiência, com a cânula exteriorizada linfa e inserido um tubo de recolha. O animal é então deixado a recuperar a consciência e se recuperar do procedimento cirúrgico O / N. A taxa de sucesso com este modelo é muito bom nas mãos de operadores experientes, mas pode ser difícil de obter a aprovação ética para conter os animais para o período prolongado de tempo necessário para a coleta de linfa. Um modelo alternativo é o lugar onde a linfa é recolhidaa partir de ratos conscientes e em movimento livre. Este modelo foi detalhado anteriormente 25. Neste modelo cânulas longas são inseridos na conduta de linfa, duodeno e artéria carótida mesentérica. As cânulas são então tunnelled abaixo da pele, exteriorizado na parte de trás do pescoço e colocada através de um sistema articulado. O rato é colocado num arnês unido ao giro e deixou-se recuperar a consciência e para recuperar do procedimento cirúrgico S / N. O animal tem livre circulação dentro de uma gaiola metabólica e amostras linfáticos e sanguíneos podem ser coletadas a partir das cânulas externalizados fora da gaiola.

Cannulation linfa mesentérica continua a ser a única ferramenta que permite a avaliação direta dos componentes linfáticos em seu estado nascente. A linfa cannulation é mais frequentemente descrito em ratos como a cirurgia é menos complexo do que os animais mais pequenos e grandes, o modelo mais barato do que animais de grande porte e os resultados parecem razoavelmente comparáveis ​​entre espécies 27. O modo de ratol pode ser modificado de acordo com a necessidade experimental ea taxa de sucesso é elevada nas mãos de operadores experientes. O modelo pode também ser acoplada a outra in vitro ou em estudos in vivo para examinar, em detalhe, o metabolismo ou função de componentes linfáticos intestinais. Uma vez estabelecido o modelo de rato canulada linfático mesentérico é assim uma ferramenta poderosa para avaliar a concentração, o transporte, a função e o metabolismo de vários parâmetros que passam directamente a partir do intestino para o sistema linfático (e em muitos casos de fluxo, eventualmente, para a circulação sistémica).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile saline Baxter healthcare AHB 1307 Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50
70 % ethanol in water Any Any brand can be used
Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4) Livingstone International JJ60243L Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=JJ60243L
Betadine solution Livingstone International BU0510 Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=BU0510
Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  KETA I 1 http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  TRO-3828 http://www.provet.com.au/
ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml) PROVET VICTORIA  VTG-DACP010020 http://www.provet.com.au/
Sodium pentobarbitone PROVET VICTORIA  24529 Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparin (35000I.U. in 35 mL) Sigma Pharmaceuticals 337220 http://sigmaco.com.au/
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E1644 Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma. 
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm Microtube extensions PE8050 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96 x0.58 mm, 30 m
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm Microtube extensions PE9658 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8 x0.5 mm, 30 m
Ruler Any Any brand can be used
Markers Any Any brand can be used
Cigarette lighter Any Any brand can be used
Veterinary adhesive Any Any brand can be used
23 gauge needles Livingstone International DN23GX0.75LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=
6&search=DN23GX0.75LV
25 gauge needles Livingstone International DN25GX1.0LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=
DN25GX1.0LV
1 ml syringe Livingstone International T3SS01TA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS01TA
10 ml syringe Livingstone International T3SS10SA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS10SA
Gauze swabs Livingstone International GSC075 Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=GSC075
Cotton buds Livingstone International CTAST075DP Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=CTAST075DP
Heating pad Ratek WT1 Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray.
Surgical light Harvard Apparatus 72-0215 with 72-0267 Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
-1_HAI_ProductDetail and  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_
-1_HAI_ProductDetail___
Surgical microscope Zeiss 495005-0014-000 Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Silk suture Livingstone International DTSK163019F4 Any brand can be used. Example here is  

3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=DTSK163019F4
Scalpel blades Fine Science Tools (FST) 10020-00 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Scalpel handle Fine Science Tools (FST) 10004-13 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Small surgical scissors Fine Science Tools (FST) 14060-09 Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Forceps with serrated curved tip Fine Science Tools (FST) 11001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x Iridectomy scissors Fine Science Tools (FST) 15000-08 Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 
1 x Forceps with straight serated tip Fine Science Tools (FST) 11650-10 Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-10 Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Forceps with smooth fine curved forceps Fine Science Tools (FST) 11063-07 Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x Hemostats Fine Science Tools (FST) 13010-12 Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Suture needle holder Fine Science Tools (FST) 12001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x Artery clamp Fine Science Tools (FST) 18050-28 Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Oleic acid Sigma Aldrich O1008 When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU
14C-oleic acid Perkin  NEC317050UC  Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Sodium taurocholate Sigma Aldrich T4009 Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU
Halofantrine Glaxo Smith Kline Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich 71507 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich 71643 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU

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