I Utero Intra-hjerte Tomato-lektin injeksjoner på mus embryoer til Gauge Nedsatt Blood Flow

1Rangos Research Center, Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 2Division of Nephrology, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rymer, C. C., Sims-Lucas, S. In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow. J. Vis. Exp. (96), e52398, doi:10.3791/52398 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dannelse og perfusjon for å utvikle nyre blodkar (bortsett fra glomeruli) er sterkt understudert. Som blodkar utvikler via angiogenese (som er forgrening av av store fartøy) og vaskulogenese (de novo fartøy dannelse), perfusjon kartlegging teknikker som harpiks kaster, in vivo ultralydavbildning, og mikro-disseksjon har vært begrenset i å demonstrere de intime relasjoner mellom Disse to prosesser og utviklingsnyrestrukturer innenfor embryoet. Her beskriver vi prosedyren for i utero intra-kardiale ultralydveiledet FITC-merket tomat lektin microinjections på museembryoer å måle ontogeny av nyreperfusjon. Tomat lektin (TL) ble perfusert i hele embryoet og nyrer høstet. Vev ble co-farget for ulike nyre strukturer, inkludert: nephron stamceller, nephron strukturer, ureter epitel, og blodkar. Starter på E13.5 store kaliber fartøyene ble dynket, men periferfartøy har vært unperfused. Ved E15.5 og E17.5, små perifere kar samt glomeruli begynte å bli dynket. Denne eksperimentelle teknikk er kritisk for å studere rollen til blodkar og blodstrøm under embryonal utvikling.

Introduction

Under embryonal utvikling to adskilte, men samtidig, vaskulære prosesser foregår: angiogenese, prosessen hvor et fartøy vokser fra en større pre-eksisterende fartøy, og vaskulogenese, som er en de novo dannelse av skip fra bolig endoteliale progenitorer 1,2. Henholdsvis det førstnevnte er synonymt med blodstrømmen, mens det sistnevnte er antatt å hovedsakelig finne sted i fravær av det.

Samtidig med blodkardannelse, begynner en syklisk og dynamisk prosess med nyre stamcelle syntese, spredning og differensiering for å utfolde seg på embryonale dag 9,5 (E9.5). På dette punktet ureteric knoppen (UB) invaderer dorsally inn i omkringliggende metanephric mesenchyme (MM), og fortsetter fram til fødselen 3. Gjentatte forgrening av UB i hurtig kondense metanephric cap mesenchyme til dannelse av de funksjonelle enheter i nyrene, i nevronet. Med hver ny generasjon av UB og nephron, er eldre generasjoner forskjøvet inn indre kortikale og marg regioner, hvor de deretter gjennomgå ytterligere modning og differensiering innenfor primært vaskulær-tette miljøer. Som vist ved Dressler et al. 3, er denne embryological prosessen utfelt ved induktiv signalering, så som krysstale mellom UB og MM, og en myriade av ekstracellulære faktorer 3-6. To nylig undersøkt ekstracellulære faktorer i utviklings bukspyttkjertel og nyrer inkluderer oksygen spenning og blodstrøm 7,8. Den sistnevnte vil bli omtalt i ytterligere detalj nedenfor med hensyn til nyre- utvikling.

For å avdekke den induktive rolle at blodstrømmen potensielt spiller i nephron stamcelle differensiering, så vel som i andre organogenesis prosesser, presise og nøyaktige metoder for embryonale blodstrøm kartlegging er avgjørende.

Alternative metoder for å måle blodstrøm omfatter forskrivning av ultrasound bildebehandling og harpiks kaster 9,10. Endelig har disse modi er vist å være iboende mangler i deres evne til å avdekke contemporaneously tidsmessige og romlige sammenstillinger mellom blodstrøm og stamcelledifferensiering. Resin kaster, for eksempel tilveiebringe en gyldig modell av fartøyet mønster innen voksent vev, men i umodne fartøy, for eksempel med embryonale tidspunkter, fartøyer er grovt underutviklet og utett. Derfor kaster harpiks ikke klarer å holde innenfor de små, ofte porøs, fartøyer.

For disse åpenbare hindringer, blant andre, valgte vi å innlemme ultralydveiledet in vivo intra-kardiale embryonale tomat lektin (TL) microinjections inn i våre undersøkelser av nyre utvikling. I denne prosedyren benytter vi en ultralyd probe til synkront lede en montert mikropipette nål fylt med 2,5 mL av TL-løsning inn i venstre hjertekammer museembryoer ved E11.5, E13.5, E15.5 og E17.5 tidspunkter. E170,5 er den nyeste utviklings alder som nålene er ikke sterk nok til å trenge mer utviklet embryo.

Fordelene ved denne metode er mikroinjeksjon rikelig. Ultralydveiledet mikroinjeksjon tillater presis posisjonering av en kanyle i embryonale venstre ventrikkel, passiv og kontrollert utvisning av løsningen i det bankende hjertet på dyret, minimal skade på hjertet og omkringliggende vev, og å unngå plutselig hjertesvikt og død embryo før full-body perfusjon. Med bruk av et FITC-merket TL, vil en hvilken som helst perfusert vaskulatur opprett markøren langs sin endotelial apikale membran. I kombinasjon med immunhistokjemi, utnytte PECAM (CD31, blodplater endothelial celleadhesjonsmolekyl) og diverse andre vaskulære markører, er vi i stand til å skille klart mellom perfundert og un-perfusert fartøy, samt karakterisere noen avvikende farging av omkringliggende vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: The University of Pittsburgh Institutional Animal Care og bruk komité godkjente alle forsøk.

1. Utarbeidelse av Ultralyd-mikroinjeksjon Instrumenter og embryoer

  1. Sette opp scenen, mount, og probe (figur 1), samt kirurgiske instrumenter (figur 2). Sted fosfatbufret saltvann (PBS) løsning (pH 7,4) i en 37 ° C varmebadet. Fyll mikroinjeksjon nålen helt med mineralolje, ved anvendelse av 1 ml sprøyte festet til et andre fleksibelt 25 G nål, gjennom sin base.
  2. Fix nålen på rotasjon montere arm, og tom nål av mineralolje løsning. Re-fill med 2,5 mL av TL løsning. Sørg for at ingen luftbobler inne i kanylen. Roter nålen arm mot veggen, vekk fra scenen.
  3. Bedøve den gravide moren i anestesi kammeret via kontinuerlig infusjon av isofluran. Når mor er gjengitt bevisstløs, overføre anestesi til nese anbrakt på caudal side av scenen, og sted mor i liggende stilling med snuten i nesen tube for å tillate en videreføring av et fullt bedøvet tilstand.
  4. Tape lemmer i 45 ° vinkel, eller med hender og føtter uthvilt og plassert overtop EKG / Temperature monitor faner. Det er viktig at den gravide demningen blir kontinuerlig overvåket for å sikre at bedøvelse er tilstrekkelig og at salven i anvendt for øynene for å redusere tørking.
  5. Påfør hårfjerning produktet over nedre del av magen til mor, tørk forsiktig av med tørre bomullspinner, og deretter igjen med en 70% etanol-mettet bomullspinner for å fjerne overflødig produkt og hår. Sørg for å rense abdominal hud ut av alt hår på stedet av snittet (figur 3).
  6. Utfør en laparotomi på den gravide moren hjelp av gode kirurgiske tenger og sakser. Pass på å unngå å kutte noen store fartøy eller viscerale organer. Gjøre først, rett snitt av epidermis 1,5-2 cm over vagina og fortsetter skjæres mot ribbeina i omtrenteligely 2-3 cm. Utsett subkutan membran, finn linea alba ("hvite linjen") (figur 3), og kuttet parallelt med første innsnitt, langs samme lengde, for å avsløre interne viscerale organer og livmor saccules.

2. Utvinning av embryoer

  1. Bruke 6-tommers bomull-tipped applikator å manøvrere mor og foster. Skyv (ikke press) på huden med applikator å manipulere først embryo ut av innsnitt åpningen. Etter ekstraksjon av den første embryo saccule, langsomt og forsiktig trekke resten av livmor horn gjennom og inn på utvendig morens. Unngå å trekke tarmen eller andre organer gjennom snitt på dette stadiet.
  2. Kvantifisere embryoer og forsiktig plassere venstre livmor horn tilbake til mor. Deretter begynner å plassere den høyre livmor-horn tilbake til mor starter med embryoet saccule lengst fra skjeden på hornet og beveger seg nedover. Fortsett denne til bare to embryoer forbli eksponert (Figur 4). Til slutt, til posisjons embryoene i en kolonne over og parallelt innsnitt linje, å være bevisst på ikke å klippe av livmor sirkulasjon.
  3. Plassere leire blokker og posisjon mellom armer og kropp, samt ben og hale. Pass på at leirflater er omtrent på nivå med laparotomi snittet. Fukt fenestrert petriskål med 37 ° C PBS.
  4. Ta tak strekker pinsett med høyre hånd og fenestrert petriskål med venstre hånd (fenestration parallelt med embryo) og bringe lukkede tang ~ 5 cm gjennom fenestration, fra toppen av petriskål. Åpne tang helt uten å rive fenestration mesh.
  5. Manøvrere hendene over embryoer og fokusere synet på de to embryo saccules. Uten (eller lett) berøre saccules med fenestration meshing eller tang, skyver dem gjennom slit og satt petriskål på mors mage. Med pinsett fortsatt utvidet, manipulere fenestrert mesh å sete det på hver side og på bunnen av hver embryo (Figur 5
  6. Deretter plasserer blå gummi som inneholder vegg i petriskål, uten å klemme eller skade befruktede egg (figur 6). Sørg for at leiren blokkene er godt balansering petriskål, embryo, og gummi-holdig vegg. Til slutt, fyll petriskål med 37 ° C PBS inntil embryoer er helt under vann (figur 6), mens kontrollere for lekkasjer ved fenestrert meshing.

3. injeksjonsprosedyren

  1. Lavere injeksjon scene med mor og embryo ned ved hjelp av justerings Z-nivå knappen (figur 1), og deretter rotere kanyle og montere arm og stille opp direkte med ultralyd probe, med nål ½ cm til venstre og under probespissen (figur 7) . Push nål-arm (ikke nål) 45 ° bort fra sonden. Vær forsiktig med å treffe tuppen av nålen med parabolen eller ultralyd probe.
  2. Hev injeksjon scenen tilbake til opprinnelig høyde, med ultralyd pkappe rett over embryoer Probe må være litt nedsenket og innen 3-4 mm av den embryonale vev. Bruk X & Y scenen justeringsknapper (figur 8) for å endre embryo / mor / scene posisjon til å systematisk finne juling embryonale hjertet.
  3. Direkte Center of ultralydskjermen observere en svart senter mål markør trukket (*). Lokal venstre ventrikkel (fortrinnsvis) eller atrium ved hjelp av X & Y scenen justeringsknapper (Figur 8) og deretter heve eller senke scenen ved hjelp av roterende knott på scenen for å posisjonere injeksjon målet nettopp over den svarte sentrum markør på ultralydskjermen.
  4. Bruk X scenen justeringsknapp for å flytte embryo til høyre, ut av ultralydskjermen. Omplassere mikroinjeksjon nål og arm tilbake på plass, ½ cm unna og 90 ° til ultralydproben (figur 7).
  5. Ved hjelp av mikroinjeksjon montere justeringsknapper (Figur 9C-G), posisjon nål med tydelig spiss aligned med sentrum markør. Juster sprøytevinkel (ved hjelp av knotter i figur 9C og EG), og X, Y og Z-vektorer av mikro-nål til å sikre at nålespissen er fokusert i riktig plan. Trekke mikroinjeksjon nål bruker utelukkende den "injeksjon" knotten (figur 9F), må ikke justere andre dimensjoner.
  6. Igjen, ved å bruke utelukkende X finjustering trinn knott trekk embryo tilbake under sonden med mål nøyaktig på sentermerket på ultralydskjermen. Sørg for at venstre ventrikkel er nå nøyaktig på samme X, Y og Z flyet.
  7. Neste, med bare "injeksjon" knotten på mikroinjeksjon montere, sakte punktering embryo med mikroinjeksjon nål og gradvis bringe spiss inn i venstre hjertekammer. Injisere hele 2,5 mL av TL-løsning inn i venstre hjertekammer, eller til de tomme advarsel pipelyder, ved å holde "tom" og trykke "fylle" en gang (2A & B). På denne tideninjeksjons observere en skygge som utgår fra spissen av nålen, som er TL kommer inn i hjertekammeret (figur 10). I revers, raskt trekke mikroinjeksjon nål rotere "injeksjon" knotten (figur 9F) på mikroinjeksjon montere når injeksjonen er fullført.
  8. Fortsett videre til neste embryo og gjenta denne prosedyren for de resterende embryoer følger denne serie av trinn og til slutt plassere de endelige embryo tilbake til demningen mage. Bytt anestesi til kammeret boksen og forsiktig flytte mor her i 15 minutter fra tidspunktet for den siste injeksjonen.

4. Høsting embryo og analyse

  1. Ofre dam via halsdislokasjon. Utvid laparotomi snittet for enkelt å fjerne livmor horn fra moren. Hold embryoene innenfor livmor sac. Plassere embryoene i kjølt PBS.
  2. Dissekere embryoer fra livmor sac (om nødvendig collect vev for genotyping) og plasser hele embryo jegn 4% Paraformaldehyde (PFA) over natten, deretter inn 30% sukrose over natten, fryse i kryostat seksjonering medium. Deretter kuttet cryosection og plasser det lysbilder for immunhistokjemisk analyse. Eventuelt bruke vev for hel-mount av dehydrerende i 100% metanol, etter fiksering i 4% PFA.
  3. For immunhistokjemisk analyse plassere frysesnitt i PBS for å fjerne oktober Så blokk seksjonene med 10% normalt esel serum i 30 min. Deretter legger PECAM primært antistoff ved 1: 100 fortynning natten ved 4 ° C. Den neste dagen, vaske lysbildene i PBT tre ganger for 10 minutter hver, og legge esel anti rotte 594 sekundær og inkuberes i 1 time ved RT.
    MERK: Dette er en svært krevende teknikk som krever optimalisering og koordinering av ultralyd og mikroinjeksjon. Det er en veldig bratt læringskurve relatert til denne teknikken og krever fire til seks uker med veiledet injeksjoner før man blir dyktigere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vaskulær formasjon foran flyt i å utvikle nyre

Et flertall av embryonale vev (inkludert nyre) inneholder en tett vaskulaturen (både unperfused og perfusert), selv ved tidlig fosterdød tidspunkter. For bedre å måle og analysere blodgjennomstrømningen i å utvikle nyre benyttet vi en metode for i utero embryonale intrakardielle microinjections. Med bruk av en høy oppløsning ultralyd for å identifisere den embryonale hjertet ved E11.5 gjennom E17.5, og etter utvinning og eksponering av en enkelt livmor saccule via en laparotomi, var vi i stand til å injisere 2,5 mL av TL (fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugert).

Vi har funnet den største suksessen injisere E13.5 og E15.5 embryonale tidspunkter, med en suksessrate på ca ~ 80% til 90%, henholdsvis. På grunn av tilstedeværelsen av en forholdsvis umodne hjerte E11.5 og en eksistens av tett brusk og dannelse av ben ved E17.5, fjerntliggende timeg punktene er relativt vanskelig å injisere, med et vesentlig lavere sannsynlighet for å lykkes i forhold til den midterste embryonale tidspunkter. Man kan forvente minst ~ 50% og ~ 30% suksessrate med E11.5 og E17.5 tidspunkter, henholdsvis.

Av co-merking vev med PECAM (CD31), en universell endothelial markør, er vi i stand til kvalitativt kategorisere fluorescerende fartøyer og vev inn i tre grupper: perfusert blodkar (PECAM positiv & TL positiv), unperfused blodkar (PECAM positiv), og abnormt perfusert strukturer (TL positiv). Denne spesielle fargemønster tillater oss å romlig skille mellom områder av perfusjon og un-perfusjon (Figur 11).

På E11.5, oppdaget vi at perfundert fartøy kapsle utvikle nyre i en web-lignende mønster uten egentlig å trenge inn i organ (Figur 12B). Ved E13.5, ble store fartøyer perfundert med noen av de mindretilbehørs fartøy flekker med TL (Figur 12C). Farging kan også ses gjennom noen av ureter epitel, kan dette enten være fra glomeruli som allerede er perfusert eller på grunn av den iboende lekkasjen av tidlig fosterdød fartøy. Ved E15.5 store skip ble perfusert, kunne også observeres imidlertid et stort antall glomeruli holder TL flekken, noe som tyder på at signifikant filtrering skjer (figur 12D). Også på dette tidspunkt en rekke mindre kaliber fartøy vises perfuserte, selv om en betydelig del av den ytre nephrogenic sonen synes å være blottet for blodstrømmen. Til slutt, men ved E17.5 et flertall av nyren ble perfusert med unntak av vaskulaturen av nephrogenic sonen, som er hovedsakelig fri for perfusjon (men tett i PECAM positive fartøy) og således indikerer et fravær av angiogenese i randområdene. Mindre kaliber fartøy inneholde TL og gjennomsnittlig antall perfuserte glomeruli har dramatisk iøkt i forhold til tidligere tidspunkter (Figur 12E).

Figur 1
Figur 1. Ultralyd probe, kirurgisk scene, mikroinjeksjon system, rail system, og EKG / Temperature monitor grunnleggende sett opp.

Figur 2
Figur 2. Nødvendig kirurgisk utstyr, løsninger og utstyr. (A) Bomull-tipped applikatorer. (B) Utvide (Ring) tang. (C) Kirurgisk saks. (D) Blunt-tipped tang. (E) fin pinsett. (F) Mikroinjeksjon Needle (Origio, # C060609). (H) Injeksjon / Fyll kontrolleren. (I) fosfatbufret saltvann (PBS). (J) mineralolje (Sigma Aldrich).

Figur 3
Figur 3. En 2-cm laparotomi er utført på bedøvet mor, utsette subkutis (bukveggen) over livmoren. Utnytte de kirurgiske saks og fin pinsett, utsett linea alba og gjøre innsnitt parallelt med epidermal kutt. Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Figur 4
Figur 4 1-2 E15.5 livmor saccules hentet gjennom laparotomi snitt og utsatt.. Klikk her for å se et størreversjonen av figuren.

Figur 5
Figur 5. Exposed livmor saccules guidet gjennom slit i fenestrert petriskål hjelp strekker tang. Fenestrert inngrep seter snuggly ved foten av saccules.

Figur 6
Figur 6. Blå inneholdvegg plassert til høyre for livmor saccules. Petriskål fylt med 37 ° C PBS inntil embryoer og inneholdende vegg er helt neddykket. Leiren blokkene plasseres fast under Petri-tallerken / embryo mellom armer og kropp og ben og hale.

Figur 7
Figur 7. Injection system positio ned ½ cm til venstre og under, og 90 ° til ultralyd probe.

Figur 8
Figur 8. Stage X og Y justeringsmekanismer.

Figur 9
Figur 9. Empty / Fyll enhet, mikroinjeksjon system, og iscenesette mount. (A) Fyll knappen. (B) Sprøyt knappen. (C) Rundpinne vinkeljustering knott. (E) Fin X justeringsknapp. (F) "Injection" knott. (G) Kurs X justeringsknapp. (H) Stage rullerende høydejusteringsknapp.

98fig10.jpg "/>
Figur 10. Ultralyd bilde av E15.5 intra-hjerte TL mikroinjeksjon. Needle tips er posisjonert innen hjerte- kammer, er TL løsning angitt med svart skygge i løpet av to kamre. Hjerteposen og perikard hulrom er lett differensiert.

Figur 11
Figur 11. Områder mellom perfusjon, unperfusion, og avvikende flekker skjelnet. Viser den første panelet PECAM flekken. Den midterste panelet viser TL flekken over nøyaktig det samme området av vev. Ureter knopp er abnormt farget; store fartøyene er omsluttet av hvite stiplede linjer. Den siste panelet er flettingen. Hvite piler indikerer lekkasje fartøy, og grå piler demonstrere en overgang mot et fartøy bli dynket. Gule strukturene representerer fullt perfusert blodkar.oad / 52398 / 52398fig11large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Figur 12
Figur 12. Embryo og nyre perfusjon ontogeny er undersøkt. (A) Hele E11.5 embryo er perfundert, med svært perifere skip innen hode og hale regioner som holder TL. (B) perfusert fartøyer ble sett rundt, men ikke inkorporert i utviklingen av nyren på E11.5 i en web-lignende mønster, er det også en ganske stor mengde av diffus farging på dette punktet. (C) E13.5 nyre viser store, store kaliber fartøyene er dynket i hele nyre (hvit og gul pil), med perfusjon fraværende innenfor nefrogen sone (hvit stiplet linje). (D) E15.5 nyre viser perfusjon gjennom små kaliber, perifere kar (gule piler),i noen glomeruli (hvite piler), og igjen et fravær av perfusjon ved perifer nyre mantel. (E) E17.5 nyre viser enorme gjennomstrømning glomeruli (hvite piler) og små kaliber fartøy (gule piler). Den nefrogen sone er umulig å skille fra resten av nyre på dette forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroinjeksjon anestesi og tidsramme

Med hensyn til bedøvelsen av moren, er det viktig å holde luftmengden konstant (2-3 l / min) og ved lav PSI. Flyten av beroligende må holdes på ca 1,75 til 2 l / min. Samtidig må tidsrammer der injeksjoner foregår overvåkes nøye og kontrolleres for med hvert kull. For hvert kull injeksjonsprosedyren bør holdes under 45 min. Betydningen av denne tidsgrense er av vesentlig betydning for eksperimentet, som hvert embryo må opprettholdes innenfor en konstant, normal pulsnivå for å lette kontrollert og uforanderlig perfusjon i hele kroppen, og organ av interesse. Vi har funnet ut at forlengelse injeksjoner resultater i tvilsomme resultater og svingninger i perfusjon mønsteret mellom embryo og senker prisene på vellykkede injeksjoner (dvs. langsom puls, hjertedød). Til slutt, etter den siste injeksjon innenfor kullet, er det viktigfor å tillate omtrent 15 min før embryoer blir høstet for å lette riktig, full perfusjon innenfor hvert embryo.

Prosessuelle behandling og pleie av embryoer

Under utvinning av embryoene, har vi funnet større forekomst av suksess med injeksjoner som er oppnådd ved stadig å ivareta den generelle helse og integritet av livmorslimhinnen og embryoer under embryo utvinning. Ved hjelp av de delikate bomull-tipped applikatorer (mettet med PBS) til å manipulere og manøvrere livmor sac og saccules er avgjørende for å sikre overlevelsen av mor og foster gjennom hele prosedyren. For det første er det viktig å sikre at den fysiske integritet av uterus og placenta blir riktig opprettholdt. Unngå contorting de saccules på en måte som vil hindre blodtilførselen til embryoer eller forårsake betydelige skader i blodårene som forsyner blodtilførselen til morkaken. Dette kan oppnås ved å ekstrahere er et maksimumm av 1-2 embryoer i en tid (mindre ekstrahering av hele uterin sac for første telling) og ved å plassere applikatorer bort fra store blodkar i bunnen av placenta.

Plassering av Embryonic injeksjonsstedet

Føring av mikroinjeksjon nål på riktig sted med ultralyd maskinen er også kritisk til hver injeksjon forsøk. Nøye oppmerksomhet må gis til lokalisering og sentrering av venstre hjertekammer på midten markør. Etter dette, må nålen være plassert og sentrert nøyaktig på midtmarkøren og å innrette kanylen og injeksjonsstedet på samme X- og Y-plan. Når dette er fullført, sakte trekke nålespissen nærmere injeksjonsstedet og unngå å bruke unødvendig stress for perikard sac og hjerte. Dette gjøres ved å tillate at nålen etter hvert passere gjennom vev lag, i stedet for å tvinge passasje av nålen gjennom dem. I løpet av injeksjonen, er det også viktig å look ut for en svart skygge som kommer fra nålespissen (Figur 10). Dette er en indikasjon på den TL løsning fylling ventrikkelen. Hvis nålespissen er i riktig posisjon, bør skyggen kontinuerlig oppstår og forsvinner som TL er matet ut i aorta. Imidlertid, hvis den perikardiale hulrommet ser ut til å engorge, er dette en indikasjon på at kanylen er av målet av den venstre ventrikkel og TL løsning er å fylle den perikardiale hulrommet rundt hjertet. Dette er en vanlig feil som er lett korrigeres ved å flytte kanylen på sin X og Y-planet, med noen små justeringer som finner sted med nålen fortsatt innenfor embryo. Unngå å trekke ut nålen fra embryoet på dette stadiet.

Ultralydveiledet in vivo mikroinjeksjon begrensninger

Iboende, besitter ultralyd mikroinjeksjon en rekke grunnleggende tekniske begrensninger. Først og fremst, den mikroinjeksjon nål volumkapasitet begrenser aldersspredningen av injeksjoner til E17.5 i musen. 2,5 ul av TL-løsning er vist i våre studier for å fullstendig perfuse embryoer opp til E15.5. Men bare etter dette tidspunkt, TL til blodvolumet forholdet blir å minuscule og fortynnet til effektivt å tagge perifere nyre endotelceller membraner. Således er et forminsket bilde av blodstrøm til stede ved senere tidspunkter punkt injeksjoner. I tillegg skaper dannelsen av ben og brusk i embryoet en naturlig barriere for nålespissen, og dermed fører til forlenget injeksjonstider og hyppige sprekker i nålen hodet. Disse begrensninger kan overvinnes ved å benytte en ny injeksjonssystem med større nål styrke og volumkapasiteter.

Alternative embryonale blodstrøms kartlegging teknikker

Til dags dato, alternative metoder for kartlegging embryonale mus blodstrømmen inkludere gjennomføring av harpiks kaster, immunhistokjemi flekker, og høy Resolut ion ultralydavbildning. Som harpiks kaster (med integrering av avansert bildebehandling teknikker) er for tiden den mest populære alternativet, vil dette bli nærmere omtalt nedenfor. Resin kaster tillate etablering av nøyaktige tredimensjonale representasjoner av flyt innenfor postnatal organer. Imidlertid har liten suksess vært hadde med bildebehandling prenatal nyrevevet på grunn av porøs blod blodkar og begrensninger i oppløsning. Til sammenligning, konjugert TL flekker mulig binding til endotele membranantigener som fører til en høyere grad av presisjon. I andre tilfeller, harpiks cast viskositet tidlig avkorter strømme inn glomeruli fartøy og små kapillære senger, lage eksperimentell begrensning ved høyere forstørrelse. Ved lavere forstørrelse, er denne teknikken klart bart å etablere strømningsmønster i forhold til utviklingsland. Omvendt, kan TL høyoppløselig analyse av blodstrøm i forhold til utviklings strukturer på cellenivå.

ent "> Future program og veibeskrivelse

Våre data tyder på at blodgjennomstrømningen og oksygenering er kritiske faktorer med hensyn til nephron stamcelle differensiering. For ytterligere å belyse sine roller i nyre utvikling, må fremtidige undersøkelser avgrense underliggende anatomiske mekanismer utløsende dette fysiologisk prosess samt undersøke transkripsjonssignalveier som formidler dette fenomenet også. En hypotese, med hensyn til å bygge bro over gapet mellom fenomen og mekanisme, er at glatt muskelcelle og pericyte aggregater spille medvirkende roller i iscenesetter den forbigående avkutting av blodstrøm til stamcelle regioner i utviklings organer. For å teste dette, må ytterligere immunofluorescent farging og analyse skal gjennomføres med fokus på disse celletypene på nefrogen sone grensen. I forhold til fremtidige undersøkelser av underliggende signalveier, ønsker vi å utforske rollene til hypoksi induserbare faktorer ogVon Hippen Lindau signalveier. Begge disse har i stor grad vært innblandet gjennom litteratur som å spille viktige induktive roller i å opprettholde hypoksisk og oksygen miljøer innen stamcelle regioner (i stor grad sett å være hypoksisk) og områder for differensiering (områder som har størst behov for oksygenering), henholdsvis. Videre ønsker vi å avhøre rolle erytropoietin (EPO) i formidling prosesser av angiogenese og vaskulogenese hele nyre vaskulær utvikling. EPO er en nyre glykoprotein som spiller viktige roller i endothelial differensiering og vedlikehold. Sin rolle i blod mediert endothelial differensiering er i stor grad ukjent. Til slutt ønsker vi å gjennomføre in vivo mikroinjeksjon eksperimenter med vasodilatasjon forbindelser for å styrke gyldigheten av disse undersøkelsene ytterligere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Sigma Aldrich 022M4004V concentration 1:5,000
Pecam BD Biosciences 553370 concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin Vector Laboratories FL-1321 concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat) Jackson Immunoresearch 712-585-150 concentration 1:200
Microinjection Needle Origio Mid Atlantic Devices C060609
Mineral Oil Fisher Scientific BP26291
1 ml syringe Fisher Scientific 03-377-20
Clay Blocks Fisher Scientific HR4-326
Surgical Tape Fisher Scientific 18-999-380
PBS Fisher Scientific NC9763655
Hair Removal Product Fisher Scientific NC0132811
Surgical Scissors Fine Science tools 14084-08
Fine Forceps Fine Science tools 11064-07
Surgical Marking Pen Fine Science tools 18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy) Fine Science tools 11151-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
  2. Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8, (6), e65993 (2013).
  3. Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136, (23), 3863-3874 (2009).
  4. Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (5), 693-713 (2012).
  5. Costantini, F., Kopan , R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development. Dev Cell. 18, (5), 698-712 (2010).
  6. Das, A., et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat Cell Biol. 15, (9), 1035-1044 (2013).
  7. Rymer, C., et al. Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation. Am J Physiol Renal Physiol. (2014).
  8. Shah, S. R., et al. Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation. Developmental biology. 349, (2), 342-349 (2011).
  9. Andres, A. C., et al. EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts. Mech Dev. 120, (4), 511-516 (2003).
  10. Wagner, R., et al. High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT. Microsc Microanal. 17, (2), 215-219 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics