I Utero intrakardielle Tomat-lectin injektioner på museembryoer at måle den renale blodgennemstrømning

1Rangos Research Center, Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 2Division of Nephrology, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rymer, C. C., Sims-Lucas, S. In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow. J. Vis. Exp. (96), e52398, doi:10.3791/52398 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dannelsen og perfusion for at udvikle nyre blodkar (bortset fra glomeruli) er stærkt dublerede. Som vaskulatur udvikler via angiogenese (som er den forgrening af større skibe) og vaskulogenese (de novo fartøj dannelse), teknikker perfusion kortlægning såsom harpiks afstøbninger, in vivo ultralydsscanning og mikro-dissektion er begrænset i at demonstrere de intime relationer mellem disse to processer og udvikle nyre strukturer i embryoet. Her beskriver vi proceduren for in utero intrakardielle ultralyd-styrede FITC-mærkede tomat lectin mikroinjektioner på museembryoer at måle ontogenese af renal perfusion. Tomat lektin (TL) blev perfunderet hele embryo og nyrer høstet. Væv blev co-farvet for forskellige nyre strukturer, herunder: nephron stamceller, nephron strukturer, ureteric epitel og kar. Starter ved E13,5 store kaliber fartøjer blev perfunderet dog perifertskibe forblev unperfused. Ved E15.5 og E17.5, små perifere kar samt glomeruli begyndt at blive perfunderet. Denne eksperimentelle teknik er kritisk for at studere rollen af ​​vaskulatur og blodgennemstrømningen under fosterudviklingen.

Introduction

Under fosterudviklingen to adskilte, men samtidige, vaskulære processer foregår: angiogenese, en proces, hvorved et fartøj vokser fra en større præ-eksisterende fartøj, og vaskulogenese, som er en de novo dannelsen af fartøjer fra hjemmet endotheliale progenitorer 1,2. Henholdsvis førstnævnte er synonymt med blodgennemstrømning, mens sidstnævnte menes at stort set finder sted i fravær af det.

Samtidig med dannelsen af ​​blodkar, en cyklisk og dynamisk nyre progenitorcelle syntese, proliferation og differentiering begynder at udfolde sig på embryonisk dag 9,5 (E9.5). På dette tidspunkt den ureteric opløbet (UB) invaderer dorsalt i omgivende metanephric mesenchyme (MM), og fortsætter indtil fødslen 3. Gentagne forgrening af UB ind hurtigt kondenserende metanephric kasket mesenchym begynder dannelsen af ​​de funktionelle enheder i nyren, nephron. Med hver ny generation af UB og Nephron, er ældre generationer forskydes ind indvendige kortikale og medullære regioner, hvor de derefter undergår yderligere modning og differentiering inden primært vaskulær-tætte miljøer. Som det fremgår af Dressler et al. 3 er denne embryologisk proces udfældes ved induktiv signalering, såsom krydstale mellem UB og MM, og et utal af ekstracellulære faktorer 3-6. To nyligt undersøgte ekstracellulære faktorer inden for udvikling af bugspytkirtel og nyrer omfatter oxygenspænding og blodgennemstrømningen 7,8. Sidstnævnte vil blive diskuteret mere detaljeret nedenfor med hensyn til nyre udvikling.

For at blotlægge den induktive rolle, blodgennemstrømning potentielt spiller i nephron progenitorcelle differentiering, såvel som i andre organogenese processer, præcise og nøjagtige metoder til embryonale blodgennemstrømning mapping er nødvendigt.

Alternative metoder til at måle blodgennemstrømning omfatter ordinering af ultrasound billedbehandling og harpiks kaster 9,10. Sammenfattende har disse tilstande vist sig at ligge i sagens natur mangler i deres evne til samtidigt afsløre tidsmæssige og rumlige sammenstillinger mellem blodgennemstrømning og stamcelle differentiering. Resin afstøbninger, for eksempel, en gyldig model for fartøj mønster i voksent væv, men i umodne skibe, såsom med embryonale tidspunkter, fartøjerne er groft underudviklet og utætte. Derfor harpiks kaster undlader at holde inden for de små, ofte porøs, fartøjer.

For disse åbenbare forhindringer, blandt andre, valgte vi at indarbejde ultralyd-vejledt in vivo intrakardielle embryonale tomat lectin (TL) mikroinjektioner i vores undersøgelser af nyre udvikling. I denne procedure udnytter vi en ultralydsonde til synkront lede en monteret mikropipette nål fyldt med 2,5 pi TL opløsning ind i den venstre ventrikel af musefostre ved E11.5, E13,5, E15.5 og E17.5 tidspunkter. E17.5 Er den seneste udviklingsmæssige alder som nåle ikke er stærke nok til at trænge ind i mere udviklede foster.

Fordelene ved denne mikroinjektion metode er rigelige. Ultralyd-vejledt mikroinjektion tillader præcis positionering af en kanyle i den embryonale venstre ventrikel, passiv og kontrolleret udvisning af opløsningen i det bankende hjerte af dyret, minimal skade på hjerte og omgivende væv, og undgåelse af pludseligt hjertesvigt og død embryo inden hele kroppen perfusion. Med anvendelse af en FITC-mærket TL, vil enhver perfunderet vaskulatur opretholde markør langs dens endotel apikale membran. I kombination med immunhistokemi, udnytte PECAM (CD31, Platelet endotel celleadhæsionsmolekyle) og forskellige andre vaskulære markører, er vi i stand til klart at skelne mellem perfusioneret og un-perfunderet skibe, samt karakterisere enhver afvigende farvning af omgivende væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: University of Pittsburgh Institutional Animal Care og brug Udvalg godkendte alle forsøg.

1. Fremstilling af ultralyd-mikroinjektion Instrumenter og embryoner

  1. Opsætning scenen, mount, og sonde (figur 1) samt kirurgiske instrumenter (Figur 2). Place phosphatbufret saltvand (PBS) opløsning (pH 7,4) i en 37 ° C opvarmning bad. Fyld mikroinjektion nålen helt med mineralsk olie under anvendelse af 1 ml sprøjte fastgjort til en anden fleksibel 25 G nål, gennem sin base.
  2. Fix nål på rotation mount arm, og tomme nål af mineralolie løsning. Re-fill med 2,5 pi TL løsning. Sørg for, at der ikke er luftbobler i kanylen. Drej nålen arm mod væggen, væk fra scenen.
  3. Bedøver den gravide mor i anæstesi kammeret via kontinuerlig infusion af isofluran. Når mor er gjort bevidstløs, overføre anæstesi til næse rør placeret på Caudal side af scenen, og sted mor i rygleje med snude i næsen rør for at tillade en fortsættelse af en fuldt bedøvet tilstand.
  4. Tape lemmer i 45 graders vinkler, eller med hænder og fødder hvilede og placeret overtop EKG / temperaturovervågning faner. Det er vigtigt, at den gravide dæmningen løbende overvåges for at sikre, at anæstesi er tilstrækkeligt, og at salve i anvendt for øjnene for at reducere tørring.
  5. Påfør hårfjerning produkt tværs underlivet af moderen, forsigtigt tørre med tørre vatpinde, og derefter igen med en 70% ethanol-mættet vatpinde for at fjerne eventuelt overskydende produkt og hår. Sørg for at rense abdominal hud fra alle hår på stedet af indsnit (figur 3).
  6. Udfør en laparotomi på den gravide mor hjælp fine kirurgiske tænger og sakse. Sørg for at undgå at skære nogen større fartøjer eller indre organer. Gør først, lige indsnit i epidermis 1,5-2 cm over vagina og fortsætter skæres mod ribben for approximately 2-3 cm. Expose den subkutane membran, find linea alba ("hvide linie") (figur 3), og skære parallelt med indledende indsnit langs den samme længde, for at eksponere interne indre organer og uterus saccules.

2. Ekstraktion af embryoner

  1. Brug 6-tommer bomuld spids applikatorer at manøvrere mor og embryoner. Skub forsigtigt (ikke tvinge) på huden med applikator til at manipulere første foster ud af indsnit åbning. Efter ekstraktion af den første embryo saccule, blidt og langsomt trække resten af ​​uterine horn gennem og på moderens ydre. Undgå at trække tarm eller andre organer gennem indsnit på nuværende tidspunkt.
  2. Kvantificere embryoner og anbring forsigtigt venstre livmoderhorn tilbage i moderen. Derefter begynde at placere højre uterine horn tilbage i mor starter med embryo saccule længst væk fra vagina på hornet og bevæger sig nedad. Fortsæt dette indtil kun to embryoner fortsat udsat (Fifigur 4). Endelig at placere embryoner i en kolonne over og parallelt snitlinien, være bevidste om ikke at afskære uterin cirkulation.
  3. Placer ler blokke og position mellem arme og krop, samt ben og hale. Sørg for, at ler overflader er omtrent på niveau med laparotomi snit. Fugt fenestrerede petriskål med 37 ° C PBS.
  4. Tag fat strækker pincet med højre hånd og fenestreret petriskål med venstre hånd (fenestration parallelt med embryoner) og bringe lukkede pincet ~ 5 cm gennem fenestration, fra toppen af ​​petriskålen. Åbne pincet helt uden at rive fenestration mesh.
  5. Manøvre hænder over embryoner og fokusere syn på de to embryo saccules. Uden (eller let) røre saccules med fenestration meshing eller pincet, skub dem gennem slidsen og sæt petriskål på mors mave. Med pincet stadig forlænget, manipulere fenestreret mesh til sæde det på begge sider og på bunden af hver embryo (figur 5
  6. Dernæst placeres blå gummi indeholdende væg i petriskålen uden at klemme eller skade fostre (Figur 6). Sørg ler blokke er fast balancering petriskål, embryo, og gummi-holdige væg. Endelig fylde petriskål med 37 ° C PBS indtil embryonerne helt nedsænket (figur 6), samtidig med at kontrollere for lækager ved fenestreret meshing.

3. Injektion Procedure

  1. Lavere injektion scene med mor og embryoner ned ved hjælp justering Z-niveau knop (figur 1) og drej kanyle og montere arm og line op direkte med ultralyd sonde, med nål ½ cm til venstre og under sondens spids (figur 7) . Skub nål-arm (ikke nål) 45 ° væk fra sonden. Vær omhyggelig med ikke at ramme spidsen af ​​nålen med parabol eller ultralyd sonde.
  2. Hæv injektion etape tilbage til oprindelige højde, med ultralyd probe direkte over embryoner Sonden skal være let nedsænket og inden 3-4 mm af den embryonale væv. Brug X & Y justering fase drejeknapper (figur 8) for at ændre embryo / mor / scene stand til systematisk at finde bankende embryonale hjerte.
  3. Direkte center af ultralyd skærmen observere et sort center målmarkøren trukket (*). Find venstre ventrikel (at foretrække) eller atrium ved hjælp af justering fase knapper X & Y (figur 8) og derefter hæve eller sænke bordet ved hjælp af knop revolverende på scenen for at placere mål indsprøjtning netop over den sorte center markør på ultralyd skærmen.
  4. Brug X justering fase knappen for at flytte embryo til højre ud af ultralyd skærmen. Flyt mikroinjektion nål og arm tilbage på plads, ½ cm væk fra og 90 ° i forhold til ultralyd-probe (figur 7).
  5. Brug mikroinjektion mount justeringsknapperne (9C-G) position nål med spids klart aligned med centrum markør. Juster injektion vinkel (ved hjælp af drejeknapper i figur 9C og EG), og X, Y og Z vektorer for mikronål at sikre nålespidsen er fokuseret i det rigtige plan. Træk mikroinjektion nål hjælp alene "indsprøjtning" knappen (figur 9F), omhyggelig med ikke at justere andre dimensioner.
  6. Igen, ved hjælp udelukkende X fine justering fase knop flytte embryo tilbage under sonden, med målet nøjagtigt på midten mærket på ultralyd skærmen. Kontroller, at den venstre ventrikel er nu nøjagtigt på samme X, Y og Z planet.
  7. Dernæst med bare "indsprøjtning" knappen på mikroinjektion mount, langsomt punktere foster med mikroinjektion nål og gradvist bringe spids ind i den venstre ventrikel. Injicere den fulde 2,5 pi TL opløsningen i venstre ventrikel, eller indtil de tomme advarsel bip lyde, ved at holde "tom" og trykke "fyld" én gang (figur 2A & B). På dette tidspunktinjektion observere en skygge udgår fra spidsen af nålen, som er TL ind i hjertekammeret (figur 10). Omvendt, hurtigt trække mikroinjektion nål dreje "injektion" knappen (Figur 9F) på mikroinjektion mount når injektionen er fuldført.
  8. Fortsæt til næste embryo og gentage denne procedure for de resterende embryoner følger denne række trin og endelig placere de endelige embryoner tilbage i dæmningen underliv. Skift anæstesi til kammeret box og forsigtigt flytte mor her i 15 min fra tidspunktet for den sidste injektion.

4. Høst Embryoner og analyse

  1. Sacrifice dæmning via cervikal dislokation. Udvid laparotomi snit til nemt at fjerne uterine horn fra moderen. Hold embryoner inden uterine vej. Placer embryoner i kølet PBS.
  2. Dissekere embryoner fra uterus sac (om nødvendigt indsamle væv til genotypebestemmelse) og placer det hele embryo in 4% paraformaldehyd (PFA) natten over, derefter i 30% saccharose natten over, fryse i kryostat sektionering medium. Derefter skæres kryosektionen og placere den på dias til immunhistokemisk analyse. Eventuelt bruge væv til hel-mount ved at dehydrere i 100% methanol, efter fiksering i 4% PFA.
  3. For immunhistokemisk analyse placere kryosektioner i PBS for at fjerne OLT. Derefter blokere sektionerne med 10% normal donkey serum i 30 minutter. Derefter tilsættes PECAM primære antistof ved 1: 100 fortynding natten over ved 4 ° C. Den næste dag vaskes objektglassene i PBT 3 gange i 10 minutter hver og tilføje æsel-anti-rotte 594 sekundære og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Dette er en meget krævende teknik, der kræver optimering og koordinering af ultralyd og mikroinjektion. Der er en meget stejl indlæringskurve relateret til denne teknik og kræver fire til seks uger af vejledt injektioner før man bliver dygtige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vaskulær formation forud flow udvikle nyre

Et flertal af embryonisk væv (herunder nyre) indeholder et tæt vaskulatur (både unperfused og perfunderet), selv på tidlige embryoniske tidspunkter. For bedre gauge og analysere blodgennemstrømningen i udviklingslandene nyre vi udnyttet en fremgangsmåde in utero embryonale intrakardiale mikroinjektioner. Med brug af en høj opløsning ultralyd til at identificere den embryonale hjerte ved E11.5 gennem E17.5, og efter ekstraktion og eksponering af en enkelt uterin saccule via en laparotomi, var vi i stand til at injicere 2,5 pi TL (fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret).

Vi har fundet den største succes indsprøjtning E13.5 og E15.5 embryoniske tidspunkter, med en succesrate på ca. ~ 80% til 90%, hhv. På grund af tilstedeværelsen af ​​et relativt umodne hjerte ved E11.5 og en eksistens af tæt brusk og dannelse af knogle ved E17.5, perifere timig punkter er forholdsvis vanskeligt at injicere med en væsentligt lavere sandsynlighed for succes i sammenligning med de midterste embryonale tidspunkter. Man kan forvente mindst ~ 50% og ~ 30% succesrate med E11.5 og E17.5 tidspunkter hhv.

Ved co-mærkning væv med PECAM (CD31), en universel endotel markør, er vi i stand til kvalitativt kategorisere fluorescerende skibe og væv i tre grupper: perfuseret kar (PECAM positiv & TL positiv), unperfused kar (PECAM positiv), og afvigende perfunderet strukturer (TL positiv). Denne særlige farvningsmønster tillader os at skelne rumligt mellem områder af perfusion og un-perfusion (figur 11).

Ved E11.5, opdagede vi, at perfunderede fartøjer indkapsle udvikle nyre i en web-lignende mønster uden faktisk trænge ind i organet (figur 12B). Ved E13.5 blev større kar perfunderet med et par af de mindretilbehør fartøjer farvning med TL (figur 12C). Farvning kan også ses gennem nogle af ureteric epitel, kan denne enten være fra glomeruli, der allerede er perfunderet eller på grund af den iboende utæthed af tidlige embryonale fartøjer. Ved E15.5 større fartøjer blev perfunderet, kan imidlertid et stort antal glomeruli også observeres holde TL pletten, hvilket antyder, at væsentlig filtrering forekommer (figur 12D). Også på dette tidspunkt en række mindre kaliber fartøjer vises perfunderet, selv om en betydelig del af den ydre nefrogen zone synes at være blottet for blodgennemstrømningen. Endelig, men ved E17.5 et flertal af nyren blev perfunderet bortset vaskulatur af nefrogen zone, som er overvejende fri for perfusion (dog tæt i PECAM positive kar) således indikerer et fravær af angiogenese i randområder. Mindre kaliber fartøjer indeholder TL og det gennemsnitlige antal perfusionerede glomeruli har dramatisk iøget i forhold til tidligere tidspunkter (figur 12E).

Figur 1
Figur 1. Ultralydsprobe, kirurgisk scene, mikroinjektion systemet, tog, og EKG / Temperatur monitor grundlæggende sæt op.

Figur 2
Figur 2. Nødvendigt kirurgisk udstyr, løsninger og udstyr. (A) Bomuld spids applikatorer. (B) Udvidelse (Ring) pincet. (C) kirurgiske sakse. (D) Blunt spids pincet. (E) Fin pincet. (F) Mikroinjektion Needle (Origio, # C060609). (H) Injektion / Fill controller. (I) phosphatbufret saltvand (PBS). (J) mineralolie (Sigma Aldrich).

Figur 3
Figur 3. En 2-cm laparotomi udføres på bedøvede mor, og udsætter det subkutane lag (bugvæggen) over livmoderen. Udnytte de kirurgiske sakse og fine pincet, udsætte linea alba og gøre indsnit parallelt med epidermal snit. Klik her for at se en større version af figuren.

Figur 4
Figur 4. 1-2 E15.5 uterine saccules udvundet gennem laparotomi snit og udsat. Klik her for at se et størreversion af figuren.

Figur 5
Figur 5. Udsat uterine saccules guidet gennem slidsen i fenestreret petriskål hjælp strækker pincet. Fenestrerede indgreb sæder snuggly på bunden af saccules.

Figur 6
Figur 6. Blå indeholdende væg placeret til højre for uterine saccules. Petriskål fyldt med 37 ° C PBS indtil embryoner, og som indeholder væg er helt neddykket. Clay blokke placeret sikkert under Petri-skål / embryo mellem arme og krop og ben og hale.

Figur 7
Figur 7. Indsprøjtningssystem positio ned ½ cm til venstre og nedenfor, og 90 ° til ultralyd-probe.

Figur 8
Figur 8. Stage X og Y justering mekanismer.

Figur 9
Figur 9. Tøm / Fyld enhed, mikroinjektion systemet og iscenesætte mount. (A) Fyld-knappen. (B) indsprøjtes knappen. (C) Rundpinde justering vinkel knop. (E) Fin X justeringsknappen. (F) "Injection" knappen. (G) Kursus X justeringsknappen. (H) Stage revolverende højdejustering knop.

98fig10.jpg "/>
Figur 10. Ultralyd billede af E15.5 intrakardielle TL mikroinjektion. Nålespidsen er placeret inden hjertekammer, er TL løsning angivet med sort skygge inden for to kamre. Hjertesækken og perikardiehulrummet let differentieres.

Figur 11
Figur 11. Områder mellem perfusion unperfusion og afvigende farvning skelnes. Det første panel viser PECAM pletten. Den midterste panel viser TL pletten i nøjagtig samme område af væv. Ureteric opløbet er afvigende farves; større fartøjer er indkapslet af hvide punkterede linjer. Det sidste panel er sammenfletningen. Hvide pile angiver fartøj lækage, og grå pile demonstrere en overgang til et skib bliver perfunderet. Gule strukturer repræsenterer fuldt perfunderet vaskulatur.OAD / 52398 / 52398fig11large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af figuren.

Figur 12
Figur 12. Embryo og nyre perfusion ontogeni undersøges. (A) Hel E11.5 embryo er perfunderet, med de meget perifere kar indenfor hoved og hale regioner holder TL. (B) perfusionerede fartøjer blev set omkring men ikke indarbejdet i den udviklende nyre på E11.5 i en web-lignende mønster, er der også en ganske stor mængde diffus farvning på dette punkt. (C) E13.5 nyre viser store, store kaliber fartøjer perfunderet hele nyren (hvid og gul pil), med perfusion fraværende inden nefrogen zone (hvid stiplet linie). (D) E15.5 nyre viser perfusion gennem lille kaliber, perifere kar (gule pile),i nogle glomeruli (hvide pile), og igen et fravær af perfusion på perifer nyre Mantel. (E) E17.5 nyre viser enorme perfusion gennem glomeruli (hvide pile) og mindre kaliber fartøjer (gule pile). Den nefrogen zone er umulig at skelne fra resten af nyrerne på dette forstørrelse. Klik her for at se en større udgave af figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroinjektion anæstesi og tidsramme

Med hensyn til bedøvelse af moderen, er det vigtigt at holde luftstrømmen konstant (2-3 l / min) og ved lav PSI. Strømmen af ​​beroligende skal holdes på ca. 1,75-2 l / min. Samtidig skal tidsrammer, hvor injektionerne foregår nøje overvåges og kontrolleres for hver kuld. For hvert kuld injektionsproceduren bør holdes under 45 min. Betydningen af ​​denne frist er altafgørende for eksperimentet, som hver embryo skal holdes inden for en konstant, normal puls interval for at lette kontrolleret og uforanderlig perfusion i hele kroppen og orgel af interesse. Vi har fundet, at forlænge injektioner medfører tvivlsomme resultater og udsving i perfusion mønstre mellem embryoner og sænker satserne for succesfulde injektioner (dvs. langsom puls, hjertedød). Endelig, efter den sidste injektion i kuld, er det vigtigtat tillade ca. 15 min før embryoner høstes for at lette korrekt, fuld perfusion inden for hvert foster.

Proces- behandling og pleje af embryoner

Under ekstraktion af embryoner, har vi fundet større satser for succes med injektioner, der opnås ved konstant at deltage til den generelle sundhed og integritet livmoderslimhinden og embryoner under embryo ekstraktion. Brug den fine bomuld spids applikatorer (mættet med PBS) til at manipulere og manøvrere uterus sac og saccules er bydende nødvendigt at sikre overlevelsen af ​​moderen og embryoner hele proceduren. Først er det vigtigt at sikre, at den fysiske integritet af livmoderen og moderkagen er ordentligt vedligeholdt. Undgå contorting de saccules på en måde, der vil hindre blodtilførslen til embryonerne eller forårsage betydelige brud i blodkar, der forsyner blodtilførslen til moderkagen. Dette kan opnås ved at ekstrahere en Maksi-m af 1-2 embryoner ad gangen (medmindre ekstrahere hele uterine sac til indledende count) og ved at placere applikatorer væk fra store blodkar i bunden af ​​placenta.

Placering af den embryoniske injektionsstedet

Ledende mikroinjektionen nålen i den rigtige placering med ultralyd maskine er også kritisk for hver injektion forsøg. Skal have særlig opmærksomhed lokalisering og centrering af den venstre ventrikel på midten markør. Efter denne, skal nålen være placeret og centreret præcist på midtermarkøren samt at tilpasse nål og injektionsstedet på samme X og Y plan. Når dette er færdig, langsomt trække nålespidsen tættere på injektionsstedet og undgå at anvende unødig stress til hjertesaek og hjerte. Dette gøres ved at lade nålen til gradvist passere gennem væv lag, snarere end at tvinge passage af nålen gennem dem. Under injektion, er det også vigtigt at look ud for en sort skygge udgår fra nålespidsen (figur 10). Dette er indikativt for TL opløsning fylder ventrikel. Hvis nålen spids er i den korrekte position, bør skyggen løbende vises og forsvinder som TL skubbes ind i aorta. Men hvis perikardiehulrummet synes at mætte, er vejledende, at nålen går forbi den venstre ventrikel og TL opløsningen fylder perikardiehulrummet omgiver hjertet. Det er en almindelig fejl, der er let korrigeres ved at flytte kanylen på X og Y-planet, med eventuelle mindre justeringer, der finder sted med nålen stadig inden embryoet. Undgå at udvinde nålen fra embryoet på dette stadie.

Ultralyd-vejledt in vivo mikroinjektion begrænsninger

Inherent, ultralyd mikroinjektion besidder en række grundlæggende tekniske begrænsninger. Først og fremmest nål volumen mikroinjektionenkapacitet begrænser den aldersgruppe af injektioner til E17.5 i musen. 2,5 pi TL løsning er vist i vore studier til helt perfundere embryoner op til E15.5. , Lige efter dette tidspunkt, TL blodvolumen forholdet bliver dog diminutive og fortyndet til effektivt at tagge perifere renale endotheliale membraner. Således er en formindsket billede af blodgennemstrømningen er til stede ved senere tidspunkt injektioner. Derudover dannelsen af ​​knogle og brusk i embryoet skaber en naturlig barriere for nålespidsen, hvilket fører til forlængede injektion tider og hyppige revner i nålehovedet. Disse begrænsninger kan overvindes ved anvendelse af et hidtil ukendt injektioner systemet med større nål styrke og volumen kapacitet.

Alternative embryonale blodgennemstrømning kortlægningsteknikker

Til dato, alternative metoder til kortlægning embryonale mus blodgennemstrømning omfatter gennemførelse af harpiks afstøbninger, immunhistokemi farvning og høj resolut ion ultralydsscanning. Som harpiks afstøbninger (med integration af avancerede billeddiagnostiske teknikker) er i øjeblikket den mest populære alternativ, vil dette blive diskuteret nærmere nedenfor. Resin kaster mulighed for at oprette nøjagtige tredimensionelle gengivelser af strømmen i postnatal organer. Imidlertid har lidt succes været havde med billeddannelse prænatal nyrevæv grund porøs blod kar og begrænsninger i opløsning. I sammenligning konjugeret TL pletter muliggøre binding til endotel membranantigener fører til en højere grad af præcision. I andre tilfælde, harpiks støbt viskositet tidligt afkorter strømme ind glomeruli skibe og små kapillærbanerne, skaber eksperimentel begrænsning ved højere forstørrelser. Ved lavere forstørrelser, denne teknik er tydeligvis levedygtig at etablere strømningsmønstre i forhold til udviklingsområder. Omvendt TL tillader høj opløsning analyse af blodgennemstrømningen i forhold til udviklingsmæssige strukturer på det cellulære niveau.

ent "> fremtidige anvendelse og retninger

Vores data tyder på, at blodgennemstrømningen og iltningen er kritiske faktorer med hensyn til nephron stamcelle differentiering. For yderligere at belyse deres roller i renal udvikling, må fremtidige undersøgelser afgrænse underliggende anatomiske mekanismer udfældes denne fysiologisk proces samt undersøge transkriptionelle signalveje, der medierer dette fænomen også. En hypotese, med hensyn til at bygge bro mellem fænomen og mekanisme, er, at glatte muskelceller og pericyt aggregater spiller bidragspligtige roller i orkestrere den forbigående trunkering af blodgennemstrømningen i stamceller regioner i udviklingslandene organer. For at teste dette skal yderligere immunfluorescensfarvning og analyser udføres med fokus på disse celletyper ved nefrogen zone grænse. Med hensyn til fremtidige undersøgelser af underliggende signalveje, vil vi gerne udforske roller hypoxi inducerbare faktorer ogVon Hippen Lindau signalveje. Begge disse er stort set blevet impliceret i hele litteraturen som spiller vigtige induktive roller i at opretholde hypoxisk og iltede miljøer indenfor stamceller regioner (hovedsagelig set at være hypoxisk) og områder af differentiering (områder i størst behov for iltning), hhv. Desuden vil vi gerne afhøre rolle erythropoietin (EPO) i mediering processerne for angiogenese og vaskulogenese hele nyre vaskulær udvikling. EPO er en renal glycoprotein, der spiller kritiske roller i endotel differentiering og vedligeholdelse. Dens rolle i blod medieret endotel differentiering er stort set ukendt. Endelig vil vi gerne foretage in vivo mikroinjektion eksperimenter med vasodilatation forbindelser til yderligere at styrke gyldigheden af disse undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Sigma Aldrich 022M4004V concentration 1:5,000
Pecam BD Biosciences 553370 concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin Vector Laboratories FL-1321 concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat) Jackson Immunoresearch 712-585-150 concentration 1:200
Microinjection Needle Origio Mid Atlantic Devices C060609
Mineral Oil Fisher Scientific BP26291
1 ml syringe Fisher Scientific 03-377-20
Clay Blocks Fisher Scientific HR4-326
Surgical Tape Fisher Scientific 18-999-380
PBS Fisher Scientific NC9763655
Hair Removal Product Fisher Scientific NC0132811
Surgical Scissors Fine Science tools 14084-08
Fine Forceps Fine Science tools 11064-07
Surgical Marking Pen Fine Science tools 18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy) Fine Science tools 11151-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
  2. Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8, (6), e65993 (2013).
  3. Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136, (23), 3863-3874 (2009).
  4. Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (5), 693-713 (2012).
  5. Costantini, F., Kopan , R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development. Dev Cell. 18, (5), 698-712 (2010).
  6. Das, A., et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat Cell Biol. 15, (9), 1035-1044 (2013).
  7. Rymer, C., et al. Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation. Am J Physiol Renal Physiol. (2014).
  8. Shah, S. R., et al. Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation. Developmental biology. 349, (2), 342-349 (2011).
  9. Andres, A. C., et al. EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts. Mech Dev. 120, (4), 511-516 (2003).
  10. Wagner, R., et al. High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT. Microsc Microanal. 17, (2), 215-219 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics