Generación de células T CAR para realizar la terapia adoptiva en el contexto de Glioblastoma estándar de cuidado

Immunology and Infection

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Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (96), e52397, doi:10.3791/52397 (2015).

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Abstract

Introduction

El glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral maligno primario más común y es invariablemente fatal. La resección quirúrgica junto con estándar no específica de la quimioterapia y la radioterapia cuidado de no eliminar completamente las células malignas, que resulta en un pronóstico sombrío de menos de 15 meses en los pacientes con esta enfermedad 1. En contraste, la inmunoterapia ofrece un enfoque preciso para apuntar específicamente a las células tumorales, y por lo tanto tiene el potencial para servir como una plataforma de tratamiento altamente eficaz con menor riesgo de toxicidad colateral 2-4. Células T diseñadas ex vivo para expresar receptores de antígenos quiméricos (CAR) ofrecen una estrategia versátil para la inmunoterapia tumoral. CARs se generan mediante la fusión de la región variable extracelular de un anticuerpo con la molécula de señalización de una o más células T intracelular (s), en lugar de una de longitud completa complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) -restringido receptor de la célula T 5. Este modo de recono antígeno-anticuerpo-comoOn permite para las células T específicas de antígeno reactivos para reconocer y responder a los antígenos tumorales en ausencia de MHC y se pueden adaptar para un repertorio de antígeno virtualmente infinito.

Células T CAR ingeniería contra una variedad de antígenos tumorales han demostrado eficacia preclínica y la promesa excepcional en la clínica 6-9. En concreto, en el contexto de GBM, una variante de crecimiento epidérmico receptor del factor de CAR plataforma de células T focalización III (EGFRvIII), una mutación específica del tumor expresa en la superficie de la célula 10, se ha demostrado prolongar la supervivencia en los ratones portadores de glioma 11. A pesar de su versatilidad, sin embargo, el beneficio clínico de la terapia adoptiva CAR no se ha realizado plenamente, en parte debido a la inmunosupresión asociada al tumor y la evasión inmune 12-16, así como los desafíos en el establecimiento y mantenimiento de las células T específicas de antígeno in vivo. Aprovechando estándar de cuidado (SOC) con inmunoterapia potencialmente puede superar varios de estos limitaciones, resulta en una mayor eficacia tanto en la configuración preclínica y clínica.

SOC para el post-resección GBM consiste en altas dosis de temozolomida (TMZ), un agente alquilante de ADN 17, y la irradiación de todo el cerebro (WBI) 1. Estos tratamientos se presume que en sinergia con vacunas tumorales a través de la regulación positiva de la expresión de MHC tumor 18-20 y el derramamiento de antígenos por las células tumorales muertas 17,19,21,22. De hecho, la adición de TMZ 20,23 o 18,24 WBI conduce a una mayor eficacia antitumoral de los tratamientos de base inmunitaria en el entorno preclínico. Además, como muchos agentes quimioterapéuticos citotóxicos no específicos, TMZ se sabe que causa 25,26 linfopenia sistémica, que puede ser aprovechada como medio de host-acondicionado para las plataformas de terapia adoptiva 27-29. Lymphodepletion mediada por TMZ se ha demostrado para mejorar la frecuencia y la función de las células T específicas de antígeno, lo que aumenta la eficacia de un ADOPplataforma de terapia tiva contra los tumores intracraneales 30. En el contexto de la terapia CAR, lymphodepletion sirve como un medio de host-acondicionado por tanto reducir el número de células T supresoras endógena 31, y la inducción de la proliferación homeostática 32 a través de la competencia reducido para citoquinas 33, mejorando así la actividad antitumoral 11,34. Dada la relación sinérgica entre GBM SOC e inmunoterapia plataformas, evaluar nuevas terapias adoptivas y plataformas de vacunas en el contexto del SOC es crítico para sacar conclusiones significativas respecto a la eficacia.

En este protocolo, se describe un método para la generación y administración intravenosa de células T CAR-EGFRvIII murino específico junto a TMZ y WBI en ratones con tumores intracraneales EGFRvIII-positivos (ver Figura 1 para la línea de tiempo de tratamiento). En pocas palabras, se producen las células CAR T ex vivo por transducción retroviral. Riñón embrionario humano (HEK) 293T células se transfectaron usando un complejo de ADN / lípido (que contiene el vector y los plásmidos CAR PCL-Eco) para producir virus, que luego se utiliza para transducir esplenocitos murinos activados que se cosechan y se cultivaron en paralelo. Durante el curso de la generación de CAR, los anfitriones murinos con tumores intracraneales EGFRvIII positivos se administran fraccionado de todo el cerebro de la irradiación de rayos X y el tratamiento sistémico TMZ a dosis comparables a SOC clínica. Las células T CAR se entregan por vía intravenosa a los anfitriones lymphodepleted.

El siguiente procedimiento se describe en siete fases separadas: (1) La administración de temozolomida a (3) Transfección Ratones portadores de tumores, (2) la irradiación de todo el cerebro de ratones portadores de tumores,, (4) La esplenectomía y células T Preparación, (5 ) Transducción, (6) Cultura de células T CAR y cosecha, y (7) la administración de células T CAR a ratones portadores de tumores. Estas fases consisten en varias etapas que abarcan 6-7 días y se realizan simultáneamente.

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Protocol

Este protocolo se basa en un diseño experimental donde 10 los ratones se tratan con 10 7 CAR células T cada uno. Esto significa que se necesitarán 10 8 células CAR T; el rendimiento debe ser sobrestimada por 5 x 10 7 -1 x 10 8 a la cuenta de la pérdida de viabilidad. El siguiente protocolo se escala para generar aproximadamente 200 x 10 6 células. Las células se administran por vía intravenosa a la hembra C57BL / 6 ratones con 9 días tumores intracraneales EGFRvIII positivos singénicos establecidos, desarrollado a partir de los astrocitoma KR158B o líneas celulares de melanoma B16 existentes. Concomitantemente con CAR generación de células T, los ratones portadores de tumores se administran dosis clínicamente relevantes de TMZ lymphodepletive (60 mg / kg) y WBI (16,5 Gy).

Los ratones fueron mantenidos y criados en condiciones libres de patógenos en Duke University Medical Center (DUMC). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por la Institución Universidad de Dukeal Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC).

1. Administración de temozolomida a ratones portadores de tumores

Días 0 a 4:

  1. Calcular el número total de ratones que será inyectada y multiplicar este por 0,5 para determinar el volumen de solución TMZ sea necesario (por ejemplo, 30 ratones x 0,5 ml = 15 ml TMZ) y añadir 1,5 ml a este volumen para dar cuenta de desbordamiento (16,5 ml TMZ ).
  2. Multiplique este volumen total de 3 mg / ml para determinar el peso de liofilizado TMZ necesario (por ejemplo, 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Pesar esto en un Erlenmeyer de 50 ml.
    PRECAUCIÓN: TMZ es tóxico por inhalación, ingestión y contacto con los ojos, la piel y las membranas mucosas. Consulte con la seguridad de la institución en el trabajo y / o la salud del medio ambiente y el departamento de salud para obtener recomendaciones sobre la reducción de riesgo de exposición.
  3. Multiplique el volumen total de 0,15 para determinar el volumen de dimetilsulfóxido (DMSO) necesario (por ejemplo, 16,5 x0,15 = 2,475 ml de DMSO). Filtrar esterilizar este volumen de DMSO (más un adicional de 2 ml para dar cuenta de desbordamiento) a través de un filtro de 0,2 micras en un tubo estéril. Añadir 2,475 ml de DMSO estéril al polvo TMZ.
  4. Coloque la solución TMZ / DMSO en un vaso de agua sobre una placa caliente a 65 ° C durante 10-15 minutos. Una vez TMZ se haya disuelto completamente, la solución debería ser de color amarillo pálido; Si la solución se vuelve de color rosa, a continuación, la TMZ se degrada, y una nueva solución debe ser preparada con un montón fresco de TMZ.
  5. Calcular el volumen apropiado de solución salina estéril necesaria multiplicando 0,85 por el volumen total (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml de solución salina). Añadir 15 ml de solución salina estéril a una cónica 50 ml. Mientras TMZ se está disolviendo en el DMSO, solución salina de calor a 65 ° C.
  6. Vortex la solución / DMSO TMZ para asegurar que el polvo de TMZ se haya disuelto completamente y lentamente añadir solución salina calentada a la solución / DMSO TMZ.
  7. Inmediatamente después de la preparación, cargue completamente 15 x 1 ml de tuberculina syringí con solución TMZ para la administración a 4 días establecidos ratones con tumor.
  8. Repita este procedimiento en los días 1 al 4 de un total de cinco administraciones de TMZ.

2. Todo el Cerebro La irradiación de ratones portadores de tumores

Días 2 al 4:

  1. Encienda el irradiador de rayos X y deje que se caliente hasta el voltaje completo. Asegúrese de que el filtro adecuado está en su lugar y la entrada de la tensión y corriente apropiados (Figura 2A).
    NOTA: La dosimetría del irradiador debe determinarse con antelación para determinar los valores de voltaje y diseño de la red (Figura 2A, B) correspondiente.
  2. Calcular la longitud de tiempo que es necesario para dar lugar a 5,5 Gy de irradiación de rayos X. Por ejemplo, si los rayos X se entregan a una velocidad de 2 Gy / min, a continuación, 2,75 min es necesario para entregar un total de 5,5 Gy. Entrada de la duración de tiempo apropiado.
    NOTA: La Tabla 2 proporciona ratón WBI dosifica unaND sus equivalentes clínicos en seres humanos. En el contexto de los gliomas de alto grado, 60 Gy fraccionó WBI (fracciones de 2 Gy, 5 días / semana durante 6 semanas) es el estándar de la atención clínica, y el equivalente murino utilizado aquí es 16,5 Gy (5,5 Gy x 3).
  3. Preparar una solución fresca de ketamina / xilazina para la anestesia sistémica mediante la adición de 2 ml de ketamina y xilazina 1 ml a 17 ml de solución salina de tal manera que la solución final es de 10 mg / ml de ketamina y 1 mg / ml de xilazina.
  4. Pesar los ratones y administrar 10 l de ketamina / xilazina por vía intraperitoneal por gramo de peso corporal de tal manera que los animales reciben una dosis de ketamina a 100 mg / kg y 10 mg / kg de xilazina. Ratones debe estar completamente sedado y visiblemente respirar menos de 2 minutos de la ketamina administración / xilazina.
  5. Para mantener la humedad oftálmica en animales sedados, frote suavemente una pequeña cantidad de lágrimas artificiales pomada en cada ojo.
  6. Coloque los ratones sedados en la parrilla de tal manera que las cabezas se colocan en el área que recibe la más alta de rayos X enintensidad (Figura 2B, C). Cuerpos Escudo de cuello para abajo con el tamaño apropiado de tubos de plomo para bloquear la entrega de rayos X sistémica (Figura 2D).
  7. Coloque los ratones colocados bajo el haz de rayos X de tal manera que el láser que denota el punto focal del haz de rayos X está en la coordenada (0,0) en el diseño de cuadrícula. Comience la entrega de rayos X.
  8. Cuando la entrega de rayos X, retire los animales del irradiador y colóquela sobre una almohadilla térmica. No albergar animales sedados con animales conscientes hasta que los animales han recuperado el conocimiento suficiente para mantener la posición decúbito esternal. Una vez que los animales pueden mantener decúbito esternal, coloque animales conscientes de vuelta en sus jaulas apropiadas.
  9. Repita este procedimiento en los días 3 y 4 de un total de tres dosis fraccionadas de radiación.

3. La transfección

Día -1:

  1. Preparar los medios de comunicación D10 mediante la adición de 50 ml de suero bovino fetal (FBS) a 500 ml de Dulbecco Modified medio Eagle (DMEM).
  2. Preparar los medios de comunicación de células T (TCM) mediante la adición de 5,5 ml de L-glutamina, piruvato de sodio 5,5 ml, 5,5 ml aminoácidos no esenciales, y 5,5 ml penicilina / estreptomicina (pen / strep) a 500 ml de medio RPMI-1640. A continuación, añadir 550 l de 2-mercaptoetanol y 550 l de gentamicina. Por último, añadir 50 ml de FBS.
  3. Harvest in vitro células HEK293T cultivadas y llevar a una concentración de 7,5 x 10 6 células / ml en medio D10.
  4. Placa de 10 ml de medio D10 y añadir 1 ml de suspensión celular HEK293T en cada uno de 16 x 10 cm poli-D-lisina (PDL) placas recubiertas.
  5. Incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2.

Día 0:

  1. Reemplace los medios con 10 ml D10 fresco al menos 30 minutos antes de la transfección de las células.
  2. Determinar la cantidad de plásmido vector, PCL-Eco vector, y el reactivo de transfección liposomal requerido para la transfección multiplicando el número total de placas + 1 (16 + 1 = 17) por 14,1 gplásmido vector (14,1 x 17 = 239,7 g), 9,9 g PCL-Eco vector (9.9 x 17 = 168,3 g), y 60 l de reactivo de transfección liposomal (60 x 17 = 1020 l). Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de la preparación de soluciones.
  3. Etiquetar dos tubos A y B. En el tubo A, añadir 239,7 g plásmido vector y 168,3 g PCL-Eco vector a (1,5 x 17) ml de suero reducido medio de Eagle modificado (RS-MEM). En el tubo B, añadir 1.020 l de reactivo de transfección liposomal a (1,5 x 17) ml RS-MEM.
  4. Incubar A y B por separado durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Mezclar A y B juntos suavemente (vórtex durante 1-2 seg o invertir varias veces) y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente para formar lípido / complejo de ADN.
  6. Añadir lípido / ADN gota complejo gota a células HEK293T en placa de 10 cm.
  7. Se incuba a 37 ° C durante 6-8 horas o durante la noche (no exceda de 24 horas).
  8. Después de 6-8 horas de incubación, reemplace medio con 12 ml de TCM fresco para la producción viral. Este medio plateadose utilizará en el Día 2 como sobrenadante viral para la transducción de células T.

4. La esplenectomía y T Preparación de la célula

Día 0:

  1. Verter 10 ml de TCM en un cónico de 50 ml y el lugar en el hielo para la recolección de bazo.
  2. Sacrificar el número apropiado de animales por asfixia de CO 2 y la decapitación secundario: Coloque los animales en una jaula recibir CO 2 a una velocidad de flujo de 10 a 30% jaula volumen / minuto, según las directrices de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (no más de 5 animales pueden ser sacrificado al mismo tiempo) hasta que termina la respiración y durante dos minutos después. Retire los animales de la cámara de CO 2 y decapitar.
    NOTA: Una bazo de un 6-12 semanas de edad hembra C57BL / 6 mouse producirá aproximadamente 4,5-5 x 10 7 esplenocitos. Aquí, 4 bazos se cosecharán durante aproximadamente 200 x 10 6 células.
  3. Coloque el ratón de modo que su lado derecho quede hacia arriba, yrocíe con etanol al 70%. Con las pinzas, tomar un pliegue delgado de piel debajo de la caja torácica izquierda y cortar una ligera incisión con las tijeras. Pele la piel, tomar cuidadosamente un pliegue delgado del peritoneo con una pinza y se corta una pequeña cavidad.
  4. El bazo es un órgano pequeño alargado de color rojo, y oscuro que se parece a un grano de aplanado; delicadamente agarrar el bazo con las pinzas y especial cortando el tejido conectivo circundante. Coloca los bazos extirpados en la cónica que contiene 10 ml de TCM en el hielo.
  5. Verter bazos más de un 70 micras filtro de células de malla y desagregar por maceración con el extremo romo de la parte interior de una jeringa de 5 ml para generar una suspensión de una sola célula. Un máximo de dos bazos debe desglosarse por colador de malla.
  6. Use un pequeño volumen de TCM para lavar cuidadosamente el filtro siguiente desagregación, a percibir los esplenocitos restantes. Piscina todo bazos desglosados ​​en una suspensión de una sola célula. Aumentar el volumen final a 50 ml con TCM para un lavado und girar a 300 xg durante 10 min.
  7. Preparar una solución de tampón de lisis 1x mediante la adición de 5 ml de 10x tampón de lisis a 45 ml de agua estéril. Para eliminar las células rojas de la sangre, pellet se resuspende en 5 ml de 1x tampón de lisis por bazo en un Erlenmeyer de 50 ml, mezclando bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Si superior a 5 bazos, utilice un tubo de centrífuga de 250 ml. Coloque cónico o tubo de centrífuga en un baño de 37 ° C el agua durante 5 min.
  8. Retire la reacción de lisis del baño de agua y añadir TCM en una relación 1: 1 con tampón de lisis para neutralizar la reacción. Lavar centrifugando a 300 xg durante 10 min.
  9. Aspirar el sobrenadante y pellet totalmente resuspender en TCM (2 ml / bazo, 8 ml total de 4 bazos) pipeteando arriba y abajo.
  10. Contar las células mediante la adición de 10 l de suspensión celular a 190 l de azul de tripano (1:20 dilución). Multiplicar el número obtenido en uno de los cuatro cuadrados reticulados por 20 x 10 4 x volumen total (8 ml) para obtener el número total de células (por ejemplo, células 125 x 20 x 10 4 6 esplenocitos).
  11. Diluir las células a una concentración de 2 x 10 6 células / ml en TCM, suplementado con 2 mg / ml de concanavalina A (ConA) y 50 UI / ml recombinante humana interleucina-2 (rhIL-2). Por lo tanto, para 200 x 10 6 esplenocitos, añadir 92 ml de medio a 8 ml células, 200 mg ConA y 5.000 UI rhIL-2.
  12. Añadir 2 ml de células a cada pocillo de placas tratadas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, de tal manera que 4 x 10 6 células están en cada pocillo (por ejemplo, 100 ml de células requerirán aproximadamente 4 placas).
  13. Incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2.

5. Transducción

Día 1:

  1. Calcular el número de cultura no tejido tratado placas de 24 pocillos necesarios para la transducción de multiplicar el número de bazos cosechados por 2 (se necesitan 8 platos para 4 bazos).
  2. A continuación, calcular el volumen requerido de fragmento de fibronectina humana recombinante solución (RHFF)necesaria para placas capa multiplicando (número total de pozos + 3) x 0,5 ml (8 placas x 24 pozos = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
  3. Preparar 97,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene RHFF a una concentración de 25 g / ml multiplicando el volumen total por 25 g (97,5 x 25 = 2437,5 g). Añadir esta cantidad de RHFF a 97,5 ml de PBS.
  4. Escudo cultura no tejido tratado placas de 24 pocillos añadiendo 0,5 ml de solución de PBS / RHFF por pocillo.
  5. Incubar toda la noche a 4 ° C.

Día 2:

  1. Volcado de solución de PBS / RHFF de cultura no tejido tratado placas de 24 pocillos.
  2. Añadir 1 ml / pocillo de albúmina de suero bovino al 2% (BSA) en PBS y se incuba a temperatura ambiente durante 30 min.
  3. Retire BSA por volcar firmemente plato. Lave añadiendo 2 ml de PBS.
  4. Recoger el líquido sobrenadante viral mediante la transferencia de los medios de comunicación de cada placa PDL HEK293T en un tubo de 250 ml de centrífuga y centrifugar 10 min a 500 x g.
  5. Transferir cuidadosamente su viralpernatant en un tubo de centrífuga de 250 ml fresca, asegurándose de no perturbar el sedimento de células que puedan haber formado.
  6. Añadir TCM fresco al sobrenadante viral tal que el volumen final es de 3 ml más de la cantidad necesaria para pocillos recubiertos con RHFF. Por ejemplo, para 192 pocillos recubiertos con RHFF, llevar el volumen de sobrenadante viral a 192 + 3 ml = 195 ml.
  7. Eliminar esplenocitos cultivados de la incubadora y resuspender pipeteando suavemente arriba y abajo 2 - 3 veces en cada pocillo. Pasar a un Erlenmeyer de 250 ml. Si se utiliza una pipeta multicanal, utilizando un depósito estéril antes de la transferencia ayudará a agilizar este paso. Count como se describe anteriormente y centrifugado a 300 xg durante 10 min.
  8. Añadir rhIL-2 de sobrenadante viral a una concentración de 50 UI / ml. Por ejemplo, añadir 50 x 195 = 9750 UI rhIL-2 a 195 ml de sobrenadante viral.
  9. Resuspender esplenocitos en sobrenadante viral a 1 x 10 6 células / ml
  10. Añadir 1 ml / pocillo de suspensión de esplenocitos a placas de 24 pocillos recubiertas con RHFF.
  11. Centrifugado durante 90 minutos de acuerdo a los siguientes valores: 770 × g, aceleración = 4, freno / deceleración = 0, 32 ° C.
  12. Preparar una solución de TCM con 50 UI / ml de rhIL-2. Por ejemplo, preparar una solución de 200 TCM mediante la adición de 10.000 IU rhIL-2. Añadir 1 ml de rhIL-2 / TCM a cada pocillo después de la centrifugación.
  13. Cultura durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2.

6. CAR células T cultura y la Cosecha

Días 3 y 4:

  1. Si las células T a alcanzar> 80% de confluencia, las células se pueden dividir (generalmente, al día 3 o el día 4). Para dividir celdas, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo en cada pocillo 2-3 veces, y pasar 1 ml de cada pocillo en nuevos pozos de una placa de 24 pocillos frescos de cultivo de tejidos tratados. A continuación, añadir 1 ml de TCM fresco con 50 UI / ml de IL-2 a cada pocillo de tal manera que el volumen final es de 2 ml en todos los pocillos.
  2. Si las células no llegan a> 80% de confluencia, realizar un cambio de medio de comunicación por pipeteando lentamente fuera de 1 ml de medios de comunicación desde la parte superior de cada pocillo. Evite disturbing células asentadas en la parte inferior, mientras que la eliminación de los medios de comunicación. Añadir 1 ml de TCM fresco que contiene 50 IU / ml de rhIL-2.

Día 5:

  1. Resuspender las células T CAR pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 3 veces en cada pozo y la transferencia a un tubo de centrífuga de 250 ml. Girar las células a 300 xg durante 10 min.
  2. Completamente sobrenadante aspirado sin molestar a pellet. Lavar una vez con PBS, contar las células como se describió anteriormente, y se lava con PBS una segunda vez. Un rendimiento celular CAR T típica es de aproximadamente 1 x 10 6 células por pocillo (8 placas células x 24 pozos = 192 x 10 6 CAR T).
  3. Resuspender las células en PBS a una concentración de 5 x 10 7 / ml para una inyección de 1 x 10 7 en un volumen de 200 g (por ejemplo, para 192 x 10 6 células T CAR, resuspender lavaron sedimento en 3,84 ml PBS).

7. CAR Administración de células T a ratones portadores de tumores

Día 5:

  1. Transpocélulas rt sobre hielo para animalario para inyección intravenosa. Cargar 500-1.000 l en jeringa de insulina con 27-31 G aguja, lo que garantiza que todas las burbujas son expulsadas.
  2. Coge un ratón en la base de la cola y colocar en la traba de tubo.
  3. Tirar de la cola tensa con la vena hacia arriba, y se deslizan la aguja aproximadamente 1-2 mm debajo de la piel en la vena mediante la inserción paralela a la vena de la cola. Lentamente expulsar a 200 l en la vena. Si la aguja está correctamente insertado en la vena, el volumen fluirá fácilmente en; de lo contrario habrá resistencia y necesitarán la aguja para ser removido de la cola y se vuelven a insertar correctamente.

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Representative Results

Las células T CAR son generados por la transducción con el vector retroviral EGFRvIII CAR 11. Este vector, MSGV1, se desarrolló a partir del vector SFGtcLuc_ITE4 35, que contiene el virus de células madre murinas (MSCV) repeticiones terminales largas, la extendida región gag y sitio de empalme sobre (donador de empalme, sd, y aceptor de empalme, sa), y viral señal de empaquetamiento (ψ). El CAR EGFRvIII que contiene el fragmento humano anti-EGFRvIII de una sola cadena variable (scFv) 139, en tándem con CD8TM murino, CD28, el 4-1BB, y CD3 regiones intracelulares, se clonó en el vector retroviral aguas abajo del sitio NcoI (Figura 3) .

Después de la transducción, las células T CAR se puede cuantificar y fenotipados por citometría de flujo. Células EGFRvIII CAR T pueden ser visualizados con un panel de 2 colores compuesta por un estreptavidina-ficoeritrina (SA / PE) conjugado biotynlated multímero EGFRvIII derivados y anti-CD3 FITC. El uso de la cultura y de transducción de protocols describen aquí, se observa rutinariamente expresión CAR entre 55-70% de esplenocitos murinos (Figura 4a) 11. Alternativamente, los coches también se pueden teñir para la expresión utilizando cabra-anti-humano F (ab ') 2-anticuerpos secundarios biotina primaria y SA / PE que se ha descrito previamente 36. CAR células T pueden ser fenotipados aún más por la adición de otros anticuerpos marcados con fluorescencia al panel CAR de dos colores. Por ejemplo, la tinción de CD8 y CD4 muestra que el 70% de los coches transducidas son células T CD8 +, mientras que el 20% son células T CD4 + (Figura 4B). Células T CAR con este perfil de expresión se ha demostrado que el tráfico fácilmente al cerebro y el tratamiento de tumores intracraneales.

Tabla 1:. Temozolomida dosis basado en el peso de los animales dosis temozolomida se calcularon sobre la base de una dosis total de 60 mg / kg.

El peso corporal Volumen
25 g 0,50 ml
0,48 ml
23 g 0,46 ml
22 g 0,44 ml
21 g 0,42 ml
20 g 0,40 ml
19 g 0,38 ml
18 g 0,36 ml
17 g 0,34 ml
16 g 0,32 ml
15 g 0,30 ml
14 g 0,28 ml
13 g 0,26 ml
12 g 0,24 ml
11 g 0,22 ml
D d # Fracciones CAMA SOC
16.5 5.5 3 62 GBM
14 7 2 63 GBM
20 4 5 60 GBM
12 6 2 48 LGA
16 4 4 48 LGA
21 3 7 52.5 LGA
12 3 4 30 Met
16 2 8 32 Met

Tabla 2:. Dosis de radiación biológicamente equivalentes clínicamente relevantes dosis de radiación se calcularon según CAMA = D [1 + d / (α / β)], donde D = dosis total, d = fraccionado dosis, y α / β = 2). La dosis total administrada como WBI al host murino se muestra en términos de XXdosis fraccionadas e entregados y la dosis humana que se modela por aquellas fracciones de dosis. Para fines modelo, también se muestra el tumor maligno para los que la cama es estándar de cuidado.

Figura 1
Figura 1:. Línea de tiempo para el tratamiento de los ratones portadores de tumor y concurrente ex vivo la generación de coche estándar de la quimioterapia y la irradiación de atención de todo el cerebro comienza 4 días después de la implantación del tumor (A). Durante este intervalo de tiempo, las células T CAR se generan y se cultivan ex vivo (B) y se entregan después de un ciclo completo de anfitrión acondicionado.

Figura 2
Figura 2: Diseño y configuración de administración de la radiación.Los rayos X son entregados de acuerdo a una dosimetría de 320 kV y 10 mA, con una duración variable elegida de acuerdo con la dosis deseada (A). El campo focal de la radiación de rayos X es una estrecha zona de 2,5 cm. Animales sedados se organizan de acuerdo a la red (B) de manera que sus cabezas se encuentran en la zona de mayor intensidad de rayos X; (C) muestra la vista desde un extremo del haz de rayos X. Aproximadamente 4 animales pueden estar bajo el irradiador durante un curso de administración de rayos X de acuerdo con esta disposición de la rejilla (B, D). Tubería de plomo se utiliza para proteger el cuerpo, dejando sólo sus cabezas expuestas durante WBI (D).

Figura 3
Figura 3: El vector retroviral SFGtcLuc_ITE4 modificado, MSGV1, se utilizó para la transducción y la generación de células T El CAR.Inserto CAR EGFRvIII que contiene el fragmento humano anti-EGFRvIII cadena única variable (scFv) 139, en tándem con CD8TM murino, CD28, el 4-1BB, y CD3 regiones intracelulares, está flanqueado por virus murino de células madre (MSCV) repeticiones terminales largas (LTR ). Aguas arriba de la inserción de coches son la región gag extendida y sitio de empalme sobre (empalme de donantes, sd, y aceptor de empalme, sa), y la señal de empaquetamiento viral (ψ).

Figura 4
Figura 4: coches de EGFRvIII se expresan en la superficie de las células T 48 horas después de la transducción, las células T se tiñeron para la expresión en superficie de las CAR EGFRvIII utilizando un multímero compuesto de LEEKKGNYVVTDHC-K (biotina) -NH 2 / estreptavidina-PE.. Células T no transducidas del mismo donante también se tiñeron como un control negativo. Los datos muestran el número de células T CAR (eje y) son positivos para stacaniza por el multímero conjugado con PE EGFRvIII (eje x), cerrada en células CD3 + como un marcador de células T, donde se encontró la expresión para ser 60,9% (A). Células T CAR teñidas para CD4-PerCP-Cy5.5 y CD8-APC muestran un perfil de expresión de 21,7% y 70,9%, respectivamente (B).

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Discussion

La línea de tiempo de tratamiento descrito aquí fue diseñado para modelar estándar clínico de atención y potenciar sus efectos para la terapia adoptiva CAR. CAR dosis de células T, los regímenes de TMZ, y la administración de la radioterapia pueden ser modificados para mejorar la actividad in vivo de células T, lymphodepletion, y el asesinato del tumor en. Regímenes de TMZ se puede aumentar para producir mielosupresión de host y una mayor expansión de las células transferidas adoptivamente 30. Además, los efectos lymphodepletive de TMZ se puede recapitulan por dosis baja (4-6 Gy) de una sola fracción de irradiación corporal total (TBI), eludiendo así las propiedades tumoricidas de SOC. El régimen de radiación aplicada aquí imita una dosis biológicamente equivalente de 60 Gy; sin embargo, el número de fracciones y dosis fraccionadas puede ser sintonizado para imitar otras dosis clínicas (Tabla 2). Es importante destacar que, nuestro modelo de SOC utiliza dosis biológicamente equivalentes de WBI, en lugar de radiación de haz externo entregado focalmente al tumor y margins, como se utiliza a menudo en la clínica, y por lo tanto pueden dar lugar a una dosis menor de radiación administrada al tumor y un aumento del riesgo de toxicidad a cerebro de ratón sano. A pesar de estas limitaciones, sin embargo, el IBM es una técnica aceptada para el modelado de radioterapia clínica en un entorno preclínico.

CAR dosis de células T pueden ser aumentadas o disminuidas para observar los efectos de dosis en matar tumor y la supervivencia global 11. Además, el momento del tratamiento y la vía de administración puede ser modificado para ver diferencias en la eficacia. Por ejemplo, las células T CAR pueden ser entregados por vía intracraneal para asegurar la actividad en el sitio del tumor. El rendimiento de las células T CAR-positiva puede variar dependiendo de la eficacia de la transducción. Una forma de garantizar un transducción exitosa es mediante la realización de una proteína fluorescente (GFP) -control verde durante todo el procedimiento. Para ello, 1 HEK293T placa de PDL 10 cm puede ser asignado para la transfección de GFP y la transducción de un solo pocillo de células T para Pedregaln para GFP en los días 3-5. Un factor crítico en la eficacia de transducción es la medida de la activación de células T y la proliferación tras la adición de sobrenadante viral. Observamos una discrepancia importante entre nuestro método de activación de las células T, que se logra mediante la adición de ConA al medio de cultivo, y el utilizado en el ámbito clínico, logrado por los anticuerpos monoclonales agonistas de CD3 y CD28. Aunque este último se utiliza rutinariamente para generar retrovirales transducen células T CAR pacientes y también ha tenido éxito en la transducción de las células T murinos, se determinó previamente que ConA estimulación llevó a transducciones mejores y más consistentes 37. También hemos observado que CAR T rendimiento global célula puede variar en función de cuando se realiza paso 5.18. Si experimenta pobre rendimiento de células T CAR, se recomienda realizar el paso 5.18 inmediatamente después del paso 5.17 en lugar de esperar a que la incubación de 5-6 horas. Aunque esto puede afectar la eficiencia de transducción, no hemos observado dif significativaconferencias en la expresión de superficie CAR en nuestros estudios.

Después de la transducción, las células T CAR se puede cuantificar y fenotipados por citometría de flujo; manchamos nuestras células EGFRvIII CAR T con un panel de 2 colores compuesta por un estreptavidina-ficoeritrina (SA / PE) conjugado biotynlated multímero EGFRvIII derivados y anti-CD3. Alternativamente, los coches también se pueden teñir para la expresión utilizando cabra-anti-humano F (ab ') 2-anticuerpos secundarios biotina primaria y SA / PE que se ha descrito previamente 36. Rutinariamente Observamos expresión CAR entre 55-70% de esplenocitos murinos 11. Hemos demostrado anteriormente que la entrega de las células T con este perfil de expresión CAR puede tráfico fácilmente al cerebro y el tratamiento de tumores. Linfopenia inducida por TBI TMZ- o mejora la expansión clonal de las células transferidas de forma adoptiva, el aumento de la frecuencia de células CAR-positivos y su respuesta global antitumoral. Células CAR T pueden ser rastreados en vivo tiñendo de sangre periférica con la unatetrámero ppropriate; esta es una técnica útil para la comprensión de CAR T supervivencia de las células con el tiempo y los efectos de host-acondicionado en función de las células T CAR y persistencia. Alternativamente, si no tetrámero está disponible para el receptor de antígeno, un indicador fluorescente puede ser incluido en el constructo CAR vector, o células T CAR puede ser etiquetado ex vivo con carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) antes de la administración para el seguimiento in vivo.

Dependiendo del modelo de tumor, la plataforma de la inmunoterapia, y el régimen de SOC, SOC clínica administrada junto con la terapia adoptiva o vacunas puede conducir a efectos tóxicos. TMZ es un agente alquilante de ADN que conduce a la muerte celular no específica, y la intensificación de dosis puede resultar en la pérdida de peso y la morbilidad en huéspedes murinos. Las dosis altas y fracciones prolongados de WBI pueden resultar en hidrocefalia. Además, los efectos inflamatorios de la vacuna contra fuertes y / o respuestas de células T adoptiva transferidos pueden conducir a la morbilidad portormentas de citoquinas tóxicas. También es importante tener en cuenta los efectos de la anestesia sistémica en animales mórbidos. Si TMZ y WBI conducen a toxicidades significativas, a continuación, la ketamina / xilazina dosis se pueden disminuir en un 20-25% para reducir el riesgo de mortalidad, como animales sólo tienen que ser sedado e inmovilizado durante 10 min para la administración de pequeñas dosis de radiación (2- 8 Gy).

Host acondicionado es fundamental para todas las plataformas de inmunoterapia que incluyen la transferencia adoptiva. Como pruebas de inmunoterapia a menudo son evaluados en el contexto de SOC, la evaluación preclínica de inmunoterapias debe hacerse dentro de este ajuste para recapitular el escenario clínico. Presentamos aquí un ejemplo de aprovechamiento de la lymphodepletive y efectos tumoricidas de SOC con terapia adoptiva utilizando células T CAR. Este régimen es una herramienta poderosa que se puede aplicar a otras plataformas de inmunoterapia para evaluar los efectos de SOC combinado.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector Imgenex 10045P Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A Sigma Aldrich C2010 Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin ClonTech/Takara T100B Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate Life technologies 11995-065 HEK293 culture media
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life technologies 11058-021 Transfection media
200 mM L-Glutamine Life technologies 25030-081 T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate Life technologies 11360-070 T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life technologies 11140-050 T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol Life technologies 21985-023 Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life technologies 15140-122 T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml) Life technologies 15750-060 T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum Gemini Bio Products 100-500 Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade Gemini Bio Products 700-100P Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate) BD Biosciences 555899 Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers Corning 352350 Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine Corning 356469 Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Name Company Catalog Number Comments
Temozolomide Best Pharmatech N/A Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide Sigma Life Sciences D2650 Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline Hospira IM 0132 (5/04) Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl Henry Schein Animal Health 11695-0701-1 Ketamine solution
AnaSed Lloyd Inc N/A Xylazine sterile solution 100 mg/ml

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