In Utero Intrakardiella Tomat-lektin Injektioner på musembryon att Gauge renala blodflödet

1Rangos Research Center, Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 2Division of Nephrology, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rymer, C. C., Sims-Lucas, S. In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow. J. Vis. Exp. (96), e52398, doi:10.3791/52398 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bildandet och perfusion att utveckla njur blodkärl (bortsett från glomeruli) är kraftigt understudied. Som kärl utvecklas via angiogenes (vilket är den förgrening av av stora fartyg) och vaskulogenes (de novo kärlbildning), perfusion kartläggningstekniker såsom hartsavgjutningar, in vivo ultraljud och mikro dissektion har begränsad demonstrera intima relationer mellan dessa två processer och utvecklingsnjur strukturer inom embryot. Här beskriver vi proceduren in utero Intrakardiella ultraljud-styrda FITC-märkta tomatlektin microinjections på musembryon att mäta ontogenin av renal perfusion. Tomatlektin (TL) perfunderades hela embryot och njurar skördas. Vävnaderna samar färgas för olika njurstrukturer inklusive: nephron stamceller, nephron strukturer, ureteric epitel och kärl. Börjar på E13.5 grovkalibriga fartyg perfusion dock periferakärl förblev unperfused. Genom E15.5 och E17.5, små perifera kärl samt glomeruli började bli perfusion. Denna experimentella teknik är avgörande för att studera rollen av kärl och blodflöde under fosterutvecklingen.

Introduction

Under fosterutvecklingen två diskreta, men ändå samtidiga, vaskulära processer äger rum: angiogenes, den process genom vilken ett fartyg växer från en större befintligt kärl och vaskulogenes, vilket är en nybildning av kärl från bostäder endotel progenitorceller 1,2. Respektive, är den tidigare synonymt med blodflödet, medan den senare tros till stor del äger rum i frånvaro av den.

Samtidig till blodkärlsbildning, en cyklisk och dynamisk process av njur stamcellstransplantation syntes, proliferation och differentiering börjar utvecklas på embryonala dag 9,5 (E9.5). Vid denna punkt i ureteric knoppen (UB) invaderar dorsalt i omgivande metanefrisk mesenkym (MM), och fortsätter fram till födseln 3. Upprepade förgrening av UB in snabbt kondensera metanefrisk cap mesenkym börjar bildningen av de funktionella enheterna i njuren, nephron. Med varje ny generation av UB och Nephron, är äldre generationer förskjuts in inre kortikala och märg regioner, där de sedan genomgå ytterligare mognad och differentiering inom främst vaskulär-täta miljöer. Som framgår av Dressler et al. 3, är detta embryologisk process påskyndades av induktiv signalering, såsom överhörning mellan UB och MM, och en myriad av extracellulära faktorer 3-6. Två nyligen undersökta extracellulära faktorer inom utvecklings bukspottkörteln och njurarna inkluderar syrespänning och blodflöde 7,8. Det senare kommer att diskuteras ytterligare i detalj nedan med avseende på njurutveckling.

För att exponera den induktiva roll som blodflödet spelar potentiellt i nefronet stamceller differentiering, liksom i andra organogenesen processer, exakta metoder för embryonal blodflöde kartläggning är absolut nödvändigt.

Alternativa metoder för att mäta blodflödet inkluderar förskrivning av ultrasound avbildning och harts casts 9,10. Slutgiltigt, har dessa lägen visat sig vara inneboende saknas i deras förmåga att samtidigt presentera tidsmässiga och geografiska sammanställningar mellan blodflöde och stamcellsdifferentiering. Resin avgjutningar, till exempel, ger en giltig modell av fartyget mönstring inom vuxna vävnader, men i omogna fartyg såsom med embryonala tidpunkter, fartyg är grovt underutvecklade och läckande. Därför kastar harts misslyckas att hålla inom de små, ofta poröst, fartyg.

För dessa uppenbara hinder, bland andra, valde vi att införliva ultraljud-guidad in vivo Intrakardiella embryonala tomatlektin (TL) microinjections i våra undersökningar av njurutveckling. I detta förfarande använder vi en ultraljudssond att synkront styra en monterad mikropipett nål fylld med 2,5 ul av TL lösning in i den vänstra ventrikeln av musembryon vid E11.5, E13.5, E15.5 och E17.5 tidpunkterna. E170,5 är den senaste utvecklingsålder som nålarna är inte stark nog att penetrera mer utvecklade embryot.

Fördelarna med denna mikroinjektion metod är riklig. Ultraljud-guidad mikroinjektion möjliggör exakt positionering av en injektionsnål inom embryonala vänster kammare, passiva och kontrollerad utvisning av lösningen i att slå hjärtat av djuret, minimal skada på hjärtat och omgivande vävnader, och undvikande av plötslig hjärtsvikt och död embryo före hela kroppen perfusion. Med användning av en FITC-märkt TL, kommer varje perfusion vaskulatur bibehålla markör längs dess endotel apikala membran. I kombination med immunohistokemi, utnyttja PECAM (CD31, trombocyter endotelcellsadhesion molekyl) och diverse andra vaskulära markörer, har vi möjlighet att tydligt skilja mellan perfusion och un-perfusion fartyg, samt karakterisera något avvikande färgning av omgivande vävnader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: University of Pittsburgh Institutional Animal Care och användning kommittén godkände alla experiment.

1. Beredning av Ultraljud-mikroinjektion Instrument och embryon

  1. Ställ in scenen, mount, och sond (Figur 1) samt kirurgiska instrument (Figur 2). Placera fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning (pH 7,4) i en 37 ° C uppvärmningsbadet. Fyll mikroinjektion nål helt med mineralolja, med hjälp av 1 ml spruta fäst till en andra flexibel 25 G nål, genom sin bas.
  2. Fix nålen på rotation montera armen, och tom nål av mineralolja lösning. Åter fyll med 2,5 pl TL lösning. Se till att inga luftbubblor finns i injektionsnålen. Vrid nålen armen mot väggen, bort från scenen.
  3. Söva den gravida mamman i anestesi kammaren via kontinuerlig infusion av isofluran. När mamma återges medvetslös, överföra anestesi till näsan röret placeras på caudal sidan av scenen, och placera mor i ryggläge med nosen i näsan röret för att möjliggöra en fortsättning på ett helt bedövad tillstånd.
  4. Tape lemmar i 45 ° vinkel, eller med händer och fötter vilade och placerade overtop EKG / temperaturvakt flikar. Det är viktigt att den gravida dammen övervakas kontinuerligt för att säkerställa att anestesi är tillräcklig och att salvan i tillämpad på ögonen för att minska torkning.
  5. Applicera hårborttagning produkt över nedre delen av magen hos modern, torka försiktigt av med torra bomullspinnar, och sedan igen med en 70% etanolmättad tops för att ta bort eventuellt överskott produkt och hår. Se till att rengöra bukhuden bort av allt hår på plats av snitt (Figur 3).
  6. Utför en laparotomi på gravida mamman med fina kirurgisk pincett och sax. Var noga med att undvika att skära några större kärl eller inre organ. Gör först, raka snitt i epidermis 1,5-2 cm ovanför slidan och fortsätter skära in mot revben för approximately 2-3 cm. Exponera subkutana membranet, lokalisera linea alba ("white line") (Figur 3), och skär parallellt med initial snitt, längs samma längd, för att exponera interna viscerala organ och livmodern saccules.

2. Utvinning av embryon

  1. Använd 6-tums bomullspinne applikatorer att manövrera mor och embryon. Tryck försiktigt (tvinga inte) på huden med applikator för att manipulera första embryo ur snitt öppningen. Efter extraktion av det första embryot saccule, sakta och försiktigt dra resten av livmoderhornet genom och på moderns exteriör. Undvik att dra tarmar eller andra organ genom snitt i detta skede.
  2. Kvantifiera embryon och försiktigt placera vänstra livmoderhorn tillbaka in mamma. Sedan börja placera rätt livmoderhornet tillbaka in mamma börjar med embryot saccule längst från slidan på hornet och rör sig nedåt. Fortsätt så tills endast två embryon kvar exponerade (Figur 4). Slutligen till positions embryon i en kolumn ovanför och parallellt snitt linje, som är medveten att inte skära av livmodercirkulationen.
  3. Placera lera block och position mellan armar och kropp, samt ben och svans. Se till att lera ytorna är ungefär i nivå med laparotomi snitt. Blöt med fönster petriskål med 37 ° C PBS.
  4. Fatta sträcker pincett med höger hand och med fönster petriskål med vänster hand (fönster parallellt med embryon) och ta med slutna pincett ~ 5-cm genom fönster, från toppen av petriskålen. Öppna pincett helt utan riva fönster mesh.
  5. Manövrera händerna ovanför embryon och fokusera synen på de två embryo saccules. Utan (eller lätt) röra saccules med fönstergaller eller pincett, skjut dem genom slitsen och ställa petriskål på mammas mage. Med pincett fortfarande förlängas, manipulera med fönster mesh som sittplats det på varje sida och botten av varje embryo (Figur 5
  6. Därefter placerar blå gummi som innehåller väggen i petriskål, utan att klämma eller skadade embryon (Figur 6). Se till att lera block är fast balansering petriskål, embryo, och gummi-innehållande väggen. Slutligen fyll petriskål med 37 ° C PBS tills embryon helt under vatten (Figur 6), samtidigt som man reglerar efter läckor vid med fönster ingrepp.

3. injektionsproceduren

  1. Lägre injektion scen med mor och embryon ner med justering Z-nivå ratten (figur 1) och vrid sedan injektionsnål och montera arm och rada upp direkt med ultraljudssond, med nål ½ cm till vänster och under sondspetsen (Figur 7) . Push nål-arm (ej nål) 45 ° bort från sonden. Var noga med att inte träffa nålspetsen med skålen eller ultraljudssonden.
  2. Höj injektion skede tillbaka till ursprungliga höjden, med ultraljud probe direkt ovanför embryon Probe måste vara något nedsänkt och inom 3-4 mm av embryonal vävnad. Använd X & Y justerings skede rattarna (Figur 8) ändra embryo / mor / stadium position för att systematiskt lokalisera slå embryonala hjärtat.
  3. Direkt Center of ultraljud skärmen observera en svart center målmarkör dras (*). Leta vänster kammare (föredras) eller atrium med hjälp av X & Y justerings skede rattarna (Figur 8) och sedan höja eller sänka scenen med hjälp roterande ratten på scenen för att placera injektionsmålet just över den svarta mittmarkeringen på ultraljudsskärmen.
  4. Använd X justerings skede ratten för att flytta embryo till höger, bort från ultraljudsskärmen. Flytta mikroinjektion nål och arm på plats, ½ cm från och 90 ° till ultraljudssonden (Figur 7).
  5. Använda mikroinjektion montera justeringsvred (Figur 9C-G), ställning nål med spetsen klart aligned med mittmarkeringen. Justera insprutningsvinkel (med hjälp av rattarna i figur 9C & EG), och X, Y och Z vektorer mikro nål för att säkerställa nålspetsen är fokuserad på rätt planet. Dra tillbaka mikroinjektion nål enbart med hjälp av "injektion" ratten (Figur 9F), noga med att inte ställa andra dimensioner.
  6. Igen, med hjälp enbart X finjusteringsstadiet ratten flytta embryo tillbaka under sonden, med målet exakt på mittmarkeringen på ultraljudsskärmen. Se till att den vänstra ventrikeln är nu exakt på samma X-, Y- och Z-planet.
  7. Nästa, med bara "injektion" ratten på mikroinjektion fästet, sakta punktera embryo med mikroinjektion nål och gradvis föra spetsen i vänster kammare. Injicera hela 2,5 pl TL lösningen i vänster kammare eller tills de tomma varnings pip hörs, genom att hålla "tom" och knacka "fylla" en gång (figur 2A & B). Vid denna tidpunktav injektions observera en skugga som emanerar från spetsen av nålen som är TL kommer in i hjärtkammaren (Figur 10). I back, snabbt dra mikroinjektion nål vrida på "injektion" vredet (Bild 9F) på mikroinjektion fästet när injektionen är klar.
  8. Fortsätt till nästa embryo och upprepa proceduren för resterande embryon efter denna serie steg och slutligen placera de sista embryon tillbaka in i dammen buk. Växla anestesi till kammarlåda och försiktigt flytta mor här för 15 min från tidpunkten för den sista injektionen.

4. Skörd Embryon och analys

  1. Offra dammen via cervikal dislokation. Expandera laparotomi snitt för att enkelt ta bort livmoderhornen från modern. Håll embryon inom livmodersäcken. Placera embryon i kylda PBS.
  2. Dissekera embryon från livmoder sac (vid behov samla vävnad för genotypning) och placera hela embryot in 4% paraformaldehyd (PFA) över natten, sedan i 30% sackaros natten, frysa i kryostaten sektione medium. Skär sedan den kryosektion och placera den på bilder för immunhistokemisk analys. Eventuellt använder vävnad för hela montering genom dehydratisering i 100% metanol, efter fixering i 4% PFA.
  3. För immunhistokemisk analys placera kryosnitt i PBS för att avlägsna ULT. Därefter blockera sektioner med 10% normalt åsna serum under 30 minuter. Tillsätt sedan PECAM primär antikropp vid 1: 100 späd natten vid 4 ° C. Nästa dag, tvätta glasen i PBT 3 gånger i 10 min vardera och lägg åsne-anti-råtta 594 sekundär och inkubera under 1 h vid RT.
    OBS: Detta är en mycket krävande teknik som kräver optimering och samordning av ultraljud och mikroinjektion. Det finns en mycket brant inlärningskurva med anknytning till denna teknik och kräver fyra till sex veckor av mentor injektioner innan man blir duktig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kärlbildningen föregår flöde i att utveckla njur

En majoritet av embryonal vävnad (inklusive njuren) innehåller en tät kärl (både unperfused och perfusion), även vid tidiga embryonala tidpunkter. För att bättre mätare och analysera blodflödet inom utveckla njur vi utnyttjade en metod för in utero embryonala intrakardiella microinjections. Med hjälp av en högupplöst ultraljud för att identifiera den embryonala hjärtat vid E11.5 genom E17.5, och efter extraktion och exponering av en enda livmoder saccule via en laparotomi, kunde vi injicera 2,5 pl TL (fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugerad).

Vi har hittat den största framgången injicera E13.5 och E15.5 embryonala tidpunkter, med en framgång på ca ~ 80% till 90%, respektive. På grund av närvaron av en relativt omogen hjärta vid E11.5 och en tillvaro av tät brosk och bildning av ben vid E17.5, den avsides belägna timig punkter är jämförelsevis svåra att injicera, med en betydligt lägre sannolikhet för framgång i jämförelse med de mellersta embryonala tidpunkter. Man kan förvänta sig åtminstone ~ 50% och ~ 30% träff med E11.5 och E17.5 tidpunkter, respektive.

Genom samtidig märkning vävnad med PECAM (CD31), en universell endotel markör, har vi möjlighet att kvalitativt kategori fluorescerande fartyg och vävnader i tre grupper: perfusion kärl (PECAM positiv & TL positiv), unperfused kärl (PECAM positiv), och avvikande perfunderad strukturer (TL positiv). Denna speciella färgningsmönstret tillåter oss att rumsligt skilja mellan områden med perfusion och un-perfusion (Figur 11).

Vid E11.5, upptäckte vi att perfusion fartyg kapsla in utveckla njur i en webb-liknande mönster utan faktiskt tränger in i orgeln (Figur 12B). Genom E13.5 har stora fartyg perfusion med några av de mindreaccessory fartyg färgning med TL (Figur 12C). Färgning kan också ses inom några av ureteric epitel, kan detta antingen vara från glomeruli som redan är perfusion eller på grund av den inneboende läckage av tidiga embryonala fartyg. Genom E15.5 stora fartyg perfusion, kunde också observeras dock ett stort antal glomeruli håller TL fläcken, vilket tyder på att betydande filtrering sker (Figur 12D). Även vid denna tidpunkt ett antal mindre kaliber fartyg verkar perfusion, även om en betydande del av den yttre nefrogen zonen verkar sakna blodflödet. Slutligen dock av E17.5 en majoritet av njuren var perfusion utom för kärl av nefrogen zonen, som är övervägande saknar perfusion (dock tätt i PECAM positiva kärl) vilket indikerar en frånvaro av angiogenes i perifera regioner. Mindre kaliber fartyg innehåller TL och det genomsnittliga antalet perfuserade glomeruli har dramatisktökat i jämförelse med tidigare tidpunkter (figur 12e).

Figur 1
Figur 1. Ultraljud sond, kirurgisk skede, mikroinjektion systemet, järnvägssystem, och EKG / Temperaturvakt grundläggande installation.

Figur 2
Figur 2. Nödvändig kirurgisk utrustning, lösningar och enheter. (A) bomullspinne applikatorer. (B) Förlänga (ring) pincett. (C) kirurgisk sax. (D) Blunt-tippade pincett. (E) fin pincett. (F) mikroinjektion Needle (ORIGIO, # C060609). (H) Injektion / Fill regulatorn. (I) Fosfatbuffrad saltlösning (PBS). (J) mineralolja (Sigma Aldrich).

Figur 3
Figur 3. En 2-cm laparotomi utförs på sövda mor, utsätta subcutis (bukväggen) ovanför livmodern. Använda de kirurgiska saxar och fin pincett, exponera linea alba och göra snitt parallellt med epidermal cut. Klicka här för att en större version av bilden.

Figur 4
Figur 4. 1-2 E15.5 livmoder saccules utvinns genom laparotomi snitt och exponeras. Klicka här för att se en störreversion av figuren.

Figur 5
Figur 5. Utsatt livmoder saccules guidas genom skåra i med fönster petriskål med hjälp sträcker pincett. Fenestrated meshning säten tätt vid basen av saccules.

Figur 6
Figur 6. Blå innehåller vägg placerad till höger om livmoder saccules. Petriskål fylld med 37 ° C PBS tills embryon och innehåller väggen är helt under vatten. Clay block placeras säkert i Petri-skål / embryo mellan armar och kropp och ben och svans.

Figur 7
Figur 7. Insprutningssystem positionering ned ½ cm till vänster och nedan, och 90 ° till ultraljudssonden.

Figur 8
Figur 8. Steg X- och Y-justeringsmekanismer.

Figur 9
Figur 9. Tom / Fill enhet, mikroinjektion systemet, och scen fäste. (A) Fill-knapp. (B) Injicera knappen. (C) Rundsticka vinkeljusteringsratten. (E) Fina X justeringsratten. (F) "Injection" ratten. (G) Kurs X justeringsratten. (H) Stage revolverhöjdjusteringsvredet.

98fig10.jpg "/>
Figur 10. Ultraljud bild av E15.5 Intrakardiella TL mikroinjektion. Nålspetsen är placerad inuti hjärtkammaren, är TL-lösning indikeras av svart skugga inom två kamrar. Hjärtsäck och perikardiell hålighet lätt differentieras.

Figur 11
Figur 11. Områden mellan perfusion, unperfusion och avvikande färgning skönjas. Visar den första panelen på PECAM fläcken. Den mellersta panelen visar TL fläcken över exakt samma område av vävnad. Ureteric knopp är onormalt färgas; stora fartyg är inneslutna av vita streckade linjer. Den sista panelen är sammanfogningen. Vita pilar indikerar läckage kärl, och grå pilar visar en övergång till ett fartyg blir perfusion. Gula strukturer är helt representativt för perfusion vaskulatur.oad / 52398 / 52398fig11large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av bilden.

Figur 12
Figur 12. Embryo och njure perfusion ontogeny undersöks. (A) Hela E11.5 embryo perfusion, med mycket perifera kärl inom huvud och svans regioner håller TL. (B) perfusion fartyg sågs kring men inte införda i den utveckla njur vid E11.5 i en webb-liknande mönster, finns det också en ganska stor mängd diffus färgning på denna punkt. (C) E13.5 njure visar stora, grovkalibriga fartyg perfusion hela njuren (vit och gul pil), med perfusion frånvarande inom nefrogen zon (vit streckad linje). (D) E15.5 njure visar perfusion hela finkalibrig, perifera kärl (gula pilar),i vissa glomeruli (vita pilar), och återigen en avsaknad av perfusion vid perifer njure mantel. (E) E17.5 njure visar stor perfusion hela glomeruli (vita pilar) och finkalibriga fartyg (gula pilar). Den nefrogen zonen är omöjlig att skilja från resten av njuren vid denna förstoring. Klicka här för att se en större version av bilden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroinjektion anestesi och tidsram

När det gäller bedövning av mamman, är det viktigt att hålla luftflödet konstant (2-3 L / min) och vid låg PSI. Flödet av lugnande medel måste hållas vid ca 1,75-2 L / min. Samtidigt måste tidsramar där injektionerna sker noga övervakas och kontrolleras för med varje kull. För varje kull injektionsproceduren bör hållas under 45 min. Betydelsen av denna tidsfrist är avgörande för experimentet, eftersom varje embryo måste hållas inom en konstant, normal puls intervall för att underlätta kontrollerad och oföränderlig perfusion i hela kroppen och organ av intresse. Vi har funnit att förlänga injektioner ger tvivelaktiga resultat och fluktuationer i perfusion mönstren mellan embryon och sänker andelen lyckade injektioner (dvs, långsam hjärtfrekvens, hjärt död). Slutligen, efter den sista injektionen inom kullen är det viktigtatt tillåta ca 15 min innan embryon skördas för att underlätta en korrekt, fullständig perfusion inom varje embryo.

Procedur behandling och vård av embryon

Under extraktionen av embryona, har vi funnit högre hastigheter av framgång med injektioner som åstadkoms genom att kontinuerligt sköta den övergripande hälsa och integritet av livmoderslemhinnan och embryon under embryoutvinning. Använda den känsliga bomullspinne applikatorer (mättade med PBS) för att manipulera och manövrera livmodersäcken och saccules är absolut nödvändigt för att säkerställa överlevnaden av mor och embryon under hela förfarandet. För det första är det viktigt att se till att den fysiska integriteten av livmodern och moderkakan är väl underhållna. Undvik contorting de saccules på ett sätt som kommer att hindra blodflödet till embryon eller orsaka betydande sprickor i blodkärlen som försörjer blodflödet till moderkakan. Detta kan åstadkommas genom att extrahera en maximalt hoppm 1-2 embryon på en gång (såvida extrahera hela livmoder sac för initial count) och genom att placera applikatorer bort från stora blodkärl vid basen av moderkakan.

Destination av embryonala injektionsstället

Vägledande mikroinjektion nålen på rätt plats med ultraljud maskin är också kritisk till varje injektion försök. Noggrann uppmärksamhet måste ägnas åt lokaliserings och centrering av vänster kammare på mittmarkör. Efter detta måste nålen vara placerad och centreras exakt på mittmarkeringen samt för att rikta nålen och injektionsstället på samma X- och Y-planen. När detta är klart, långsamt dra nålspetsen närmare insprutningsstället och undvika att applicera otillbörlig påkänning på hjärtsäcken och hjärtat. Detta görs genom att tillåta att nålen gradvis passera genom tissueskikt, snarare än att tvinga passage av nålen genom dem. Under injektion, är det också viktigt att look ut för en svart skugga som kommer från nålspetsen (Figur 10). Detta är indikativt av TL lösningen fyller ventrikeln. Om nålspetsen är i rätt läge, bör skuggan kontinuerligt dyka upp och försvinna som TL matas ut i aorta. Men Om perikardiell kaviteten tycks uppsluka, är detta vägledande att nålen på mål av vänster kammare och TL lösningen fyller hjärt hålrum som omger hjärtat. Detta är ett vanligt misstag som lätt korrigeras genom att flytta injektionsnålen på X och Y-planet, med eventuella smärre justeringar som sker med nålen fortfarande inom embryot. Undvik extrahera nålen från embryot i detta skede.

Ultraljud styrd in vivo mikroinjektion begränsningar

Naturligt, ultraljudsmikroinjektion besitter ett antal grundläggande tekniska begränsningar. Först och främst, mikroinjektion nål volymenkapacitet begränsar åldern av injektioner till E17.5 i musen. 2.5 pl TL-lösning har visats i våra studier att helt BEGJUTA embryon upp till E15.5. Men precis efter denna tidpunkt, TL blodvolymförhållandet blir att minimal och späddes för att effektivt märka perifera renala endoteliala membran. Sålunda är en minskad bild av blodflöde närvarande vid senare tidpunkter punkt injektioner. Dessutom bildandet av ben och brosk i embryot skapar en naturlig barriär för nålspetsen, vilket leder till förlängda insprutningstider och täta sprickor i nålen huvudet. Dessa begränsningar kan övervinnas genom att använda en nya injektioner system med större nål styrka och volymkapacitet.

Alternativa embryonala blodflödet kartläggningstekniker

Hittills alternativa metoder för kartläggning embryonala mus blodflöde omfattar genomförandet av harts avgjutningar, immunohistokemi färgning, och hög resolut ion ultraljudsundersökningar. Som harts avgjutningar (med integrering av avancerad avbildningstekniker) är för närvarande den mest populära alternativet, kommer detta att diskuteras mer i detalj nedan. Resin avgjutningar möjliggöra skapandet av noggranna tredimensionella representationer av flödet inom postnatal organ. Emellertid har liten framgång har haft med bildbehandling prenatal njurvävnad pga poröst blodvaskulaturen och begränsningar i upplösning. I jämförelse, konjugerade TL fläckar möjliggöra bindning till endotel membranantigener som leder till en högre grad av precision. I andra fall, harts gjutna viskositet förtid stympar flöda in glomeruli fartyg och små kapillärbäddar, skapa prövningsbegränsning vid högre förstoringar. Vid lägre förstoringar, är denna teknik klart lönsamt att etablera flödesmönster i relation till utvecklingsregioner. Omvänt tillåter TL högupplösande analys av blodflödet i förhållande till utvecklings strukturer på cellnivå.

ent "> Framtida tillämpning och riktningar

Våra data tyder på att blodflödet och syresättningen är kritiska faktorer med avseende på nefronet stamfar differentiering. För att ytterligare belysa sina roller i njur utveckling måste framtida utredningar avgränsa underliggande anatomiska mekanismer fällnings denna fysiologisk process samt undersöka transkriptionsignalvägar som förmedlar detta fenomen också. En hypotes, när det gäller att överbrygga klyftan mellan fenomenet och mekanismen är att glatta muskelceller och pericyte aggregat spelar bidragande roll i iscensättandet gående trunkering av blodflödet i stamcells regioner i utvecklings organ. För att testa detta, måste ytterligare immunofluorescerande färgning och analys genomföras med fokus på dessa celltyper vid nefrogen zonen gränsen. När det gäller framtida undersökningar av underliggande signalvägar, skulle vi vilja undersöka roller hypoxi inducerbara faktorer ochVon Hippen Lindau signalvägar. Båda dessa har i stort sett varit inblandad i hela litteraturen som att spela viktiga roller induktiva upprätthålla hypoxisk och oxygene miljöer inom stamcells regioner (till stor del ses som hypoxisk) och områden av differentiering (områden som är i störst behov av syresättning), respektive. Dessutom vill vi att förhöra roll erytropoietin (EPO) vid medieprocesserna angiogenes och vaskulogenes hela njurkärlutveckling. EPO är en njur glykoprotein som spelar avgörande roller i endotel differentiering och underhåll. Dess roll i blod medierad endotel differentiering är till stor del okända. Slutligen vill vi föra in vivo mikroinjektion experiment med vasodilatation föreningar för att ytterligare stärka giltigheten av dessa undersökningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Sigma Aldrich 022M4004V concentration 1:5,000
Pecam BD Biosciences 553370 concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin Vector Laboratories FL-1321 concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat) Jackson Immunoresearch 712-585-150 concentration 1:200
Microinjection Needle Origio Mid Atlantic Devices C060609
Mineral Oil Fisher Scientific BP26291
1 ml syringe Fisher Scientific 03-377-20
Clay Blocks Fisher Scientific HR4-326
Surgical Tape Fisher Scientific 18-999-380
PBS Fisher Scientific NC9763655
Hair Removal Product Fisher Scientific NC0132811
Surgical Scissors Fine Science tools 14084-08
Fine Forceps Fine Science tools 11064-07
Surgical Marking Pen Fine Science tools 18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy) Fine Science tools 11151-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
  2. Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8, (6), e65993 (2013).
  3. Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136, (23), 3863-3874 (2009).
  4. Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (5), 693-713 (2012).
  5. Costantini, F., Kopan , R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development. Dev Cell. 18, (5), 698-712 (2010).
  6. Das, A., et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat Cell Biol. 15, (9), 1035-1044 (2013).
  7. Rymer, C., et al. Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation. Am J Physiol Renal Physiol. (2014).
  8. Shah, S. R., et al. Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation. Developmental biology. 349, (2), 342-349 (2011).
  9. Andres, A. C., et al. EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts. Mech Dev. 120, (4), 511-516 (2003).
  10. Wagner, R., et al. High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT. Microsc Microanal. 17, (2), 215-219 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics