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 JoVE Medicine

नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस का उपयोग कर सूखे रक्त स्पॉट पर Immunosuppressant Tacrolimus की मात्रा

1, 1, 1, 1, 2, 3, 4, 1

1iC42 Clinical Research and Development, University of Colorado, Anschutz Medical Campus, 2Division of Clinical Pharmacology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Food and Drug Administration (FDA), Center of Drug Evaluation Research - Office of Generic Drugs, 4Transplant Clinical Research, University of Cincinnati

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    Summary

    Cite this Article

    Shokati, T., Bodenberger, N., Gadpaille, H., Schniedewind, B., Vinks, A. A., Jiang, W., et al. Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS. J. Vis. Exp. (105), e52424, doi:10.3791/52424 (2015).

    Abstract

    calcineurin अवरोध करनेवाला Tacrolimus संयुक्त राज्य अमेरिका में ठोस अंग प्रत्यारोपण के बाद सबसे प्रतिरक्षादमनकारी उपचार प्रोटोकॉल की आधारशिला है। Tacrolimus एक संकीर्ण चिकित्सीय सूचकांक दवा है और के रूप में इस तरह के चिकित्सकीय दवा निगरानी और उसके पूरे रक्त गर्त सांद्रता पर आधारित खुराक समायोजन की आवश्यकता है। घर चिकित्सकीय दवा और पालन की निगरानी की सुविधा के लिए, सूखे खून के धब्बे के संग्रह के लिए एक आकर्षक अवधारणा है। एक उंगली छड़ी के बाद, रोगी घर पर फिल्टर पेपर पर एक बूंद खून एकत्र करता है। खून सूख गया है, के बाद यह Tacrolimus उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग मात्रा निर्धारित है जहां विश्लेषणात्मक प्रयोगशाला के लिए भेज दिया जाता है (एचपीएलसी-एमएस / एमएस) एक सरल मैनुअल प्रोटीन वर्षा कदम और ऑनलाइन स्तंभ निष्कर्षण के साथ संयोजन में।

    Tacrolimus विश्लेषण के लिए, एक 6 मिमी डिस्क रक्त स्थान के संतृप्त केंद्र से मुक्का मारा है। रक्त जगह एक गोली ब्लेंडर एक का उपयोग कर homogenized हैएन डी तो प्रोटीन मेथनॉल / 0.2 एम ZnSO 4 आंतरिक मानक डी 2, 13 सी-Tacrolimus युक्त के साथ उपजी हैं। Vortexing और centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला के 100 μl एक ऑनलाइन निकासी कॉलम में इंजेक्ट किया जाता है और 5 मिलीग्राम / 0.1 फार्मिक एसिड / acetonitrile के मिनट के साथ धोया (7: 3, वी वी) के लिए 1 मिनट। इसके बाद, स्विचिंग वाल्व सक्रिय है और analytes विश्लेषणात्मक स्तंभ पर वापस-प्लावित (और एक 0.1% फार्मिक एसिड / acetonitrile ढाल का उपयोग कर अलग) कर रहे हैं। Tacrolimus मिलकर एक मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर सकारात्मक बहु प्रतिक्रिया मोड (एम आर एम) में मात्रा निर्धारित है।

    परख 1 से 50 एनजी / एमएल से रैखिक है। के रूप में 20 दिनों से अधिक का मूल्यांकन इंटर-परख परिवर्तनशीलता (3.6% -6.1%) और सटीकता (91.7% -101.6%) स्वीकृति मानदंडों को पूरा। औसत निकासी वसूली 95.5% है। कैरी ओवर, मैट्रिक्स हस्तक्षेप और मैट्रिक्स प्रभाव कोई प्रासंगिक हैं। Tacrolimus आरटी पर और एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सूखे खून के धब्बे में स्थिर है। में निकाले नमूनेautosampler कम से कम 72 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रहे हैं।

    Introduction

    Tacrolimus मैक्रोलाइड संरचना 8 (चित्रा 1) है कि एक शक्तिशाली immonosuppressant 1-7 है। 653 ग्राम / एल, इथेनॉल: - सीआईएस के कारण सीएन बांड की किन्नर संवयविता इसे उलट चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग किया जा सकता है कि समाधान 9 में दो रोटामर रूपों (एचपीएलसी) Tacrolimus एल्कोहल (मेथनॉल में lipophilic और घुलनशील है 355 जी / एल), हाइड्रोकार्बन halogenated (क्लोरोफॉर्म: 573 ग्राम / एल) और आकाश। । 0.1 ग्राम / एल और पानी (पीएच: 3: यह स्निग्ध हाइड्रोकार्बन (हेक्सेन में संयम से घुलनशील है। अणु किसी क्रोमोफोर और उसके यूवी अवशोषण अधिकतम शामिल नहीं करता है 9 .0047 जी / एल) calcineurin के निषेध के माध्यम से 192 एनएम Tacrolimus कार्य करता है । कार्रवाई के अपने तंत्र संदर्भों 10,11 में समीक्षा की गई है। यह वर्तमान में संयुक्त राज्य अमेरिका के 12 में ठोस अंग प्रत्यारोपण के रोगियों के 80% से अधिक में प्रयोग किया जाता है।

    Tacrolimus की चिकित्सीय सूचकांक considere हैD 13 संकीर्ण हो। इसके अलावा, Tacrolimus खुराक और रक्त सांद्रता के बीच संबंध खराब है और फार्माकोकाइनेटिक्स 14,15 चर रहा है। प्रत्यारोपण के रोगियों में Tacrolimus खुराक मार्गदर्शन करने के लिए चिकित्सीय दवा निगरानी इसलिए सामान्य नैदानिक ​​अभ्यास 16-20 है। लक्ष्य के लिए एक पूर्व निर्धारित चिकित्सकीय सीमा के भीतर Tacrolimus रक्त सांद्रता रखने के लिए है। चिकित्सकीय खिड़की के ऊपर सांद्रता अधिक-प्रतिरक्षादमन, कैंसर और ऐसे नेफ्रोटोक्सिटी, न्यूरोटॉक्सिटी, उच्च रक्तचाप और मधुमेह के रूप में विषाक्तता, के लिए खतरा बढ़ जबकि चिकित्सकीय रेंज नीचे Tacrolimus रक्त सांद्रता, क्रोनिक या तीव्र Allo प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की वृद्धि की गतिविधि में परिणाम हो सकता है। Tacrolimus की उच्च फ़ार्माकोकायनेटिक इंट्रा-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता प्रत्यारोपण अंग है और मरीज ​​को अस्तित्व 21,22 दोनों के लिए हानिकारक हो सकता है। Tacrolimus फार्माकोकाइनेटिक्स की अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता मुख्य रूप से CYP3A5 बहुरूपताओं, इंट्रा-व्यक्ति के लिए कारणों की वजह से है, जबकिपरिवर्तनशीलता शामिल हैं, लेकिन दवा दवा, रोग-दवा ​​और भोजन-दवा बातचीत 14,15 तक सीमित नहीं हैं। इसके अलावा प्रतिरक्षादमनकारी चिकित्सकीय दवा आहार के पालन के अभाव में एक योगदान कारक और भ्रष्टाचार नुकसान 23,24 के लिए एक प्रमुख कारण है।

    इन कारणों से अक्सर घर चिकित्सकीय दवा और Tacrolimus पूरे रक्त सांद्रता का पालन निगरानी रोगियों को हर समय वांछित चिकित्सकीय खिड़की के भीतर Tacrolimus जोखिम है कि यह सुनिश्चित करने के लिए फायदेमंद हो सकता है कि सुझाव। हालांकि, यह वर्तमान नैदानिक ​​अभ्यास 15 निषेधात्मक है रसद और अधिक लगातार चिकित्सकीय दवा निगरानी की लागत के रूप में है। कारणों में से एक मरीज को एक phlebotomist खींचा आवश्यक शिरापरक रक्त नमूना है यह देखने के लिए किया है। सूखे खून के धब्बे हाल ही में एक आकर्षक अवधारणा 25-28 के रूप में उभरा है। रोगी छड़ी एक सरल उंगली के बाद एक विशेष फिल्टर पेपर कार्ड पर और रक्त मौके घ है के बाद एक बूंद खून एकत्र करता हैRied, यह Tacrolimus के विश्लेषण और मरीज वर्तमान में ले जा सकता है कि किसी भी अन्य प्रतिरक्षादमनकारी के लिए एक केंद्रीय प्रयोगशाला में भेजा जा सकता है। इस तरह के सूखे खून के धब्बे (खून की आम तौर पर 20 μl) 25,29-43 के रूप में होने के कारण बहुत छोटी रक्त की मात्रा में Tacrolimus और अन्य immunosuppressants की मात्रा का ठहराव के लिए अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस assays के विकास के लिए संभव हो गया है। एक और लाभ यह इस तरह के सूखे खून के धब्बे के रूप में न्यूनतम इनवेसिव, कम मात्रा नमूना संग्रह रणनीतियों बहुत छोटे बच्चों के 28 में चिकित्सकीय दवा निगरानी और फ़ार्माकोकायनेटिक अध्ययन की सुविधा है।

    Tacrolimus आमतौर पर शिरापरक EDTA पूरे रक्त 15 में मापा जाता है। कारण Tacrolimus बड़े पैमाने पर रक्त कोशिकाओं में वितरित करता है कि और नैदानिक ​​अध्ययन नैदानिक ​​घटनाओं 15,18 के साथ तुलना में प्लाज्मा रक्त में Tacrolimus गर्त सांद्रता के बीच बेहतर सहसंबंध को सूचित किया है कि कर रहे हैं। इसकी तुलना में, टा का विश्लेषणसूखे खून के धब्बे में crolimus फिल्टर पेपर मैट्रिक्स के साथ मिलाया जाता है कि केशिका रक्त पर आधारित है। यह नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण के साथ Tacrolimus और संभावित हस्तक्षेप के solubilization के संदर्भ में चुनौतियों प्रस्तुत करता है। यहाँ हम एक उच्च प्रवाह ऑनलाइन स्तंभ नमूना को साफ प्रक्रिया और नियंत्रण रेखा-एमएस / एमएस विश्लेषण के साथ संयोजन में एक गोली ब्लेंडर का उपयोग कर सूखे रक्त स्थान के homogenization के आधार पर एक स्थापित और मान्य परख प्रस्तुत करते हैं। आज के रूप में, इस परख सफलतापूर्वक क्लिनिकल परीक्षण में पालन की निगरानी के लिए पांच हजार से अधिक Tacrolimus सूखे रक्त मौके नमूनों की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया है।

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    Protocol

    स्वस्थ व्यक्तियों से डी-पहचान रक्त नमूनों के कोलोराडो अस्पताल के विश्वविद्यालय (अरोड़ा, कोलोराडो) से थे। सत्यापन के अध्ययन के लिए और साथ ही Calibrators और गुणवत्ता नियंत्रण के नमूने की तैयारी के लिए डी-पहचान रक्त बैंक के नमूनों का उपयोग कोलोराडो बहु संस्थागत समीक्षा बोर्ड (COMIRB, अरोड़ा, कोलोराडो) द्वारा "छूट" माना जाता था।

    संदर्भ और समाधान के 1. तैयारी

    1. क्रय Tacrolimus और आंतरिक मानक डी 2, माल की सूची में सूचीबद्ध विक्रेताओं से 13 सी Tacrolimus।
      1. Tacrolimus के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता और डी 2 के लिए 10 माइक्रोग्राम / एमएल, 13 सी-Tacrolimus की एकाग्रता में शुद्ध मेथनॉल में स्टॉक समाधान तैयार करें। तीन स्वतंत्र weightings के आधार पर संदर्भ सामग्री के शेयर समाधान करें। अशेष स्टॉक समाधान और दुकान -70 डिग्री सेल्सियस पर या नीचे।
    2. प्रोटीन वेग के लिए समाधान तैयार(:, 3 वी: 7 वी) और पानी में मेथनॉल / 0.2 एम ZnSO 4 का उपयोग Tacrolimus निकाल सकते हैं। यह समाधान भी आंतरिक मानक डी 2, 2.5 एनजी / एमएल की एकाग्रता में 13 सी-Tacrolimus होता है और खाली नमूनों की निकासी के लिए छोड़कर सभी नमूने (1.3.3 देखें) की निकासी के लिए प्रयोग किया जाता है।
      1. प्रत्येक निकासी दिन पर हौसले इस प्रोटीन वर्षा समाधान तैयार है और 12 घंटे में समाधान की समाप्ति निर्धारित किया है।
    3. अंशांकन वक्र और गुणवत्ता नियंत्रण (QC) नमूनों की तैयारी
      1. शुद्ध मेथनॉल का उपयोग कर शेयर समाधान का उचित dilutions के प्रदर्शन से Tacrolimus के शेयर समाधान तैयार करें।
      2. , Calibrators और गुणवत्ता नियंत्रण के नमूने तैयार EDTA पूरे रक्त में उचित पतला शेयर समाधान के 20 μl स्पाइक के लिए, 20 मिनट और विभाज्य के लिए सेलुलर रक्त घटकों में Tacrolimus के सजातीय वितरण के लिए अनुमति देने के लिए एक पानी के स्नान में कोमल झटकों के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते 1.5 मिलीलीटर नाकड़ा मेंशंक्वाकार नीचे के साथ ropylene ट्यूब और तस्वीर पर पलकों। कार्बनिक विलायक के रिश्तेदार मात्रा 5% से अधिक नहीं है कि सुनिश्चित करें।
      3. स्पॉट एक विंदुक का उपयोग फिल्टर कार्ड पर प्रत्येक चक्र के मध्य में नुकीला पूरे रक्त के 50 μl।
      4. 3 घंटे के लिए आरटी पर फिल्टर कार्ड पर खून के धब्बे सूखी।
      5. 1, 2.5, 5, 10, 25, और 50 एनजी / एमएल के Tacrolimus सांद्रता में मानव EDTA पूरे रक्त में Tacrolimus अंशांकन मानकों तैयार करें। आंतरिक मानक डी 2, 13 सी-Tacrolimus ("शून्य नमूना") युक्त प्रोटीन वर्षा समाधान के साथ अंशांकन मानकों की तरह निकासी के लिए एक खाली नमूना तैयार करें।
      6. 0, 2, 4, 20, 40 एनजी / एमएल की सांद्रता में मानव EDTA पूरे रक्त में क्यूसी नमूने तैयार। एक खाली नमूना तैयार करें। आंतरिक मानक डी 2 युक्त वर्षा निकाले जाते हैं कि क्यूसी नमूने के विपरीत, 13 सी-Tacrolimus, करता है कि प्रोटीन वर्षा समाधान के साथ इस खाली नमूना निकालनेआंतरिक मानक डी 2, 13 सी-Tacrolimus ("खाली नमूना") को शामिल नहीं।
    4. नैदानिक ​​नमूनों का संग्रह
      1. 43,44 में वर्णित के रूप में सूखे खून के धब्बे लीजिए।

    2. Tacrolimus की निकासी सूखे रक्त स्पॉट नमूने

    1. दिखने में स्वीकार्य नमूना गुणवत्ता और मात्रा 45 सुनिश्चित करने के लिए सूखे रक्त मौके का निरीक्षण किया।
    2. एक 6 मिमी छेद पंच के साथ फिल्टर कार्ड पर खून के स्थान के पंच केंद्र।
      नोट: घूंसे की गुणवत्ता वजन द्वारा नजर रखी जा सकती है। एक मुक्का मारा संतृप्त फिल्टर डिस्क 0.09 मिलीग्राम (: 4.83- 5.14 मिलीग्राम, एन = 12 रेंज) ± औसत 5.02 मिलीग्राम में वजन का होता है।
    3. शंक्वाकार नीचे और तस्वीर पर पलकों के साथ 1.5 मिलीलीटर polypropylene ट्यूबों में जगह डिस्क।
    4. प्रत्येक ट्यूब 20-30 गोलियों जोड़ें।
    5. प्रत्येक ट्यूब में (2.5 एनजी / एमएल आंतरिक मानक के साथ वी: 0.2 एम ZnSO 4, 7: 3, वी मेथनॉल) प्रोटीन वर्षा समाधान के 500 μl जोड़ें। Extr के लिएखाली नमूनों की कार्रवाई, आंतरिक मानक के बिना प्रोटीन वर्षा समाधान का उपयोग करें।
    6. ("10" की स्थापना, अधिकतम गति) 1 मिनट के लिए बुलेट ब्लेंडर में डिस्क Homogenize।
    7. 10 मिनट के लिए ("10" की स्थापना, अधिकतम गति) बहु-ट्यूब भंवर पर आरटी पर नमूने हिला।
    8. नमूने अपकेंद्रित्र 16,000 XG और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    9. एक 300 μl डालने के साथ सुसज्जित कांच एचपीएलसी शीशियों में supernatants स्थानांतरण। पूर्व भट्ठा Teflon के जवानों का प्रयोग करें।
      नोट: निकाले नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर या नीचे नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण तक संग्रहित किया जा सकता है।

    3. नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण

    1. लोड 100 सी 8 कारतूस निकासी स्तंभ पर निकाले नमूना की सतह पर तैरनेवाला के μl और एक 7 से धो लें: पानी में 0.1% फार्मिक एसिड की 3 अनुपात: 5 मिलीलीटर की एक प्रवाह पर acetonitrile / मिनट 1 मिनट के लिए। स्विचिंग वाल्व के कनेक्शन चित्रा 2 में दिखाया जाता है और ढाल तालिका 1 में निकासी पंप द्वारा चलाए
    2. इसके बाद, विश्लेषणात्मक स्तंभ पर पूर्व स्तंभ से analytes की पीठ के फ्लश में जिसके परिणामस्वरूप स्विचिंग वाल्व को सक्रिय करें।
    3. 65 डिग्री सेल्सियस के लिए स्तंभ थर्मोस्टेट सेट करें।
    4. तालिका 1 में दिखाया प्रवाह दरों और ढाल का उपयोग विश्लेषणात्मक स्तंभ से analytes Elute।
    5. टर्बो electrospray आयनीकरण स्रोत के माध्यम से मिलकर एक मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए विश्लेषणात्मक स्तंभ कनेक्ट करें। 2 टेबल के अनुसार मास स्पेक्ट्रोमीटर के मुख्य मापदंडों को समायोजित करें।
    6. कई प्रतिक्रिया मोड (एम आर एम) में सकारात्मक आयनों ([एम + ना] +) का पता लगा। मात्रा का ठहराव के लिए निम्नलिखित आयन संक्रमण का उपयोग करें: Tacrolimus: मी / z (जन / प्रभारी) = 826.6 616.2 और डी 2, 13 सी-Tacrolimus →: मी / z = 619.2 → 829.6।
      नोट: कुल चलाते समय 4.6 मिनट है।

    4. मात्रा

    1. प्रत्येक रन के लिए, 1.3.5 और में तैयार Calibrators पर आधारित एक अंशांकन वक्र उत्पन्नप्रत्येक विश्लेषणात्मक रन में शामिल हैं।
      1. मास स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर (शिखर क्षेत्र [विश्लेष्य] / शिखर क्षेत्र [आंतरिक मानक]) विश्लेष्य की प्रतिक्रिया कारक बनाम नाममात्र सांद्रता साजिश रचने के द्वारा एक अंशांकन वक्र उत्पन्न करता है।
      2. 1 / एक्स भार के साथ संयोजन में एक वर्ग फिट का उपयोग कर Calibrators फिट बैठते हैं।
    2. सूखे खून के धब्बे में मात्रा Tacrolimus के लिए निकाले एमआरएम chromatograms में Tacrolimus और आंतरिक मानक चोटियों को एकीकृत। Tacrolimus के लिए प्रतिक्रिया कारक (शिखर क्षेत्र [विश्लेष्य] / शिखर क्षेत्र [आंतरिक मानक]) की गणना और मास स्पेक्ट्रोमेट्री सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अंशांकन वक्र के साथ तुलना करें।

    5. सत्यापन प्रक्रिया

    1. पता लगाने (Llod) की ऊपरी सीमा और मात्रा का ठहराव (LLOQ) की निचली सीमा।
      1. पता लगाने (Llod) की निचली सीमा के रूप में 1: 4 के एक चोटी के लिए शोर अनुपात के साथ सबसे कम Tacrolimus एकाग्रता पर विचार करें। के रूप में मात्रा का ठहराव (LLOQ) की निचली सीमा को परिभाषित करेंके बराबर या नाममात्र एकाग्रता और बराबर या बेहतर की तुलना में 20% परिशुद्धता (विचरण का गुणांक) से ± 20% विचलन की तुलना में बेहतर सटीकता के साथ अंशांकन वक्र की सबसे कम एकाग्रता।
    2. अंतर और अंतर-दिन सत्यता और precisions।
      1. 2 एनजी / एमएल (QC1), 4 एनजी / एमएल (QC2), 20 एनजी / एमएल (QC3) और 40 एनजी / एमएल (QC4) के चार एकाग्रता के स्तर पर सटीकता और परिशुद्धता परीक्षण करें।
      2. , मानव EDTA पूरे रक्त में प्रत्येक सत्यापन दिन पर क्यूसी नमूने तैयार फिल्टर कार्ड, निकालने पर शुष्क है, और जैसा कि ऊपर वर्णित का विश्लेषण।
      3. क्यूसी एकाग्रता के स्तर के अनुसार 6 नमूनों के साथ इंट्रा-डे सटीकता और परिशुद्धता का निर्धारण करते हैं।
      4. 20 दिनों से अधिक अंतर-दिन सटीकता और परिशुद्धता का आकलन करें। 4 नमूने प्रत्येक दिन के साथ प्रत्येक क्यूसी स्तर को मापने।
      5. प्रत्येक दिन पर क्यूसी नमूनों के साथ एक साथ दो अंशांकन घटता का विश्लेषण करें।
      6. नाममात्र एकाग्रता के% (एकाग्रता स्तर प्रति छह नमूने, 5.2.2 देखें) के रूप में इंट्रा-डे सटीकता की गणना। कैल्कविचरण (सीवी%) के गुणांक के रूप Ulate परिशुद्धता।
      7. स्वीकृति नाममात्र एकाग्रता के 85% से 115% की सीमा में यह गिर जाता है तो इंट्रा-डे सटीकता स्वीकार्य पर विचार करें। यह 15% की एक सीवी (विचरण का गुणांक) के बराबर या बेहतर है स्वीकार्य है, तो इंट्रा-डे परिशुद्धता पर विचार करें।
      8. 20 सत्यापन दिनों से अधिक का विश्लेषण प्रत्येक क्यूसी एकाग्रता के स्तर के लिए मतलब के रूप में अंतर-दिन सटीकता और परिशुद्धता की गणना।
      9. स्वीकृति नाममात्र एकाग्रता के 85% से 115% की सीमा में यह गिर जाता है, तो इसका मतलब अंतर-दिन सटीकता स्वीकार्य पर विचार करें। यह 15% की एक सीवी (विचरण का गुणांक) के बराबर या बेहतर है स्वीकार्य है, तो अंतर-दिन परिशुद्धता पर विचार करें।
    3. मैट्रिक्स हस्तक्षेप का बहिष्कार।
      1. मैट्रिक्स संकेतों की वजह से हो सकता है कि हस्तक्षेप के बहिष्कार के लिए, खाली सूखे खून के धब्बे (8 विभिन्न व्यक्तियों, अधिमानतः 4 पुरुषों और 4 महिलाओं) का विश्लेषण।
      2. दिखने में आयन chromatograms का निरीक्षण किया। अगर प्रतिधारण समय के भीतर चोटियोंTacrolimus की खिड़की LLOQ पर Tacrolimus साथ नुकीला एकीकृत और खाली नमूनों में Tacrolimus चोटियों में से उन लोगों के साथ वक्र के तहत अपने-अपने क्षेत्रों की तुलना, पता चला रहे हैं। खाली नमूनों में चोटियों के क्षेत्र LLOQ पर Tacrolimus के उन लोगों के 15% से अधिक नहीं कर रहे हैं।
    4. आयन दमन / आयन वृद्धि।
      1. सह-eluting मैट्रिक्स घटकों के कारण आयन दमन / आयन वृद्धि के संभावित हस्तक्षेप का आकलन करने के लिए 45 के रूप में वर्णित एक के बाद स्तंभ अर्क प्रोटोकॉल का प्रयोग करें।
      2. 0.1% फार्मिक एसिड में भंग कर 10 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में Tacrolimus दिखे: मेथनॉल (30:70, वी / वी) के बाद स्तंभ 10 μl / मिनट की दर से।
        1. विश्लेषणात्मक स्तंभ और मास स्पेक्ट्रोमीटर के electrospray स्रोत के बीच टी-टुकड़ा के माध्यम से एक सिरिंज पंप कनेक्ट करें।
        2. Tacrolimus के लिए एम आर एम संक्रमण के एमएस / एमएस संकेत तीव्रता पर नजर रखने और अपने आंतरिक मानक (मी / z = 616.2 और मी / z = 829.6 → 619.2 → 826.6) extrac के इंजेक्शन के बादटेड खाली नमूने (एन = अलग व्यक्तियों से 8 नमूने)।
          नोट: आयन दमन संकेत और आयन वृद्धि एक चोटी की गिरावट का कारण बनता है, जबकि आयन दमन / आयन वृद्धि के अभाव में analytes की जान फूंकना की वजह से निरंतर संकेत, खाली मैट्रिक्स के इंजेक्शन से प्रभावित नहीं होना चाहिए।
    5. आगे बढ़ाना।
      1. उच्चतम Calibrators के बाद खाली नमूने निकाले विश्लेषण करके संभावित ले ओवर का आकलन (50 एनजी / एमएल, एन = 6)।
      2. दिखने में आयन chromatograms का निरीक्षण किया। Tacrolimus की अवधारण समय खिड़की के भीतर चोटियों का पता चला रहे हैं, तो LLOQ पर Tacrolimus साथ नुकीला एकीकृत और खाली नमूनों में Tacrolimus चोटियों में से उन लोगों के साथ वक्र के तहत अपने-अपने क्षेत्रों की तुलना करें। खाली नमूनों में चोटियों के क्षेत्र LLOQ पर Tacrolimus के उन लोगों के 15% से अधिक नहीं कर रहे हैं।
    6. निष्कर्षण वसूलियां।
      1. क्यूसी सैम की निकासी के बाद analytes की संकेतों की तुलना द्वारा वसूलियां का निर्धारण करेंमंदिरों खाली सूखे खून के धब्बे के उन लोगों के साथ सभी चार एकाग्रता का स्तर (एन = एकाग्रता प्रति 6) पर निकासी के बाद Tacrolimus की समान मात्रा के साथ नुकीला।
      2. QCs के चार सेट (: 2, 4, 20, 40 एनजी / एमएल एकाग्रता स्तर) तैयार करें।
      3. फिल्टर पेपर कार्ड पर खाली EDTA पूरे रक्त के 50 μl खोलना और 2 घंटे के लिए सुखाने के द्वारा "वसूली परीक्षण के नमूने" इसी का एक और 4 सेट तैयार करें।
      4. इसके बाद, क्यूसी और खाली "वसूली परीक्षण के नमूने" दोनों के लिए, कैंची के साथ फिल्टर कार्ड पर पूरे रक्त जगह बाहर कटौती और शंक्वाकार नीचे और तस्वीर पर ढक्कन के साथ एक polypropylene ट्यूब में जिसके परिणामस्वरूप डिस्क जगह है।
      5. सभी नमूनों को निकालें।
      6. कांच एचपीएलसी शीशियों में supernatants (400 μl) हस्तांतरण।
      7. 2, 4, 20 और 40 एनजी / एमएल (200, 400, 2,000, 4,000 एनजी / एमएल Tacrolimus शेयर सोल के 4 μl की सांद्रता तक पहुंचने के लिए खाली "निकाले वसूली के नमूने परीक्षण के लिए" Tacrolimus शेयर समाधान जोड़ेंसतह पर तैरनेवाला के 400 μl) के संस्थानों।
      8. नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण के बाद, क्यूसी नमूने और इसी एकाग्रता की "वसूली परीक्षण के नमूने" दोनों में संकेतों की तुलना (निकासी / संकेत नमूने निकासी x 100 के बाद नुकीला से पहले वसूली% = संकेत नमूने नुकीला)।
    7. कमजोर पड़ने अखंडता।
      1. का उपयोग करते हुए कमजोर पड़ने अखंडता की स्थापना के नमूने 500, 250 और 100 एनजी / एमएल पर analytes के साथ नुकीला।
      2. निकासी के बाद, प्रोटीन वर्षा समाधान का उपयोग कर नमूने पतला (1:10, एन = 3 एकाग्रता के स्तर के अनुसार)।
      3. नाममात्र सांद्रता से विचलन की गणना। 85% के भीतर नाममात्र स्वीकार्य के -115% गिर परिणाम है कि विचार करें।
    8. Stabilities।
      1. सभी चार एकाग्रता का स्तर (एन = एकाग्रता प्रति 4) अलग समय अंक पर और विभिन्न भंडारण की स्थिति के तहत विश्लेषण में क्यूसी नमूने का उपयोग stabilities की जाँच।
      2. नाममात्र मूल्यों के साथ भंडारण के बाद परिणामों की तुलना करें। आर पर विचार85% के भीतर नाममात्र स्वीकार्य के -115% गिर कि esults।
      3. 4 डिग्री सेल्सियस, -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने और -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने में 1 सप्ताह, परिवेश के तापमान पर एक सप्ताह के लिए नमूना स्थिरता स्थापित करना।
      4. तीन चक्रों से अधिक टेस्ट फ्रीज पिघलना स्थिरता (-20 डिग्री सेल्सियस)। 4 डिग्री सेल्सियस के लिए समायोजित thermostatted autosampler में नमूने रखकर टेस्ट निकाले नमूना और autosampler स्थिरता। 72 घंटे के बाद नमूनों इंजेक्षन।

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    Representative Results

    एक खाली नमूना के प्रतिनिधि आयन chromatograms, एक नमूना 3 चित्र में दिखाए गए हैं मात्रा का ठहराव और एक रोगी के नमूने की निचली सीमा पर नुकीला।

    कैलिब्रेशन घटता

    पता लगाने की निचली सीमा मिलीलीटर 0.5 एनजी / था और मात्रा का ठहराव की निचली सीमा 1.0 एनजी / एमएल था। उच्च सांद्रता सामान्य परिस्थितियों में क्लिनिक में पहुंचा जा की संभावना नहीं के रूप में पचास एनजी / एमएल उच्चतम अंशशोधक के रूप में चुना गया था।

    कैलिब्रेशन घटता हौसले से, मानव EDTA पूरे रक्त में प्रत्येक मान्यता के दिन पर तैयार फिल्टर कार्ड पर सूखे और साथ निकाले गए थे मेथनॉल / 0.2 एम ZnSO 4 (70:30 वी / वी) + आंतरिक मानक (आंतरिक मानक के अंतिम एकाग्रता: 2.5 एनजी / एमएल )। 1 दिन सत्यापन के लिए (एन = 6 क्यूसी स्तर के लिए Calibrators और एन = 6 के लिए) और 2 दिन के लिए - (प्रत्येक क्यूसी स्तर के लिए एन = 2 Calibrators के लिए और एन = 4) 20 सांद्रता 1, 2.5, 5 के साथ विश्लेषण किया गया, calib के लिए 10, 25, 50 एनजी / एमएलrators। एक ठेठ अंशांकन वक्र चित्रा 4 में दिखाया गया है। नाममात्र की 115% से 85% की सत्यता मतलब, (6 गैर शून्य Calibrators की एक न्यूनतम के साथ) Calibrators के 2/3 के लिए काम कर रहे सीमा के भीतर स्वीकार्य माना जाता था। सहसंबंध का मतलब गुणांक (आर) = 0.999 (एन = 40 अंशांकन घटता) था।

    Accuracies और Precisions

    परिणाम तालिका 3 में विस्तार से दिखाया गया है।

    निष्कर्षण रिकवरी

    औसत निकासी वसूलियां (2 एनजी / एमएल), 92.2 (4 एनजी / एमएल), 95.5 (20 एनजी / एमएल), 96.2 (40 एनजी / एमएल) 98.2% थे।

    मैट्रिक्स Interferences, आयन दमन / आयन संवर्धन परीक्षण का उपयोग सतत पोस्ट-स्तंभ आसव एंड कैरी ओवर

    करने के लिए इसी आठ अलग-अलग व्यक्तियों (एन = 4 महिला और एन = 4 पुरुष) अवधारण समय पर पता चला संकेतों LLOQ (1 एनजी / एमएल) के कम से कम 15% से खाली नमूनों के विश्लेषण सेपता चला Tacrolimus शिखर विशिष्ट माना जा सकता है कि यह दर्शाता है Tacrolimus शिखर। एक प्रतिनिधि उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है। आयन दमन / आयन वृद्धि द्वारा संभावित हस्तक्षेप आठ विभिन्न स्वस्थ व्यक्तियों से खाली सूखे रक्त के नमूनों का उपयोग कर परीक्षण किया गया। एक प्रतिनिधि प्रयोग चित्रा 5 में दिखाया गया है। महत्वपूर्ण आयन दमन / आयन बढ़ाने का कोई संकेत नहीं मनाया गया। LLOQ पर संकेत के 15% से अधिक चोटियों में जिसके परिणामस्वरूप कोई प्रासंगिक ले जाने वाला पाया गया।

    कमजोर पड़ने वफ़ादारी

    कमजोर पड़ने अखंडता का लक्ष्य सांद्रता तक पहुंचने के लिए उच्चतम अंशशोधक (100, 250 और 500 एनजी / एमएल) के ऊपर सांद्रता में तैयार किया है और निकासी के बाद प्रोटीन वर्षा समाधान में पतला 1:10 नमूनों का विश्लेषण करके जांच की गई: 10, 25, और 50 एनजी / मिलीलीटर। मीन सत्यता नाममात्र सांद्रता के 115% से 85% की स्वीकृति मानदंडों के भीतर गिर पड़ा। सभी dilutions टीईएसटेड स्वीकृति मानदंडों (तालिका 4) से मुलाकात की।

    Stabilities

    सूखे खून के धब्बे में Tacrolimus की स्थिरता बदलती परिस्थितियों में जमा थे, जो सभी चार स्तरों (एन = 4 / एकाग्रता स्तर), पर क्यूसी नमूनों का विश्लेषण करके जांच की गई।

    मीन सत्यता नाममात्र सांद्रता के 115% से 85% की स्वीकृति मानदंडों के भीतर गिर पड़ा। परिणाम तालिका 5 में विस्तार से दिखाया गया है। 3 फ्रीज और पिघलना चक्र के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के 1 महीने के बाद -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के 1 महीने के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के 1 हफ्ते के बाद आरटी पर भंडारण के 1 हफ्ते के बाद कोई नुकसान,,,,, और 4 डिग्री सेल्सियस पर ऑटो पारखी में निकाले नमूने के 72 घंटे के बाद स्पष्ट थे।

    निष्कर्षण पम्प विश्लेषणात्मक (क्षालन) पंप
    जल + 0.1% फार्मिक एसिड Acetonitrile प्रवाह की दर [μl / मिनट] टाइम [मिनट] जल + 0.1% फार्मिक एसिड Acetonitrile प्रवाह की दर [μl / मिनट]
    0 70 30 5000 0 13 87 1000
    1 70 30 5000 2 2 98 1,200
    1 1 2 98 100 3.5 2 98 1,200
    3 2 98 100 3.6 13 87 1000
    3.1 20 80 2,000 4.6 13 87 1000
    4 70 30 5000
    4.6 70 30 5000

    निष्कर्षण के लिए तालिका 1. ढाल कार्यक्रम और विश्लेषणात्मक एचपीएलसी पंप्स।

    पैरामीटर सेटिंग
    टकराव गैस (सीएडी) 10
    परदा गैस (CUR) (साई) 30
    आयन स्रोत गैस 1 (जीएस 1) (साई) 50
    आयन स्रोत गैस 2 (GS2) (साई) 30
    छिटकानेवाला वर्तमान (नेकां) (वी) 1
    तापमान (मंदिर) (डिग्री सेल्सियस) 600
    IonSpray वोल्टेज (है) (वी) 5500
    इंटरफ़ेस हीटर (आइ) पर
    Declustering संभावित (डीपी) (वी) 136
    प्रवेश क्षमता (ईपी) (वी) 10
    टक्कर ऊर्जा (सीई) (वी) 47
    टक्कर सेल से बाहर निकलने के संभावित (CXP) (वी) 16

    तालिका 2 टर्बो electrospray इंटरफेस और मास स्पेक्ट्रोमीटर पैरामीटर। नामकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री सॉफ्टवेयर में प्रयोग किया जाता है कि करने के लिए संगत (निर्माता जानकारी के लिए, माल की सूची देखें)।

    <टीडी> 106
    मान्यकरण डे क्यूसी स्तर [नाममात्र एकाग्रता की%]
    2 4 20 40
    दिन 1 93.0 86.3 88.9 93.4
    101 90.4 95.3 100
    85.6 95.9 99.0 97.5
    88.6 93.6 105 103
    85.0 97.4 97.2 109
    89.1 96.7 100 101
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 90.4 93.4 97.6 100.7
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 6.6 4.6 5.5 5.2
    दूसरा दिन 92.8 86.0 103
    91.1 88.8 94.7 87.0
    88.6 90.9 92.8 94.2
    97.2 93.7 94.2 115
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 92.4 89.9 96.2 97.9
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 3.9 3.6 4.8 12.2
    तीसरा दिन 97.6 101 98.4 112
    104 85.6 102 110
    99.2 88.4 99.4 105
    96.3 87.2 108 117
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 99.3 90.6 102.0 111.0
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 3.4 7.8 4.2 4.5
    4 दिन 95.2 88.6 112 94.5
    105 87.3 93.2 116
    99.8 96.2 103 103
    100 104 97.2 99.4
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 100.0 94.0 101.4 103.2
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 4.0 8.2 8.1 8.9
    दिन 5 106 90.4 101 106
    108 89.0 100
    102 101 96.6 128
    105 88.8 105 107
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 105.3 92.3 102.2 110.3
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 2.4 6.3 4.2 11.1
    दिन 6 90.9 93.7 119 106
    98.8 88.1 96.4 110
    94.6 96.3 99.1 108
    108 100 102 102
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 98.1 94.5 104.1 106.5
    7.5 5.3 9.8 3.2
    7 दिन 85.1 87.5 99.5 95.4
    86.4 85.4 94.7 101
    94.5 87.3 98.9 94.6
    85.5 97.0 101 99.6
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 87.9 89.3 98.5 97.7
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 5.1 5.8 2.7 3.2
    दिवस 8 86.1 92.5 91.9 102
    87.5 91.5 95.2 88.5
    115 85.6 92.1 102
    85.8 85.9 95.4 108
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 93.6 88.9 93.7 100.1
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 15.3 4.1 2.0 8.2
    दिन 9 88.9 91.4 96.9 100
    90.0 89.8 95.0 100
    69.7 85.9 95.8 109
    91.9 87.0 105 101
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 85.1 88.5 98.2 102.5
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 12.2 2.9 4.7 4.3
    10 दिन 90.9 91.3 96.2 100
    97.7 89.5 94.4 100
    99.9 109 98.7 96.8
    99.1 90.0 95.7 96.1
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 96.9 95.0 96.3 98.2
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 4.2 9.9 1.9 2.1
    11 दिन 92.7 91.9 88.2 104
    96.6 91.2 97.0 110
    109.0 92.8 970.6 102
    98.3 107 93.7 111
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 99.2 95.7 94.1 106.8
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 7.0 7.9 4.6 4.1
    12 दिन 87.7 85.5 105 95.3
    112 88.1 101 96.1
    102 89.1 89.7 97.5
    106 92.5 102 104
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 101.9 88.8 99.4 98.2
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 10.1 3.3 6।7 4.0
    13 दिन विफल 85.7 93.3 102
    101 105 88.0 93.9
    112 98.0 91.4 102
    104 113 104 101
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 105.7 100.4 94.2 99.7
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 5.4 11.5 7.3 3.9
    14 दिन 91.5 89.1 97.4 93.1
    90.4 87.1 93.9 99.8
    89.7 97.0 94.8 106
    97.4 86.8 89.9 विफल
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 92.3 90.0 94.0 99.6
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 3.8 5.3 3.3 6.5
    15 दिन 92.8 92.8 92.5 95.4
    97.5 96.3 96.2 95.5
    95.5 108 97.3 99.3
    110 109 115 113
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 99.0 101.5 100.3 100.8
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 7.7 8.1 10.0 8.3
    16 दिन 93.7 97.8 90.7 112
    90.3 87.1 विफल 101
    97.9 88.3 95.5 107
    91.4 85.7 89.3 96.7
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 93.3 89.7 91.8 104.2
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 3.6 6.1 3.5 6.4
    17 दिन 88.0 86.0 93.7 103
    89.8 90.8 94.8 93.2
    85.9 91.1 99.7 94.8
    86.7 88.1 95.6 91.7
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 87.6 89.0 96.0 95.7
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 1.9 2.7 2.7 5.3
    18 दिन 89.6 85.8 91.0 98.3
    89.6 86.2 88.3 93.6
    विफल 86.7 96.8 104
    88.1 85.8 95.2 111
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 89.1 86.1 92.8 101.7
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 1.0 0.5 4.2 7.4
    19 दिवस 98.0 </ टीडी> 89.7 94.2 102
    88.3 86.0 97.6 102
    91.6 88.1 95.8 97.5
    90.7 90.1 92.8 88.3
    इंट्रा-डे सटीकता [%] 92.2 88.5 95.1 97.5
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 4.5 2.1 2.2 6.6
    20 दिन 93.0 87.0 99.4 101
    97.3 87.6 95.5 91.9
    89.0 88.4 91.2 93.5
    104 90.7 97.7 115
    इंट्रा-डे सटीकता[%] 95.8 88.4 96.0 100.4
    इंट्रा-डे अस्पष्टता [सीवी%] 6.7 1.8 3.7 10.5

    इंटर-डे सटीकता और अस्पष्टता
    इंटर-दिन सटीकता 95.2 91.7 97.2 101.6
    इंटर-डे अस्पष्टता 6.1 4.5 3.6 4.2

    टेबल गुणवत्ता नियंत्रण के नमूने 3. परिणामों पर 20 दिन। डेटा नाममात्र के% के रूप में प्रस्तुत किया है। "असफल" के रूप में सूचीबद्ध नमूने प्रयोगशाला / साधन त्रुटियों को खो गए थे कि नमूने हैं। सबसे कैस मेंतों, कोई चोटियों सब पर पता चला रहे थे या आंतरिक मानक शिखर याद आ रही थी।

    घोला 1:10
    कमजोर पड़ने के बाद नाममात्र लक्ष्य एकाग्रता 50 एनजी / एमएल
    98.6
    94.5
    91.4
    सटीकता [%] 94.8
    अस्पष्टता [सीवी%] 3.6
    घोला 1:10
    कमजोर पड़ने के बाद नाममात्र लक्ष्य एकाग्रता 10 एनजी / एमएल
    103
    99.5
    101
    सटीकता [%] 101.2
    अस्पष्टता [सीवी%] 1.8
    घोला 1:10
    कमजोर पड़ने के बाद नाममात्र लक्ष्य एकाग्रता 25 एनजी / एमएल
    91.7
    98.2
    103
    सटीकता [%] 97.6
    अस्पष्टता [सीवी%] 5.7

    कमजोर पड़ने वफ़ादारी परीक्षण। डाटा की तालिका 4. परिणाम नाममात्र के% के रूप में प्रस्तुत किया है।

    आरटी पर स्थिरता, दिन 1
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    91.9 85.8 86.0 102
    86.7 85.7 88.5 102
    86.0 85.9 90.1 103
    89.2 98.0 90.8 112
    नाममात्र एकाग्रता का% 88.5 88.9 88.9 104.8
    अस्पष्टता [% सीवी] 2.7 6.1 2.1 4.9
    आरटी पर स्थिरता, दिन 3
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    88.6 105 101 113
    94.1 100 98.5 103
    100 101 106 109
    99.5 102 102 108
    नाममात्र एकाग्रता का% 95.6 102.0 101.9 108.3
    अस्पष्टता [% सीवी] 5.3 2.2 3.1 4.1
    आरटी पर स्थिरता, 7 दिन
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    105 103 91.7 109
    101 107 100 110
    102 108 107 105
    93.8 105 109 111
    नाममात्र एकाग्रता का% 100.5 105.8 101.9 108.8
    अस्पष्टता [% सीवी] 4.7 2.2 7.8 2.6
    बी
    4 डिग्री सेल्सियस, दिन 1 में स्थिरता
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    101 89.9 95.8 100
    88.9 91.0 94.1 99.0
    96.2 100 102 96.7
    89.5 87.8 95.4 88.6
    नाममात्र एकाग्रता का% 93.9 92.2 96.8 96.1
    अस्पष्टता [% सीवी] 5.8 5.4 3.5 5.2
    4 डिग्री सेल्सियस, 3 दिन में स्थिरता
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    87.3 85.2 105 95.3
    विफल 87.8 101 96
    101 88.8 89.6 97.5
    106 92.2 102 104
    नाममात्र एकाग्रता का% 98.1 88.5 99.4 98.2
    अस्पष्टता [% सीवी] 9.7 2.9 6.8 4.0
    4 डिग्री सेल्सियस, 7 दिन में स्थिरता
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    94.0 98.5 96.1 110
    92.9 96.4 109 109
    91.7 96.3 97.9 115
    94.7 96.9 99.8 113
    नाममात्र एकाग्रता का% 93.3 97.0 100.7 111.8
    अस्पष्टता[%सीवी] 1.3 1.0 5.7 2.8
    सी
    -20 डिग्री सेल्सियस, 3 दिन में स्थिरता
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    87.3 98.7 111 111
    93.5 89.6 108 105
    89.5 91.5 107 112
    88.2 99.1 108 92.4
    नाममात्र एकाग्रता का% 89.6 94.7 108.5 105.1
    अस्पष्टता [% सीवी] 2.7 4.9 1.7 9.0
    -20 डिग्री सेल्सियस, 7 दिन में स्थिरता
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    96.5 98.7 102 109
    94.8 94.6 114 106
    95.5 102 98.1 108
    107 99.5 115 105
    नाममात्र एकाग्रता का% 98.5 98.7 107.3 107
    अस्पष्टता [% सीवी] 5.7 3.1 8.5 1.8
    </ टीडी>
    -20 डिग्री सेल्सियस, दिन 30 में स्थिरता
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    82.3 83.1 90.4 93.2
    87.9 85.8 85.3 97.9
    85.7 88.6 98.3 98.0
    92.0 95.6 110 103
    नाममात्र एकाग्रता का% 87.0 88.3 96.0 98.0
    अस्पष्टता [% सीवी] 4.1 5.4 10.8 4.0
    डी </ टीडी>
    -80 डिग्री सेल्सियस, 3 दिन में स्थिरता
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    87.5 96.5 96.7 विफल
    विफल 97.6 98.7 110
    88.8 96.4 106 109
    87.3 101 96.5 109
    नाममात्र एकाग्रता का% 87.9 97.9 99.5 109.3
    अस्पष्टता [% सीवी] 0.8 2.2 4.5 0.6
    -80 डिग्री सेल्सियस, 7 दिन में स्थिरता क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    विफल 98.0 105 99.8
    97.1 106 104 105
    99.7 102 99.3 102
    101 99.9 109 106
    नाममात्र एकाग्रता का% 99.3 101.5 104.3 103.2
    अस्पष्टता [% सीवी] 2.0 3.4 4.0 2.8
    -80 डिग्री सेल्सियस, दिन 30 में स्थिरता
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 20 40
    88.2 85.3 89.6 96.7
    96.2 92.6 85.8 94.1
    83.9 93.7 91.0 105
    95.6 94.0 98.9 102
    नाममात्र एकाग्रता का% 91.0 91.4 91.3 99.5
    अस्पष्टता [% सीवी] 6.0 4.1 5.5 4.9

    रुक पिघलना स्थिरता, -20 डिग्री सेल्सियस, 1 चक्र
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] </ टीडी> 2 4 20 40
    92.5 86.2 90.2 94.3
    89.8 90.5 85.4 104
    94.7 88.6 93.4 104
    101 89.2 93.7 96.3
    नाममात्र एकाग्रता का% 94.5 88.6 90.7 99.7
    अस्पष्टता [% सीवी] 4.8 1.8 3.9 5.1
    , स्थिरता पिघलना रुक -20 डिग्री सेल्सियस, 2 चक्र
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    99.1 97.6 विफल 85.3
    93.1 88.1 93.4 92.0
    94.9 91.5 85.8 93.9
    विफल 90.5 86.8 85.4
    नाममात्र एकाग्रता का% 95.7 91.9 88.7 89.2
    अस्पष्टता [% सीवी] 3.1 4.0 4.1 4.5
    , स्थिरता पिघलना रुक -20 डिग्री सेल्सियस, 3 चक्र
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    95.7 विफल 86.0 93.3
    95.5 87.4 85.0 91.3
    90.5 89.1 86.0 86.0
    96.9 85.7 90.2 विफल
    नाममात्र एकाग्रता का% 94.7 87.4 86.8 90.2
    अस्पष्टता [% सीवी] 2.8 1.7 2.3 3.8
    एफ
    4 डिग्री सेल्सियस, 24 घंटा पर निकाले नमूना स्थिरता
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    122 112 91.0 104
    93.5 106 91.8 96.1
    111 94.8 98.2 93.5
    98.4 97.6 91.3 89.8
    नाममात्र एकाग्रता का% 106.2 102.6 93.1 95.9
    अस्पष्टता [% सीवी] 12.8 7.9 3.4 6.0
    4 डिग्री सेल्सियस, 48 घंटा पर निकाले नमूना स्थिरता
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    106 108 93.7 110
    105 98.1 94.6 98.9
    103 98.4 95.0 92.6
    108 93.1 89.7 85.5
    नाममात्र एकाग्रता का% 105.5 99.4 93.3 96.8
    अस्पष्टता [% सीवी] 2.1 6.2 2.4 10.4
    4 डिग्री सेल्सियस, 72 घंटा पर निकाले नमूना स्थिरता
    क्यूसी स्तर [एनजी / एमएल] 2 4 20 40
    96.5 112 96.4 104
    101 95.3 103 95.2
    94.2 105 93.5 99.5
    100 96.9 92.6 89.3
    नाममात्र एकाग्रता का% 97.9 102.3 96.4 97.0
    अस्पष्टता [% सीवी] 3.1 7.7 4.7 6.3

    स्थिरता परीक्षण के पटल 5. परिणाम। एक: 7 दिनों में आरटी पर सूखे खून के धब्बे पर Tacrolimus की स्थिरता, बी: फ्रिज में सूखे खून के धब्बे (4 डिग्री सेल्सियस) से अधिक 7 दिनों, पर Tacrolimus की स्थिरता सी: -20 डिग्री पर सूखे खून के धब्बे पर Tacrolimus की स्थिरता सेल्सियस से अधिक 1 माह, डी: -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखे खून के धब्बे पर Tacrolimus की स्थिरता एक महीने से अधिक, ई: सूखे खून के धब्बे पर Tacrolimus की स्थिरता पर तीन फ्रीज पिघलना चक्र (-20 डिग्री सेल्सियस), एफ : 72 घंटा से अधिक चार डिग्री सेल्सियस पर नमूना / autosampler स्थिरता निकाली गई। डेटा नाममात्र एकाग्रता के% के रूप में प्रस्तुत किया है। "असफल" के रूप में सूचीबद्ध नमूने प्रयोगशाला / साधन त्रुटियों को खो गए थे कि नमूने हैं। ज्यादातर मामलों में कोई चोटियों सब पर पता चला रहे थे या आंतरिक मानक शिखर याद आ रही थी।

    चित्र 1
    Tacrolimus। एटम नंबरिंग की चित्रा 1. संरचना प्योर एंड एप्लाइड कैमिस्ट्री (आईयूपीएसी) नामकरण के अंतर्राष्ट्रीय संघ इस प्रकार है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    स्विचिंग वाल्व 2. कनेक्शन चित्रा।424fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्र तीन। प्रतिनिधि आयन chromatograms। (ए) फिल्टर पेपर पर देखा एक खाली रक्त के नमूनों की प्रतिनिधि आयन वर्णलेख (निर्माता जानकारी के लिए, माल की सूची देखें) और सूख गया। तीर Tacrolimus शिखर, (बी) नमूने मात्रा का ठहराव (1 एनजी / एमएल) की निचली सीमा पर नुकीला एक खाली रक्त का प्रतिनिधि आयन वर्णलेख फिल्टर पेपर पर देखा और सूखे, और (सी) प्रतिनिधि आयन वर्णलेख की अवधारण समय के निशान फिल्टर पेपर पर एक प्रत्यारोपण रोगी द्वारा एकत्र की एक नमूने की। यह एक गर्त नमूना है और मापा Tacrolimus एकाग्रता 2.1 एनजी / एमएल था। यह नमूना घर पर मरीज द्वारा एकत्र की है और था कि एक चिकित्सीय परीक्षण से किया गया था सिनसिनाटी संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय (सिनसिनाटी, ओह) ने मंजूरी दे दी। सभी रोगियों को उनके उचित लिखित सहमति दे दी है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न के रूप में आयन chromatograms मूल प्रिंट बहिष्कार कर रहे हैं (निर्माता जानकारी के लिए, माल की सूची देखें)। आयन chromatograms में नीले और लाल लाइनों आंतरिक मानक डी 2, क्रमशः 13 सी Tacrolimus और Tacrolimus का प्रतिनिधित्व करते हैं। मुख्य Tacrolimus और आंतरिक मानक चोटियों के सामने eluting शिखर रोटामर कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4. प्रतिनिधि कैलिब्रेशन वक्र। एक मूल प्रिंट आउट मास स्पेक्ट्रोमेट्री सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न के रूप में दिखाया गया है।424 / 52424fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 5
    चित्रा 5. प्रतिनिधि आयन वर्णलेख (आयन दमन / आयन संवर्धन)। तीर Tacrolimus चोटी की अवधारण समय के निशान एक संभावित मैट्रिक्स प्रभाव का आकलन करने के लिए एक निकाले रिक्त रक्त का नमूना पोस्ट-स्तंभ Tacrolimus का आसव और इंजेक्शन के दौरान मापा। मैट्रिक्स प्रभाव का परीक्षण 46 में वर्णित प्रक्रिया के आधार पर किया गया था। प्रभाव का पता चला था कोई प्रासंगिक मैट्रिक्स। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Discussion

    ऊपर उल्लिखित के रूप में, सूखे खून के धब्बे के आधार पर चिकित्सकीय दवा और Tacrolimus का पालन निगरानी की अवधारणा को आकर्षक है, हालांकि, आम तौर पर शिरापरक EDTA पूरे रक्त के नमूनों में Tacrolimus की नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण से जुड़े लोगों के परे जाना कि विश्लेषणात्मक चुनौतियों का सामना कर रहे हैं। इनमें शामिल हैं, लेकिन मैट्रिक्स यहां इस्तेमाल किया फिल्टर कार्ड सामग्री और कम रक्त की मात्रा (20 μl) की कपास linters सामग्री में भिगो केशिका पूरे रक्त तथ्य यह है कि, तक सीमित नहीं हैं। फिर भी, एक केंद्रीय प्रयोगशाला में उच्च throughput विश्लेषण एक मजबूत, विशिष्ट और अति संवेदनशील नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस परख के साथ संयोजन में मैट्रिक्स हस्तक्षेप और मैट्रिक्स प्रभाव की कमी है कि नमूने में यह परिणाम है कि एक तेज और विश्वसनीय निष्कर्षण विधि की आवश्यकता है। पहले से मुक्का मारा फिल्टर कार्ड निकासी / नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण में विफल रहता है के मामले में फिर से विश्लेषण के लिए छोड़ दिया पर पर्याप्त सामग्री आम तौर पर वहाँ नहीं है के रूप में परख की विश्वसनीयता महत्वपूर्ण है।

    फाईवर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल lter कार्ड इन एक एफडीए को मंजूरी दे दी वर्ग द्वितीय डिवाइस के रूप में, NCCLS मार्गदर्शन LA4-A5 44 के अनुपालन में हैं और CE चिह्नित यूरोप में हैं चुने गए हैं (निर्माता जानकारी के लिए, माल की सूची देखें)। पूरी तरह से भरा है, तो वाटमान 903 फिल्टर कार्ड पर एक चक्र धारण ≈50 रक्त 46 μl। हालांकि, व्यक्तिगत रोगियों द्वारा एकत्र रक्त की बूंदों के आकार भिन्न है और उचित नमूना तकनीक में प्रशिक्षण आवश्यक 46 है।

    रक्त मौके नमूना सूख एक मुक्का मारा-बाहर निकालने का पहला महत्वपूर्ण कदम homogenization है। हमारे अनुभव के आधार पर, एक गोली ब्लेंडर का उपयोग अधिक कुशल और ऐसे sonication के रूप में निकासी दक्षता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल अन्य तरीकों से बेहतर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। गोली ब्लेंडर का उपयोग लगातार 90% से ऊपर निकासी वसूलियां प्राप्त करने के लिए आवश्यक था। निष्कर्षण प्रक्रिया की विश्वसनीयता के लिए, यह सभी सेंट्रीफ्यूज temperat किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए भी महत्वपूर्ण थाUre नियंत्रित (4 डिग्री सेल्सियस) और vortexing कदम अधिक चर और कम निकासी वसूली में हुई है, जो कम से कम 10 मिनट, नहीं था। इसके अलावा, यह Tacrolimus वसूली प्रोटीन वर्षा समाधान का सही रचना के लिए बहुत संवेदनशील है के रूप में मेथनॉल / ZnSO 4 अनुपात बदल नहीं है कि महत्वपूर्ण है।

    अगली चुनौती मैट्रिक्स हस्तक्षेप और प्रभाव के कारण हो सकता है कि सामग्री के आदर्श विहीन एक साफ निकालने प्राप्त करने के लिए है। इस प्रकार, के रूप में अक्सर EDTA के रक्त के नमूनों से Tacrolimus की निकासी के लिए इस्तेमाल एक सरल एक कदम प्रोटीन वर्षा कदम के लिए एक व्यवहार्य विकल्प नहीं माना जाता था। प्रोटीन (एक आइसोटोप लेबल आंतरिक मानक के अलावा सहित) ZnSO 4 का उपयोग कर वर्षा, vortexing और centrifugation के बाद, supernatants एक 2 डी एचपीएलसी प्रणाली में और एक ऑनलाइन निकासी स्तंभ पर इंजेक्ट किया गया। एक साधारण 6-बंदरगाह का उपयोग पारंपरिक पूर्व स्तंभ कारतूस पर 5 मिलीग्राम / मिनट के उच्च प्रवाह का उपयोग कर ऑनलाइन स्तंभ निष्कर्षणTacrolimus के विश्लेषण के लिए स्विचिंग वाल्व 47 से पहले वर्णित किया गया है। कि Tacrolimus और इसकी आंतरिक मानक निष्कर्षण स्तंभ के सामने केंद्रित करने और सफाई चरण के दौरान स्तंभ पर विस्थापित नहीं किया तो मोबाइल चरण में चुना गया था। वर्तमान प्रोटोकॉल में इस्तेमाल ऑनलाइन निकासी नकारात्मक एचपीएलसी विश्लेषण को प्रभावित किए बिना अपेक्षाकृत बड़े नमूना संस्करणों के इंजेक्शन सहित कई फायदे था। निष्कर्षण स्तंभ के शीर्ष पर analytes को समृद्ध बनाने के बाद वापस फ्लश ("ध्यान केंद्रित शिखर") विशेष रूप से कम Tacrolimus सांद्रता के साथ नमूने के लिए सॉफ्टवेयर एल्गोरिथ्म के द्वारा और अधिक विश्वसनीय एकीकरण के लिए अनुमति तेज चोटियों में हुई। 48 ऑनलाइन सफाई कदम ही दूर नहीं किया संभवतः मैट्रिक्स यौगिकों दखल दे, लेकिन यह भी नमूना डी-नमकीन। उच्च मात्रा, उच्च throughput नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस assays के लिए एक महत्वपूर्ण अभी तक शायद ही कभी चर्चा समस्या की वजह से वृद्धि करने के लिए नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस प्रणाली की संवेदनशीलता का ह्रास हुआ हैबड़े समूहों के विश्लेषण के दौरान electrospray स्रोत के प्रदूषण। कोई महत्वपूर्ण मैट्रिक्स प्रभाव (आयन दमन / आयन वृद्धि) मनाया गया। संभावित मैट्रिक्स प्रभाव के नकारात्मक प्रभाव के संयोजन से / कम से बचा रहे थे निम्नलिखित: 16,000 XG, उच्च प्रवाह ऑनलाइन निकासी, संभावित हस्तक्षेप जल्दी Eluting से Tacrolimus के स्पष्ट chromatographic जुदाई में प्रोटीन वर्षा के बाद मेथनॉल / ZnSO 4, centrifugation का उपयोग प्रभावी प्रोटीन वर्षा विश्लेषणात्मक स्तंभ और इसके बजाय इस तरह के ascomycin के रूप में संरचनात्मक रूप से संबंधित आंतरिक मानकों के आंतरिक मानक के रूप में आइसोटोप लेबल Tacrolimus के उपयोग से।

    मात्रा का ठहराव की निचली सीमा 1 एनजी / एमएल, और वर्तमान में अक्सर EDTA के रक्त के नमूनों में Tacrolimus की चिकित्सकीय दवा की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है कि सबसे immunoassays की तुलना में इस प्रकार कम था। मात्रा का ठहराव के इस निचली सीमा भी तथाकथित कम calcineurin अवरोध करनेवाला लंबी अवधि immunosuppres के लिए पर्याप्त हैनिर्णायक रखरखाव प्रोटोकॉल।

    सूखे खून में Tacrolimus यों को पहले से वर्णित नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस assays के साथ इसकी तुलना में 29-34,36,39,41,42, वर्तमान परख मैचों धब्बे या कम मात्रा का ठहराव की सीमा, निकासी वसूली, शुद्धता के मामले में उनके प्रदर्शन से अधिक और सटीक तरह आम तौर पर स्वस्थ व्यक्तियों से रक्त के नमूनों के आधार पर सत्यापन के दौरान स्वीकार्य परिणाम दे जो एक कदम प्रोटीन वर्षा प्रक्रियाओं और अति लघु क्रोमैटोग्राफी बार, के रूप में संभावित जोखिम भरा अवधारणाओं से परहेज करते हुए। हालांकि, प्रत्यारोपण के रोगियों के खून की संरचना को प्रभावित है और जो कई दवाओं ले कि बीमारियों वाले मरीजों के लिए एक अत्यधिक जटिल समूह हैं। इस तरह से यह लगभग असंभव सत्यापन के दौरान व्यक्ति के रोगियों में मौजूद हो सकता है और केवल व्यवहार्य रणनीति यह इस तरह के संभावित हस्तक्षेप के जोखिम को कम करता है कि एक तरह से परख स्थापित करने के लिए है हो सकता है कि सभी संभावित हस्तक्षेप बाहर करने के लिए बनाता है। सूखे रक्त एसपीओटीएस जैसे रक्त चिपचिपापन पर hematocrit का प्रभाव है और इस तरह फिल्टर पेपर 49 पर लागू रक्त का प्रसार गुण के रूप में चुनौतियों का सामना किया। इस तरह के प्रभाव पहले से ही चिकित्सकीय उचित सीमा 29,32 भीतर hematocrits और Tacrolimus सांद्रता में सूखे खून के धब्बे में Tacrolimus विश्लेषण को प्रभावित करने के लिए नहीं वर्णित किया गया है, क्योंकि यह यहाँ फिर से परीक्षण नहीं किया गया था। ऊंचा तापमान पर सूखे खून के धब्बे में Tacrolimus की भी स्थिरता पहले से ही सूखे खून के धब्बे में दूसरों के लिए और Tacrolimus द्वारा अध्ययन किया गया है सूखे रक्त के लदान के लिए महत्वपूर्ण है, जो भी 60 डिग्री सेल्सियस से 32, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए स्थिर हो सकता है और पाया गया विशेष रूप से गर्मियों के दौरान न तापमान नियंत्रित परिस्थितियों में स्पॉट।

    गोली ब्लेंडर homogenization के संयोजन पर आधारित इस परख, उच्च प्रवाह ऑनलाइन स्तंभ सफाई और नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण अन्य आई एम एम की मात्रा का ठहराव के लिए रसायन assays के विकास के लिए एक मंच की रणनीति प्रदान कर सकता हैअकेले या एक साथ, साथ ही सूखे रक्त मौके नमूनों में अन्य दवाओं के unosuppressants।

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    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Tacrolimus U.S. Pharmacopeial Convention 1642802
    D2,13C-Tacrolimus Toronto Research Chemicals Inc. F370002
    Red blood cells University of Colorado Hospital W20091305500 V
    Plasma University of Colorado Hospital W2017130556300Q
    Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9% Sigma-Aldrich 439126-4 L
    Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UV Thermo Fisher Scientific A955-4
    Isopropanol 99.9%, HPLC Fisher Scientific BP2632-4
    Methanol Optima LC/MS Thermo Fisher Scientific A452-4
    Water Optima LC/MS, UHPLC-UV Thermo Fisher Scientific W6-4
    Formic acid Thermo Fisher Scientific A118P-500
    Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
    Zinc sulfate Thermo Fisher Scientific Z68-500
    0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008649
    1.5 ml Eppendorf tube Thermo Fisher Scientific 02-682-550
    10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008651
    10 μl pipet tips with filter, sterile Neptune BT 10XLS3
    100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008653
    100 μl pipet tips with filter, sterile Neptune BT 100
    1,000 μl pipet tips with filter, sterile Multimax 2940
    2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008650
    2 ml Eppendorf tube Thermo Fisher Scientific 02-681-258
    20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008652
    20 μl pipet tips with filter, sterile GeneMate P-1237-20
    200 μl pipet tips with filter Multimax 2938T
    200 μl pipet tips with filter, sterile Multimax 2936J
    50 ml Falcon tube BD Falcon 352070
    300 μl inserts for HPLC vials Phenomenex ARO-9973-13
    Balance PR2002 Mettler Toledo 1117050723
    Balances AX205 Delta Range Mettler Toledo 1119343379
    Bullet Blender Homogenizer Next Advance BBX24
    Centrifuge Biofuge Fresco Heraeus 290395
    Disposable Wipes PDI Q55172
    Glass v ials, 4 ml Thermo Fisher Scientific 14-955-334
    Glass vials, 20 ml Thermo Fisher Scientific B7800-20
    Gloves, nitrile Titan Brand Gloves 44-100S
    HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clear Phenomenex ARO- 9921-13
    Lids for HPLC vials Phenomenex ARO- 8952-13-B
    Needle, 18 G 1.5 Precision Glide 305196
    Rack for Eppendorf tubes Thermo Fisher Scientific 03-448-11
    Rack for HPLC Vials Thermo Fisher Scientific 05-541-29
    Steel beads 0.9 – 2 mm Next Advance SSB14B
    Storage boxes for freezers / refrigerators Thermo Fisher Scientific 03-395-464
    Standard multi-tube vortexer VWR Scientific Products 658816-115
    Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK GE Whatman  2016-05
    Autosampler CTC PAL  PAL.HTCABIx1
    Binary pump, Agilent 1260 Infinity Agilent Technologies 1260 G1312B
    Binary pump, Agilent 1290 Infinity Agilent Technologies 1290 G4220A
    Micro vacuum degasser, Agilent 1260 Agilent Technologies 1260 G13798
    Column oven,  Agilent 1290 with 2 position  Agilent Technologies 1290 G1216C
    Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve Agilent Technologies 1290 G1316C
    HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm Phenomenex 820950-926
    HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm Phenomenex 993967-906
    Tandem Mass Spectrometer
    API5000 MS/MS with TurboIonspray source AB Sciex 4364257
    Mass spectrometry software AB Sciex Analyst 1.5.1

    References

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