В Utero Intra-сердечная томатно-лектин инъекций по эмбрионов мыши, чтобы измерить почек кровотока

1Rangos Research Center, Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 2Division of Nephrology, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rymer, C. C., Sims-Lucas, S. In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow. J. Vis. Exp. (96), e52398, doi:10.3791/52398 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Формирование и перфузии развития почечной кровеносные сосуды (кроме клубочков) значительно изучено недостаточно. Как сосудистой развивается с помощью ангиогенеза (который ответвляется крупных сосудов) и васкулогенез (De Novo образования сосудов), методы картирования перфузии, такие как смолы слепков, в естественных условиях ультразвуковой визуализации и микро-рассечение были ограничены в демонстрации интимных отношений между эти два процесса и развития почечной структуры в зародыше. Здесь мы опишем процедуру внутриутробному внутри сердца под ультразвуковым контролем FITC-меченных томатов лектин микроинъекций на эмбрионах мыши, чтобы измерить онтогенез почечной перфузии. Томатный лектин (TL) заливают по всему эмбриону и почек урожая. Ткани совместно окрашивали для различных структур почек, включая: нефрона предшественников, нефрона структур, мочеточника эпителия и сосудов. Начиная с E13.5 крупных сосудов калибра перфузировали, однако периферическойсосуды оставались unperfused. По E15.5 и E17.5, небольшие периферические сосуды, а также клубочки начал становиться перфузии. Это экспериментальная методика имеет решающее значение для изучения роли сосудистой и кровотока во время эмбрионального развития.

Introduction

Во время эмбрионального развития два дискретные, но одновременно, сосудистые процессы происходят: ангиогенез, процесс, при котором сосуд растет от основной предварительно существующего судна, и васкулогенезе, который заново образование сосудов из жилых эндотелиальных клеток-предшественников 1,2. Соответственно, первое является синонимом кровотока, а второй, как полагают, в значительной степени имеют место в отсутствие него.

Одновременно с образованием кровеносных сосудов, циклический и динамичный процесс синтеза почек клеток-предшественников, пролиферации и дифференцировки начинает разворачиваться на день эмбрионального 9,5 (E9.5). На данный момент мочеточника бутон (UB) вторгается дорсально в окружающую метанефрической мезенхиму (мм), и продолжается до рождения 3. Повторное разветвление UB в быстро конденсации метанефрической крышки мезенхимы начинается формирование функциональных подразделений почек, нефрона. С каждым новым поколением УБ и НефРон, старшие поколения смещаются во внутренние коркового и мозгового регионах, где они затем подвергаются дальнейшему созреванию и дифференциации в первую очередь сосудисто-плотных средах. Как видно из Дресслера и др., 3, этот процесс эмбрионального осаждают индуктивной передачи сигналов, таких как перекрестные помехи между UB и ММ, и множество внеклеточных факторов 3-6. Два недавно исследовали внеклеточные факторы в рамках развивающегося поджелудочной железы и почки включают напряжение кислорода и кровоснабжение 7,8. Последнее будет обсуждаться более подробно ниже со отношению к развитию почек.

Для того, чтобы подвергать индуктивный роль, что поток крови потенциально играют в дифференциации клеток-предшественников нефрона, а также в других процессах органогенеза, точных и точных методов эмбрионального отображения кровотока является обязательным условием.

Альтернативные методы замера кровоток включают рецепт улtrasound изображений и смолы бросает 9,10. Окончательно, эти режимы, как было показано, чтобы быть по своей природе не хватает в их способности одновременно обнародует временные и пространственные сопоставления между кровотоком и дифференцировку стволовых клеток. Смола отливок, например, обеспечить действительное модель сосуда рисунка в тканях взрослого организма, однако в незрелых сосудов, таких как эмбриональные с моментами времени, сосуды сильно развиты и вытекающей. Таким образом, смола бросает не проведет в крошечных, часто пористый, сосудов.

Для этих очевидных препятствий, в частности, мы решили включить УЗИ наведением в естественных условиях внутри сердца эмбриональных помидор лектина (TL) микроинъекций в наших исследованиях развития почек. В этой процедуре мы используем ультразвуковой зонд синхронно направлять установленный микропипетки иглы, наполненный 2,5 мкл TL раствора в левый желудочек из мышиных эмбрионов в точках E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 и время. E170,5 является последняя возраст развитием, иглы не достаточно сильны, чтобы проникнуть в более развитый эмбрион.

Преимущества этого метода микроинъекции в изобилии. Ультразвуковая руководствуясь микроинъекции позволяет точно позиционировать иглу для инъекций в течение эмбрионального левого желудочка, пассивный и контролируемое изгнание раствора в бьющееся сердце животного, минимальным ущербом для сердца и окружающих тканей, и во избежание внезапной сердечной недостаточности и смерти эмбрион до полного тела перфузии. С использованием FITC-меченого TL, любой перфузии сосудистой будет поддерживать маркер вдоль ее эндотелиальной апикальной мембране. В сочетании с иммуногистохимии, используя PECAM (CD31, тромбоцитов эндотелия молекулы клеточной адгезии) и различные другие сосудистые маркеры, мы можем четко различать перфузируемые и ООН-перфузии сосудов, а также охарактеризовать любые аберрантные окрашивание окружающих тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Питтсбургского университета Институциональные животных уходу и использованию комитета утвердил все эксперименты.

1. Подготовка Ультразвуковая микроинъекции инструменты и эмбрионов

  1. Настройка этап, горы, и зонд (рисунок 1), а также хирургические инструменты (Рисунок 2). Место фосфатный буферный раствор (PBS) раствор (рН 7,4) в C потепления бане 37 °. Заполните микроинъекции иглы полностью с минеральным маслом, с использованием 1 мл шприц, присоединенный к второй гибкой иглы 25 G, через его основание.
  2. Fix иглу на вращение крепление руку, и пустой игла раствором минеральной нефти. Залить 2,5 мкл TL решения. Убедитесь, что пузырьки воздуха не присутствуют в инъекционной иглы. Поверните иглу руку по направлению к стене, подальше от сцены.
  3. Обезболить беременной матери в анестезии камеры посредством непрерывной инфузии изофлюрана. Когда мать потерял сознание, перенести наркоз, нос трубки, расположенной на сaudal сторона сцены, и место матери в положении лежа на спине с рыла носом трубы, чтобы продолжение полностью под наркозом государства.
  4. Ленточные конечности в 45 °, или с руками и ногами отдохнувшим и позиционируется возвышаться ЭКГ вкладки / монитор температуры. Важно, что беременной плотины постоянно контролироваться, чтобы гарантировать, что анестезии является достаточным и что мазь, приложенного к глазам, чтобы уменьшить сушки.
  5. Применить Удаление волос по всей нижней части живота матери, нежно протрите сухим ватным тампоном, а затем снова с 70% этанола, насыщенных ватные тампоны, чтобы удалить излишки продукта и волосы. Убедитесь, чтобы очистить брюшную кожу от всех волос на месте разреза (рис 3).
  6. Выполните лапаротомии на беременной матери Использование тонких хирургических щипцов и ножниц. Будьте осторожны, чтобы избежать сокращения каких-либо серьезных судов или внутренних органов. Сделайте первый, прямой разрез эпидермиса 1,5-2 см выше влагалища и продолжают резать к ребрами для approximatЭли 2-3 см. Expose подкожной мембрану, найдите белой линии ("Белая линия") (Рисунок 3), и параллельно начальной разрез вдоль той же длины, чтобы разоблачить внутренний внутренних органов и матки мешочки.

2. Добыча эмбрионов

  1. Используйте 6-дюймовые ватным аппликаторы для маневра мать и эмбрионов. Аккуратно надавите (не заставляйте) на коже с аппликатором, чтобы манипулировать первый зародыш из отверстия разреза. После извлечения первого эмбриона мешочка, медленно и осторожно потяните оставшуюся часть рога матки через и на внешности матери. Избегайте потянув кишечника или других органах, через разрез на данном этапе.
  2. Количественная эмбрионов и осторожно положите левый рог матки обратно в матери. Тогда начнет размещение правильный рог матки обратно в матери, начиная с эмбриона мешочек, наиболее удаленном от влагалища на рога и двигаться вниз. Продолжайте это до тех пор только два эмбриона остаются открытыми (Fiфигура 4). Наконец, эмбрионы позиции в столбце выше и параллельно линии разреза, будучи осведомленным не отрезать приток матки.
  3. Поместите глиняных блоков и положение между руками и туловищем, а также ноги и хвост. Убедитесь, что глинистые поверхности примерно на одном уровне с лапаротомии разрез. Смочите Фенестрированные чашку Петри с 37 ° C PBS.
  4. Возьмите, проходящих щипцы с правой стороны, и Фенестрированные чашки Петри с левой стороны (фенестрация параллельно эмбрионов) и принести закрытую щипцы ~ 5 см через оконных, из верхней части чашки Петри. Открытые щипцы полностью, не разрывая светопрозрачных сетку.
  5. Маневр руки над эмбрионами и сосредоточиться взгляд на двух эмбрионов мешочков. Без (или слегка) касание мешочки с оконных сетки или пинцетом, сдвиньте их через щель и установить чашку Петри на животе матери. С щипцы еще расширен, манипулировать Фенестрированные сетку, чтобы усадить его на обе стороны, и в основании каждого эмбриона (рис 5
  6. Далее, поместите синий каучук, содержащий стену в чашку Петри, без защемления или ранения эмбрионов (Рисунок 6). Убедитесь, что глиняные блоки прочно балансировки чашку Петри, эмбрион, резино-содержащие стену. Наконец, заполнить чашку Петри с 37 ° C PBS до эмбрионы полностью погружены (рисунок 6), в то время как контроль на герметичность в фенестрированной сетки.

Процедура 3. Инъекции

  1. Нижняя ступень впрыска с матерью и эмбрионов вниз, используя ручку регулировки Z-уровень (Рисунок 1), а затем поверните инъекционной иглы и установите руку и выстраиваются непосредственно с ультразвукового зонда, с иглой ½ см слева и под зонда (рис 7) , Нажмите игольчатые руку (не иглы) 45 ° вдали от зонда. Будьте осторожны, чтобы не ударить кончик иглы с блюдом или ультразвукового зонда.
  2. Поднимите этап инъекций Вернуться к первоначальной высоты, с ультразвуковым рхалат прямо над эмбрионов зонд должен быть слегка погружен в пределах 3-4 мм от эмбриональной ткани. Использовать рентгеновские & Y ступень регулирующего ручки (Рисунок 8) внести изменения в положение эмбриона / мать / Stage систематически местонахождение избиения эмбрионального сердца.
  3. Непосредственно центр ультразвуковой экране наблюдать черную центр целевой маркер обращается (*). Найдите левого желудочка (предпочтительно) или атриум с помощью ручки регулировки этап X и Y (рис 8), а затем поднять или опустить стадию с использованием ручки вращающийся на сцену, чтобы конечное положение впрыска точно над черным центрального маркера на экране ультразвука.
  4. Используйте ручку регулировки этап X, чтобы переместить эмбрион вправо, от экрана ультразвука. Повторно микроинъекции иглу и руки обратно на место, ½ см от 90 ° до ультразвукового зонда (рис 7).
  5. Использование микроинъекции крепления ручек регулировки (рис 9C-G), то положение иглы с наконечником ясно альigned с центральной маркера. Отрегулируйте угол впрыска (с помощью ручки на рисунке 9C и EG), и X, Y, и Z векторы микро-иглы для обеспечения кончик иглы ориентирована в правильном плоскости. Уберите микроинъекции иглу с помощью исключительно на "инъекцию" ручку (рис 9F), стараясь не изменить другие размеры.
  6. Опять же, используя исключительно X тонкой ручкой регулировки этап перемещения эмбриона обратно под зондом, с целью точно на центральной меткой на экране ультразвука. Убедитесь, что левый желудочек теперь точно на том же X, Y, и Z плоскости.
  7. Далее, только с "инъекции" ручку на микроинъекции крепление, медленно проколоть эмбриона с микроинъекции иглы и постепенно довести наконечник в левый желудочек. Вводите полные 2,5 мкл TL раствора в левый желудочек или до пустых звуков предупреждающий сигнал, путем проведения "пустой" и нажав "заполнить" один раз (рис 2А & B). В это времявпрыска наблюдать тень, исходящую от кончика иглы, которая TL ввода в сердечной камеры (рисунок 10). В обратном направлении, быстро убрать микроинъекции иглу вращающийся "инъекции" ручку (рис 9F) на микроинъекции установить, когда инъекция завершена.
  8. Продолжить на следующей эмбриона и повторите эту процедуру для оставшихся эмбрионов, следующих за этим ряд шагов, и, наконец, поставить окончательные эмбрионов обратно в живот плотины. Включите анестезии в камеру коробки и осторожно двигаться сюда мать в течение 15 мин со времени последней инъекции.

4. Сбор эмбрионов и анализ

  1. Жертвоприношение плотину с помощью смещения шейных позвонков. Развернуть лапаротомия разрез с легкостью удалять рога матки от матери. Держите эмбрионов в матки мешка. Поместите эмбрионы в охлажденном PBS.
  2. Проанализируйте эмбрионов из матки мешка (при необходимости собирать ткань для генотипирования) и поместите весь эмбрион яп 4% параформальдегид (PFA) в течение ночи, а затем в 30% сахарозы в одночасье, заморозить в криостат секционирования среду. Затем вырежьте cryosection и поместить его на слайды для иммуногистохимического анализа. Возможно, использовать ткани для целого монтажа путем дегидратации в 100% метанола, после фиксации в 4% PFA.
  3. Для иммуногистохимического анализа поместить криосрезы в PBS, чтобы удалить октября Затем блок секции 10% нормальной сыворотки осла в течение 30 мин. Затем добавить РЕСАМ первичного антитела в разведении 1: 100 в течение ночи при 4 ° С. На следующий день, мыть слайдов в PBT 3 раза по 10 мин каждый и добавить осла против крысу 594 среднее и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень требовательных техника требует оптимизации и координации ультразвука и микроинъекции. Существует очень крутой кривой обучения, связанные с этой технологией и требует 5:56 недель обучил инъекций, прежде чем становится опытным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сосудистые образования предшествует поток в развитии почек

Большинство из эмбриональной ткани (в том числе почки) содержит плотную сосудистую (как unperfused и перфузии), даже на ранних эмбриональных моменты времени. Чтобы лучше калибра и анализа кровотока в развивающихся почек мы использовали метод внутриутробному эмбриональных внутрисердечной микроинъекций. С использованием ультразвука высокого разрешения для выявления эмбриональных сердце в E11.5 через E17.5 и после извлечения и воздействия одного матки мешочка через лапаротомии, мы смогли внедрить 2,5 мкл TL (флуоресцеинизотиоцианат (FITC) -conjugated).

Мы нашли самый большой успех для инъекций E13.5 и E15.5 эмбриональных моменты времени, с вероятностью успеха примерно ~ 80% до 90%, соответственно. Из-за присутствия относительно незрелых сердца у E11.5 и наличием плотного хряща и образованием кости в E17.5, периферийное тия точки сравнительно трудно ввести, с существенно более низкой вероятностью успеха в сравнении с средним эмбриональных моменты времени. Можно ожидать, по крайней мере, ~ 50% и ~ 30% ставки успеха с E11.5 и время E17.5 пунктов соответственно.

СО-маркировки ткани с PECAM (CD31), универсальной эндотелия маркера, мы можем качественно классифицировать люминесцентные сосуды и ткани на три группы: перфузии сосудистой (PECAM положительный и TL положительный), unperfused сосудистой (PECAM положительный), и аномально перфузируемые структуры (TL положительным). Это определенный шаблон окрашивание позволяет пространственно различать между областями перфузии и ООН-перфузии (Рисунок 11).

В E11.5, мы обнаружили, что перфузируемые суда инкапсуляции развивающихся почек в виде ленты, узор, фактически не проникая в орган (рис 12б). По E13.5, крупные сосуды вливают несколько меньше,аксессуары суда окрашивание TL (рис 12С). Окрашивание также может рассматриваться в течение часть мочеточника эпителия, это может быть либо из клубочков, которые уже перфузии или из-за присущей неплотности ранних эмбриональных сосудов. По E15.5 основные сосуды перфузией, однако большое число клубочков также можно было наблюдать проведении TL пятно, предполагая, что значительное фильтрации происходит (рис 12г). Также в это время отмечают ряд более мелких сосудов калибра появляются перфузии, хотя значительная часть внешней нефрогенной зоны, как представляется, лишена кровотока. Наконец, однако, E17.5 большинство почки заливают в сосудистой сети нефрогенной зоны, которая является преимущественно лишена перфузии (менее плотной в РЕСАМ положительных сосудов), таким образом, указывающий на отсутствие ангиогенеза в периферийных областях, кроме. Небольшие суда калибра содержать TL и среднее число перфузии клубочков резко вувеличилась по сравнению с предыдущими временных точках (рис 12е).

Рисунок 1
Рисунок 1. Ультразвукового зонда, хирургический этап, система микроинъекции, топливная система и ЭКГ / температуры монитор базовый набор до.

Фиг.2
Рисунок 2. Необходимо хирургическое оборудование, решения и устройства. (A) ватным аппликаторы. (B) Продление (кольцо) щипцами. (C) Хирургические ножницы. (D) с тупым концом пинцета. (E) тонким пинцетом. (F) Микроинъекция иглы (ORIGIO, # C060609). (H) Раствор для инъекций / Fill контроллер. (I), забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). (J) Минеральное масло (Sigma Aldrich).

Рисунок 3
Рисунок 3. 2 см лапаротомия выполняется на наркоза матери, подвергая подкожный слой (передней брюшной стенки) выше матки. Используя хирургические ножницы и тонких щипцов, подвергают белой линии и сделать разрез параллельно, чтобы сократить эпидермиса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4. 1-2 E15.5 матки мешочки выводится через лапаротомии разрез и экспозиции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большеверсия рисунка.

Рисунок 5
Рисунок 5. Открытые матки мешочки направляется через щель в фенестрированной чашке Петри с использованием проходящих щипцами. Фенестрированные сетки места ожидающий на базе мешочков.

Рисунок 6
Рисунок 6. Голубой содержащий стена находится справа от матки мешочков. Петри не заполнен 37 ° C PBS до эмбрионов и содержащий стенку полностью погружен в воду. Глиняные блоки размещены надежно под чашки Петри / эмбриона между руками и туловищем и ногами и хвостом.

Рисунок 7
Рисунок 7. Система впрыска позиционированием Нед ½ см слева и ниже, и 90 ° к ультразвукового зонда.

Рисунок 8
Рисунок 8. Стадия X и механизмы регулирования Y.

Рисунок 9
Рисунок 9. Пустой / Fill устройство, систему микроинъекции и стадии крепление. Кнопку () Заполните. (B) кнопку Inject. (C) Ручка регулировки угла круговые спицы. (E) Штраф X ручка регулировки. (F) "Injection" ручку. (G) курс X ручка регулировки. (H) Этап поворотный переключатель высоты регулировки.

98fig10.jpg "/>
Рисунок 10. Ультразвуковое изображение E15.5 внутри-сердечной TL микроинъекции. Кончика иглы расположен внутри сердечной камеры, решение TL указывается черной тенью в течение двух палат. Перикард и полости перикарда легко отличить.

Рисунок 11
Рисунок 11. Области между перфузии, unperfusion и аномальным окрашивания различить. Первая панель показывает PECAM пятно. Средняя панель отображает TL пятно над точно так же участка ткани. Мочеточников бутон аберрантно пятнами; основные сосуды заключены белыми пунктирными линиями. Последняя панель является слияние. Белые стрелки показывают утечку сосудов, а серые стрелки показывают переход в сторону судна становится перфузии. Желтые структуры представляют собой полностью перфузии сосудов.OAD / 52398 / 52398fig11large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.

Рисунок 12
Рисунок 12. Эмбрион и почек перфузии онтогенез исследованы. () Всего E11.5 эмбриона перфузии, с очень периферических сосудов внутри головы и хвоста регионах, занимающих TL. (B) перфузируемые суда были замечены вокруг, но не включены в развивающихся почек на E11.5 в виде ленты, узор, есть также довольно большое количество диффузного окрашивания в этой точке. (C) E13.5 почек показывает основные, крупные сосуды калибра перфузируют всей почек (белого и желтого стрелкой), с перфузией отсутствующего в нефрогенного зоны (белый пунктир). (D) E15.5 почек показывает перфузии в течение малого калибра, периферических сосудов (желтые стрелки),в отдельных клубочков (белые стрелки), и снова отсутствием перфузии в периферийной каминной полке почек. (E) E17.5 почек показывает огромный перфузии всей клубочков (белые стрелки) и мелкие сосуды калибра (желтые стрелки). Нефрогенная зона ничем не отличается от остальной части почки в этом увеличении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Микроинъекция анестезия и временные рамки

Что касается анестезии матери, важно, чтобы поток воздуха константу (2-3 л / мин) и при низкой PSI. Поток успокоительное должно быть проведено примерно в 1.75-2 л / мин. Одновременно, сроки, в которых инъекции происходят должны быть тесно мониторинг и контроль над с каждого помета. Для каждого помета процедура инъекции должен находиться под 45 мин. Важность этого срока имеет первостепенное значение для эксперимента, так как каждый эмбрион должен поддерживаться в пределах постоянной, нормальной диапазоне частоты сердечных сокращений, чтобы облегчить контролируемый и неизменный перфузии по всему телу и органа интересов. Мы обнаружили, что удлинение инъекции результатов в сомнительных результатов и колебаний в структуре перфузии между эмбрионов и снижает тарифы успешных инъекций (например, медленно сердечного ритма, сердечная смерть). Наконец, после последней инъекции в помете, очень важночтобы примерно 15 мин до эмбрионы собирают в целях содействия надлежащему, полный перфузии в течение каждого эмбриона.

Процессуальное лечение и уход эмбрионов

Во время извлечения эмбрионов, мы нашли более высокие темпы успеха с помощью инъекций, которые проделанной постоянно посещать для общего здоровья и целостности оболочки матки и эмбрионов во время извлечения эмбрионов. Используя тонкие ватным аппликаторы (насыщенного PBS), чтобы манипулировать и маневрировать матки мешок и мешочки являются обязательными для обеспечения выживания матери и эмбриона в течение всей процедуры. Во-первых, важно обеспечить, чтобы физическая целостность матки и плаценты надлежащим образом. Избегайте кривя в мешочки таким образом, что будет препятствовать притоку крови к эмбрионов или вызвать значительные разрывы в кровеносных сосудов, снабжающих приток крови к плаценте. Это может быть достигнуто путем извлечения Maximuм 1-2 эмбрионов, в то время (если извлечение весь маточный мешок для начального отсчета) и позиционирования аппликатора от крупных кровеносных сосудов у основания плаценты.

Расположение в месте инъекции эмбриональных

Руководящие микроинъекции иглу в нужное место с машиной ультразвука также имеет важное значение для каждой попытки введения. Особое внимание следует уделить обнаружения и центровки левого желудочка на центральный маркер. После этого игла должна быть расположена и по центру точно по центру, а маркер выровнять иглу и место инъекции в тот же X и Y плана. После завершения этого процесса, медленно сделать кончик ближе к месту инъекции иглу и избегать применения чрезмерных нагрузок на перикард и сердца. Это можно сделать, позволяя игла постепенно проходит через ткани слоев, а не заставляя прохождение иглы через них. Во время инъекции, важно также, чтобы лООК за черной тенью, исходящей от кончика иглы (Рисунок 10). Это свидетельствует о TL решения, заполняющего желудочка. Если кончик иглы находится в правильном положении, тень должна постоянно появляются и исчезают, как TL выбрасывается в аорту. Однако, если полость перикарда, кажется, поглощать, это свидетельствует, что игла слишком поторопился с левого желудочка и TL решение заполнения полости перикарда, окружающей сердце. Это распространенная ошибка, что легко исправляется путем перестановки инъекционной иглой на его X и Y плоскости с любыми небольшими изменениями, происходящими с иглой еще в зародыше. Избегать извлечения иглы из эмбриона на этой стадии.

Ультразвуковая ориентироваться в естественных условиях ограничений микроинъекции

По своей сути, УЗИ микроинъекции имеет ряд принципиальных технических ограничений. Прежде всего, объем иглы микроинъекциимощность ограничивает возрастной диапазон инъекций до E17.5 у мыши. 2,5 мкл раствора TL, как было показано в наших исследований, чтобы полностью заливать эмбрионов до E15.5. Тем не менее, только после этого момента времени, TL к объему крови становится ничтожна и разбавляли эффективно пометить периферийных почек эндотелиальные мембраны. Таким образом, уменьшается картина кровотока присутствует в более поздний момент времени инъекции. Кроме того, формирование кости и хряща у эмбрионов создает естественный барьер для кончика иглы, что приводит к удлиненным времени впрыска и частых трещин в головке иглы. Эти ограничения могут быть преодолены путем использования системы новые инъекций больших мощностей прочности иглы и объема.

Альтернативные методы отображения эмбриональные кровотока

На сегодняшний день, альтернативные методы отображения эмбрионального потока крови мышей включать осуществление смолы слепков, окрашивание иммуногистохимии и высокий resolut ионная ультразвуковое исследование. Как смол бросает (с интеграцией передовых методов визуализации) в настоящее время наиболее популярной альтернативой, этот вопрос будет обсуждаться более подробно ниже. Смола отливок позволяют для создания точных трехмерных представлений потока в послеродовой органов. Однако, мало успех был имел с изображения пренатальной почечной ткани вследствие пористой сосудистой крови и ограничений в разрешении. Для сравнения, конъюгированные TL пятна обеспечить сцепление с эндотелиальными мембранные антигены, ведущие к более высокой степени точности. В других случаях, вязкость смолы, которые бросили преждевременно обрезает поступать в клубочки сосудов и мелких капилляров кровати, создавая исследуемого ограничение на высоких увеличениях. При более низких увеличениях, этот метод, очевидно, жизнеспособным на установление структуры потока в отношении развивающихся регионах. С другой стороны, TL позволяет с высокой разрешающей анализ кровотока по отношению к развития структур на клеточном уровне.

ЛОР "> Будущее применение и направления

Наши данные показывают, что кровоток и насыщение кислородом являются критическими факторами по отношению к нефрона дифференциацию клеток-предшественников. Для дальнейшего выяснения их роли в почечной развития, будущие исследования должны очертить основные анатомические механизмы провоцирующих эту физиологический процесс, а также изучить транскрипции сигнальные пути, которые обеспечивают этому явлению. Одна из гипотез, в отношении преодоления разрыва между явлением и механизма является то, что гладкомышечных клеток и перицитов агрегаты играть способствующих роль в оркестровки переходного усечение кровотока в стволовых клеток регионах развивающихся органов. Для того, чтобы проверить это, дальнейшего иммунофлуоресцентного окрашивания и анализ должны проводиться с акцентом на этих типах клеток в нефрогенного границе зоны. С точки зрения будущих исследований, лежащая в основе сигнальных путей, мы хотели бы изучить роль индуцируемого гипоксией факторов иФон Hippen Линдау сигнальных путей. Оба эти были в значительной степени вовлечены в течение литературе играют важную индуктивные роли в поддержании гипоксии и насыщенным кислородом среды в стволовых клеток регионах (в основном рассматриваются как гипоксическая) и участков дифференциации (областей, в наибольшей степени нуждаются в оксигенации), соответственно. Кроме того, мы хотели бы допросить роль эритропоэтина (ЭПО) в опосредовании процессов ангиогенеза и васкулогенеза в ходе развития почек сосудистой. ЭПО почечная гликопротеин, который играет важнейшую роль в эндотелиальных дифференциации и технического обслуживания. Его роль в крови опосредуется эндотелиальной дифференциации в значительной степени неизвестно. Наконец, мы хотели бы провести в естественных условиях экспериментов микроинъекции с сосудорасширяющих соединений в целях дальнейшего укрепления обоснованность этих исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Sigma Aldrich 022M4004V concentration 1:5,000
Pecam BD Biosciences 553370 concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin Vector Laboratories FL-1321 concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat) Jackson Immunoresearch 712-585-150 concentration 1:200
Microinjection Needle Origio Mid Atlantic Devices C060609
Mineral Oil Fisher Scientific BP26291
1 ml syringe Fisher Scientific 03-377-20
Clay Blocks Fisher Scientific HR4-326
Surgical Tape Fisher Scientific 18-999-380
PBS Fisher Scientific NC9763655
Hair Removal Product Fisher Scientific NC0132811
Surgical Scissors Fine Science tools 14084-08
Fine Forceps Fine Science tools 11064-07
Surgical Marking Pen Fine Science tools 18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy) Fine Science tools 11151-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
  2. Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8, (6), e65993 (2013).
  3. Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136, (23), 3863-3874 (2009).
  4. Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (5), 693-713 (2012).
  5. Costantini, F., Kopan , R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development. Dev Cell. 18, (5), 698-712 (2010).
  6. Das, A., et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat Cell Biol. 15, (9), 1035-1044 (2013).
  7. Rymer, C., et al. Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation. Am J Physiol Renal Physiol. (2014).
  8. Shah, S. R., et al. Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation. Developmental biology. 349, (2), 342-349 (2011).
  9. Andres, A. C., et al. EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts. Mech Dev. 120, (4), 511-516 (2003).
  10. Wagner, R., et al. High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT. Microsc Microanal. 17, (2), 215-219 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics