La culture de

Immunology and Infection
 

Summary

Heligmosomoides polygyrus est un nématode murin avec de puissantes capacités immunomodulateurs qui ressemblent étroitement à celles de l'infection hautement répandue helminthes humaine. Ici, nous décrivons un protocole pour le maintien à long terme de la H. polygyrus cycle de vie.

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Johnston, C. J., Robertson, E., Harcus, Y., Grainger, J. R., Coakley, G., Smyth, D. J., McSorley, H. J., Maizels, R. Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products. J. Vis. Exp. (98), e52412, doi:10.3791/52412 (2015).

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Abstract

Heligmosomoides polygyrus (anciennement connu sous le nom Nematospiroides dubius, et également appelé par certains comme H. bakeri) est un helminthes gastro-intestinal qui emploie plusieurs mécanismes immunomodulateurs d'établir une infection chronique chez la souris et étroitement ressemble infections prévalentes d'helminthes humaines. H. polygyrus a été largement étudié dans le domaine de la régulation immunitaire helminthes dérivé et a été trouvé pour supprimer puissamment modèles expérimentaux de l'allergie et de l'auto-immunité (à la fois d'une infection active et produits sécrétés isolés). Le protocole décrit dans le présent document décrit la gestion du H. polygyrus cycle de vie pour la production de larves L3 cohérente, la récupération des parasites adultes, et la collecte de leurs produits d'excrétion-sécrétion (HES).

Introduction

Heligmosomoides polygyrus est un helminthes gastro-intestinal murin naturel qui est étroitement liée à la très répandues nématodes parasites humains 1. Contrairement à d'autres modèles, tels que nématodes Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus établit toujours une infection chronique chez la souris comme un résultat direct de plusieurs mécanismes de immunomodulateurs puissant qu'il emploie pour supprimer l'hôte de la réponse immunitaire 2.

H. polygyrus a un cycle de vie direct: larves L3 infectieux sont ingérés par transmission féco-orale (ou administré par gavage oral dans le cadre d'un laboratoire), après quoi ils migrent vers la couche de sous-séreux du duodénum et enkystent avant de revenir à la lumière intestinale comme vers adultes environ huit jours après l'infection initiale. L'accouplement et la production d'oeufs se produit par jour 10 et il est possible de récolter les vers adultes pour la culture et la collecte de produits d'excrétion-sécrétion de da14 y compter trois. H. polygyrus interagit également avec la microflore commensale, à une augmentation de lactobacilles présente chez les souris sensibles infectés 4-6, et l'augmentation des niveaux de H. polygyrus infection après exposition des souris à 6 lactobacilles.

Infection active à H. polygyrus a été démontré que la protection contre l'immunopathologie dans de nombreux modèles animaux de l'auto-immunité 7-10, la colite 11,12 et 13 à 16 allergie. Il a donc été un grand intérêt dans le potentiel de molécules excréteur-sécrétoires de ce parasite ("HES") en bas-modulent pathologie in vivo 17,18. En effet, des effets protecteurs sont vus après le traitement des souris avec des produits HES 19 par des voies qui sont maintenant identifiés 18,20. Ici, nous décrivons un protocole pour la production fiable de Heligmosomoides polygyrus et la récupération de ses produits sécrétésqui peut être en outre utilisés pour une gamme d'études biochimiques et immunologiques fonctionnels.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures dans ce protocole sont effectués conformément aux lignes directrices énoncées par le Royaume-Uni Home Office et de l'Université des Services vétérinaires Edimbourg.

1. L'infection de souris par gavage

  1. Magasin Heligmosomoides polygyrus L3 larves dans l'eau distillée jusqu'à six mois à 4 ° C.
  2. Avant utilisation, lavez larves L3 trois fois dans l'eau distillée: centrifuger à 300 g pendant 10 min (avec frein), mais enlever tous les 500 pi d'eau (pour éviter les larves L3 granulés inquiétante) et remettre le culot à chaque fois.
  3. Pour le troisième lavage, ajouter de l'eau à un volume exact (typiquement 40 ml) et aspirer 20 pi avec une pointe coupe 200 pi d'élargir son ouverture. Placer deux échantillons de 20 ul sur la surface d'une boîte de culture de 60 mm et compter les larves L3 (généralement mobile, et mieux vu sous un grossissement de 50X avec un microscope à dissection). Remettre en suspension le culot final dans de l'eau distillée à une Concentration de 2000 larves L3 par ml.
  4. Pour la production du cycle de vie, d'infecter (C57BL / 6xCBA) souris F1 huit semaines, âgé de 400 H. polygyrus larves L3 dans 200 ul d'eau distillée par gavage par voie orale (souris retenir en position verticale par la peau du cou et passer doucement l'aiguille de gavage émoussée par la bouche et de l'œsophage dans l'estomac). Bien agiter avant chaque infection (larves se installent rapidement dans l'eau) et aspirer 200 pi dans une seringue de 1 ml; utiliser une aiguille de gavage dédiée à bout arrondi. Pour l'infection expérimentale de souris plus jeunes (6-8 semaines anciens), ou d'autres souches consanguines (par exemple C57BL / 6 ou BALBc), infecter des souris avec 200 larves L3.

2. Propagation et entretien de H. polygyrus

  1. Placez charbon dans le centre d'une grande baignoire en plastique et laissez l'eau froide du robinet afin de fonctionner au-dessus d'un minimum de 30 min (non lavés charbon actif est toxique pour les larves L3). Videz l'eau de la baignoire et placer le charbon de bois sur tDeux couches de papier absorbant, le laissant exposé à l'air ambiant jusqu'à séchage complet.
  2. Si les œufs sont nécessaires, gratter les matières fécales premier sur le côlon avec des pinces et ciseaux (si nécessaire). Si un grand nombre de larves L3 est nécessaire, placer des souris sur une grille de fils et de recueillir des boulettes fécales sur plusieurs jours.
  3. Mélanger les selles avec du charbon de bois granulé à un rapport d'au moins 1: 1, pour obtenir une consistance juste humides assez pour adhérer à papier filtre. Appliquer une fine couche sur le centre de certains papier filtre humide dans une boîte de Pétri et placer dans une boîte humide (ajouter un peu de serviette de papier humide et un plat d'eau) dans l'obscurité pendant 12 à 14 jours.
  4. Retirer larves L3 de 7 jours à compter, et les recueillir sur au moins deux reprises avant que le papier est jeté. Les larves former un anneau autour du bord du papier filtre; soulever le papier filtre sur la boîte de Pétri et rincer les larves qui sont à gauche de la plaque (en utilisant une pipette et 5 ml d'eau stérile par plaque) dans un tube de 50 ml.
  5. Ascenseurle papier filtre et récolter les larves restant à gauche sur la plaque avec de l'eau distillée dans un tube de 50 ml. Centrifuger la solution d'effluents à 300 g pendant 10 min. Laver les larves trois fois à l'eau distillée, puis stocker à 4 ° C dans un maximum de 50 ml d'eau distillée jusqu'au moment requis.
    REMARQUE: Les larves restent viables et infectieux pendant au moins six mois.

3. Collection des adultes H. polygyrus Worms

  1. Préparer l'appareil Baermann modifié à l'avance comme représenté sur la Figure 1.
  2. Souris Cull quatorze jours après l'infection.
  3. Laver l'abdomen avec 70% d'éthanol. Couper la peau sur l'abdomen et tirez pour révéler la paroi abdominale antérieure. Faire une incision médiane pour entrer dans la cavité péritonéale.
  4. Retirer l'ensemble du petit et grand intestin (du duodénum proximal rectum distal). Placer dans une boîte de Pétri sec.
  5. Redresser l'intestin sur toute sa longueur; exciser le côlon fèces contenant; placer cela dans un plat à part pour les préparations d'œufs plus tard.
  6. Exciser les proximales 20 cm de l'intestin grêle qui contient les vers adultes -identified par la paroi relativement épaisse du duodénum et souvent un aspect rouge dues à des vers intra-luminal. Placez dans un (100 mm de diamètre) boîte de Pétri avec 5 ml de la solution de Hanks, chauffée à 37 ° C (deux spécimens par boîte).
  7. Ouvrez la partie de l'intestin proximal ver rempli longitudinalement avec des ciseaux (ciseaux à bout rond sont les meilleurs pour cela), et racler l'intérieur de paroi intestinale avec deux lames de verre pour enlever les vers. Puis jetez la paroi intestinale propre.
  8. Vers pointe dans de petits sacs de mousseline, base fermée et sécurisée avec trombones autour du bord de l'entonnoir de verre (Figure 1).
  9. Remplissez entonnoir avec une solution de Hanks et ajouter environ 4 boîtes de Pétri de vers dans chaque entonnoir.
  10. Placez l'appareil sur 37 ° C incubateur pendant 1-2 heures, en agitant doucement à mi-parcours pour délogerles débris de la préparation de l'intestin qui peuvent obstruer le filtre de mousseline. Prenez soin d'éviter le déversement de débris à l'extérieur du sac de mousseline - cela va causer une contamination de la préparation finale HES. Les vers adultes auraient lentement migré à travers le tissu de mousseline et se sont installés au fond du tube à essai en verre. Détacher délicatement le tube à essai dans le tuyau en caoutchouc reliant dessus de l'évier (en prenant soin d'éviter de perdre des vers à ce point).
  11. En utilisant une pipette en plastique, transférer les vers dans un tube de 50 ml et laver six fois avec Hanks Solution (permettent de vers à régler avec gravité, supprimer les médias avec un Stripette, ajouter 40 ml de Hanks Solution et répéter cinq fois).
    REMARQUE: la culture du ver doit être maintenue stérile partir de ce point.
    1. Déplacer vers une hotte à flux laminaire et laver encore six fois dans une solution stérile de Hanks additionné de 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine, prêt pour la culture in vitro.
  12. Comptez levers adultes récupérés en prenant deux échantillons de 20 ul prises avec une pointe jaune coupe d'élargir son ouverture; attendre environ 50% de la quantité de larves inoculées.

4. Configuration de cultures pour HES: Préparation Moyen, adultes Worms

  1. Tremper les vers de 3,11 à environ 10 ml de RPMI additionné de 10% de gentamycine pendant 20 min, en laissant reposer le tube à un angle pour assurer des vers sont entièrement couverts.
  2. Effectuer cette dans une hotte à flux laminaire: laver à nouveau six fois avec une solution de Hanks (complété avec 5 U / ml de pénicilline et 5 ug / ml de streptomycine).
  3. Préparer H. polygrus médias.
  4. Le maintien de la stérilité dans une hotte à flux laminaire, à 500 ml de RPMI1640, ajouter 11,1 ml de 45% de glucose (concentration finale de 1,2% comme RPMI 1640 contenant 0,2% de glucose), 5 ml de 100x Peniclllin-streptomycine (concentration finale de 5 U / ml de pénicilline, 5 ug / ml de streptomycine), 5 ml de L-glutamine (2 mM de concentration finale), et5 ml de gentamycine (concentration finale 1%). Ne pas ajouter de FCS.
  5. vers aliquotes dans des flacons T25 ventilés, env. 1000 vers dans 15 ml H. polygyrus médias par flacon, et le lieu debout dans 37 ° C incubateur (5% de CO 2) pour trois semaines.

5. Préparation de HES

  1. Récupérer HES-contenant des milieux de culture à partir de cultures à des intervalles de plus de deux fois par semaine, l'annulation de la première collection après 24 h de la culture (en raison de niveaux élevés de contamination LPS et protéines de l'hôte - peuvent être traitées séparément ou mis au rebut). Gardez chaque collecte séparée et clairement étiquetés avec le numéro de date et lot. Remplacer avec un volume égal de H. polygyrus médias à chaque fois.
  2. Centrifugeuse HES-contenant les médias à 400 x g pendant 5 min. Puis filtrer stériliser par 0,2 um filtres à faible liaison aux protéines en tubes de 50 ml. Magasin dans le congélateur à -20 ° C clairement étiqueté avec la date de la récolte du ver et la date de HES collection.
  3. Après 21 jours de collecte HES de la culture, jeter vers.
  4. Piscine 500-1000 ml de surnageant HES (habituellement de stock congelé, et non y compris la collecte premières 24 h) et se concentrer sur un filtre de 3000 MWCO dans le dispositif d'ultrafiltration sous pression d'azote.
    NOTE: Soyez très prudent de ne pas laisser le filtre à sec.
    1. Pour mettre en place le dispositif de filtrage, d'abord laver le côté brillant de la membrane 3 kDa dans un bécher de 1 litre avec de l'eau distillée pendant 3 x 20 min tout en remuant. Monter le dispositif d'ultrafiltration selon les instructions du fabricant avec membrane filtrante côté brillant vers le haut. Lieu dans l'armoire à 4 ° C et passer 50 ml d'eau distillée à travers avant de commencer à se concentrer HES en gestion commune.
    2. Ajouter dans chaque tube de HES dans le dispositif de filtration selon les besoins (100 à 140 ml par jour), jusqu'à ce que le volume est concentré jusqu'à 2-5 ml.
  5. Afin d'éliminer les contaminants de milieux de culture contenant HES, ajouter 50 ml de pyrfibrinogène exempt de PBS au dispositif de filtration et vers le bas et ensuite concentré à environ 2 ml. Répétez cette étape deux fois (150 ml de PBS au total). Transfert HES dans un tube de 15 ml, stériliser par filtration (avec un filtre de 0,2 um) dans une hotte à flux laminaire et mesurer la concentration de protéine en utilisant un spectrophotomètre (E = 10 280) ou par dosage de Bradford.
  6. Aliquote, étiquette avec numéro de lot et la date, et le gel à -80 ° C.
  7. Effectuez un test de LAL chromogène selon les protocoles du fabricant sur chaque lot de HES avant de l'utiliser. Si les niveaux de LPS sont supérieures à 1 U LPS pour 1 pg de protéine, envisager de ne pas utiliser ce lot pour des expériences in vivo ou in vitro de cultures.
  8. Traiter les HES recueillies à 24 h séparément de la même manière; elle contient le LPS et des protéines de l'hôte et, tout en ne convient pas pour des expériences fonctionnelles, il est une source utile de molécules individuelles qui peuvent être isolés par monoclonal purification par affinité d'anticorps.

Representative Results

Susceptibilité à l'infection par H. polygyrus est contrôlée dans une large mesure par l'arrière-plan génétique de la souche de la souris (tableau 1); Souris C57BL / 6 et de l'ABC sont très sensibles 21,22. Pour l'entretien du cycle de vie du parasite, l'hybride F1 entre ces deux souches a été choisi pour sa capacité à résister beaucoup plus élevés charge parasitaire sans morbidité (dommages épithéliales intestinales excessive) soit par rapport à la souche parentale. Gavage oral de 400 larves L3 est utilisé pour maintenir le cycle de vie chez les souris F1 (résultant en charge parasitaire adultes présentés dans la figure 2), tandis que la dose de 200 larves L3 est généralement utilisé pour des expériences de souches consanguines homozygotes (par exemple, C57BL / 6 ou BALBc). Toutefois, cette dose peut être nécessaire de réduire en fonction de co-facteurs environnementaux qui peuvent différer entre les établissements d'origine animale, tels que les variations de la flore intestinale.

Lots de HES ont prouvé effi reproductiblecacité dans des dosages fonctionnels et de la composition de protéine; De plus, quand les surnageants de chaque semaine successive de culture ont été analysés, jusqu'à un total de 4 semaines, les profils de protéines se sont avérées très similaire (figure 3). Lorsque la concentration HES est mesurée par dosage de Bradford (voir 5.5), le total protéine est généralement d'environ 1 mg / ml (Figure 4).

Un autre procédé de concentration HES est un concentrateur centrifuge (par exemple des membranes de coupure Vivaspin 3 kDa), dans lequel les échantillons sont centrifugés à jusqu'à 4000 g dans un rotor centrifuge pivotant vers l'extérieur, l'élimination des sels tampons et des composants de faible poids moléculaire. Concentration centrifuge est plus adapté aux petits volumes de traitement (1-10 ml) et sont limitées à un facteur de concentration maximum d'environ 30x.

Lors de la collecte HES, éviter la contamination est critique. Pour éviter la contamination avec des molécules d'accueil, nous écartons HES-suiteaining milieux de culture à partir de la 24 première heure après la récolte du ver adulte de l'intestin de la souris. Nous quantifions également le niveau de contamination LPS dans chaque lot de HES avec un dosage chromogénique LAL (voir 5.7). 1 U de LPS équivaut à ~ 100 pg LPS et des niveaux inférieurs à ce 23 sont considérées comme négligeables. Dans nos mains, la plupart des lots de HES sont nettement en dessous de cette limite, la concentration moyenne de LPS dans HES étant 0,23 U / pg (Figure 5). Les effets de LPS dans des modèles in vivo de pathologie (par exemple, la suppression des réponses asthmatiques) nécessite au moins 10 ng de LPS 23. Ainsi, dans l'administration in vivo de 5 ug HES partir d'un lot de 100 pg LPS / pg HES comprendra 500 pg de LPS, bien en dessous de la concentration efficace lorsque LPS devient un problème.

Figure 1
Figure 1: Appareil Baermann BaerAppareillage mann pour la collecte des adultes de H. polygyrus (tel que décrit dans la section 2).

Figure 2
Figure 2: moyenne Worm Burden 14 jours après l'infection avec 400 larves L3 ver moyenne pèse 14 jours après l'infection avec 400 larves L3. Les points de données sont présentés à partir de 19 tours de l'infection de souris C57BL / 6xCBA distincts. Moyenne ± SEM montrée.

Figure 3
Figure 3: profils protéiques de HES partir semaines consécutives dans la culture profil SDS-PAGE de protéines HES recueillies au cours des semaines successives de la culture.

Figure 4
Figure 4: Quantité final de HES de 500 ml contenant ES médias rendement de protéines HES de 11 lots différents provenant d'environ 500 ml de surnageant de culture. Moyenne ± SEM montrée.

Figure 5
Figure 5: LPS contamination de niveaux de contamination HES LPS en 41 lots d'HES mesurées par le test de Limulus ameobocyte. Concentration médiane LPS = 86 U par mg de HES.

Figure 6
Figure 6: Schéma d'animation de H. Résumé du cycle de vie polygyrus des étapes clés du cycle de vie du gavage des larves L3, grâce à la récupération des larves et les vers adultes à l'isolement des HES.


Figure 7: Schéma d'animation des HES et ses fonctions d'effets immunomodulateurs clés de médiateurs solubles et exosomes contenues dans HES.

Génotype (et la souche de fond) Phénotype de l'infection primaire Référence
Souches consanguines
A / J, ABC, C3H Très sensible 22,29
C57BL / 6 et des souris C57BL / 10 Sensible 22,30
BALB / c, DBA / 2, 129 / J Intermédiaire 22,31
NIH, SJL, SWR Faible sensibilité 22,32
Transgénique pour des cytokines ou des récepteurs de cytokines
IL-1β - / - Plus sensibles 33
IL-1R - / - Moins sensible (a); aucune modification de la sensibilité, mais une augmentation des granulomes (b) (A) 33
(B) 34
IL-2Rß transgénique (C57BL / 6) Résistant 35
IL-4 - / - La fécondité supérieur 36
IL-4R - / - (souris C57BL / 6 ou BALB / c) Très sensible 22
IL-6 - / - (souris BALB / c ou C57BL / 6) Très résistant 37
IL-9 transgéniques(FVB) Résistant 38
IL-21R - / - (C57BL / 6) Insuffisantes Th2, diminué granulome gormation 39,40
IL-25 - / - (BALB / c) Plus sensibles 33
IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) Aucune modification de la sensibilité 33
TGFβRIIdn (C57BL / 6) Haute Th1, sensibilité accrue 41,42
Transgénique pour les marqueurs de cellules T
CD28 - / - (BALB / c) La fécondité légèrement supérieur 43
CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) La fécondité supérieur 44
OX40L - / - (BALB / c) La fécondité supérieur &# 160; 45
Transgéniques pour loci immunitaire innée
Type 1 récepteur de l'interféron (IFNAR) - / - (C57BL / 6) La fécondité supérieur, plus de granulomes 34
MyD88 - / - (C57BL / 6) Plus résistantes, plus de granulomes 34
C-KitW / Wv (WBB6) Plus sensibles 46,47

Tableau 1: infections primaires avec H. polygyrus dans des souches génétiquement différentes et gènes ciblée souris.

Discussion

Le cycle de vie de H. produit de polygyrus d'une manière fiable cohérente. Après l'ingestion naturelle ou gavage oral de L3 larves au jour 0, les kystes commencent à se former sous la séreuse duodénale par jour 5, progressant vers mues larvaires, puis en train de devenir des vers adultes dans la lumière intestinale du jour 10, les oeufs peuvent être vus dans les selles de 14 jours et les granulomes sont visibles sur la surface séreuse du duodénum au jour 21. Le protocole décrit ci-dessus (et résumés dans la figure 6) permet une production à haut débit de H. produits polygyrus de excréteurs-sécrétoire (HES), en plus de la récupération fiable des larves L3 viable pour les futures infections expérimentales du cycle et de la vie.

L'infection à H. polygyrus a été montré pour avoir un effet protecteur dans des modèles de l'asthme dépendant de OVA ou Der p 1 (acariens allergène) 14. En outre, la suppression de l'inflammation des voies aériennes peut être transférée avec CD4 + CD25 + + 14 ou CD23 des cellules B réglementaires hi 24 de non-sensibilisés, H. polygyrus infectés par souris. Dans les modèles d'auto-immunité, H. polygyrus infection a été montré pour être suppressif dans le modèle encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) de la sclérose en plaques 9, et la suppression peut être transféré avec des cellules T CD4 + ou des cellules B CD19 + de souris infectées 24.

Produits d'excrétion-sécrétion de Heligmosomoides (HES) modulent la réponse immunitaire de l'hôte et supprimer l'inflammation médiée par Th2 par un certain nombre de mécanismes (décrites dans la figure 7), comprenant: a) Inhibition de la réponse des cellules dendritiques pour stimulation 25, b) induction de CD4 lymphocytes T régulateurs Foxp3 + + 18. et c) le blocage de l'IL-33 la production 20. HES a montré un effet protecteur lorsqu'il est administré unet sensibilisation ou un défi dans le modèle OVA-alun de l'asthme 19 et également lorsque administré par voie intranasale avec l'extrait de Alternaria allergène 20, par la suppression de la petite IL-33 de presse. Éviter la contamination LPS des HES est souvent cruciale pour le succès des futures expériences immunologiques. Dans le protocole décrit ici, les étapes critiques dans la réalisation de cet doivent se assurer que les débris contenus dans les sacs de mousseline de l'appareil Baermann ne entre pas dans la préparation de HES final (voir 2.10) et de mettre de côté la solution ES à partir des 24 premières heures de la culture (voir 5.1).

Au cours des dernières années, HES a été caractérisé à fond au niveau protéomique avec plus de 370 protéines distinctes identifiées 26,27. En outre, ES à partir du 4ème stade larvaire a été soumis à l'analyse protéomique 28. Les travaux en cours comprend la caractérisation des composants majeurs glycanes de HES, connues pour être fortement immunogène 3, et sécrétée micro-RNComme qui sont encapsulés dans des vésicules de 50 à 100 nm ou exosomes (Buck et al., Soumis pour publication). Avec la mise en place de protocoles reproductibles pour la collecte des ES de ce parasite très immunomodulateur, et avec de nombreuses données protéomiques identifiant les composants moléculaires de HES, le décor est désormais planté pour l'identification et l'essai thérapeutique de molécules individuelles de H. polygyrus qui peut médier les effets principaux sur le système immunitaire de l'hôte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon concentrator Millipore 5112 Model 8050 50 ml
http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM
_NF-5122
Hanks’ buffered salt solution Sigma H9394 500 ml
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB
Penicillin streptomycin Invitrogen 15070-063 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063
L-glutamine Invitrogen 25030-081 200 MM 100ml
https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081
Activated charcoal Merck 1.09624.0500 18-35 mesh
http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624
Glucose solution Sigma G8769 100 ml 45% solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB
Falcon tubes Sarstedt 62.547.254 50 ml
http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon
T25 Flasks Sigma CLS430639  25cm vented flask
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB
Chromogenic LAL assay Lonza 50-647U QCL-1000 assay
http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx
Gentamicin Gibco 15710-049 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Gibco 11875093 500 ml; without L-glutamine
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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