Mezenterik Lenf Kanal Kanüllü Rat Modeli: Bağırsak Lenfatik İlaç Ulaştırma Değerlendirilmesine Uygulaması

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trevaskis, N. L., Hu, L., Caliph, S. M., Han, S., Porter, C. J. The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport. J. Vis. Exp. (97), e52389, doi:10.3791/52389 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

bağırsak lenf sistemi sıvı taşıma, lipit emilimi ve immün fonksiyonu önemli roller oynar. Lenf superior mezenterik lenf kanalı yakınsama lenf damarlarının ve düğümlerin bir dizi üzerinden ince bağırsaktan doğrudan akar. Mezenterik lenf kanalı kanülasyon böylece bağırsak akan mezenterik lenf toplama sağlar. Mezenterik lenf ve lipoprotein fraksiyonu (lipidler, lipofilik moleküller ve apo-proteinleri) (örneğin, sitokinler ve bağırsak hormonları olarak sıvı, peptidler ve proteinler) bağışıklık hücreleri (% 99 lenfositler), sulu kısmın bir hücre fraksiyonu oluşur. mezenterik lenf kanalı kanülasyon model bu nedenle lenf sistemi yoluyla konsantrasyon ve barsaktan faktörlerin bir dizi taşıma hızını ölçmek için kullanılabilir. Farklı ihtiyaçlara cevap vermek üzere bu faktörlere değişiklikler (örneğin, diyetler, antijenler, ilaçlar) ve hastalık (örneğin, iltihabi bağırsak hastalığı, HIV, diyabet) de olabilir bE tespit edilmiştir. Ilgi genişleyen bir alan bağırsak emilim lipit yollar ile ilişkilendirmek oral lipofilik ilaçların ve ön ilaçların emilimini lenfatik ulaşım rolüdür. Burada tarif, detaylı, bağırsak doğumu takiben birkaç saat için lenf sistemi yoluyla oranı ve lipid ve ilaç taşıma ölçüde değerlendirilmesini sağlayan bir mezenterik lenf kanalı kanüllü sıçan modeli. yöntem lenf diğer parametrelerin ölçümü için de uyarlanabilir. Biz deneysel başarısını teyit ve elde edilen verileri yorumlamak için nasıl talimat sağlamak için bu karmaşık cerrahi yöntemi kurarken karşılaşılabilecek zorluklar ayrıntılı açıklamaları yanı sıra başarısız ve başarılı deneyler temsilcisi veriler sağlamaktadır.

Introduction

Lenf her ince bağırsak villus 1 içinde bulunan tek lacteals de kaynaklanan bir tek yönlü süreci ile ince bağırsakta akar. Lacteals böylece sıvı, makro moleküllerin, hücre ve lenf oluşumuna nispeten geçirgendir lacteals bu faktörlere girişi ile başlar. lacteals ilk lenf sonradan lenfatik mikrodamarlar ağı, toplama (afferent) lenf damarları, mezenterik lenf düğümleri ve sonuçta sonrası düğüm (efferent) lenf damarlarının bir dizi aracılığıyla bağırsak akar. Düğümleri içinde, lenf değişimi kandan düğüm giren düğüm yerleşik bağışıklık hücreleri hem de malzeme oluşur medüller sinüslerin dizisinden geçmektedir. Ince bağırsakta akan tüm lenf sonunda efferent superior mezenterik lenf kanalı ve sonradan sisterna chyli içine yakınlaşıyor. Sisterna chyli da lenf kaudal periferal dokulara drenaj, INTEST toplarinal, karaciğer ve bel bölgeleri ve mediasten ve vücudun kafatası parçaları gelen lenf birlikte göğüs lenf kanalı katıldı. Torasik lenf kanalı sol internal juguler ve subklavian damarları kavşakta venöz sisteme doğrudan lenf boşaltır. superior mezenterik lenf kanalı doğrudan lenf toplama sağlar Burada açıklanan protokol, böylece bağırsak lenf sistemi yoluyla sistemik (genel) dolaşıma bağırsak doğrudan transit çeşitli faktörlerin analizini kolaylaştırır.

bağırsak lenf sistemi tahsis ana fizyolojik fonksiyonları, sıvı dengesini korumak için lipid ve bir lipofilik molekül absorpsiyonunu kolaylaştırmak için uygun bağışıklık karşılıklarının 1 sağlamak için bulunmaktadır. Tümör hücreleri ve virüsler de 2-4 ve anahtar değişiklikler çeşitli inflamatuar ve metabolik patolojiler 5-7 lenfatikler içinde meydana bağırsak lenfatikler yoluyla yaymak. Kutumezenter çeşitli hücrelerin ve moleküllerin konsantrasyonu ve taşıma hızı bir bağırsak lenfatikler yoluyla toplu sıvı akışının analizi yanı sıra kantifikasyonunu sağlayan içinde mezenterik lenf kanalı nulation lenf toplamak için. Çeşitli zorluklar (örneğin, diyetler, antijenler, ilaçlar) ve hastalık modellerinde yanıt olarak konsantrasyon veya bu faktörlerin transit değişiklikler (örneğin, kolit, HIV, diyabet) de değerlendirilebilir. Bu kapsamlı analiz ve burada mukayese edilebilir her lenf bileşeni tanımlamak mümkün iken, mezenterik lenf basitçe sulu, lipid ve hücresel aşamadan oluşmaktadır. Sulu fazda ilgi bileşenleri gibi antijenler veya tolerogenler 8 gibi sitokinlerin ve mast hücresi aracılarının 9 ve bu inkretinlerin 10 gibi metabolik mediatörleri olarak bağışıklık haberci olarak peptidler ve proteinler bulunmaktadır. Post-düğüm mezenterik lenf hücresel fraksiyon lenfosit (99 üzerinden%) neredeyse tamamen oluşures 11. Çeşitli bağışıklık hücreleri (dendritik hücreler, mast hücreleri, vs), önceden düğüm mezenterik Lenfatikleri butonu ama düğüm 12 içinde kalır. Afferent lenf içindeki hücreler ilgi iseniz, mezenterik lenf çıkarılması yoluyla bu hücreleri toplamak mümkündür mezenterik lenf kanalı 12 kanülasyondan önce birkaç gün düğümleri. Bu şekilde afferent ve efferent lenf kanalları doğrudan bağlı olan ve afferent lenf lenf hücrelerinin mezenterik lenf kanalına doğrudan geçer. bağırsak lenfatiklerin geçen çeşitli bağışıklık hücreleri geçiş ve fenotipin bu şekilde kontrol edilebilir. Belki bugüne kadar mezenterik lenf toplamak için belirtilen en yaygın nedeni, ancak, bağırsak işleme, emilimi ve diyet lipidler ve lipofilik moleküllerin 10 naklini incelemektir.

Alımından sonra, diyet lipidler, örneğin trigliserit yağ asitlerinin ve monogliserit, fosfonat için (sindiriliryağlı asitler ve lizofosfolipidin, ve yağ asidi ve kolesterol gibi), kolesterol estere holipid ve safradan amfifillerin ilave edilerek küçük bir misel ve vesiküler yapılarına bağırsak lümeni içinde dağılmış (fosfolipidler, kolesterol ve safra tuzları) ve eylem Pankreas enzimleri 10,13. Buradan onlar enterositler içine emilir. Absorbe bileşenlerin bir kısmı emici hücreleri (enterositler) içinde trigliseritleri, fosfolipitleri ve kolesterol ester meydana getirmek üzere yeniden esterleştirilirler. Bu yeniden esterifiye lipitler salgılanan safra mukozal lipit havuzları veya bağırsak kan kaynağı 13 den alınan eksogen lipid bileşeni ve endojen yağ bileşenlerinin bir kombinasyonu monte edilir. Buradan esterlenmiş lipidler ya enterositler saklanır ya da birlikte, çeşitli apoprotein ve diğer lipofil moleküller ile bağırsak lipoproteinlerin (kilomikronlar, çok düşük yoğunluklu lipoproteinlerin (VLDL)) (içine yerleştirilebilir 10,13. Bağırsak lacteals bağırsak kan kılcal daha kendi giriş daha geçirgen olduğu gibi enterositlerin çıktıktan sonra, lipoproteinler özellikle mezenterik lenf sistemi yoluyla sistemik dolaşıma bağırsaklardan taşınır. Emilen yağ bileşenlerinin bir kısmı, aynı zamanda, ortaya çıkan yegane olmayan lipoprotein olarak kılcal kan damarlarının ve portal damarı yoluyla sistemik dolaşıma bağırsaktan taşınan 14 moleküllerdir. Bununla birlikte, genelde, portal ven taşıma güzergahı, kısa ve orta zincir uzunluğuna sahip lipid absorpsiyon sadece önemli bir oyuncu.

mezenterik lenf toplanması ve böylece bağırsak ile ilgili lipoproteinler ve ilgili bileşenleri (lipitler, lipofilik moleküller, apo-proteinleri) sevk değerlendirilmesini sağlar. lipoproteinler miktarı ve mezenterik lenf lipoproteinler, genel olarak, bir nascen içinde avantajlı olarak karakterize edilebilirt devlet onlar yaygın tür lipoprotein lipaz 15 gibi sistemik enzimler tarafından modifiye edilmiş değil çünkü. Mezenterik lenf kanüle sıçan modeli tarihsel olarak, belki de en yaygın olarak bağırsaktan lipit / lipoprotein taşıma analizi için tarif edilmiş olmasına rağmen, ilgi genişleyen bir alan lipofilik ilaçlar, ön ilaçları ve diğer ksenobiyotiklerin 13,16 taşınmasında lenfatiklerin rolü hangi Burada anlatılan modelin odak noktasıdır. (Genellikle uzun zincirli trigliserid> 50 mg / g olarak log P> 5 ve çözünürlüğe sahip olanlar istisna belirgin olmakla birlikte) lipofilik ilaçlar 17,18, 19 ve diğer ksenobiyotikler 13,16 ya pasif ya da bağırsak lenfatiklerin erişebilir ön-ilaçları aktif bağırsak lipoprotein taşıma yollarının 19 entegre.

sıçan mezenterik lenf kanülasyon tekniği böylece birçok uygulamalar vardır. Bollman ve diğ., Bir TECHNIQ tarifmodeline varyasyonları daha sonra tarif edilmiştir yana vi. 1948 20 sıçanlarda mezenterik lenf kanalı cannulate. Sıçan çeşitli anestezik 21,22 ile anestezi edilir Örneğin, toplama oluşabilir, ya da bilinçli halde iken 23,24 hareketli 15 veya serbestçe ölçülü. (- 5 mi / saat, tipik olarak 0) 25 Sıçanlar farklı rehidrasyon çözümleri ve mide, bağırsak veya parenteral, farklı oranlarda lipit ve ilaç formülasyonlarında başka maddeleri tatbik edilebilir. Bazı çalışmalarda göğüs lenf kanalı ziyade mezenterik lenf kanalı göğüs lenf kanalı da diğerinden lenf aldıkça bu, ilgi faktörüne bağlı olarak, ince bağırsaktan geçiş abartma olsa lenfatikler yoluyla bağırsak ulaşım tahmin etmek kanüle bölgeler 22,26. Lenf kanülasyon modelleri de farelerde 15,27, mini-pi dahil olmak üzere çeşitli başka türlerde de tarif edilmiştirgs 12, koyun 28,29, domuzlar ve köpekler 30 31. Ancak, sıçan modeli en yaygın ve tutarlı atıf olduğunu. Bilinçli 25'inde lenf toplanması ardından veya 22 sıçan ve fareler 15,27 anestezi mezenterik lenf kanalı kanülasyon için detaylı protokoller daha önce yayınlanmış olan ve ilgi okuyucu bu protokollere yöneliktir. Bu protokol görüntülenmiştir biçimde tekniği göstermek için ilk.

lenf kanüle sıçan modeli, gider açısından cerrahi ve etik hususlar kolaylığı büyük hayvan modelleri üzerinde avantajları vardır. Fare modeli ile karşılaştırıldığında fare modeli transgenik hayvanların 27 daha detaylı çalışmalar olanak rağmen, mezenterik lenf kanülasyon cerrahi de sıçanlarda kolaydır. Bununla birlikte, sıçan modelinde, fizyoloji farklılıklar ile ilişkili, özellikle de, bu sınır extrapolat bazı sınırlamalar vardırDiğer ön-klinik ve klinik durumlara iyon. Örneğin, fare safra akışı sabit ve daha yüksek tür gıda ise gıda alımından bağımsız olması, lipidler safra akışını 32 harekete geçirir. Bu daha büyük türler ve insanlarda görülen ne yansıtan sıçan temsilcisi öncesi ve sonrası tokluk ortamları elde etmek zorluklar yaratır. Gerçekçi insan dozajı 25 oluşturur lenfatik taşıma değerlendirilirken ilaç verme çalışmaları için, daha büyük bir türleri de tercih edilebilir. Yeni bir çalışmada, mezenterik lenf lipid ulaşım oranları türler 27 arasında lipit ulaşım verilerinin değerlendirilmesiyle bazı güven sağlayan eşdeğer kütle ve lipid Çeşidi verilmesinden sonra türlerin (fare, sıçan, köpek) arasında karşılaştırılabilir olduğu görülmüştür. Ancak, hayvan boyutu (yani, köpek> rat> fare) sırasına göre bir modeli lipofilik ilaç, Halofantrin taşınımı. Bir ölçekleme faktörü böylece ex gerekebilirDiğer türlere sıçan lenfatik ilaç taşıma verilerini trapolate.

Lenf kanülasyon modelleri bir sınırlama, genel olarak, lenf damarları damar 33 kanüle sonra değişmiş bir basınç gradyanı karşı çalışmak beri lenf akışını ve taşıma değiştirebilir lenfatik kanal doğrudan pasif lenf koleksiyonu. Lenf kanülasyon modeli aynı tekniği ile yabancı laboratuarlarda kurmak zor olabilir. Alternatif model de tarif edilmiştir. Örneğin, lipoproteinler ve lipofilik moleküller olarak bağırsak lenf sistemi yoluyla faktörler, geçiş, dolaylı olarak kan toplama ile incelenmiştir. Bu tür bir model, ağızdan mevcudiyetinde uygulama ve inhibitör yokluğunda, aşağıdaki lipid ve / veya ilaçların kan düzeylerinin karşılaştırılmaktadır (örneğin, kolşisin, Pluronik L81, sikloheksimid) lenfatik taşıma 34 blok bağırsak lipoprotein üretiminin. Bir avantajıKan örneklerinin toplanması yoluyla dolaylı lenfatik taşıma miktarını modellerin invaziv cerrahi 35 gerekmez gibi insanlarda lenfatik taşıma bazı değerlendirilmesini sağlar olmasıdır. Bununla birlikte, lenfatik taşıma inhibitörleri, özel değildir ve lenfatiklerin ile taşınır faktörler seyreltildi ve bu değerlendirmede zorlaştırmaktadır sistemik dolaşımda modifiye edilmiştir. İn vitro alternatifler de tarif edilmiştir. Örneğin, Caco-2 hücre veya izole edilmiş enterosit kültürleri daha ayrıntılı olarak Lenfatikleri 36-38 butonu moleküllerin bağırsak salgılanmasını çalışma için kullanılmıştır. İnsan bağırsak mikroçevresinin daha temsilcisi gelişmiş in vitro modeli yakın zamanda 39 tanımlanmıştır. Bu modelde, bir lenfatik endotel hücre tabakası lenfatik bağırsaklarda maddelerin transferi daha ayrıntılı bir analizini sağlar Caco-2 hücreleri ile birlikte kültürlenir. Bununla birlikte, vitr içindeo hücre sistemleri döviz akışını eksikliği ve bağırsak lümen ve altta yatan kan ve lenfatik vasküler kaynağı ile yani arabağlantı aktarın. Alternatif bir yaklaşımda, Klassis ark. Damar kasılması, lenf akışı ve mezenterik lenf damarları 33 floresan lipid konsantrasyonları arasında kantitatif karşılaştırmalar sağlayan yerinde görüntüleme sisteminde bir çift kanal (yüksek-hızlı parlak alan görüntü ve floresan) kurdu. Vitro sistemlerde bahsedilen boyunca bu modelin bir avantajı, lenfatik yoluyla bağışıklık hücrelerinin geçişine doğru izleme mümkün kılmasıdır. Kütle lipid (ya da ilaç) taşıma mutlak ölçümleri, ancak, yine de görüntüleme yöntemleri kullanılarak elde edilmiştir. In vitro ve in silico özellikle de 40-42 yayınlanmıştır bağırsak lenfatiklerin ile lipofilik ilaç taşıma ölçüde tahmin yaklaşımlar değildir. Birkaç c Örneğin, ex vivo olarak afinitePlazma şilomikronların için iyodu in vivo 41 kendi lenfatik taşıma oldukça iyi korelasyon bulunmuştur. Daha sonra, aynı grup birden fizikokimyasal özellikleri 40 dayalı şilomikronların için ilaç afinite tahmin etmek siliko modelde kurulu. Holm ve ark., Aynı zamanda doğrudan moleküler tanımlayıcılar 42 dayanarak lipofilik bileşiklerin lenfatik taşıma tahmin siliko modelinde nispeten karmaşık bir tesis. Bu modeller, bilinmeyen ilaçlar lenfatik taşıma ölçüde tahmin etmek için kullanışlı bir yaklaşım sağlayabilir. Ilaç ve farklı laboratuarlarda genelinde geniş modellerin Doğrulama, ancak onların doğruluğu ve tekrarlanabilirliği onaylamak için gerekli olacaktır.

Mezenterik lenf kanalı kanülasyon böylece doğrudan ince bağırsağa ve faktörler (hücre, proteinlerin karmaşık dizi transit oranını drenaj lenf içeriğini incelemek için tek yolu kalır,in vivo bir durumda lenf içinde peptidler, lipidler, ilaçlar). Bu yazıda mezenterik lenf ve anestezi sıçanların sistemik kan toplama sağlar mezenterik lenf kanalı ve karotis arter kanülasyon için bir protokol açıklar. Örnek veri modeli mezenterik lenf sistemi ile bağırsaktan bir lipid ve ilaç taşıma incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu model ve sorun giderme kılavuzunu kurulmasında karşılaşılan zorluklar olabilir bir tartışma izler. Kurulan kez modeli bağırsak lenfatik taşıma araştırmak için güçlü bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu yazıda anlatılan çalışmalar yerel hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış ve Araştırma ve Öğretim kurallarda Hayvanlarının Bakımı için Avustralya ve Yeni Zelanda Konseyi çerçevesinde yapılmıştır. Herhangi bir hayvan prosedürü başlamadan önce, uygun izin yerel kurum / kuruluş aracılığıyla elde emin olun. Bütün hayvan cerrahi ile olduğu gibi, cerrahi, aseptik koşullar altında ve etik ve başarılı sonuçların elde edilmesi için gerekli olan zaman anestetikler, analjezik ve antibiyotik tatbik edilen, uygun bir eğitimli operatörler tarafından yapılır olduğundan emin olun.

1. Hazırlıklar Günü Cerrahi Prosedür önce

  1. Gerekirse ameliyat öncesi siçana gece Hızlı. Sıçan olun suya ücretsiz erişimi vardır.
  2. Hazırlama çözeltiler fareye tatbik edilecek.
    1. Bu tür steril serum fizyolojik veya Ringer solüsyonu gibi bir rehidrasyon solüsyonu hazırlayın.
    2. Hazırlayın birestetik çözümler gerektiği gibi. Burada tarif edilen deneylerde kullanılan anestezik "ketamin 100 mg 1.9 ml / ml, iksilazin 100 mg / ml, 0.5 ml, ml asepromazin 10 mg / 0.2 ml tuzlu su içinde 2.5 ml birleştirerek" Kokteyl 1 "hazırlanmıştır oluşuyordu ketamin 100 mg / ml ve 0.1 ml asepromazin 10 mg / ml 1 ml oluşan kokteyl 2 ". NOT: o zaman uzun bir süre için anestezi cerrahi uçağı sağlayabilir olarak İnhale izofluran veya sevofluran tercih edilebilir.
    3. İsteğe bağlı olarak, örneğin, bir yağ emülsiyonu içinde ilaç ihtiva eden bir formülasyonun hazırlanması. Depolanması ve uygulanması süresince formülasyonun stabilitesini sağlamak için uygun bir stabilite çalışmaları yapın.
      Not: formülasyon ve ilacın kesin doğası lenfatik ilaç taşıma çalışmaların amacı olarak, her çalışma ile değişecektir tatbik edilecek bir formülasyon ve ilaç Admini bir fonksiyonu olarak lenfatik ilaç taşıma etkinliğini değerlendirmek için en sık sıkstered.
      1. Daha önce tarif edildiği gibi 43, Şekil 4 ve buraya 5 temsili deneylerde kullanılan formülasyon hazırlanır. Kısaca, fosfat tamponlu tuzlu su (pH 6.9), 5 mM sodyum taurokolat oluşan, sulu bir faz 5.6 ml dispersiyona önce 14 ° C, oleik asit (2-5 uCi) ve 40 mg oleik asit içine halofantrin (200 ug) içermektedir.
      2. 2-monoolein içeren formülasyonlar için, oleik asit fazı ihtiva eden halofantrin aynı zamanda sulu faza, diğer bileşenler ile birlikte 2-monoolein 7.1 mg ekleyin. 2-Monoolein nispeten kararsızdır ve 1-monoolein ile isomerises olarak farenin hemen önce uygulamadan 2-monoolein içeren formülasyonlar hazırlayın.
      3. Daha sonra, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca ultrasonikasyon ile formülasyonları emülsifiye.
        Not: Daha önce 43 tarif edildiği gibi), emul görsel muayene: i formülasyonların stabilitesinin gözlenmesipolarize ışık altında yon hazırlandıktan hemen sonra herhangi bir faz değişim ve / veya ayırma bir gösterge sağlamak için dinamik ışık saçılması ile dozlamadan sonra emülsiyon ayrılır faz bağlantılı değildir ki, ii) partikül boyutu analizi sağlar ve halofantrin konsantrasyonları iii) analizi kullanarak Doğrulanmış bir HPLC analizi.
  3. Lenf kanülün fışkırması için tuz içerisinde anti-koagülan 10 mg çözelti / ml EDTA, steril su içinde ya da 10 lU / ml heparin hazırlayın. Karotid arter kanülün fışkırması için tuzlu su içinde 10 lU / ml heparin - aynı zamanda 2.5 ihtiva eden bir anti-koagülan çözelti hazırlayın.
  4. Mezenterik lenf kanalı (0.8 mm OD, 0.5 mm ID), karotid arter (0.96 mm OD, 0.58 mm ID veya 0.8 mm OD, 0.5 mm ID) ve duodenum (0.96 mm OD, 0.58 mm ID içine yerleştirilmesi için polietilen kanüller hazırlayın )
    1. Lenf Cann için 15 cm - karotis arter ve duodenal kanül ve 10 30 cm - Gerekli uzunlukta (genellikle 25 kanüller kesinula) ve () Şekil 1 bir steril cerrahi bıçak kullanarak kanüller ucunda bir eğim yerleştirin.
      NOT: Bu kanül yerleştirme kolaylığı artırır ve kanül tıkanma sonrası ekleme insidansını azaltır.
    2. Boyutuna kesme sonra, kendi üzerinde geri kanül küçük bir bölümünü döngü bir çakmak ya da sıcak plaka ile ısıtılarak tarafından intraduodenal kanül bir J şekil çapa noktasını yerleştirin (Şekil 1).
  5. (Adım 1.3 hazırlandı), bir anti-koagülan çözelti ihtiva eden bir 25 G iğne ve şırınga lenf kanül takın. Anti-pıhtılaşma çözeltisi ile lenf kanül doldurun ve kanül O çözümü bırakın / N lenf toplama sırasında lenf kanül içinde pıhtı oluşumu insidansını azaltmak için.
  6. Lenf ve kan örneği toplama tüpleri hazırlayın. Lenf ve kan örneği alındıktan lenf toplama tüpleri, etiket tüpleri önceden ağırlığında ve anti-koagülan çözelti ilave edin. Yeterli anti-koagülan solut eklemeToplanan lenf veya kan 20 lU / ml heparin - iyon steril su içinde 1 mg / ml EDTA nihai konsantrasyon veya 10 elde etmek.

Cerrahi Prosedür başlayan 2. Hazırlıklar hemen önce

  1. Patent olduğundan emin olmak için, steril tuzlu su ya da anti-koagülan çözelti ile yıkama tüm kanülü kontrol edin.
  2. Cerrahi prosedür için sıçan hazırlayın.
    NOT: mezenterik lenf kanalı yedim veya mezenterik lenf sütlü ve yüksek lipid yükü ile opak hale geldikçe yağ doz edilmiş sıçanlarda daha görünür. Önce başlayan ameliyat 2 saat - Zeytin veya soya yağı 0,5 olarak - (1 ml 0.1 civarında) Bazı operatörler, özellikle ameliyat yeni olanlar, bu nedenle fareler bir yağ ile ön-dozlandığında zaman daha kolay mezenterik lenf kanalı cannulate bulmak . Bununla birlikte, ön-doz yağı yağ, doz öncesi ideal olmayabilir, öyle ki, lenf içinde lipid, lipofilik ilaç ve diğer faktörlere lenfatik naklini etkilerDeneyin amacı, bağlı olarak değişir.
    1. Cerrahi ve örnek toplama dönemi boyunca sıçan anestezisi.
      1. Örneğin, Kokteyl, 1.5 ml / kg deri altından enjeksiyon ile anestezi başlatmak bir 25 G iğne takılı bir 1 ml şırınga kullanılarak sıçan boynun arkasındaki bir deri içine kat (aşama 1.2.2 itibaren). (Aşama 1.2.2 itibaren) kokteyl 2, 0.44 ml / kg bir 25 G iğne takılı bir 1 ml şırınga ile, gerekli yaklaşık olarak her bir saatte bir intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi bakımı.
      2. Cerrahi anestezi derinliği solunum hızı, bıyık hareket, kas tonusu ve ayağın kıstırma gibi bir uyarıcıya tepkileri gözlemleyerek yeterli olduğundan emin olmak başlamadan önce. Gerekli ek anestezi uygulayın.
    2. Karotis arter kanül için lenf ve duodenum kanülasyon için batın sağ tarafını dahil cerrahi bölgelerden gelen kürk ve boyun ve sol klavikula bölgesini Tıraşyon.
    3. Aseptik povidine-iyot solüsyonu veya klorheksidin solüsyonu ve% 70 etanol fırçalayın kullanarak cerrahi bölgeleri temizleyin. % 70 etanol ile bir nihai temizlik ile terbiye, her bölge için bu 3 kez tekrarlayın.
  3. Isıtılmış bir cerrahi pedi (37 ° C) üzerinde temiz bir kağıda dorsal recumbence hayvan yerleştirin.

Mesenterik lenf kanalının 3. kanülasyonu

  1. Sağ tarafı operatörü doğru bakacak hayvan yerleştirin. Veya gerektiği gibi bir cerrahi mikroskop yardımı olmadan ameliyat.
  2. Düz 4 cm'lik kesi yaklaşık 2 cm göğüs kafesi (kot marjı) sağ alt kanadına orta hat (xiphoid süreç) uzanan bir steril neşter bıçak kullanarak karın kas duvarının üst tabaka açın (Şekil 2B bakınız).
  3. Küçük bir çift sağ kanadına orta hatta yan 5 mm - 4 arası karın kas duvarının kalan katmanları açınCerrahi makas (Şekil 2B bakınız).
  4. Sol karın kas duvarı altındaki küçük bağırsağa çekin ve 2 kullanarak bir yerde saklayın - normal tuzlu su ile doymuş steril gazlı bez 3 adettir.
  5. Mezenterik lenf kanalı görselleştirme kolaylaştırmak için sağ böbrek düzeyinde sıçan arkasına altına yatay olarak yerleştirilmiş bir 10 ml'lik plastik şırınga üzerine sıçan Köprü.
  6. - (Şekil 2C görmek titreşimli koyu kırmızı kan damarı) mezenterik arterin sağ böbrek dik ve hemen rostral ve paralel çapı 1 mm gemi, yaklaşık 0.5: superior mezenterik lenf kanalı bulun.
    Not: aç bırakılmamış veya yağ önceden verilen sıçanlarda kap, beyaz opak ve oldukça saydam olduğu aç farelerde daha görselleştirmek için daha kolaydır.
  7. İkinci, daha küçük aksesuar lenf kanalı olup olmadığını belirlemek için geniş superior mezenterik lenf kanalı ve mezenterik arterin hemen kaudal alanını kontrol edinMevcut. Varsa, kanalı severing ve superglue ile tıkayıp, ya da kanal etrafında bir dikiş atılarak kanal içinden lenf akışını engellemek bağırsak akan lenf tüm hacmi superior mezenterik lenf kanalı toplanan emin olmak için.
  8. Sağ böbreğin alt kenarında peri-böbrek yağ yatağından düz forseps bir çift geçirin ve superior mezenterik lenf kanalı ile paralel bir doğrultuda hemen vena kava altında bağ dokusu katmanları aracılığıyla.
  9. Forseps ucu lenf kanül tutun ve bir ucu hemen mezenterik lenf kanalına bitişik ve sağ böbrekte düzeyinde hayvandan dışarı çıkarılmış diğer peri-böbrek yağ yatağından çekin kullanma.
  10. Künt diseksiyon ile bağ ve yağ dokusu katmanları örten mezenterik lenf kanalı izole edin. Delmek veya lenf kanalı zarar vermemeye özen gösterin.
  11. Lenf kanalı izole sonra, küçük bir ho yapmakmikro-makas, kuyumcu forseps keskin ucu veya 25 G iğne ile ya lenf kanalı le. Tamamen gemiyi sever dikkat edin.
  12. Lenf kanül tamamen hava boşlukları anti-pıhtılaşma solüsyonu (bir şırınga kullanarak ve 25 G iğne) ile dolu olduğundan emin olun. Forseps küçük bir çift yardımı ile küçük bir delik aracılığıyla mezenterik lenf kanalı içinde 4 mm - lenf kanül yaklaşık 2 yerleştirin.
  13. Birkaç dakika için lenf kanül gözlemleyin. Kanülasyon başarılı olursa kanül serbest toplama ucundan bağırsak lenf kademeli akışını gözlemleyin. 3.12 - kanülasyon başarılı değilse, tekrar 3.8 adımları.
  14. Kanülasyon başarılı olursa, lenf kanalı içine giriş deliğinin üzerine veteriner yapıştırıcı küçük bir damla koyarak kanül sabitleyin. Aşırı veteriner yapıştırıcı uygulanması yoluyla gemi tıkamak için özen gösterin.
  15. Veteriner yapıştırıcı ayarlamak için bekleyen, glikozu ikenkanülasyon prosedürü başarılı olmasını sağlamak için birkaç dakika lenf akışını ettik. Kanülasyon başarısı bazı kere, dikkatle karın boşluğunda yerleştirildi gazlı parçaları kaldırmak ve orijinal konumuna ince bağırsak yerleştirin.
  16. Pıhtılaşmaya karşı maddeyi ihtiva lenf toplama tüpü yerleştirin serbest akan lenf toplamak için kanül ucunda (adım 1.6).
  17. Daha sonra, rehidrasyon çözeltiler ve / veya formülasyonlar infüzyonu için duodenum kanül.

Duodenum 4. Kanülasyon

  1. Rehidrasyon solüsyonu ile doldurulmuş bir şırınga (örneğin, 10 mi) ile on iki parmak bağırsağı kanül takın.
  2. Çekerek nazik aşağı üzerine mide ortaya ince bağırsak bölümünde, (daha fazla kan damarları ile) parlak pembe olarak duodenum tanımlayın.
  3. Yaklaşık 2 cm mide ve duodenum (pilor) kavşağında altında duodenum küçük bir delinme delik açın kullanaraksteril 23 G iğne.
  4. Delinme delikten duodenal kanül J şeklindeki çengel ucunu. Siyanoakrilat yapıştırıcı bir damla ile yerde sabitleyin.
  5. Bir infüzyon pompası yüklü rehidrasyon şırıngaya kanül takarak sıçan hidrasyon başlar. Literatüre göre rehidrasyon oranları aralığı 0,5-3 ml / saat 15,25.
  6. Lenf ve onikiparmak bağırsağı kanülasyon tamamlanmasından sonra, sütür ile karın kas duvarında kesi kapatın. Daha sonra insizyon tarafı boyunca doku yapıştırıcısı (siyanoakrilat) birkaç damla tatbik birlikte kesiğin her iki yanı üzerinde derinin sıkıştırarak cilt insizyonu kapatın.

Karotis Arter 5. Kanülasyon

karotid arter kanülasyonu önce veya mezenterik lenf kanalının kanül sonra gerçekleştirilebilir. Bazı operatörler önce po azaltmak amacıyla lenf kanalı cannulating karotis arter cannulate tercihhayvan taşırken tentially lenf kanül yerinden oynatmamaya.

  1. Artere eklemek için boru bölümünü tanımlamak için konik ucundan karotis arter kanül 2.5 cm bir işareti koyun. Anti-pıhtılaşma solüsyonu ile dolu bir şırınga bağlı 23 veya 25 G iğne (Fasetsiz yani) kanül diğer ucunu ve anti-pıhtılaşma çözüm hava boşlukları bulunduğundan emin yapma kanül doldurun.
  2. Kanül kolaylaştırmak için, operatör doğru işaret gergin boyun ve kafa ile sırt yatma anestezi sıçan yerleştirin. Bazı operatörler sıçan kuyruğu operatörü doğru bakacak şekilde bu tekniği gerçekleştirmek için tercih unutmayın.
  3. Sagital düzlemde trakea sol üstünde deri tabakası ile 1,5 cm boyuna kesi - 1 koyun.
  4. Altta yatan eşli boyun kasları ortaya çıkarmak için künt uçlu forseps kullanarak cilt altı bağ dokusu incelemek.
  5. Boyun kasları t geri çekino (~ 1 cm'lik cilt yüzeyi ve darbelerin altında bulunan) sol karotis arter ortaya koymaktadır. Künt diseksiyon ile arter örten bağ dokusu temizleyin.
  6. Dikkatle komşu vagus sinir parça zarar vermemeye özen, künt doku forseps kullanarak arterin bir ~ 1 cm bölümünü izole edin. Açılış ve çevre dokuya ve vagus siniri kurtarmak için arterin iki yanı boyunca dikey olarak künt ucu forseps kapatarak bu gerçekleştirin.
  7. Ince uçlu forseps kullanarak, karotis arter altında iki ipek sütür iplik ve izole arter bölümünün her iki ucunda koyun. Sıçan kalbi ve klavikula (Şekil 3A) operatörün ve sağdaki için dikiş yakın kapalı kravat.
  8. Arter (Şekil 3B) altında düz ince uçlu forseps bir çift yerleştirerek arter yoluyla kan akışını tıkamak.
  9. Ince uçlu iris makas kullanarak, arter (yaklaşık 1/3 üst yüzeyinde küçük bir kesi yerleştirinyol aşağı izole bölgenin üstünden). Heparinize tuzlu su ile arter yüzeyinde Dökülen kan yıkayın ve yavaşça pamuk ipuçlarını kullanarak silin.
  10. Kavisli ucu forseps bir çift ile artere kanül ucu yerleştirin. Bir kez takılı, kan akışını kapatılmasıy düz ince uçlu forseps kaldırmak ve kanül eklemek için sırt ve diğer sızıntı kan durdurmak için arterin içine kanül tutmak için iki forseps çiftleri, birini kullanarak artere kanül 2.5 cm ilerlemek.
  11. Arterin içine kanül tutun ve kan akışını tıkamak için adım 5.8 arter altına yerleştirildi düz ince uçlu forseps kaldırmak için küçük bir arter kelepçe kullanın.
  12. Kanül içine anti-koagülan çözelti enjekte etme ve kan küçük bir miktar (Şekil 3C) geri çekilmesi ile kanülün açıklığını teyit edin. Sonra antikoagülan solüsyonu ile kanül yıkayın ve bir çakmak alevi veya kanül fişi kullanarak ucunu mühür.
  13. Inci KravatAdım 5.8 arter altına yerleştirilen iki sütür ile yerde e kanül.
  14. Arter kelepçesini çıkarın ve arter ve kanül etrafında üçüncü dikiş sabitleyin. Dikişlerle yara boyun kapatın.

6. Post-cerrahi Dönemi ve Formülasyon İnfüzyon

  1. Anestezi altında ve ısıtmalı pad üzerinde fare tutmak için devam edin.
  2. Kanüllerinin tamamlanmasından sonra en az 0.5 saat duodenuma rehidrasyon solüsyonu infüzyonu yoluyla sıçan rehydrate. Kanülasyon sonrası ilk döneminde - (0.5 ml / saat ~ 0.1) ve yakında sabit taban yükselmesi lenf akış hızı azalma uyun (0,4-2,5 ml / saat rehidrasyon hızına bağlı olarak).
  3. Geri kazanma periyodunu takiben, kanül yoluyla duodenuma (lipidler, uyuşturucu, vs. ihtiva eden) ilgili bir formülasyon aşılamak. İsteğe bağlı olarak, formülasyonun akış hızını ayarlamak için bir enfüzyon pompası kullanılır. NOT: protokol burada açıklanan hayvanlar ANAES kalırCerrahi ve lenf toplama süresi boyunca thetised ve ek analjezi gerekli değildir, öyle ki anestezi altında ötenazi edilir. Protokol değiştirilmiş ve hayvanlar uygun analjezi ve post-operatif bakım gerekecektir sonra bilincini kazanmak için etkin ise.
  4. Formülasyon, aşılama tamamlanmasından sonra su kaybını önlemek için duodenuma, normal tuzlu su ile 1.5-3 ml / saat oranında sıçan rehidrate devam etmektedir.
  5. Gerektiği gibi alt karın yumuşak aşağı itme yoluyla mesane, (adım 2.3 göre) sıcaklığını korumak için 37C ısıtılmış cerrahi pad üzerinde ekspres idrar sıçan tutmak ve adım 2.2 uyarınca (oftalmik merhem her saat yeniden devam. 3). Hayvan işleminden sonra bilincini kazanmak için ise düzenli vücut pozisyonu değişir tavsiye edilir.

Lenf ve kan Örneklerinin 7. Koleksiyon lipid ve İlaç emilimi değerlendirmek için

  1. Sürekli olarak lenf toplayınpıhtılaşmayı önleyici ihtiva eden tüpler. Gerekli zaman aralıklarında Değişim tüpleri (örneğin, saatlik).
  2. Ayarlanan zaman noktalarında kan örnekleri toplayın.
    1. Geri yaklaşık mühürlü sonundan itibaren 2 cm kanül bükerek kanül aracılığı ile kan akışını tıkamak. Mühürlü ucunu keserek veya kanül fişi çıkartarak kanül açmak.
    2. Kan tüm kanül doldurana kadar boş bir şırınga kullanarak, kanül heparinize tuzlu çekme.
    3. Yeni bir boş şırınga kullanarak, pıhtılaşmayı önleyici içeren bir tüp kan ve yerin istenilen hacmi çekme.
    4. İlk şırınga kullanarak, gereksiz kan kaybını azaltmak için örnekleme önce alınan kan değiştirin. Dik hava kabarcığı kanül girmek sağlamak için tutarken enjeksiyondan önce, şırınga fiske.
    5. Bir şırınga kullanılarak, anti-koagülan çözelti ile sıçandan çıkarıldı kan hacmini değiştirmek. Herhangi bir pıhtı olabilir kalan hiçbir kalıntı kan kanül görünür olduğundan emin olunve kanül engellemek.
    6. Bend kanül mühürlenmemiş ucundan yaklaşık 2 cm kan akışını engellemek ve şırınga kaldırmak için. Bir çakmak alevi veya bir kanül fiş kullanarak, kanül kapatın.
  3. Sıçandan alınan kan ve lenf toplama tamamlanmasından sonra,> 100 mg / kg sodyum pentobarbıton intraperitonal uygulama yoluyla fare euthanize.
  4. Her dönemde toplanan lenf kütlesini ölçerek lenf akış hızını belirleyin.
  5. Lipid ve ilaç emilme etkinliğini değerlendirmek için, örneğin HPLC, HPLC-MS ya da, ticari kitler kullanılarak, lenf ve kan kullanarak ilaç ve lipid konsantrasyonu ölçümü.
  6. Toplanan ölçülen konsantrasyon ve lenf hacminin üründen lenf ilaç ve lipidlerin kitle ulaşım hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

temsili bir deneyin sonuçları, Şekil 4 ve 5'te gösterilmiştir mezenterik lenf kanülasyon modeli kullanılarak bağırsak doğum sonrası lenf sistemi ile kümülatif boyut ve lipid ve ilaç taşıma hızını ölçmek için. Bu deneyde, örnek lipofilik 200 ug fosfat tamponlu 5.6 mi, 5 mM sodyum taurokolat dağıtılır ve 7.1 mg 2-monoolein - ilaç halofantrin, 40 mg, oleik (5 uCi 14C-oleik asit 2 de dahil olmak üzere), asit ihtiva eden bir formülasyon içinde 2 saat boyunca sıçan duodenum içine uygulandı tuz pH 6.9. Sözkonusu formülasyon uygulama sonrasında fareler 2.8 ml / onikiparmak bağırsağına infüse edilen, normal tuzlu su ile st bir oranda rehidre edildi. Lenf 10 saat boyunca her saat başı değiştirilebilir tüpler içinde sürekli olarak toplandı. aynı compon içeren bir formülasyon için, daha önce tarif edilen bir protokole göre bir formülasyon hazırlandı ve deney gerçekleştirilmiştirBunun dışında veliler 2-monooleinin 43 içermiyordu.

1.3 mL / saat - Şekil 4 'de gösterildiği üzere, bu deneysel koşullar başarıyla kanül fareler için ortalama lenf akış hızı 0.4 arasında değişir. Kanülasyon Aşağıdaki 3 saat ve daha sonra arttı - Bazı sıçanlarda lenf akış oranı ilk 1 biraz düşüktü. Bu genellikle lenf kanülasyon takip görülür. Ayrıca başarısız deney için lenf akış hızı Şekil 4'te de gösterilmiştir. Bu durumda akış hızı toplama süresi boyunca başarılı deney görülenden daha önemli ölçüde daha düşük olarak kaldı. Benzer şekilde, trigliserid ve halofantrin kümülatif lenfatik taşıma başarısız deneme (Şekil 5A ve B) önemli ölçüde daha düşük olmuştur. Başarılı grupta ortalama kümülatif halofantrin taşıma dozunun% 15.1 idi, kümülatif trigliserid taşıma 61 10 saat boyunca mg ve uygulanan r oranı oldulenf içinde taşınan adiolabelled eksojen lipit doz% 54 (Şekil 5C) idi. Bu değerler, 2-monoolein 43 (Tablo 1) olmaması haricinde aynı komponentleri içeren benzer bir formülasyon için, daha önce görülen önemli ölçüde farklı değildir. Bu monogliserid kaynağı yokluğunda yağ asitleri içeren formülasyonlar monogliserit içeren seçilmesi gerekir lenf içindeki lipid ve ilaç taşıma desteği düşündürmektedir. Bu sonuç, tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak anlatılmıştır.

Şekil 5D Halofantrin ve uygulamadan sonra zamanla lenf trigliserid taşıma oranı temsilcisi verileri gösterir. Lenf içine hem trigliserid ve ilaç taşıma oranı lipid ve ilaç uygulamasını takiben birkaç saat zirveleri ve daha sonra bazal düzeylere geri döner. Gibi, ilaç iletimdeki oranı bağırsak lenfatik lipit ve ilaç taşıma deneylerinde tipikilaç olarak trigliserid nakliye için görülen her zaman diliminde ayna sırasında lenf t, trigliserid bakımından zengin lipoproteinlerin ile birlikte lenf içine taşınır.

Şekil 1,
Şekil 1, bir karotid arter veya lenf kanülün kesik ucunun şekli ve duodenal kanül J-şekilli kesik ucunun şematik gösterimi.

Şekil 2,
Şekil (A) lenf kanalı cannulate hazırlık traş karın, (B) karın kas duvarı düz 4 cm'lik kesi lenf kanalı erişmek için sağ kanadına orta hat uzanan açıldı ve 2. Fotoğraf (C ) sarı daire içinde superior mezenterik lenf kanalı () sağ böbrek dik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil arter altına yerleştirilen düz ince uçlu forseps bir çift ile tıkalı bağladılar operatör, (B), izole karotis arter ve kan akışına yakın bir iki ipek sütür ile izole (A) karotis arter 3. Fotoğraf, ve (C) yerine kanül ve açıklığı ile bir karotis arter geri kan küçük bir miktar çizerek kontrol ediliyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4 "src =" / files / ftp_upload / 52.389 / 52389fig4highres.jpg "/>
Zaman. Sıçanlar üzerinde mezenterik lenf akış hızı (ul / saat) Şekil 4. Temsilcisi veriler 200 ug halofantrin, (2 uCi 14 C-oleik asit ile) 40 mg oleik asit ve 7.1 mg 2-monooleinin 5.6 ihtiva eden bir formülasyon uygulandı 2 saat 0 - fosfat tamponlu tuzlu su içinde 5 mM sodyum taurokolat (pH 6.9) ile yıkanmaktadır. Gösterilen veriler n ± SEM ortalama vardır = 3 başarılı deneyler (kapalı daireler, ●) ve n = 1 başarısız sonuç (açık üçgenler, Δ).

Şekil 5,
Mezenterik lenf içine lipid ve ilaç nakliyesi için Şekil 5. Örnek verileri. (A) 'Model ilaç halofantrin (Hf,% doz), (B), trigliserit (TG mg) ve (C), eksojen yağlı asit (% taraması, toplu taşımae) ve iletim hızı, (D) TG (mg / saat) ve Hf uCi 14 2, 200 ug halofantrin, 40 mg, oleik asit (ihtiva eden bir formülasyonun uygulanmasından sonra zamanla mezenterik lenf içine (% olarak doz / saat) Cı-oleik asit) ve 0, fosfat tamponlu tuzlu su içinde 5.6 ml 5 mM sodyum taurokolat (pH 6.9) 'de 7.1 ila 2 mg-Monoolein - 2 saat. Gösterilen veriler n ± SEM ortalama vardır = 4 başarılı deneyler (kapalı daireler, ●) ve n = 1 başarısız sonuç (açık üçgenler, Δ). Eksojen yağ asidi taşıma başarısız deneyde ölçülen ancak başarısız deneylerde genellikle düşük değildi. Başarısız deney için veriler netlik Panel D ihmal edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

M olmadanonoolein 2-monolein ile
Ortalama SEM Ortalama SEM
Halofantrin (% olarak doz) 15.1 0,8 15 1.6
Trigliserid (mg), 67 4 61 6
Toplam yağ asidi (umol) 261 16 248 23
Eksojen oleik asit (umol) 82 5 65 6
Endojen yağlı asit (umol) 180 17 183 28

40 mg oleik asit içeren formülasyonlar lenf kanalı kanüle sıçan mezenterik 200 mikrogram Halofantrin uygulanmasını takiben 10 saat boyunca kümülatif lenfatik ulaşım verilerinin karşılaştırılması Tablo 1. (containinve 7.1 mg 2-Monoolein. Veri içermeyen fosfat tamponlu tuzlu su (pH 6.9), 5 mM sodyum taurokolat içinde emülsifiye g 1 uCi 14C-oleik asit), n = 4 sıçan için ortalama ± SEM temsil eder. Istatistiksel olarak anlamlı fark 2 grup arasında görülür.

2-monoolein omurgaya bağlı oleik asit lenf içine ölçülen eksojen oleik asit taşımacılığında hesaba olmadığı gibi, bu endojen yağ asidi taşıma doğru bir ölçü değildir 2-monoolein ile dozlanmış grupta.

2 b-monoolein olmadan dozlu grupta Halofantrin ve toplam yağ asidi taşıma verileri daha önce referans 43 Şekil 5. yılında yayımlandı ve tablo formatında burada üretilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

sıçan mezenterik lenf kanülasyon modeli çeşitli maddelerin meydan konsantrasyon ve çeşitli hücreler ve barsaktan lenf içine ve tepki olarak ortaya bu değişiklikler (örneğin lipidler ve uyuşturucu gibi) moleküllerin taşınması oranının doğrudan ölçümü sağlar (diyet antijen, ilaç formülasyonları, vs.) 10,27 ve hastalığın (kanser, virüs, kolit, insülin direnci, vb), 5-7. lenf içinde toplanan parçalar ayrıca ek deneyler kullanılabilmektedir. Örneğin, hücreler 44 damıtılması lipoproteinler ve lenf ya da lipoproteinlerin veya hücreleri gibi bileşenleri, ilaç, radyo-floresan prob içeren belirteçler ile yüklü kültürlenebilir. Bunlar daha sonra doğrudan fonksiyon, metabolizma, boşluk ve / veya doku eğilim desenleri 45-47 değerlendirmek için alıcı hayvanların içine yeniden infüze edilebilir. Sıçan lenf kanülasyon modeli oth üzerinde birçok avantajı vardırer, in vitro, in situ silico ve in vivo modellerde girişte tarif edildi. En önemlisi, kanülasyon lenf sıvısının bileşenlerin tüm hacmi doğrudan erişim sağlayan tek yöntemdir. Deneyimli bir operatörün elinde yapıldığında modeli>% 80, sağlam tekrarlanabilir ve deneysel başarı oranları elde edilebilir. Ancak, cerrahi teknik başlangıçta özellikle tekniği aşina olmayan bir laboratuarda, usta zor olabilir.

Birkaç adım mezenterik lenf kanülasyon modelinin başarısı için kritik öneme sahiptir. İlk cerrahi aletler ve kanül tipi ve hazırlık doğru seçimdir. Bizim laboratuvar boyutları OD 0.8 x 0,5 mm ID PE kanüller kullanır. Ancak, diğer laboratuarları aynı boyutta 15 PVC kanüller ile başarı yaşamış. Kanül ve ucu eğik olarak kesmek de önlemeye yardımcı olur, bir anti-koagülan içinde ön-ıslatmatıkanması ve içindeki pıhtı oluşumu, kanül sonrası ekleme (adım 3.13). Bazı operatörler özellikle kritik bulmak cerrahi prosedürün ilk adımı lenf kanalı (adım 3.10) Yukarıdaki bağ ve yağ dokusu katmanları temizlemek için dikkat çekici. Bu doku ve lenf kanalı arasındaki yerine lenf kanalı içine kanül yerleştirilmesini önlemek için yardımcı olur. Lenf kanalı kırılgan ve hasar kolay Ancak, bu temizleme adımı zordur. Diğer bir mikroskop gerekli değildir bulmak olsa da bazı, bu aşama, ve kanül yerleştirme en başarılı bir ameliyat mikroskobu yardımıyla tamamlanır. Kanal içine kanül takarken yönü ve kesik ucu ekleme göreli derinlik damar duvarına (adım 3.12) tarafından tıkalı olan kanül önlemek için bazı dikkate alınmasını gerektirir. Her operatör kendi bireysel tercihi bulmak eğilimindedir. Ayrıca önemli ca içindeki hava kabarcığı oluşumuna kaçınma olduğununnula yerleştirilmesi sırasında hava boşlukları lenf serbest akışı (adım 3.12) geri basınç uygulayın gibi. Son olarak, yerine kanül sabitlemek için veteriner yapıştırıcının uygulama kanül ucu (aşama 3,14) daraltmak ve kapamak için kap neden olabilir kanal üstüne doğrudan yerleştirildi yapıştırıcı olarak kanalın içine sokulma noktasının altında olmalıdır.

Bir ameliyat başarılı olup olmadığı gibi kolay ilk kılavuz lenf akış hızıdır. Kanül yer lenf içinde olduğunda, genel olarak, ilk 30 dakika içinde yavaş yavaş akmaya başlar ve daha sonra artar. Tipik olarak, sıçanlarda başarılı kanüllerinin akış hızları> 250 gr ilk bir saat içinde> 0.1 mi / saat ve Şekil 4'te gösterildiği gibi, daha sonra, kalıcı halde> 0.4 ml / saat artar. Elbette buna bağlı olarak değişebilir, ancak . Bu nedeni olabilir deneysel durum sorun giderme açısından, lenf kanül veya akış hızı akan ise düşüktür:

    kanül kanal içine doğru takılı değil
  1. kanül kanalında ama damar duvarının yanında tıkalı
  2. kanül kanalında ama yanlış pozisyonda uygulanan yapıştırıcı ile tıkalı
  3. kanül kanalında ve kanül bir hava kabarcığı akışını yavaşlatan bir
  4. Bir pıhtı kanül içinde kurdu

Dikkatli muayene genellikle altta yatan faktör ortaya koymaktadır. Operatör kanül ilk etapta doğru yerleştirilmiş değil düşünürse yeniden ekleme gerekli sonra (yani, lenf asla akan). Kanül doğru yerde görünmektedir sonra kontrol etmek için ilk faktör bir hava kabarcığı ya da pıhtı mevcut olup olmadığıdır. Hava kabarcıkları genellikle lenf akışları ve geçici yavaş akım olarak kanül geçecek. Bu, örneğin, eklenmiş bir 25 G iğne kullanılarak kanüle geri çekilmesi ile 1 ml şırınga hava kabarcıkları ve pıhtı alınması da mümkündür. Hava kabarcığı ya da pıhtı varsa o sıçan yeniden konumlandırma ve / veya torna veya biraz kanül çekerek denemek için yararlı olabilir. Bu bazen damar duvarına karşı bloke olmayacak şekilde kanül realign edebilirsiniz. Bazen ya da kanül küçük hareketi olmadan yapıştırıcı çıkarmadan lenf de tekrar akmasını sağlar. Herkes başarısız Ancak, kanül reinserted gerekiyor. Kanül ilk denemede doğru takılı değilken bizim deneyim deneyler daha az başarılı. Ancak cerrahi kurtarma mümkündür. Ortaya bir başka komplikasyon nedeniyle sıçanlarda arasındaki anatomik varyans kanül güçlüğüdür. Örneğin, mezenterik lenf kanalı zaman zor bir yönde geçtiği ya da daha büyük bir üst mezenterik lenf kanalına mezenterik arter karşı tarafında bir aksesuar lenf kanalı vardır. Olduğu gibi (ince bağırsağa akan lenf tüm hacminin koleksiyonu gerektiren deneylerde) lenfatiklerin ile bağırsaktan toplam lipid ve ilaç taşıma değerlendirirken, aksesuar lenf kanalı, tüm lenf üstün lenf kanalına yönlendirilir, öyle ki tıkalı olması gerekir. Bu elde etmek zordur ama aksesuar kanal etrafında bir dikiş bağlama veya aksesuar kanalı severing ve veteriner yapıştırıcı (adım 3.6) ile tıkanarak denenebilir. Bir aksesuar lenf kanalının varlığı lenfatik ilaç taşıma deneylerinde deney başarısızlıkla sonuçlanır ana faktörlerden biridir. Aksesuar damar tamamen tıkalı değilse, lenf akışı ve lipit ve ilaç taşıma beklenenden daha düşüktür.

Burada sunulan protokol hayvan lenf toplama dönemi boyunca anestezi kalır. (yerine aşağıda açıklanan bilinçli modellere göre) anestezi sıçan modeli cerrahi olarak deneysel verim artar ve deney yerine birkaç gün birden ve cerrahi başarı r üzerinde yapılabiliro hareketsiz hayvanlarda kanül açıklığını korumak için kolay gibi yedik büyüktür. Anestezi teorik mide boşalmasını, bağırsak lipit işleme ve lenf akışını ve taşıma azaltabilir. Deneyimlerimize göre, ancak, lenfatik lipit ve ilaç ulaştırma yüzey aktif maddeler ile dispersiyon sindirilmiş ön ve ön-dağılmış araçlar (örneğin, yağlı asit ve monogliserit misel sistemleri içinde (by-pass mide boşaltma kadar) doğrudan duodenuma ilaç tatbik aneztezi yapılmış farelerde benzer ) eşdeğer bir trigliserid 21,23,27 olarak mideye ağızdan sonda ile ilaç uygulanan bilinçli farelere göre. Nitekim, son 10 yıl içinde laboratuarda bağırsak lenfatik ilaç taşıma deneyleri çoğunluğu nedeniyle elde edilebilir yüksek verim için anestezi modelinde yapılmıştır. Bu deneylerde, en çok yağ (örneğin, oleik asit) asit ve yüzey aktif madde 43 ihtiva eden formülasyonlarda ilaç tatbik var.Yağlı asitler bağırsak lenf lipoproteinlerin içine dahil edilmeden önce trigliserid sentez ve bu trigliserit gliserol omurgası (örneğin, 2-monogliserid ya da gliserol-3-fosfat) oluşturmak için bileşenlerin kaynağı gerektirir. Bu, bir gliserol kaynağı yokluğunda yağ asitlerinin verilmesinin düşük lenf taşımaya yol olabileceğini düşündürmektedir. Yağ asidi Bununla birlikte uygulama, eksojen tatbik yağ asidi ve lenfatik lipid ve ilaç nakliyesi 43 endojen lipidlerin katkı doğrudan hesaplanmasını mümkün kılar. Buna ek olarak, 2-monogliserid, pahalı ve hali hazırda bağırsak lümeninde gliserol sindirildiğinde 1-monogliserid için isomerises genel olarak stabil değildir. Burada bildirilen çalışmaları ile, bundan başka, lenfatik lipid göstermektedir ve madde taşıma ya da PR bir yağlı asit (örneğin, oleik asit) ve yüzey aktif madde (safra tuzu) model ilaç halofantrin uygulanmasından sonra eşdeğerdir formülasyonözünü ya da gliserol kaynağı 2-monoolein (Tablo 1) bir yapı. Gliserol endojen kaynakları bu nedenle eş lenf akışı ve lipid ve bir gliserol kaynağı yokluğunda yağ asitlerinin (örneğin, oleik asit) ile model bir ilaç uygulanmasından sonra ilaç naklini desteklemek için yeterli görülmektedir. Bu temsili lenfatik ulaşım verileri basit yağ asidi formülasyonları ile elde edilebilir güven sağlar.

gerektiğinde anestezi modeli kolaylıkla bilinçli bir modele kadar uzatılmıştır. Bilinçli modellerde formülasyonlar mide doğrudan zorla ağız yolundan verilmiştir edilebilir veya duodenum ya da damardan infüzyon halinde, doğrudan bir karşılaştırma daha fazla fizyolojik olarak uygun kabul edilebilir olmayan lenf kanül bilinçli hayvanlarda ve sonuç olarak yapılan farmakokinetik çalışmalar yapılabilir. bilinçli hayvanlarda izin daha uzun bir zaman periyodu, aynı zamanda dr için daha tam bir farmakokinetik profil toplama izin verme avantajına sahiptiranestezi altındaki deneylerde kan profilleri, özellikle uzun yarı ömür ilaçlar için, çoğu zaman eksik iken kan ug konsantrasyonları tercih edilir. Yukarıda açıklandığı gibi, ancak, bilinçli lenf kanüllenmiş çalışmalar için başarı oranı daha düşüktür ve deneyler tamamlanması daha uzun sürebilir. Literatürde tarif bilinçli lenf kanülasyon modelleri iki türü vardır. Lenf kanülasyon ameliyat sonrası bilinçli ölçülü modeller 15, içinde, hayvan sadece kendi ön yüzüne dönük olduğu ve bir toplama tüpüne dışlanmışken ve eklenen lenf kanül ile deneyin geri kalan süresi için uygun sınır içine yerleştirilmiş. Hayvan daha sonra bilincini kazanmak ve cerrahi prosedür O / N kurtarmak için izin verilir. Bu model ile başarı oranı deneyimli operatörler elinde çok iyi ama lenf koleksiyonu için gerekli zaman uzun süre hayvanları dizginlemek için etik boşluk elde etmek zor olabilir. Alternatif bir model lenf toplanan neredebilinçli ve özgürce hareket sıçanların. Bu model, daha önce 25 ayrıntılı olmuştur. Bu modelde, uzun kanüller mezenterik lenf kanalı, onikiparmak bağırsağı ve karotid arteri içine yerleştirilir. kanüller sonra boynun arka kısmında dışarıya ve bir döndürme sistemi ile yerleştirilen, deri altında tünel vardır. sıçan, bir koşum döner bağlı ve bilincinin yeniden ve cerrahi prosedür O / N kurtarmak için izin yerleştirilir. Hayvan metabolik kafes ve lenf ve kan örnekleri içinde serbest hareket kafes dışında dışlanmışken kanüller alınabilir vardır.

Mezenterik lenf kanülasyon kendi olgunlaşmamış durumda lenf bileşenlerinin doğrudan değerlendirilmesini sağlayan tek araç kalır. Cerrahi büyük hayvanlar ve sonuçlar türler 27 arasında makul benzer görünür daha modeli daha az pahalı küçük ve büyük hayvanlara göre daha az karmaşık olduğu için lenf kanülasyon genellikle sıçanlarda tarif edilmiştir. Sıçan modul Deneysel ihtiyaç ve başarı oranına göre deneyimli operatörler elinde yüksek modifiye edilebilir. Model, aynı zamanda ayrıntılı bağırsak lenf bileşenlerinin metabolizmasında veya fonksiyon, incelemek için in vitro veya in vivo çalışmalar diğer akuple edilebilir. Bir kez mezenterik lenf kanüle sıçan modeli böylece konsantrasyon, ulaşım, fonksiyon ve (sistemik dolaşıma sonunda akar ve birçok durumda) lenfatik sisteme bağırsak doğrudan geçmek çeşitli parametrelerin metabolizmasını değerlendirmek için güçlü bir araçtır kurdu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile saline Baxter healthcare AHB 1307 Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50
70 % ethanol in water Any Any brand can be used
Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4) Livingstone International JJ60243L Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=JJ60243L
Betadine solution Livingstone International BU0510 Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=BU0510
Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  KETA I 1 http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  TRO-3828 http://www.provet.com.au/
ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml) PROVET VICTORIA  VTG-DACP010020 http://www.provet.com.au/
Sodium pentobarbitone PROVET VICTORIA  24529 Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparin (35000I.U. in 35 mL) Sigma Pharmaceuticals 337220 http://sigmaco.com.au/
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E1644 Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma. 
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm Microtube extensions PE8050 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96 x0.58 mm, 30 m
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm Microtube extensions PE9658 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8 x0.5 mm, 30 m
Ruler Any Any brand can be used
Markers Any Any brand can be used
Cigarette lighter Any Any brand can be used
Veterinary adhesive Any Any brand can be used
23 gauge needles Livingstone International DN23GX0.75LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=
6&search=DN23GX0.75LV
25 gauge needles Livingstone International DN25GX1.0LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=
DN25GX1.0LV
1 ml syringe Livingstone International T3SS01TA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS01TA
10 ml syringe Livingstone International T3SS10SA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS10SA
Gauze swabs Livingstone International GSC075 Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=GSC075
Cotton buds Livingstone International CTAST075DP Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=CTAST075DP
Heating pad Ratek WT1 Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray.
Surgical light Harvard Apparatus 72-0215 with 72-0267 Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
-1_HAI_ProductDetail and  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_
-1_HAI_ProductDetail___
Surgical microscope Zeiss 495005-0014-000 Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Silk suture Livingstone International DTSK163019F4 Any brand can be used. Example here is  

3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=DTSK163019F4
Scalpel blades Fine Science Tools (FST) 10020-00 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Scalpel handle Fine Science Tools (FST) 10004-13 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Small surgical scissors Fine Science Tools (FST) 14060-09 Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Forceps with serrated curved tip Fine Science Tools (FST) 11001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x Iridectomy scissors Fine Science Tools (FST) 15000-08 Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 
1 x Forceps with straight serated tip Fine Science Tools (FST) 11650-10 Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-10 Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Forceps with smooth fine curved forceps Fine Science Tools (FST) 11063-07 Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x Hemostats Fine Science Tools (FST) 13010-12 Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Suture needle holder Fine Science Tools (FST) 12001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x Artery clamp Fine Science Tools (FST) 18050-28 Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Oleic acid Sigma Aldrich O1008 When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU
14C-oleic acid Perkin  NEC317050UC  Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Sodium taurocholate Sigma Aldrich T4009 Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU
Halofantrine Glaxo Smith Kline Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich 71507 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich 71643 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barrowman, J. A., Tso, P. Gastrointestinal lymphatics. Comprehensive Physiology. 1733-1777 (2010).
  2. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124, (3), 922-928 (2014).
  3. Mossel, E. C., Ramig, R. F. A lymphatic mechanism of rotavirus extraintestinal spread in the neonatal mouse. J Virol. 77, (22), 12352-12356 (2003).
  4. Pantaleo, G., et al. Hiv-Infection Is Active and Progressive in Lymphoid-Tissue during the Clinically Latent Stage of Disease. Nature. 362, (6418), 355-358 (1993).
  5. Chakraborty, S., Zawieja, S., Wang, W., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, R94-R102 (2010).
  6. Dixon, J. B. Lymphatic lipid transport: sewer or subway. Trends Endocrinol Metab. 21, (8), 480-487 (2010).
  7. Weid, P. -Y., Rehal, S., Ferraz, J. G. Role of the lymphatic system in the pathogenesis of Crohn's disease. Current Opinion in Gastroenterology. 27, (4), 335-341 (2011).
  8. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PloS one. 4, (12), e8442 (2009).
  9. Ji, Y., et al. Activation of rat intestinal mucosal mast cells by fat absorption. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, (11), G1292-G1300 (2012).
  10. Kohan, A., Yoder, S., Tso, P. Lymphatics in intestinal transport of nutrients and gastrointestinal hormones. Ann N Y Acad Sci. 1207, Suppl 1. E44-E51 (2010).
  11. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Targeted drug delivery to lymphocytes: a route to site-specific immunomodulation. Mol Pharm. 7, (6), 2297-2309 (2010).
  12. Rothkotter, H. J., Huber, T., Barman, N. N., Pabst, R. Lymphoid cells in afferent and efferent intestinal lymph: lymphocyte subpopulations and cell migration. Clin Exp Immunol. 92, (2), 317-322 (1993).
  13. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Lipid-based delivery systems and intestinal lymphatic drug transport: a mechanistic update. Adv Drug Deliv Rev. 60, (6), 702-716 (2008).
  14. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. Am J Physiol. 261, (3 Pt 1), G530-G538 (1991).
  15. Kohan, A. B., Howles, P. N., Tso, P. Methods for studying rodent intestinal lipoprotein production and metabolism. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 219-230 (2012).
  16. Porter, C. J., Trevaskis, N. L., Charman, W. N. Lipids and lipid-based formulations: optimizing the oral delivery of lipophilic drugs. Nat Rev Drug Discov. 6, (3), 231-248 (2007).
  17. Trevaskis, N. L., et al. The role of the intestinal lymphatics in the absorption of two highly lipophilic cholesterol ester transfer protein inhibitors (CP524,515 and CP532,623). Pharm Res. 27, (5), 878-893 (2010).
  18. Choo, E. F., et al. The Role of Lymphatic Transport on the. Systemic Bioavailability of the Bcl-2 Protein Family Inhibitors Navitoclax (ABT-263) and ABT-199. Drug Metabolism and Disposition. 42, (2), 207-212 (2014).
  19. Han, S., et al. Targeted delivery of a model immunomodulator to the lymphatic system: comparison of alkyl ester versus triglyceride mimetic lipid prodrug strategies. J Control Release. 177, 1-10 (2014).
  20. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. J Lab Clin Med. 33, (10), 1349-1352 (1948).
  21. Porter, C. J., Charman, S. A., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the triple-cannulated anesthetized rat model: effect of lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85, (4), 351-356 (1996).
  22. Boyd, M., Risovic, V., Jull, P., Choo, E., Wasan, K. M. A stepwise surgical procedure to investigate the lymphatic transport of lipid-based oral drug formulations: Cannulation of the mesenteric and thoracic lymph ducts within the rat. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49, (2), 115-120 (2004).
  23. Porter, C. J., Charman, S. A., Humberstone, A. J., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the conscious rat when administered as either the free base or the hydrochloride salt: effect of lipid class and lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85, (4), 357-361 (1996).
  24. Caliph, S. M., Charman, W. N., Porter, C. J. Effect of short-, medium-, and long-chain fatty acid-based vehicles on the absolute oral bioavailability and intestinal lymphatic transport of halofantrine and assessment of mass balance in lymph-cannulated and non-cannulated rats. J Pharm Sci. 89, (8), 1073-1084 (2000).
  25. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Adv Drug Deliv Rev. 50, (1-2), 45-60 (2001).
  26. Noguchi, T., Charman, W. N. A., Stella, V. J. Lymphatic Appearance of Ddt in Thoracic or Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rats. International Journal of Pharmaceutics. 24, (2-3), 185-192 (1985).
  27. Trevaskis, N. L., et al. A mouse model to evaluate the impact of species, sex, and lipid load on lymphatic drug transport. Pharm Res. 30, (12), 3254-3270 (2013).
  28. Kota, J., et al. Lymphatic absorption of subcutaneously administered proteins: influence of different injection sites on the absorption of darbepoetin alfa using a sheep model. Drug Metab Dispos. 35, (12), 2211-2217 (2007).
  29. McHale, N. G., Adair, T. H. Reflex modulation of lymphatic pumping in sheep. Circ Res. 64, (6), 1165-1171 (1989).
  30. White, D. G., Story, M. J., Barnwell, S. G. An Experimental Animal-Model for Studying the Effects of a Novel Lymphatic Drug Delivery System for Propranolol. International Journal of Pharmaceutics. 69, (2), 169-174 (1991).
  31. Khoo, S. M., Edwards, G. A., Porter, C. J., Charman, W. N. A conscious dog model for assessing the absorption, enterocyte-based metabolism, and intestinal lymphatic transport of halofantrine. J Pharm Sci. 90, (10), 1599-1607 (2001).
  32. Kararli, T. T. Comparison of the gastrointestinal anatomy, physiology, and biochemistry of humans and commonly used laboratory animals. Biopharm Drug Dispos. 16, (5), 351-380 (1995).
  33. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. J Biomed Opt. 17, (8), 086005 (2012).
  34. Dahan, A., Hoffman, A. Evaluation of a chylomicron flow blocking approach to investigate the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs. Eur J Pharm Sci. 24, (4), 381-388 (2005).
  35. Xiao, C., Lewis, G. F. Regulation of chylomicron production in humans. Biochim Biophys Acta. 1821, (5), 736-746 (2012).
  36. Seeballuck, F., Ashford, M., O'Driscoll, C. The Effects of Pluronic® Block Copolymers and Cremophor EL on Intestinal Lipoprotein Processing and the Potential Link with P-Glycoprotein in Caco-2 Cells. Pharmaceutical Research. 20, (7), 1085-1092 (2003).
  37. Levy, E., Mehran, M., Seidman, E. Caco-2 cells as a model for intestinal lipoprotein synthesis and secretion. The FASEB Journal. 9, (8), 626-635 (1995).
  38. Cartwright, I. J., Higgins, J. A. Isolated rabbit enterocytes as a model cell system for investigations of chylomicron assembly and secretion. Journal of Lipid Research. 40, (7), 1357-1365 (1999).
  39. Dixon, J. B., Raghunathan, S., Swartz, M. A. A Tissue-Engineered Model of the Intestinal Lacteal for Evaluating Lipid Transport by Lymphatics. Biotechnology and Bioengineering. 103, (6), 1224-1235 (2009).
  40. Gershkovich, P., et al. The role of molecular physicochemical properties and apolipoproteins in association of drugs with triglyceride-rich lipoproteins: in-silico prediction of uptake by chylomicrons. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 61, (1), 31-39 (2009).
  41. Gershkovich, P., Hoffman, A. Uptake of lipophilic drugs by plasma derived isolated chylomicrons: Linear correlation with intestinal lymphatic bioavailability. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 26, (5), 394-404 (2005).
  42. Holm, R., Hoest, J. Successful in silico predicting of intestinal lymphatic transfer. International Journal of Pharmaceutics. 272, (1-2), 189-193 (2004).
  43. Trevaskis, N. L., Porter, C. J., Charman, W. N. Bile increases intestinal lymphatic drug transport in the fasted rat. Pharm Res. 22, (11), 1863-1870 (2005).
  44. Miura, S., et al. Increased proliferative response of lymphocytes from intestinal lymph during long chain fatty acid absorption. Immunology. 78, (1), 142-146 (1993).
  45. Caliph, S. M., et al. The impact of lymphatic transport on the systemic disposition of lipophilic drugs. J Pharm Sci. 102, (7), 2395-2408 (2013).
  46. Caliph, S. M., Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Intravenous dosing conditions may affect systemic clearance for highly lipophilic drugs: implications for lymphatic transport and absolute bioavailability studies. J Pharm Sci. 101, (9), 3540-3546 (2012).
  47. Trevaskis, N. L., et al. Tissue uptake of DDT is independent of chylomicron metabolism. Arch Toxicol. 80, (4), 196-200 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics