In Utero Intraherz Tomato Lektin-Injektionen auf Maus Embryonen zu Nierendurchblutung Messer

1Rangos Research Center, Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 2Division of Nephrology, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine
Developmental Biology

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Rymer, C. C., Sims-Lucas, S. In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow. J. Vis. Exp. (96), e52398, doi:10.3791/52398 (2015).

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Abstract

Die Bildung und die Durchblutung der Entwicklung von Nierenblutgefäße (abgesehen von Glomeruli) stark under. Als Gefäßsystem entwickelt über Angiogenese und Vaskulogenese (De-novo-Gefäßbildung), Perfusion Abbildungsverfahren wie Harzabgüsse, In-vivo-Ultraschallbildgebung und Mikrodissektion haben beim Nachweis der intimen Beziehungen zwischen beschränkt (das ist die Abzweigung der großen Gefäße ist) diese beiden Prozesse und Entwicklung von Nierenstrukturen im Embryo. Hier beschreiben wir das Verfahren der in utero intrakardialen Ultraschall-geführte FITC-markiertem Lektin Tomatenmikroinjektionen auf Mausembryonen, die Ontogenese der Nierendurchblutung zu messen. Tomaten-Lektin (TL) wurde während des gesamten Embryos und Nieren geerntet perfundiert. Nephron Vorfahren, Nephronstrukturen, Harnleiter Epithel und Gefäßsystem: für unterschiedliche Nierenstrukturen einschließlich Gewebe wurden zusammen gefärbt. Schon ab E13.5 großkalibrige Gefäße durchblutet jedoch PeripherieSchiffe blieb unperfused. Durch E15.5 und E17.5, kleinen peripheren Gefäße sowie Glomeruli begonnen, durchströmt wird. Dieses experimentelle Verfahren ist für die Untersuchung der Rolle der Vaskulatur und den Blutfluss während der embryonalen Entwicklung.

Introduction

Während der Embryonalentwicklung zwei diskrete, aber gleichzeitigen, vaskuläre Prozesse ab: Angiogenese, der Prozess, bei dem ein Schiff wächst aus einem großen bereits vorhandenen Behälter und Vaskulogenese, die eine Neubildung von Gefäßen aus Wohn endothelialen Vorläuferzellen 1,2 ist. Beziehungsweise die erstere auch mit dem Blutfluss, während die letzteren wird angenommen, dass in Abwesenheit von weitgehend übernehmen.

Parallel zur Bildung von Blutgefäßen, beginnt ein zyklischer und dynamischer Prozess von Nierenvorläuferzellen Synthese, Proliferation und Differenzierung der embryonalen Tag 9.5 (E9.5) zu entfalten. An diesem Punkt der Ureterknospe (UB) dringt dorsal in das umgebende Mesenchym metanephrischen (MM), und wird fortgesetzt, bis der Geburt 3. Wiederholtes Verzweigung des UB in schnell Kondensieren metanephrischen Kappe Mesenchym beginnt somit die Bildung der funktionellen Einheiten der Niere, Nephron. Mit jeder neuen Generation von UB und nephron, werden die älteren Generationen in inneren kortikalen und medullären Regionen, in denen sie dann weitere Reifung und Differenzierung in erster Linie Gefäßreichen Umgebungen zu unterziehen verdrängt. Wie von Dressler et al. 3 hervorgeht, wird diese embryoProzess durch eine induktive Signalfällt, wie Übersprechen zwischen UB und M, und eine Vielzahl von extrazellulären Faktoren 3-6. Zwei vor kurzem untersuchten extrazellulären Faktoren innerhalb des Entwicklungs Bauchspeicheldrüse und Nieren gehören Sauerstoffdruck und Blutfluss 7,8. Letzteres wird in weiteren Einzelheiten nachstehend mit Bezug auf die Nierenentwicklung diskutiert.

Um die induktive Rolle, Blutfluß potentiell spielt in Nephron Vorläuferzelldifferenzierung, sowie in anderen Organprozessen präzise und genaue Methoden der embryonalen Blutfluß Mapping belichten ist zwingend erforderlich.

Alternative Methoden zur Messung des Blutflusses sind die Verschreibung von ultrasound Bildgebung und Harz wirft 9,10. Abschließend diese Modi wurde gezeigt, dass von Natur aus fehlen in ihrer Fähigkeit, gleichzeitig zu enthüllen zeitlichen und räumlichen Nebeneinander zwischen den Blutfluss und der Stammzelldifferenzierung. Harzabgüsse zum Beispiel geben Sie eine gültige Modell des Schiffes Strukturierung in adulten Geweben jedoch in unreifen Gefäße, wie zum Beispiel mit embryonalen Zeitpunkten, sind Gefäße stark unterentwickelt und undicht. Daher wirft Harz nicht innerhalb der winzigen, oft porös, Schiffe zu halten.

Für diese offensichtliche Hindernisse, unter anderem, haben wir beschlossen, ultraschallgeführte in vivo intrakardiale embryonalen Tomaten Lektin (TL) Mikroinjektionen in unseren Untersuchungen der Nierenentwicklung zu integrieren. In diesem Verfahren verwenden wir eine Ultraschallsonde zum synchronen Führen eines montierten Mikro Nadel mit 2,5 ul TL Lösung gefüllt ist, in den linken Ventrikel von Mausembryonen an E11.5, E13.5, E15.5 und E17.5 Zeitpunkten. E17.5 Ist die letzte Entwicklungsalter, wenn die Nadeln sind nicht stark genug, um den weiter entwickelten Embryo eindringt.

Die Vorteile dieser Methode der Mikroinjektion sind reichlich vorhanden. Ultraschall-gesteuerte Mikroinjektion ermöglicht präzise Positionierung einer Injektionsnadel in der embryonalen linken Herzkammer, passive und kontrollierte Vertreibung der Lösung in das schlagende Herz des Tieres, minimale Schäden an Herz und das umgebende Gewebe und die Vermeidung des plötzlichen Herzstillstand und Tod des Embryo vor der Ganzkörper-Durchblutung. Mit der Verwendung eines FITC-markierten TL wird jede perfundiert Vaskulatur der Marker entlang ihrer endothelialen apikalen Membran aufrechtzuerhalten. In Kombination mit Immunohistochemie unter Verwendung von PECAM (CD31, Platelet endothelial cell adhesion molecule) und verschiedene andere vaskuläre Marker sind wir in der Lage, klar zwischen perfundiert und un-durchbluteten Gefäße sowie charakterisieren anyaberrant Färbung der umgebenden Gewebe.

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Protocol

HINWEIS: Die Universität von Pittsburgh Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt alle Experimente.

1. Herstellung von Ultraschall-Mikroinjektion Instrumente und Embryonen

  1. Up-Phase, Berg und Sonde (Abbildung 1) sowie chirurgische Instrumente (Abbildung 2) ein. Statt phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (pH 7,4) in einem 37 ° C Wärmebad. Füllen Mikroinjektionsnadel vollständig mit Mineralöl, mit 1 ml Spritze auf eine zweite flexible 25 G Nadel befestigt, über seine Basis.
  2. Fix Nadel auf Drehhalterung Arm und leere Nadel des Mineralöllösung. Re-fill mit 2,5 ul TL Lösung. Sicherzustellen, daß keine Luftblasen innerhalb der Injektionsnadel vorhanden sind. Drehen Nadel Arm in Richtung Wand, weg von der Bühne.
  3. Anesthetize die schwangere Mutter in der Anästhesie Kammer über eine kontinuierliche Infusion von Isofluran. Als Mutter ist bewusstlos, übertragen Sie die Narkose zu Nasenschlauch auf der c positioniertaudal Seite der Bühne und Ort Mutter in Rückenlage mit der Schnauze in Nasenschlauch, eine Fortsetzung einer vollständig betäubt Zustand ermöglichen.
  4. Band Gliedmaßen in 45 ° Winkel oder mit Händen und Füßen ausgeruht und positioniert overtop ECG / Temperaturwächter Registerkarten. Wichtig ist, dass die schwangere Damm wird kontinuierlich überwacht, um sicherzustellen, dass die Anästhesie reicht und Salbe in angewandter für die Augen, um das Trocknen zu reduzieren.
  5. Übernehmen Haarentfernung Produkt in Unterleib der Mutter, wischen Sie mit einem trockenen Wattestäbchen, und dann noch einmal mit 70% Ethanol-gesättigte Wattestäbchen, um überschüssiges Produkt und Haare zu entfernen. Achten Sie darauf, um Bauchhaut sauber aus aller Haare an der Stelle der Inzision (Abbildung 3).
  6. Führen Sie eine Laparotomie auf der schwangeren Mutter mit feinen chirurgischen Pinzette und Schere. Achten Sie darauf, um zu vermeiden, schneiden keine großen Gefäße oder inneren Organen. Stellen Sie zuerst, gerade Schnittführung der Epidermis 1,5-2 cm über Vagina und weiter in Richtung Rippen für approximat geschnittenely 2-3 cm. Setzen Sie das Unterhautmembran, suchen Sie die Linea alba ("weiße Linie") (Abbildung 3) und parallel zur anfänglichen Schnitt geschnitten, entlang der gleichen Länge, zu entlarven interne Eingeweide und Gebärmutter Säckchen.

2. Gewinnung von Embryonen

  1. Verwenden Sie 6-Zoll-Wattestäbchen, um Mutter und Embryonen zu manövrieren. Drücken Sie vorsichtig (nicht mit Gewalt) auf der Haut mit Applikator zum ersten Embryo aus Schnitt Öffnung manipulieren. Nach der Extraktion der ersten Embryo Sacculus, langsam und vorsichtig ziehen Sie den Rest der Uterushorn durch und auf Außen der Mutter. Vermeiden Sie es, Darm und andere Organe durch Einschnitt in dieser Phase.
  2. Quantifizieren Embryonen und schonend zu platzieren linken Uterushorn wieder in die Mutter. Dann beginnen Platzierung der rechten Uterushorn wieder in die Mutter mit dem Embryo Sacculus weitesten von der Scheide auf dem Horn und nach unten bewegt. Setzen Sie diesen, bis nur noch zwei Embryonen bleiben ausgesetzt (FiAbbildung 4). Schließlich Position Embryonen in einer Säule über und parallel zur Schnittführung, wird bewusst nicht abzuschneiden Gebärmutterblutung.
  3. Zeigen Mauerziegel und Position zwischen Armen und Körper sowie Beine und Schwanz. Stellen Sie sicher, dass die Ton-Oberflächen sind etwa in Höhe Laparotomieschnitts. Befeuchten Sie die gefenstert Petrischale mit 37 ° C PBS.
  4. Fassen Erweiterung Zange mit der rechten Hand und gefenstert Petrischale mit der linken Hand (Fenster parallel Embryonen), und bringen geschlossenen Pinzette ~ 5 cm durch Fenster, von der Spitze der Petrischale. Offene Zange komplett ohne zu reißen Fenstergitter.
  5. Manövrieren Sie die Hände über Embryonen und konzentrieren Blick auf die beiden Embryo Säckchen. Ohne (oder leicht) berühren Säckchen mit Fenster Vernetzung oder Zangen, schieben Sie sie durch den Schlitz und legen Petrischale auf Bauch der Mutter. Mit einer Pinzette noch erweitert, manipulieren gefenstert Mesh, um es auf beiden Seiten und am Boden jeder Embryo zu setzen (Abbildung 5
  6. Als nächstes legen blauen Gummi Umfassungswand in Petrischale, ohne zu drücken oder zu verletzen Embryonen (Abbildung 6). Stellen Sie sicher, Mauerziegel fest Ausgleich Petrischale, Embryo und kautschukhaltige Wand. Schließlich füllen Petrischale mit 37 ° C PBS bis Embryonen vollständig eingetaucht ist (Abbildung 6), bei der Kontrolle auf Dichtheit bei gefenstert Vernetzung.

3. Injektionsverfahren

  1. Niederinjektionsstufe mit Mutter und Embryonen nach unten mit Z-Ebene Einstellknopf (Bild 1) und drehen Injektionsnadel und montieren Arm und richten Sie direkt mit Ultraschallsonde, mit Nadel ½ cm nach links und unter der Sondenspitze (Abbildung 7) . Schieben nadel Arm (nicht Nadel) 45 ° von der Sonde. Darauf achten, dass die Spitze der Nadel mit der Schale oder Ultraschallsonde getroffen.
  2. Heben Injektionsstufe zurück zur ursprünglichen Höhe, mit Ultraschall pBademantel direkt über Embryonen Probe muss leicht eingetaucht werden und innerhalb von 3-4 mm der embryonalem Gewebe. Verwenden Sie X & Y-Tisch Einstellknöpfe (Abbildung 8), um den Embryo / Mutter / Tischposition systematisch suchen Sie das Schlagen embryonalen Herzen ändern.
  3. Direkt Zentrum von Ultraschall-Bildschirm beobachten ein schwarzes Zentrum Zielmarkierung gezeichnet (*). Suchen linken Herzkammer (empfohlen) oder den Vorhof über die Bühne Einstellknöpfe X & Y (Bild 8) und dann nach oben oder unten die Bühne mit Drehknopf auf der Bühne, um Einspritzziel genau über der schwarzen Mittelmarkierung auf dem Ultraschallbildschirm zu positionieren.
  4. Verwenden Sie X Bühne Einstellknopf, um Embryos nach rechts zu bewegen, aus der Ultraschall-Bildschirm. Repositionieren Mikroinjektionsnadel und wieder an seinen Platz zu bewaffnen, ½ cm von 90 ° zu der Ultraschallsonde (7).
  5. Mit Hilfe der Mikroinjektion montieren Einstellknöpfe (9C-G), Position Nadel mit der Spitze deutlich almit der Mittenmarkierung igned. Einstellen Injektionswinkel (mit Noppen in 9C & EG), und X, Y und Z Vektoren Mikronadel sicherzustellen Nadelspitze in der richtigen Ebene fokussiert. Einfahren Mikroinjektionsnadel mit ausschließlich den "Einspritzen" Knopf (9F), darauf achten, nicht zu anderen Dimensionen anzupassen.
  6. Auch ausschließlicher Verwendung des X Feineinstellung der Bühne Knopf bewegen Embryo wieder unter die Sonde mit Ziel genau auf dem Mittelpunkt auf dem Ultraschallbildschirm. Sicherzustellen, dass die linke Herzkammer ist nun genau auf der gleichen X, Y und Z-Ebene.
  7. Als nächstes wird mit nur der "Injektion" Knopfes auf der Mikroinjektion zu montieren, langsam stechen Embryo mit der Mikroinjektionsnadel und allmählich Spitze in die linke Herzkammer zu bringen. Injizieren Sie den vollen 2,5 ul TL-Lösung in die linke Herzkammer oder, bis die Leermeldung ertönt ein Signalton, indem "leer" und tippen Sie "füllen" einmal (2A & B). Zu diesem ZeitpunktInjektions beobachten einen Schatten von der Spitze der Nadel, die der TL Eintritt in die Herzkammer (10) ist ausgeht. In umgekehrter Richtung, schnell zurückzuziehen Mikroinjektionsnadel Drehen des "Einspritzen" Knopf (9F) auf der Mikroinjektion zu montieren, wenn die Einspritzung abgeschlossen ist.
  8. Weiter geht es zum nächsten Embryo und wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Embryonen nach dieser Reihe von Schritten, anschließend noch die letzten Embryonen wieder in der Mutterleib. Schalten Narkose Kammer Box und sanft bewegen Mutter hier für 15 Minuten vom Zeitpunkt der letzten Injektion.

4. Ernten Embryonen und Analyse

  1. Sacrifice Damm über Genickbruch. Erweitern Sie den Laparotomieschnitts leicht zu entfernen Uterushörner von der Mutter. Halten Sie die Embryonen im Uterus-sac. Zeigen Embryonen in PBS gekühlt.
  2. Sezieren Embryonen aus Gebärmuttersack (ggf. sammeln Gewebe für die Genotypisierung) und setzen Sie die gesamte Embryo in 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht, dann in 30% Saccharose über Nacht gefrier in Kryostaten Schnitt Medium. Dann schneiden Sie die Kryoschnitt und legen Sie sie auf Objektträger für die immunhistochemische Analyse. Optional können Gewebe für ganze Montage durch Dehydratisierung in 100% Methanol, nach Fixierung in 4% PFA.
  3. Für immunhistochemische Analyse legen Sie die Gefrierschnitte in PBS, um die OCT entfernen. Dann blockieren die Schnitte mit 10% normalem Eselserum für 30 min. Dann fügen Sie PECAM primären Antikörper bei 1: 100 Verdünnung über Nacht bei 4 ° C. Am nächsten Tag, waschen Sie die Folien in PBT 3 mal für 10 Minuten jeweils, und fügen Sie Esel-anti Ratte 594 sekundäre und Inkubation für 1 h bei RT.
    Anmerkung: Dies ist eine sehr anspruchsvolle Technik zur Optimierung und Koordinierung von Ultraschall und Mikroinjektion erfordern. Es gibt eine sehr steile Lernkurve, um diese Technik verwandt und benötigt vier bis sechs Wochen von Mentor-Injektionen vor wird man kompetent.

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Representative Results

Gefäßbildung vorausgeht Fluss in Entwicklung von Nieren

Ein Großteil der embryonalem Gewebe (einschließlich der Niere) enthält eine dichte Gefäß (beide unperfused und durchströmt), auch in frühen embryonalen Zeitpunkten. Um besseres Maß und Analyse des Blutflusses in der Entwicklung von Nieren wir verwendeten eine Methode der in utero embryonalen intraMikroInjektionen. Mit der Verwendung eines hochauflösenden Ultraschall die embryonalen Herzens bei E11.5 durch E17.5 identifizieren und nach der Extraktion und die Belichtung kann eine einzelne uterine saccule über eine Laparotomie, waren wir in der Lage, 2,5 ul TL injizieren (Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugierten).

Wir haben die größte Erfolg Injizieren E13.5 und E15.5 embryonalen Zeitpunkten, mit einer Erfolgsquote von etwa ~ 80% bis 90% festgestellt sind. Aufgrund der Gegenwart einer relativ unreife Herzen bei E11.5 und eine Existenz von dichten Knorpel- und Knochenbildung bei E17.5 die Rand time Punkte sind vergleichsweise schwer zu injizieren, mit einer wesentlich geringeren Wahrscheinlichkeit für einen Erfolg im Vergleich zu den mittleren embryonalen Zeitpunkten. Man kann zumindest 30% Erfolg bei E11.5 und E17.5 Zeitpunkten jeweils erwarten ~ 50% und ~,.

Durch Co-Kennzeichnung Gewebe mit PECAM (CD31), eine universelle endothelialen Marker sind wir in der Lage, qualitativ kategorisieren fluoreszierende Gefäßen und Geweben in drei Gruppen: perfundierten Gefäßsystem (PECAM positive und positive TL), unperfused Gefäßsystem (PECAM positive) und abweichend perfundierten Strukturen (TL positiv). Diese besondere Färbungsmuster können wir räumlich zwischen Bereichen der Durchblutung und un-Perfusion (Abbildung 11) zu unterscheiden.

Bei E11.5, entdeckten wir, dass perfundierten Gefäße kapseln die Entwicklung von Nierenstegartigen Muster, ohne tatsächlich in das Organ (12B) eindringt. Durch E13.5 wurden große Schiffe mit ein paar von den kleineren perfundiertenZubehör Schiffe Färbung mit TL (12C). Färbung konnte auch gesehen werden, im gesamten Teil des ureteric Epithel, kann dies entweder von Glomeruli, die bereits perfundiert oder aufgrund der inhärenten Undichtigkeit frühen embryonalen Fahrzeuge. Von E15.5 großen Gefäße wurden perfundiert, könnte jedoch eine große Anzahl von Glomeruli auch Halten des TL-Färbung, was darauf hindeutet, dass signifikante Filterung auftritt (12D) beobachtet wird. Auch zu diesem Zeitpunkt eine Anzahl von kleineren Kaliber Schiffe angezeigt perfundiert, wobei ein wesentlicher Anteil der äußeren nephrogenic Zone wird ohne den Blutfluss zu sein. Schließlich jedoch von E17.5 eine Mehrheit der Niere wurde außer Vaskulatur des nephrogenic Zone, die vorwiegend frei von Durchblutung (in PECAM positiven Gefäße jedoch dicht) was auf eine Abwesenheit von Angiogenese in Umfangsbereichen perfundiert. Kleinerem Kaliber Gefäße enthalten TL und die durchschnittliche Zahl der perfundierten Glomeruli hat dramatischim Vergleich zu früheren Zeitpunkten (12E) erhöht.

Figur 1
Abbildung 1. Ultraschallsonde, chirurgische Bühne, Mikroinjektionssystem, Schienensystem, und EKG / Temperaturwächter grundlegenden Einrichtung.

Abbildung 2
Abbildung 2. Notwendige chirurgische Geräte, Lösungen und Geräte. (A) Wattestäbchen. (B) Verlängerung (Ring) Pinzette. (C) Chirurgische Schere. (D) stumpfen Pinzette. (E) Feines Zange. (F) Mikroinjektionsnadel (ORIGIO, # C060609). (H) Injektion / Fill-Controller. (I) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). (J) Mineralöl (Sigma Aldrich).

Figur 3
3. Ein 2-cm Laparotomie ist an narkotisierten Mutter durchgeführt, indem die Unterhaut (Bauchwand) über der Gebärmutter. Unter Verwendung der chirurgische Scheren und feinen Pinzette, setzen die Linea alba und machen Einschnitt parallel zur Epidermis Schnitt. Bitte klicken Sie hier, um sehen eine größere Version der Figur.

4
4. 2.1 E15.5 Gebärmutter Säckchen durch Laparotomieschnitts extrahiert und ausgesetzt. Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößernVersion der Figur.

Abbildung 5
Abbildung 5. Exposed Gebärmutter Säckchen durch den Schlitz in gefenstert Petrischale mit Erweiterung Zange geführt. Gefensterte kämmenden Sitze snuggly an der Basis der Säckchen.

Figur 6
Fig. 6 Blau enthaltende Wand rechts von Uterus Säckchen angeordnet. Petrischale mit 37 ° C gefüllt wird, bis PBS Embryonen und Umfassungswand vollständig eingetaucht ist. Hintermauerziegel sicher unter Petrischale / Embryo zwischen Armen und Körper und Beine und Schwanz gelegt.

7
7. Einspritzsystem positio Ned ½ cm nach links und unten und 90 ° zur Ultraschallsonde.

8
Abbildung 8. Stufe X und Y Einstellmechanismen.

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Abbildung 9. Leeren / Füllen Gerät, Mikroinjektionssystem und inszenieren Halterung. (A) Füllen Taste. (B) Injizieren Taste. (C) Rundnadel Winkeltrieb. (E) Feines X Einstellknopf. (F) "Injection" Knopf. (G) Course X Einstellknopf. (H) Bühnendrehknopf Höhenverstellung.

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10. Ultraschallbild von E15.5 intrakardiale TL Mikroinjektion. Nadelspitze innerhalb der Herzkammer positioniert ist, wird TL-Lösung von schwarzen Schatten in zwei Kammern angezeigt. Herzbeutel und Perikardhöhle leicht unterschieden.

11
11. Bereiche zwischen Perfusion unperfusion und anomale Färbung zu erkennen. Das erste Panel zeigt die PECAM Fleck. Das mittlere Feld zeigt den TL Fleck über genau die gleiche Gewebebereich. Ureterknospe ist abweichend Malerei; großen Gefäße werden von weißen gestrichelten Linien umgeben. Das letzte Panel ist die Zusammenführung. Weiße Pfeile zeigen Gefäß Leckage und graue Pfeile zeigen einen Übergang zu einem Gefäß zu durchblutet. Yellow Strukturen repräsentieren voll durchströmten Gefäßen.oad / 52.398 / 52398fig11large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.

12
Abbildung 12. Embryo und Nierendurchblutung Ontogenese untersucht. (A) insgesamt E11.5 Embryos durchströmt, mit den sehr peripheren Gefäße im Kopf und Schwanz Regionen Halten der TL. (B) perfundierten Gefäße gesehen umgibt, aber nicht in die Entwicklung von Nieren bei E11.5 stegartigen Muster eingebaut, gibt es auch eine ziemlich große Menge an diffuse Färbung an dieser Stelle. (C) E13.5 Nieren zeigt große, großkalibrige Gefäße im ganzen Niere (weißer und gelber Pfeil) durchströmt, mit Perfusion abwesend innerhalb nephrogenen Zone (weiß gepunktete Linie). (D) zeigt E15.5 Nierendurchblutung im gesamten Kleinkaliber, peripheren Gefäße (gelbe Pfeile),in einigen Glomeruli (weiße Pfeile), und wiederum eine Abwesenheit der Perfusion bei Umfangsnierensims. (E) E17.5 Niere zeigt wiegende Perfusion gesamten Glomeruli (weiße Pfeile) und kleinkalibrigen Gefäße (gelbe Pfeile). Die nephrogenen Zone ist zu unterscheiden von dem Rest der Niere bei dieser Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.

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Discussion

Mikroinjektionsanästhesie und Zeitrahmen

Im Hinblick auf die Betäubung der Mutter, ist es wichtig, um den Luftstrom konstant (2-3 l / min) und bei niedrigen PSI halten. Die Strömung des Beruhigungs muß bei etwa 1,75-2 L / min gehalten werden. Gleichzeitig müssen Zeitrahmen, in dem die Injektionen erfolgen genau beobachtet und mit jedem Wurf gesteuert werden. Für jeden Wurf sollte das Injektionsverfahren unter 45 Minuten gehalten werden. Die Bedeutung dieser Frist ist ausschlaggebend für das Experiment, da jeder Embryo innerhalb eines konstanten, normal Herzfrequenzbereich, um ein kontrolliertes und invariable Perfusion im ganzen Körper und interessierende Organ erleichtern aufrechterhalten werden. Wir haben festgestellt, dass eine Verlängerung Injektionen führt zu fragwürdigen Ergebnissen und Schwankungen der Durchblutungsmuster zwischen Embryonen und senkt Raten von erfolgreichen Injektionen (dh langsamer Herzschlag, Herztodes). Schließlich nach der letzten Injektion im Wurf, ist es wichtig,etwa 15 min gewartet werden, bis Embryonen werden geerntet, um eine ordnungsgemäße, vollständige Perfusion innerhalb jeder Embryo zu erleichtern.

Verfahrens Behandlung und Betreuung von Embryonen

Während der Extraktion der Embryonen haben wir größere Erfolgsraten mit Injektionen, die durch ständige Teilnahme für die allgemeine Gesundheit und die Integrität der Gebärmutterschleimhaut und Embryonen während der Embryo-Entnahme durchgeführt werden gefunden. Mit den zarten Wattestäbchen (mit PBS gesättigt) zu manipulieren und zu manövrieren die Gebärmuttersack und Säckchen sind zwingend notwendig, um das Überleben der Mutter und Embryonen während des gesamten Verfahrens zu gewährleisten. Erstens ist es wichtig, sicherzustellen, daß die physikalische Integrität des Uterus und Plazenta richtig beibehalten wird. Vermeiden verrenkt die Säckchen in einer Weise, die den Blutfluss zu den Embryonen zu behindern oder zu erheblichen Bruch in Blutgefäße, die den Blutfluss in der Plazenta versorgt. Dies kann durch Extrahieren eines Maximu bewerkstelligt werdenm 1-2 Embryos zu einem Zeitpunkt (wenn nicht Extrahieren des gesamten Uterus SAC für Anfangszahl) und durch Positionieren Applikatoren vom Hauptblutgefäße an der Basis der Plazenta.

Standort des embryonalen Injektionsstelle

Führen der Mikroinjektionsnadel in die richtige Position mit dem Ultraschallgerät ist ebenfalls kritisch für jede Injektion Versuch. Besondere Aufmerksamkeit muß auf die Ortung und die Zentrierung des linken Ventrikels auf der Mittelmarkierung gegeben. Danach muss die Nadel angeordnet und zentriert genau auf der Mittelmarkierung sowie um die Nadel und Injektionsstelle auf der gleichen X- und Y-Plan auszurichten. Sobald dies abgeschlossen ist, langsam ziehen Sie die Nadelspitze näher an der Injektionsstelle und vermeiden, dass eine übermäßige Belastung auf den Herzbeutel und Herz. Dies wird erreicht, indem die Nadel nach und nach durch Gewebeschichten übergeben, anstatt den Durchgang der Nadel zwingt durch sie getan. Während der Injektion ist es auch wichtig, look für einen schwarzen Schatten von der Nadelspitze (Abbildung 10) ausgeht. Das ist bezeichnend für die TL-Lösung Füllen der Ventrikel. Wenn die Nadelspitze in der richtigen Position, sollte der Schatten kontinuierlich erscheinen und verschwinden als TL wird in die Aorta ausgestoßen. Allerdings Wenn der Perikardhöhle scheint anschwellen, ist dies ein Hinweis, dass die Nadel trifft das Tor der linken Herzkammer und der TL-Lösung wird die Perikardhöhle um das Herz füllt. Dies ist ein häufiger Fehler, die leicht durch Neupositionierung der Injektionsnadel auf der X- und Y-Ebene behoben ist, mit irgendwelchen leichte Anpassungen stattfinden mit der Nadel noch im Embryo. Vermeiden Extrahieren der Nadel aus dem Embryo in diesem Stadium.

In-vivo-Mikroinjektion Einschränkungen Ultraschall-gesteuerte

Von Natur aus, das Ultraschallmikroinjektion besitzt eine Reihe von grundlegenden technischen Einschränkungen. Zuallererst wird die Mikroinjektionsnadel VolumenKapazität begrenzt die Altersgruppe der Injektionen E17.5 in der Maus. 2,5 ul TL Lösung wurde in unseren Studien wurde gezeigt, daß völlig perfundieren Embryonen bis E15.5. , Nur nach diesem Zeitpunkt wird jedoch der TL, um Blut-Volumen-Verhältnis zu winzig und verdünnt, um effektiv zu markieren Peripherienieren endothelialen Membranen. Somit ist eine verminderte Bild des Blutflusses zu einem späteren Zeitpunkt Injektionen vorliegen. Zusätzlich wird die Bildung von Knochen und Knorpel in den Embryo erzeugt eine natürliche Barriere für die Nadelspitze, was zu verlängerten Einspritzzeiten und häufige Risse in dem Nadelkopf führt. Diese Einschränkungen können durch die Verwendung eines neuartigen Injektionssystem mit einer größeren Nadelstärke und Volumenkapazitäten überwunden werden.

Alternative embryonalen Blutfluss Mapping-Techniken

Bis heute sind alternative Methoden der Zuordnung embryonaler Mausblutung der Umsetzung der Harzabgüsse, Immunhistochemie Färbung und hohe resolut Ionen-Ultraschall-Bildgebung. Als Harzabgüsse (mit der Integration von fortschrittlichen bildgebenden Verfahren) sind derzeit die beliebteste Alternative, wird dies weiter unten im Detail diskutiert werden. Harzabgüsse ermöglichen die Erstellung von präzisen dreidimensionalen Darstellungen der Strömung innerhalb der postnatalen Organe. Allerdings hat wenig Erfolg mit bildgebenden pränatalen Nierengewebe durch poröse Blutgefäßsystem und Grenzen der Auflösung hereingelegt worden. Im Vergleich hierzu konjugiert TL Flecken ermöglichen Bindung an Membranantigene, die zu einem höheren Grad an Präzision Endothelzellen. In anderen Fällen vorzeitig abgeschnitten Resin Viskosität fließen in Glomeruli Schiffe und winzige Kapillarbetten schaffen Prüfpräparat Begrenzung bei höheren Vergrößerungen. Bei niedrigen Vergrößerungen ist diese Technik auf die Schaffung Strömungsmuster in Bezug auf Entwicklungsregionen deutlich lebensfähig. Umgekehrt erlaubt TL hochauflösende Analyse des Blutflusses in Bezug auf Entwicklungsstrukturen auf zellulärer Ebene.

ent "> Future Anwendung und Richtungen

Unsere Daten weisen darauf hin, dass die Durchblutung und Sauerstoffversorgung sind entscheidende Faktoren im Hinblick auf die Vorläufer Differenzierung Nephrons. Um ihre Rolle in der Nierenentwicklung weiter aufzuklären, müssen zukünftige Untersuchungen zu Grunde liegenden anatomischen Mechanismen Ausfällen dieses physiologischen Prozesses zu beschreiben sowie Prüfung Transkriptionssignalwege, die dieses Phänomen zu vermitteln als auch. Eine Hypothese, in Bezug auf die Lücke zwischen Phänomen und der Mechanismus ist, dass Zellen der glatten Muskulatur und Perizyten Aggregate spielen beitrags Rollen in Orchestrierung der vorübergehende Kürzung der Blutfluss in der Stammzell Regionen der Entwicklungs Organe. Um dies zu testen, müssen weitere Immunfluoreszenzfärbung und Analysen mit dem Fokus auf diesen Zelltypen an der nephrogenen Zone Grenze durchgeführt werden. In Bezug auf die zukünftige Untersuchungen der zugrunde liegenden Signalwege, möchten wir die Rolle von Hypoxie-induzierbaren Faktoren und der ErkundungVon Hippen Lindau Signalwege. Beide sind weitgehend im gesamten Literatur spielen wichtige Rollen bei der Aufrechterhaltung der induktiven hypoxische und sauerstoffhaltigen Umgebungen in der Stammzellregionen (vor allem gesehen hypoxischen zu sein) und Bereiche der Differenzierung (Bereiche mit dem größten Bedarf der Sauerstoffversorgung), jeweils in Verbindung gebracht. Darüber hinaus möchten wir die Rolle von Erythropoietin (EPO) bei der Vermittlung der Prozesse der Angiogenese und Vaskulogenese gesamten Nierengefäßentwicklung zu verhören. EPO ist ein Nieren Glykoprotein, das eine entscheidende Rolle bei endothelialer Differenzierung und Wartung spielt. Seine Rolle bei der Blut vermittelte Endotheldifferenzierung ist weitgehend unbekannt. Schließlich möchten wir in vivo Mikroinjektionsexperimente mit Vasodilatation Verbindungen führen zur weiteren Stärkung der Gültigkeit dieser Untersuchungen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Sigma Aldrich 022M4004V concentration 1:5,000
Pecam BD Biosciences 553370 concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin Vector Laboratories FL-1321 concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat) Jackson Immunoresearch 712-585-150 concentration 1:200
Microinjection Needle Origio Mid Atlantic Devices C060609
Mineral Oil Fisher Scientific BP26291
1 ml syringe Fisher Scientific 03-377-20
Clay Blocks Fisher Scientific HR4-326
Surgical Tape Fisher Scientific 18-999-380
PBS Fisher Scientific NC9763655
Hair Removal Product Fisher Scientific NC0132811
Surgical Scissors Fine Science tools 14084-08
Fine Forceps Fine Science tools 11064-07
Surgical Marking Pen Fine Science tools 18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy) Fine Science tools 11151-10

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References

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