Automatic Translation

This translation into Dutch was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Medicine

Kwantificering van de Immunosuppressieve tacrolimus op opgedroogd bloed Spots Met behulp van LC-MS / MS

1, 1, 1, 1, 2, 3, 4, 1

1iC42 Clinical Research and Development, University of Colorado, Anschutz Medical Campus, 2Division of Clinical Pharmacology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Food and Drug Administration (FDA), Center of Drug Evaluation Research - Office of Generic Drugs, 4Transplant Clinical Research, University of Cincinnati

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    Enter your email to receive a free trial:

    Welcome!

    Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!


    By clicking "Submit", you agree to our policies.

    Admit it, you like to watch.

     

    Summary

    Cite this Article

    Shokati, T., Bodenberger, N., Gadpaille, H., Schniedewind, B., Vinks, A. A., Jiang, W., et al. Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS. J. Vis. Exp. (105), e52424, doi:10.3791/52424 (2015).

    Abstract

    De calcineurineremmer tacrolimus is de hoeksteen van de meeste immunosuppressieve behandelprotocollen na solide orgaantransplantatie in de Verenigde Staten. Tacrolimus is een smalle therapeutische index geneesmiddel en als zodanig vereist therapeutische controle van geneesmiddelen en aanpassing van de dosis op basis van haar volbloed dalconcentraties. Naar huis therapeutische geneesmiddelen en therapietrouw monitoring te vergemakkelijken, de verzameling van gedroogde bloedvlekken is een aantrekkelijk concept. Na een vingerprik, de patiënt verzamelt een druppel bloed op filterpapier thuis. Nadat het bloed is gedroogd, wordt deze verzonden naar het analytische laboratorium waar tacrolimus wordt gekwantificeerd met behulp van high-performance vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (HPLC-MS / MS) in combinatie met een eenvoudige handmatige eiwitten neerslaan en online extractiekolom.

    Voor tacrolimus analyse is een 6-mm schijf gestanst uit de verzadigde centrum van het bloed ter plaatse. Het bloed spot wordt gehomogeniseerd met behulp van een kogel een blendernd dan eiwitten worden geprecipiteerd met methanol / 0,2 M ZnSO 4 met interne standaard D 2, 13 C-tacrolimus. Na vortexen en centrifugeren, wordt 100 ul supernatant geïnjecteerd in een online extractiekolom en gewassen met 5 ml / min van 0,1 mierenzuur / acetonitril (7: 3, v: v) gedurende 1 min. Hierna wordt de schakelklep geactiveerd en de analyten worden teruggespoeld op de analytische kolom (en gescheiden met een 0,1% mierenzuur / acetonitril gradiënt). Tacrolimus wordt gekwantificeerd in de positieve meerdere reactiewijze (MRM) met een tandem massaspectrometer.

    De assay is lineair 1-50 ng / ml. Inter-assay variabiliteit (3,6% -6,1%) en de nauwkeurigheid (91,7% -101,6%) zoals bepaald meer dan 20 dagen te voldoen acceptatiecriteria. Gemiddelde extractie herstel is 95,5%. Er zijn geen relevante carry-over, matrix storingen en matrixeffecten. Tacrolimus is stabiel in gedroogde bloedvlekken bij kamertemperatuur en bij 4 ° C gedurende 1 week. Onttrokken monsters in deautosampler stabiel bij 4 ° C gedurende ten minste 72 uur.

    Introduction

    Tacrolimus is een krachtige immonosuppressant 1-7 die een macrolide structuur 8 (figuur 1) heeft. Vanwege cis - trans isomerie GN bindingen vormt twee rotameren in oplossing 9 die kunnen worden gescheiden door omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) Tacrolimus lipofiel en oplosbaar in alcoholen (methanol: 653 g / L, ethanol: 355 g / l), gehalogeneerde koolwaterstoffen (chloroform: 573 g / l) en ether. Het is slecht oplosbaar in alifatische koolwaterstoffen (hexaan: 0,1 g / l en water (pH 3. 0,0047 g / L) 9 Het molecuul bevat geen chromofoor en UV-absorptiemaximum bevat is 192 nm Tacrolimus werkt via inhibitie van calcineurine. . Het werkingsmechanisme is beoordeeld in de referenties 10,11. Het wordt momenteel gebruikt in meer dan 80% van de vaste-orgaantransplantatie patiënten in de Verenigde Staten 12.

    De therapeutische index van tacrolimus is gezioend te zijn smalle 13. Bovendien is de correlatie tussen tacrolimus en bloedconcentraties is slecht en farmacokinetiek variabel 14,15. Therapeutische drug monitoring tacrolimus dosering bij transplantatie patiënten is daarom de algemene klinische praktijk 16-20. Het doel is om de tacrolimus bloedconcentraties binnen een vooraf bepaalde therapeutische bereik te houden. Tacrolimus bloed concentraties beneden het therapeutisch bereik kan leiden tot verhoogde activiteit van chronische of acute allo-immuunreactie, terwijl concentraties boven het therapeutisch verhogen het risico van over- immunosuppressie, kanker en toxiciteit, bijvoorbeeld nefrotoxiciteit, neurotoxiciteit, hypertensie en diabetes. Hoge farmacokinetische intra-individuele variabiliteit van tacrolimus kan schadelijk zijn voor zowel de transplantatie van organen en overleving van patiënten 21,22 zijn. Terwijl de inter-individuele variabiliteit van tacrolimus farmacokinetiek wordt vooral veroorzaakt door CYP3A5 polymorfismen, redenen voor intra-individuelevariabiliteit omvatten, maar zijn niet beperkt tot, drug-drug, ziekte-geneesmiddel en food-geneesmiddelinteracties 14,15. Ook gebrek aan naleving van de immunosuppressieve therapeutische drug regime is een bijdragende factor en een belangrijke reden voor transplantaat verlies 23,24.

    Deze overwegingen suggereren dat frequent thuis therapeutische geneesmiddelen en therapietrouw monitoring van tacrolimus volbloed-concentraties nuttig om ervoor te zorgen dat patiënten de blootstelling tacrolimus binnen de gewenste therapeutische raam te allen tijde kan worden. Echter, de logistiek en de kosten van frequentere therapeutic drug monitoring als het huidige klinische praktijk 15 is onbetaalbaar. Een van de redenen is dat de patiënt om te zien een phlebotomist de vereiste veneus bloedmonster getrokken hebben. Gedroogd bloed vlekken zijn onlangs naar voren gekomen als een aantrekkelijk concept van 25-28. Na een eenvoudige vinger stick de patiënt verzamelt een druppel bloed op een speciaal filter papier kaart en na het bloed spot heeft dried kan worden verzonden naar een centraal laboratorium voor analyse van tacrolimus en andere immunosuppressieve dat de patiënt nog kan nemen. Dit is mogelijk geworden door de ontwikkeling van zeer gevoelige en specifieke LC-MS / MS assays voor het kwantificeren van tacrolimus en andere immunosuppressiva in zeer kleine hoeveelheden bloed zoals gedroogde bloedvlekken (gewoonlijk 20 pl bloed) 25,29-43. Een ander voordeel is dat minimaal invasieve, een laag volume monstername strategieën zoals gedroogde bloedvlekken sterk therapeutische controle van geneesmiddelen en farmacokinetische studies bij kleine kinderen 28 vergemakkelijken.

    Tacrolimus wordt meestal gemeten bij veneuze EDTA volbloed 15. Redenen zijn dat tacrolimus uitgebreid distribueert in bloedcellen en dat de klinische studies hebben gemeld betere correlatie tussen tacrolimus dalspiegels in het bloed dan in het plasma met klinische gebeurtenissen 15,18. In vergelijking, de analyse van tacrolimus in gedroogde bloedvlekken op basis van capillair bloed dat wordt gemengd met het filterpapier matrix. Dit biedt uitdagingen op het gebied van de solubilisatie van tacrolimus en mogelijke interferenties met de LC-MS / MS analyse. Hier presenteren we een gevestigde en gevalideerde test gebaseerd op homogenisering van de gedroogde bloedvlek met een kogel blender in combinatie met high-flow online column steekproef schoonmaak procedures en LC-MS / MS analyse. Met ingang van vandaag, heeft deze test met succes gebruikt voor de kwantificering van meer dan vijfduizend tacrolimus gedroogd bloed spot monsters voor de naleving bewaking in klinische studies.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Protocol

    De geïdentificeerde bloedmonsters van gezonde personen waren van de University of Colorado Hospital (Aurora, Colorado). Het gebruik van de geïdentificeerde bloedbank monsters voor de validatie studies, alsook voor de voorbereiding van kalibrators en kwaliteitscontrole monsters werd "vrijgesteld" beschouwd door de Colorado Multi-institutionele Review Board (COMIRB, Aurora, Colorado).

    1. Voorbereiding van referenties en oplossingen

    1. Kopen van tacrolimus en de interne standaard D 2, 13 C-tacrolimus uit de in de materialen opgesomd leveranciers.
      1. Bereid voorraadoplossingen in zuivere methanol bij een concentratie van 1 mg / ml voor tacrolimus en een concentratie van 10 ug / ml voor D 2, 13 C-tacrolimus. Maak voorraad oplossingen van referentiematerialen gebaseerd op drie onafhankelijke wegingen. Aliquot voorraadoplossingen en bewaar bij -70 ° C of lager.
    2. Bereid oplossing eiwitten precipiterenen extract tacrolimus gebruik van methanol / 0,2 M ZnSO 4 in water (7: 3, v: v). Deze oplossing bevat ook de interne standaard D 2, 13 C-tacrolimus in een concentratie van 2,5 ng / ml en wordt gebruikt voor de extractie van alle monsters behalve voor de extractie van blanco monsters (zie 1.3.3).
      1. Bereid dit eiwit precipitatieoplossing vers op elke extractie dag en stel het verstrijken van de oplossing bij 12 uur.
    3. Bereiding van ijklijn en kwaliteitscontrole (QC) monsters
      1. Bereid voorraad oplossingen van tacrolimus door het uitvoeren van geschikte verdunningen van de voorraad oplossing met behulp van pure methanol.
      2. Om ijk- en kwaliteitscontrolemonsters bereiden spike 20 pl geschikt verdund voorraadoplossing in EDTA volbloed, incubeer bij 37 ° C onder zacht schudden in een waterbad te zorgen voor homogene verdeling van tacrolimus in het cellulaire bloedproducten 20 min en aliquot in 1,5 ml poliepropylene buizen met conische bodem en snap-on deksels. Zorg ervoor dat de relatieve omvang van organische oplosmiddelen niet meer dan 5%.
      3. Spot 50 ul van het verrijkte bloed in het midden van elke cirkel op de filterkaarten met een pipet.
      4. Droog de bloedvlekken op filterkaarten bij kamertemperatuur gedurende 3 uur.
      5. Bereid tacrolimus calibratiestandaarden in menselijk EDTA volbloed bij tacrolimus concentraties van 1, 2,5, 5, 10, 25 en 50 ng / ml. Bereid een blanco monster voor de extractie als de kalibratiestandaarden met het eiwit precipitatie met interne standaard D 2, 13 C-tacrolimus ("zero sample").
      6. Bereid QC monsters humaan volbloed EDTA in concentraties van 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. Bereid een blanco monster. In tegenstelling tot de QC-monsters die zijn geëxtraheerd met neerslag met interne standaard D 2, 13 C-tacrolimus, pakt deze lege monster met eiwitprecipitatie oplossing doetde interne standaard D 2, 13 C-tacrolimus ("blanco monster") bevatten.
    4. Verzameling van klinische monsters
      1. Verzamel gedroogd bloed vlekken zoals beschreven in 43,44.

    2. Winning van tacrolimus opgedroogd bloed Spot Steekproeven

    1. Inspecteer de gedroogd bloed plek aanvaardbaar monster kwaliteit en volume 45 te waarborgen.
    2. Punch centrum van het bloed vlek op het filter kaart met een 6-mm perforator.
      Opmerking: De kwaliteit van stempels kan worden gevolgd door weging. Een geperforeerd verzadigd filter schijf weegt gemiddeld 5,02 mg ± 0,09 mg (range: 4.83- 5.14 mg, n = 12).
    3. Plaats schijven in 1,5 ml polypropyleen buizen met conische bodem en snap-on deksels.
    4. Voeg 20-30 kogels aan elke buis.
    5. Voeg 500 pi van het eiwit precipitatie-oplossing (methanol: 0,2 M ZnSO 4, 7: 3, v: v met 2,5 ng / ml interne standaard) in elke buis. Voor het extractie van blanco monsters, gebruiken eiwitprecipitatie oplossing zonder de interne standaard.
    6. Homogeniseren van de schijven in de kogel blender gedurende 1 min (maximale snelheid, de instelling "10").
    7. Schud monsters bij RT op multi-tube vortex (maximale snelheid, de instelling "10") gedurende 10 min.
    8. Centrifugeer de monsters bij 16.000 xg en 4 ° C gedurende 10 min.
    9. Breng de bovenstaande vloeistoffen in glas HPLC-flesjes uitgerust met een 300 ul insert. Gebruik pre-split Teflon afdichtingen.
      Opmerking: De geëxtraheerde monsters worden bewaard bij -20 ° C of lager totdat LC-MS / MS analyse.

    3. LC-MS / MS Analyse

    1. Belasting 100 pi van het supernatant van de geëxtraheerde monster in de extractiekolom C8 cartridge en wassen met een 7: 3 verhouding van 0,1% mierenzuur in water: acetonitril bij een stroomsnelheid van 5 ml / min gedurende 1 min. De aansluitingen van de schakelklep worden getoond in figuur 2 en het verloop gerund door de extractie pomp in Tabel 1
    2. Hierna activeert de schakelklep waardoor terugspoeling van de analyten uit de pre-kolom op de analytische kolom.
    3. Stel de kolom thermostaat op 65 ° C.
    4. Elueer de analyten uit de analytische kolom met de stroomsnelheden en verloop weergegeven in tabel 1.
    5. Sluit de analytische kolom om een tandem massaspectrometer via de turbo elektrosprayionisatie bron. Pas de belangrijkste parameters van de massaspectrometer volgens tabel 2.
    6. Detect positieve ionen ([M + Na] +) in de meervoudige reactiewijze (MRM). Gebruik de volgende ion transities voor de kwantificering: tacrolimus: m / z (massa / lading) = 826,6 → 616,2 en D 2, 13 C-tacrolimus: m / z = 829,6 → 619,2.
      Opmerking: De totale looptijd is 4,6 min.

    4. kwantificering

    1. Voor elke run, het genereren van een ijkkromme gebaseerd op het bereid in 1.3.5 en kalibratorenomvatten in elke analytische run.
      1. Genereer een ijkcurve door nominale concentraties versus respons factor analyt (Peak Area [Analyte] / Peak Area [interne standaard]) met behulp van de massaspectrometer software.
      2. Monteer de kalibratoren met een kwadratische fit in combinatie met 1 / X weging.
    2. De hoeveelheid tacrolimus in de gedroogde bloedvlekken integreren tacrolimus en de interne standaard in de uitgepakte MRM chromatogrammen. Bereken de responsfactor voor tacrolimus (Peak Area [Analyte] / Peak Area [interne standaard]) en vergelijken met de kalibratiecurve met behulp van de massaspectrometrie software.

    5. Validatie Procedures

    1. Ondergrens van detectie (LLOD) en de ondergrens van kwantificering (LLOQ).
      1. Beschouw de laagste tacrolimus concentratie met een piek-tot-ruis verhouding van 4: 1 als de onderste detectielimiet (LLOD). Definieer de ondergrens van kwantificering (LLOQ) alslaagste concentratie van de kalibratiecurve met een nauwkeurigheid gelijk aan of beter dan ± 20% afwijking van de nominale concentratie en nauwkeurigheid gelijk aan of beter dan 20% (variatiecoëfficiënt).
    2. Intra- en inter-dag nauwkeurigheid en precisie.
      1. Test de nauwkeurigheid en de precisie op vier concentraties van 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) en 40 ng / ml (QC4).
      2. Bereid de QC-monsters op elke dag validatie in menselijk EDTA volbloed droog filter cards, extract en geanalyseerd zoals hierboven beschreven.
      3. Bepaal intra-day nauwkeurigheid en precisie met 6 monsters per QC concentratie.
      4. Evalueren inter-dag nauwkeurigheid en precisie van meer dan 20 dagen. Meet elke QC-niveau met 4 monsters per dag.
      5. Analyseer twee kalibratiecurves met de QC-monsters op elke dag.
      6. Bereken intra-day nauwkeurigheid als% van de nominale concentratie (zes monsters per concentratie, zie 5.2.2). CalcUlate precisie als de coëfficiënt van variatie (CV%).
      7. Overweeg intra-day nauwkeurigheid aanvaardbaar indien zij onder de acceptatiegrenzen 85% tot 115% van de nominale concentratie. Overweeg intra-day precisie aanvaardbaar als deze gelijk is aan of beter dan een CV (variatiecoëfficiënt) van 15%.
      8. Bereken inter-dag nauwkeurigheid en precisie als het gemiddelde voor elke QC concentratieniveau boven de 20 validatie dagen geanalyseerd.
      9. Beschouw gemiddelde nauwkeurigheid inter-dag aanvaardbaar indien zij onder de acceptatiegrenzen 85% tot 115% van de nominale concentratie. Overweeg inter-dag nauwkeurig aanvaardbaar als deze gelijk is aan of beter dan een CV (variatiecoëfficiënt) van 15%.
    3. Uitsluiting van matrix storingen.
      1. Voor de uitsluiting van storingen, veroorzaakt door de matrix signalen analyseren lege gedroogde bloedvlekken (8 verschillende individuen, bij voorkeur 4 mannetjes en 4 vrouwtjes).
      2. Visueel te inspecteren ion chromatogrammen. Als pieken binnen de retentietijdraam van tacrolimus worden gedetecteerd, te integreren en hun gebieden te vergelijken onder de curve met die van tacrolimus pieken in blanco monsters verrijkt met tacrolimus op het LLOQ. Het gebied van pieken in de blanco monsters worden niet verondersteld om meer dan 15% van die van tacrolimus op de LLOQ.
    4. Ion onderdrukking / ion toebehoren.
      1. Gebruik een infusie post-column protocol zoals beschreven 45 om mogelijke storing van ion onderdrukking / ion verbetering veroorzaakt door de co-eluerende matrixbestanddelen beoordelen.
      2. Infuseren tacrolimus bij een concentratie van 10 ug / ml opgelost in 0,1% mierenzuur: methanol (30:70, v / v) na de kolom met een snelheid van 10 pl / min.
        1. Sluit een injectiepomp via T-stuk tussen de analytische kolom en de electrospray bron van de massaspectrometer.
        2. Controleer de MS / MS signaalintensiteit van MRM-overgangen van tacrolimus en de interne standaard (m / z = 826,6 → 616,2 en m / z = 829,6 → 619,2) na injectie van winningted blanco monsters (n = 8 monsters van verschillende individuen).
          Opmerking: Bij afwezigheid van ion onderdrukking / ion enhancement het continu signaal veroorzaakt door infusie van de analyten niet worden beïnvloed door injectie van de lege matrix, terwijl ion onderdrukking veroorzaakt een daling van het signaal en een verbetering ion piek.
    5. Overdragen.
      1. Evalueren mogelijke carry-over door het analyseren van gewonnen blanco monsters na de hoogste kalibratoren (50 ng / ml, n = 6).
      2. Visueel te inspecteren ion chromatogrammen. Als pieken binnen de retentietijd raam van tacrolimus worden gedetecteerd, te integreren en hun gebieden te vergelijken onder de curve met die van tacrolimus pieken in blanco monsters verrijkt met tacrolimus op het LLOQ. Het gebied van pieken in de blanco monsters worden niet verondersteld om meer dan 15% van die van tacrolimus op de LLOQ.
    6. Extractie terugvorderingen.
      1. Bepaal herstel door vergelijking van de signalen van de analyten na extractie van QC samselen op alle vier concentraties (n = 6 per concentratie) met die van lege gedroogde bloedvlekken verrijkt met de overeenkomstige bedragen van tacrolimus na de extractie.
      2. Bereid vier sets van KC (concentratie: 2, 4, 20, 40 ng / ml).
      3. Bereid eens 4 sets van de overeenkomstige "recovery proefmonsters" door het spotten van 50 pi leeg EDTA volbloed op het filter papieren kaarten en drogen gedurende 2 uur.
      4. Hierna, zowel voor de QC en blanco "recovery proefmonsters", knip de hele bloed vlek op het filter kaart met een schaar en plaats de resulterende schijven in een polypropyleen buis met conische bodem en snap-on deksel.
      5. Extract alle monsters.
      6. Breng de supernatanten (400 pi) in glas HPLC-flesjes.
      7. Voeg tacrolimus voorraadoplossing naar de lege "recovery geëxtraheerde monsters" concentraties van 2, 4, 20 en 40 ng / ml (4 pl 200, 400, 2000, 4000 ng / ml tacrolimus stock sol bereikenutions tot 400 pl supernatant).
      8. Na LC-MS / MS analyse, vergelijk de signalen in zowel QC samples en "recovery proefmonsters" van de desbetreffende concentratie (recovery% = signaalmonsters spiked voordat extractie / signaalmonsters spiked na extractie x 100).
    7. Verdunning integriteit.
      1. Vaststellen verdunning integriteit behulp monsters verrijkt met de analyten 500, 250 en 100 ng / ml.
      2. Na extractie, verdunnen monsters met behulp eiwitprecipitatie oplossing (01:10, n = 3 per concentratie).
      3. Bereken afwijkingen van de nominale concentratie. Overweeg resultaten die binnen 85% -115% van de nominale aanvaardbare vallen.
    8. Stabiliteiten.
      1. Onderzoek stabiliteiten met de QC-monsters bij vier concentraties (n = 4 per concentratie) geanalyseerd op verschillende tijdstippen en onder verschillende opslagomstandigheden.
      2. Vergelijk resultaten na opslag van de nominale waarden. Overweeg resultaten dat binnen 85% -115% van de nominale aanvaardbare vallen.
      3. Vaststellen monsterstabiliteit gedurende 1 week bij kamertemperatuur, 1 week bij 4 ° C, 1 maand bij -20 ° C en 1 maand bij -80 ° C.
      4. Test vries-dooi-stabiliteit via drie cycli (-20 ° C). Test geëxtraheerde monster en autosampler stabiliteit door het plaatsen van monsters in de autosampler thermostatisch ingesteld op 4 ° C. Injecteren monsters na 72 uur.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Representatieve ion chromatogrammen van een blanco monster een monster op de ondergrens van kwantificering en een patiëntmonster spiked zijn weergegeven in figuur 3.

    Kalibratie Curves

    De onderste detectiegrens was 0,5 ng / ml en de onderste bepalingsgrens was 1,0 ng / ml. Vijftig ng / ml werd gekozen als de kalibrator hoogste hogere concentraties onwaarschijnlijk onder normale omstandigheden in de kliniek te bereiken.

    Kalibratiecurves werden vers bereid op elke dag validatie in menselijk EDTA-bloed, gedroogd op filterpapier kaarten en geëxtraheerd met methanol / 0,2 M ZnSO 4 (70:30 v / v) + interne standaard (eindconcentratie interne standaard: 2,5 ng / ml ). Voor de dag 1 valideren (n = 6 voor kalibratie- en n = 6 voor QC-niveau) en dag 2 - 20 (n = 2 voor kalibratie- en n = 4 voor elke QC level) werden geanalyseerd met concentratie 1, 2,5, 5, 10, 25, 50 ng / ml voor calibrators. Een typische kalibratiekromme is weergegeven in figuur 4. Gemiddelde nauwkeurigheid van 85% tot 115% van de nominale, binnen het werkbereik van 2/3 van de kalibratoren (met een minimum van 6 niet-nul kalibratoren) werd aanvaardbaar geacht. De gemiddelde correlatiecoëfficiënt was (r) = 0,999 (n = 40 kalibratiecurves).

    Nauwkeurigheden en Precisions

    De resultaten zijn in detail weergegeven in Tabel 3.

    Extractie Recovery

    Gemiddelde extractie herstel was 98,2% (2 ng / ml), 92,2 (4 ng / ml), 95,5 (20 ng / ml), 96,2 (40 ng / ml).

    Matrix Storingen, Ion Onderdrukking / Ion Enhancement testen met behulp van Continuous Post-Column Infusion en Carry-over

    Analyse van de blanco monsters van acht verschillende individuen (n = 4 en n = vrouwelijke 4 male) vertoonde signalen minder dan 15% van de LLOQ (1 ng / ml) en retentietijd die overeenkomt met detacrolimus piek aangeeft dat de gedetecteerde tacrolimus piek specifiek worden overwogen. Een representatief voorbeeld wordt weergegeven in figuur 3. Potentiële storingen door ion onderdrukking / ion versterking werden getest met lege gedroogde bloedmonsters van acht gezonde individuen. Een representatief experiment wordt getoond in figuur 5. Geen aanwijzing significante suppressie ion / ion verbetering waargenomen. Geen relevante overdracht resulteert in pieken meer dan 15% van het signaal op LLOQ gedetecteerd.

    Verdunning Integriteit

    Verdunning integriteit werd onderzocht door het analyseren van monsters bereid in concentraties boven de hoogste kalibrator (100, 250 en 500 ng / ml) en verdund 1:10 in eiwitprecipitatie oplossing na extractie om het doel te bereiken van concentraties: 10, 25 en 50 ng / ml. Gemiddelde nauwkeurigheid had binnen de acceptatiecriteria van 85% dalen tot 115% van de nominale concentraties. Alle verdunningen tested met acceptatiecriteria (Tabel 4).

    Stabiliteiten

    Stabiliteit van tacrolimus gedroogde bloedvlekken werd onderzocht door het analyseren QC monsters op vier niveaus (n = 4 / concentratie), die zijn opgeslagen onder wisselende omstandigheden.

    Gemiddelde nauwkeurigheid had binnen de acceptatiecriteria van 85% dalen tot 115% van de nominale concentraties. De resultaten worden in detail getoond in Tabel 5. Geen verlies na 1 week opslag bij kamertemperatuur, na 1 week opslag bij 4 ° C, na 1 maand opslag bij -20 ° C, na 1 maand opslag bij -80 ° C, na 3 vries en ontdooi cycli en Na 72 h geëxtraheerde monsters in autosampler bij 4 ° C waren duidelijk.

    Extractie Pump Analytische (Elutie) Pump
    Water + 0,1% mierenzuur Acetonitril Debiet [ul / min] Tijd [min] Water + 0,1% mierenzuur Acetonitril Debiet [ul / min]
    0 70 30 5000 0 13 87 1000
    1 70 30 5000 2 2 98 1200
    1.1 2 98 100 3.5 2 98 1200
    3 2 98 100 3.6 13 87 1000
    3.1 20 80 2000 4.6 13 87 1000
    4 70 30 5000
    4.6 70 30 5000

    Tabel 1. Gradient Programma voor de winning en Analytische HPLC pompen.

    Parameter Omgeving
    Collision gas (CAD) 10
    Gordijn gas (CUR) (psi) 30
    Ion Source gas 1 (GS1) (psi) 50
    Ionenbron gas 2 (GS2) (psi) 30
    Vernevelaar huidige (NC) (V) 1
    Temperature (TEM) (° C) 600
    IonSpray Voltage (IS) (V) 5500
    Interface verwarming (IHE) Op
    Declustering potentiaal (DP) (V) 136
    Ingang potentiaal (EP) (V) 10
    Botsingsenergie (CE) (V) 47
    Botsing cel exit potentieel (CXP) (V) 16

    Tabel 2. Turbo Electrospray interface en massaspectrometer parameters. De nomenclatuur komt overeen met die gebruikt worden in de massaspectrometrie software (voor fabrikant details, zie Materials List).

    <td> 106
    Validatie Day QC Niveau [% van de nominale concentratie]
    2 4 20 40
    Dag 1 93.0 86.3 88.9 93.4
    101 90.4 95.3 100
    85.6 95.9 99.0 97.5
    88.6 93.6 105 103
    85.0 97.4 97.2 109
    89.1 96.7 100 101
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 90.4 93.4 97.6 100,7
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 6.6 4.6 5.5 5.2
    Dag 2 92.8 86.0 103
    91.1 88.8 94.7 87.0
    88.6 90.9 92.8 94.2
    97.2 93,7 94.2 115
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 92.4 89.9 96.2 97.9
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 3.9 3.6 4.8 12.2
    Dag 3 97.6 101 98.4 112
    104 85.6 102 110
    99.2 88.4 99.4 105
    96.3 87.2 108 117
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 99.3 90.6 102,0 111,0
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 3.4 7.8 4.2 4.5
    Dag 4 95.2 88.6 112 94.5
    105 87.3 93.2 116
    99.8 96.2 103 103
    100 104 97.2 99.4
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 100.0 94.0 101.4 103.2
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 4.0 8.2 8.1 8.9
    Dag 5 106 90.4 101 106
    108 89.0 100
    102 101 96.6 128
    105 88.8 105 107
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 105,3 92.3 102.2 110,3
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 2.4 6.3 4.2 11.1
    Dag 6 90.9 93,7 119 106
    98,8 88,1 96.4 110
    94.6 96.3 99.1 108
    108 100 102 102
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 98.1 94.5 104.1 106.5
    7.5 5.3 9.8 3.2
    Dag 7 85.1 87.5 99.5 95.4
    86.4 85.4 94.7 101
    94.5 87.3 98.9 94.6
    85.5 97.0 101 99.6
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 87.9 89.3 98.5 97.7
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 5.1 5.8 2.7 3.2
    Dag 8 86.1 92.5 91.9 102
    87.5 91.5 95.2 88.5
    115 85.6 92.1 102
    85.8 85.9 95.4 108
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 93.6 88.9 93,7 100.1
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 15.3 4.1 2.0 8.2
    Dag 9 88.9 91.4 96.9 100
    90.0 89.8 95.0 100
    69.7 85.9 95.8 109
    91.9 87.0 105 101
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 85.1 88.5 98.2 102.5
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 12.2 2.9 4.7 4.3
    Dag 10 90.9 91.3 96.2 100
    97.7 89.5 94.4 100
    99.9 109 98.7 96.8
    99.1 90.0 95.7 96.1
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 96.9 95.0 96.3 98.2
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 4.2 9.9 1.9 2.1
    Dag 11 92.7 91.9 88.2 104
    96.6 91.2 97.0 110
    109,0 92.8 970,6 102
    98.3 107 93,7 111
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 99.2 95.7 94.1 106,8
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 7.0 7.9 4.6 4.1
    Dag 12 87.7 85.5 105 95.3
    112 88,1 101 96.1
    102 89.1 89.7 97.5
    106 92.5 102 104
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 101,9 88.8 99.4 98.2
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 10.1 3.3 6.7 4.0
    Dag 13 Gefaald 85.7 93.3 102
    101 105 88.0 93.9
    112 98.0 91.4 102
    104 113 104 101
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 105,7 100,4 94.2 99.7
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 5.4 11.5 7.3 3.9
    Dag 14 91.5 89.1 97.4 93.1
    90.4 87.1 93.9 99.8
    89.7 97.0 94.8 106
    97.4 86,8 89.9 Gefaald
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 92.3 90.0 94.0 99.6
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 3.8 5.3 3.3 6.5
    Dag 15 92.8 92.8 92.5 95.4
    97.5 96.3 96.2 95.5
    95.5 108 97.3 99.3
    110 109 115 113
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 99.0 101.5 100.3 100,8
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 7.7 8.1 10.0 8.3
    Dag 16 93,7 97.8 90.7 112
    90.3 87.1 Gefaald 101
    97.9 88.3 95.5 107
    91.4 85.7 89.3 96.7
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 93.3 89.7 91.8 104.2
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 3.6 6.1 3.5 6.4
    Dag 17 88.0 86.0 93,7 103
    89.8 90.8 94.8 93.2
    85.9 91.1 99.7 94.8
    86.7 88,1 95.6 91.7
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 87.6 89.0 96.0 95.7
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 1.9 2.7 2.7 5.3
    Dag 18 89.6 85.8 91.0 98.3
    89.6 86.2 88.3 93.6
    Gefaald 86.7 96.8 104
    88,1 85.8 95.2 111
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 89.1 86.1 92.8 101,7
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 1.0 0.5 4.2 7.4
    Dag 19 98,0 </ td> 89.7 94.2 102
    88.3 86.0 97.6 102
    91.6 88,1 95.8 97.5
    90.7 90.1 92.8 88.3
    Intra-day Nauwkeurigheid [%] 92.2 88.5 95.1 97.5
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 4.5 2.1 2.2 6.6
    Dag 20 93.0 87.0 99.4 101
    97.3 87.6 95.5 91.9
    89.0 88.4 91.2 93.5
    104 90.7 97.7 115
    Intra-day Nauwkeurigheid[%] 95.8 88.4 96.0 100,4
    Intra-day Onnauwkeurigheid [CV%] 6.7 1.8 3.7 10.5

    Inter-Day Nauwkeurigheid en Onnauwkeurigheid
    Inter-dag Nauwkeurigheid 95.2 91.7 97.2 101.6
    Inter-Day Onnauwkeurigheid 6.1 4.5 3.6 4.2

    Tabel 3. Resultaten van Quality Control monsters meer dan 20 dagen. De gegevens worden weergegeven als% van de nominale. Vermeld als "mislukt" monsters zijn monsters die werden verloren fouten laboratorium / instrument. In de meeste cases, geen pieken werden gedetecteerd op alle of de interne standaard piek ontbrak.

    Verdunning 01:10
    Nominale doelconcentratie na verdunning 50 ng / ml
    98.6
    94.5
    91.4
    Nauwkeurigheid [%] 94.8
    Onnauwkeurigheid [CV%] 3.6
    Verdunning 01:10
    Nominale doelconcentratie na verdunning 10 ng / ml
    103
    99.5
    101
    Nauwkeurigheid [%] 101,2
    Onnauwkeurigheid [CV%] 1.8
    Verdunning 01:10
    Nominale doelconcentratie na verdunning 25 ng / ml
    91.7
    98.2
    103
    Nauwkeurigheid [%] 97.6
    Onnauwkeurigheid [CV%] 5.7

    Tabel 4. Resultaten van verdunning betrouwbaarheidstoetsing. De gegevens worden weergegeven als% van de nominale.

    EEN
    Stabiliteit bij KT Dag 1
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    91.9 85.8 86.0 102
    86.7 85.7 88.5 102
    86.0 85.9 90.1 103
    89.2 98.0 90.8 112
    % Van de nominale concentratie 88.5 88.9 88.9 104.8
    Onnauwkeurigheid [% CV] 2.7 6.1 2.1 4.9
    Stabiliteit bij RT, Dag 3
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    88.6 105 101 113
    94.1 100 98.5 103
    100 101 106 109
    99.5 102 102 108
    % Van de nominale concentratie 95.6 102,0 101,9 108,3
    Onnauwkeurigheid [% CV] 5.3 2.2 3.1 4.1
    Stabiliteit bij RT, Dag 7
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    105 103 91.7 109
    101 107 100 110
    102 108 107 105
    93.8 105 109 111
    % Van de nominale concentratie 100.5 105.8 101,9 108,8
    Onnauwkeurigheid [% CV] 4.7 2.2 7.8 2.6
    B
    Stabiliteit bij 4 ° C, 1 dag
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    101 89.9 95.8 100
    88.9 91.0 94.1 99.0
    96.2 100 102 96.7
    89.5 87.8 95.4 88.6
    % Van de nominale concentratie 93.9 92.2 96.8 96.1
    Onnauwkeurigheid [% CV] 5.8 5.4 3.5 5.2
    Stabiliteit bij 4 ° C, Dag 3
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    87.3 85.2 105 95.3
    Gefaald 87.8 101 96
    101 88.8 89.6 97.5
    106 92.2 102 104
    % Van de nominale concentratie 98.1 88.5 99.4 98.2
    Onnauwkeurigheid [% CV] 9.7 2.9 6.8 4.0
    Stabiliteit bij 4 ° C, Dag 7
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    94.0 98.5 96.1 110
    92.9 96.4 109 109
    91.7 96.3 97.9 115
    94.7 96.9 99.8 113
    % Van de nominale concentratie 93.3 97.0 100,7 111,8
    Onnauwkeurigheid[%CV] 1.3 1.0 5.7 2.8
    C
    Stabiliteit bij -20 ° C, Dag 3
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    87.3 98.7 111 111
    93.5 89.6 108 105
    89.5 91.5 107 112
    88.2 99.1 108 92.4
    % Van de nominale concentratie 89.6 94.7 108.5 105.1
    Onnauwkeurigheid [% CV] 2.7 4.9 1.7 9.0
    Stabiliteit bij -20 ° C, Dag 7
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    96.5 98.7 102 109
    94.8 94.6 114 106
    95.5 102 98.1 108
    107 99.5 115 105
    % Van de nominale concentratie 98.5 98.7 107,3 107
    Onnauwkeurigheid [% CV] 5.7 3.1 8.5 1.8
    </ td>
    Stabiliteit bij -20 ° C, Dag 30
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    82.3 83.1 90.4 93.2
    87.9 85.8 85.3 97.9
    85.7 88.6 98.3 98.0
    92.0 95.6 110 103
    % Van de nominale concentratie 87.0 88.3 96.0 98.0
    Onnauwkeurigheid [% CV] 4.1 5.4 10.8 4.0
    D </ td>
    Stabiliteit bij -80 ° C, Dag 3
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    87.5 96.5 96.7 Gefaald
    Gefaald 97.6 98.7 110
    88.8 96.4 106 109
    87.3 101 96.5 109
    % Van de nominale concentratie 87.9 97.9 99.5 109,3
    Onnauwkeurigheid [% CV] 0.8 2.2 4.5 0.6
    Stabiliteit bij -80 ° C, Dag 7 QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    Gefaald 98.0 105 99.8
    97.1 106 104 105
    99.7 102 99.3 102
    101 99.9 109 106
    % Van de nominale concentratie 99.3 101.5 104,3 103.2
    Onnauwkeurigheid [% CV] 2.0 3.4 4.0 2.8
    Stabiliteit bij -80 ° C, Dag 30
    QC-niveau [ng / ml] 2 20 40
    88.2 85.3 89.6 96.7
    96.2 92.6 85.8 94.1
    83.9 93,7 91.0 105
    95.6 94.0 98.9 102
    % Van de nominale concentratie 91.0 91.4 91.3 99.5
    Onnauwkeurigheid [% CV] 6.0 4.1 5.5 4.9

    E
    Vorstproef stabiliteit, -20 ° C, 1 cyclus
    QC-niveau [ng / ml] </ td> 2 4 20 40
    92.5 86.2 90.2 94.3
    89.8 90.5 85.4 104
    94.7 88.6 93.4 104
    101 89.2 93,7 96.3
    % Van de nominale concentratie 94.5 88.6 90.7 99.7
    Onnauwkeurigheid [% CV] 4.8 1.8 3.9 5.1
    Freeze dooistabiliteit, -20 ° C, 2 cycli
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    99.1 97.6 Gefaald 85.3
    93.1 88,1 93.4 92.0
    94.9 91.5 85.8 93.9
    Gefaald 90.5 86,8 85.4
    % Van de nominale concentratie 95.7 91.9 88.7 89.2
    Onnauwkeurigheid [% CV] 3.1 4.0 4.1 4.5
    Vries dooi stabiliteit, -20 ° C, 3 cycli
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    95.7 Gefaald 86.0 93.3
    95.5 87.4 85.0 91.3
    90.5 89.1 86.0 86.0
    96.9 85.7 90.2 Gefaald
    % Van de nominale concentratie 94.7 87.4 86,8 90.2
    Onnauwkeurigheid [% CV] 2.8 1.7 2.3 3.8
    F
    Onttrokken monster stabiliteit bij 4 ° C, 24 uur
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    122 112 91.0 104
    93.5 106 91.8 96.1
    111 94.8 98.2 93.5
    98.4 97.6 91.3 89.8
    % Van de nominale concentratie 106.2 102,6 93.1 95.9
    Onnauwkeurigheid [% CV] 12.8 7.9 3.4 6.0
    Onttrokken monster stabiliteit bij 4 ° C, 48 uur
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    106 108 93,7 110
    105 98.1 94.6 98.9
    103 98.4 95.0 92.6
    108 93.1 89.7 85.5
    % Van de nominale concentratie 105.5 99.4 93.3 96.8
    Onnauwkeurigheid [% CV] 2.1 6.2 2.4 10.4
    Onttrokken monster stabiliteit bij 4 ° C, 72 uur
    QC-niveau [ng / ml] 2 4 20 40
    96.5 112 96.4 104
    101 95.3 103 95.2
    94.2 105 93.5 99.5
    100 96.9 92.6 89.3
    % Van de nominale concentratie 97.9 102,3 96.4 97.0
    Onnauwkeurigheid [% CV] 3.1 7.7 4.7 6.3

    Tabel 5. Resultaten van Stability Testing. A: Stabiliteit van tacrolimus op gedroogde bloedvlekken op kamertemperatuur gedurende 7 dagen, B: Stabiliteit van tacrolimus op gedroogde bloedvlekken in de koelkast (4 ° C) gedurende 7 dagen, C: Stabiliteit van tacrolimus op gedroogde bloedvlekken op -20 ° C gedurende 1 maand, D: Stabiliteit van tacrolimus op gedroogde bloedvlekken bij -80 ° C gedurende 1 maand, E: Stabiliteit van tacrolimus op gedroogde bloedvlekken via drie vries-dooi cycli (-20 ° C), F : Extracted monster / autosampler stabiliteit bij 4 ° C gedurende 72 uur. De gegevens worden voorgesteld als% van de nominale concentratie. Vermeld als "mislukt" monsters zijn monsters die werden verloren fouten laboratorium / instrument. In de meeste gevallen werden geen pieken waargenomen op alle of de interne standaard piek ontbrak.

    Figuur 1
    Figuur 1. Structuur van tacrolimus. Atom nummering volgt de IUPAC (IUPAC) nomenclatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 2
    Figuur 2. Aansluiting van de Switching Valve.424fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 3
    Figuur 3. Representatieve Ion Chromatogrammen. (A) Vertegenwoordiger ionenchromatogram van een lege bloedmonsters gespot op filterpapier (voor fabrikant details, zie Materials List) en gedroogd. De pijl markeert de retentietijd van tacrolimus piek (B) Representatieve ion chromatogram van een blanco bloedmonsters spiked op de ondergrens van kwantificering (1 ng / ml) gespot op het filtreerpapier en gedroogd, en (C) Representatieve ionenchromatogram van een monster door een transplantatie patiënt op filtreerpapier verzameld. Dit is een trog monster en de gemeten tacrolimus concentratie 2,1 ng / ml. Dit monster werd verzameld door de patiënt thuis en komt uit een klinische studie die was goedgekeurd door de Universiteit van Cincinnati Institutional Review Board (Cincinnati, OH). Alle patiënten gaven hun juiste schriftelijke toestemming. Ion chromatogrammen zijn origineel uitdraaien zoals gegenereerd door de massa spectrometrie software (voor fabrikant details, zie Materials List). Blauwe en rode lijnen in ion chromatogrammen vertegenwoordigen de interne standaard D 2, 13 C-tacrolimus en tacrolimus, respectievelijk. De piek eluerende in de voorkant van de belangrijkste tacrolimus en de interne standaard zijn de rotameren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 4
    Figuur 4. Vertegenwoordiger Calibration Curve. Een originele print-out zoals gegenereerd door de massaspectrometrie software wordt getoond.424 / 52424fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 5
    Figuur 5. Vertegenwoordiger ionenchromatogram gemeten tijdens Post-Column Infusion van tacrolimus en Injectie van een Extracted Blank bloedmonster aan een potentiële Matrix Effect Beoordeel (Ion Onderdrukking / Ion Enhancement). De pijl markeert de retentietijd van de tacrolimus piek. Matrixeffect test was gebaseerd op de in 46 procedure. Geen relevante matrix effect werd gedetecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Hoewel, zoals hierboven vermeld, het begrip therapeutische geneesmiddel en hechting monitoring van tacrolimus basis van gedroogde bloedvlekken aantrekkelijk, er analytische uitdagingen die verder gaan dan die kenmerkend zijn voor de LC-MS / MS analyse van tacrolimus in veneus EDTA volbloedmonsters. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, het feit dat de matrix capillair volbloed gedrenkt in de katoenlinters materiaal van het filter kaartmateriaal hier gebruikt en de lage bloedvolume (20 ui). Niettemin high-throughput analyse in een centraal laboratorium vereist een snelle en betrouwbare extractie methode die resulteert in monsters met matrix storingen en matrixeffecten gebrek in combinatie met een robuuste, specifieke en zeer gevoelige LC-MS / MS analyse. Betrouwbaarheid van de assay kritisch omdat er gewoonlijk onvoldoende materiaal op het filter al gestanste kaart over voor heranalyse bij de extractie / LC-MS / MS analyse mislukt.

    De filter kaarten gebruikt in de huidige studie (voor fabrikant details, zie Materials List) werden gekozen als deze zijn een FDA goedgekeurde klasse II-apparaat, in overeenstemming zijn met NCCLS begeleiding LA4-A5 44 en zijn CE-markering in Europa. Als volledig gevuld, een cirkel op de Whatman 903 filter kaart bevat ≈50 ul bloed 46. Echter, de grootte van het bloed daalt door individuele patiënten verzameld variëren en opleiding in de juiste sampling techniek is van essentieel belang 46.

    De eerste belangrijke stap van het extraheren van een geponst-out gedroogd bloed spot monster homogenisatie. Gebaseerd op onze ervaring, het gebruik van een kogel blender efficiënter en beter reproduceerbaar dan andere methoden om de extractie efficiëntie zoals sonicatie. Het gebruik van de kogel blender essentieel was consistent bereiken extractie terugwinning boven 90%. Voor de betrouwbaarheid van de extractieprocedure, was het ook belangrijk dat alle centrifuges werden temperature gecontroleerde (4 ° C) en de vortexen stap was niet korter dan 10 min, waardoor variabeler en lagere extractie herstel. Bovendien is het belangrijk dat de methanol / ZnSO 4-verhouding niet wordt gewijzigd tacrolimus herstel is zeer gevoelig voor de juiste samenstelling van het eiwit precipitatie oplossing.

    De volgende uitdaging is om een ​​schone extract ideaal verstoken van materialen die matrix storingen en effecten kunnen veroorzaken te verkrijgen. Aldus werd een eenvoudige eenstaps proteïne neerslaan zoals vaak gebruikt voor de winning van tacrolimus uit EDTA bloedmonsters niet als een haalbare optie. Na precipitatie met behulp ZnSO eiwit 4 (inclusief toevoeging van een isotoop gemerkte interne standaard), vortexen en centrifugeren werden de supernatanten geïnjecteerd in een 2D HPLC-systeem en op een online extractiekolom. Online extractiekolom met behulp van hoge stromen van 5 ml / min van conventioneel pre-column patronen op eenvoudige 6-poortomschakelklep voor de analyse van tacrolimus zijn eerder beschreven 47. De mobiele fase werd zodanig gekozen dat tacrolimus en de interne standaard geconcentreerd in de voorkant van de extractiekolom en niet migreren de kolom tijdens de opruimstap. De online extractie toegepast bij de onderhavige protocol had een aantal voordelen, waaronder injectie van relatief grote monstervolumes zonder negatieve invloed HPLC-analyse. De back-flush na verrijken analyten bovenop de extractiekolom ("peak focus") resulteerde in scherpere pieken waardoor betrouwbaarder integratie door de software algoritme bijzonder voor monsters met een lage tacrolimus. 48 De online opruimstap niet alleen verwijderen mogelijk storende matrix verbindingen, maar ook de-gezouten het monster. Een belangrijk maar zelden besproken probleem voor high-volume, high throughput LC-MS / MS analyses is de geleidelijke verlies van de gevoeligheid van de LC-MS / MS-systeem als gevolg van toenemendevervuiling van de electrospray bron tijdens de analyse van grote batches. Geen significante effecten matrix (ion onderdrukking / ion enhancement) waargenomen. Het negatieve effect van mogelijke matrix effecten verminderd / vermeden door een combinatie van de volgende: effectieve eiwitprecipitatie toepassing van methanol / ZnSO 4, centrifugatie na eiwit precipitatie bij 16.000 xg, high-flow online extractie, duidelijke chromatografische scheiding van tacrolimus potentiële storingen vroeg eluerende de analytische kolom en het gebruik van isotoop gemerkte tacrolimus als inwendige standaard in plaats van structureel verwante interne standaarden zoals ascomycine.

    De ondergrens van kwantificering was 1 ng / ml, en dus lager dan dat van de meeste immunoassays die momenteel vaak worden gebruikt voor therapeutische drug monitoring van tacrolimus EDTA bloedmonsters. Deze ondergrens van kwantificering volstaat zelfs zogenaamde lage calcineurineremmer langdurige immunosuppressive onderhoud protocollen.

    In vergelijking met de eerder beschreven LC-MS / MS assays voor tacrolimus kwantificeren in gedroogd bloed vlekken 29-34,36,39,41,42, de huidige test wedstrijden of overtreft hun prestaties op het gebied van de ondergrens van kwantificering, extractie herstel, nauwkeurigheid en precisie terwijl het vermijden van potentieel risicovolle concepten zoals een stap procedures eiwit neerslag en ultrakorte chromatografie tijden, die meestal aanvaardbare resultaten geven tijdens de validatie op basis van bloedmonsters van gezonde individuen. Echter, transplantatiepatiënten hebben een zeer complexe groep patiënten die ziekten die de samenstelling van het bloed beïnvloeden en die meerdere medicijnen nemen. Dit maakt het nagenoeg onmogelijk om alle mogelijke storingen die in individuele patiënten tijdens de validatie en de enige haalbare strategie is het opzetten van de assay op een wijze die het risico van dergelijke potentiële storingen minimaliseert sluiten. Gedroogd bloed spots hebben problemen zoals het effect van de hematocriet van bloedviscositeit en dus de diffusie-eigenschappen van het bloed aangebracht op filterpapier 49. Dit was hier niet opnieuw getest als dergelijke effecten zijn reeds beschreven tacrolimus analyse niet beïnvloeden in gedroogde bloedvlekken op hematocrietwaarden en tacrolimus concentraties binnen klinisch redelijke grenzen 29,32. Ook de stabiliteit van tacrolimus gedroogde bloedvlekken bij verhoogde temperaturen reeds bestudeerd door anderen en tacrolimus in gedroogde bloedvlekken bleek stabiel te zijn gedurende 5 dagen bij 37 ° C of zelfs 60 ° C 32, wat belangrijk is voor verzending van gedroogde bloed plekken onder niet-temperatuur-gecontroleerde omstandigheden vooral tijdens de zomer.

    Deze assay gebaseerd op een combinatie van kogel blender homogeniseren kan high-flow online column cleanup en LC-MS / MS analyse van een platform strategie voor de ontwikkeling van bioanalytische assays voor het kwantificeren van andere imm biedenunosuppressants, alleen of gelijktijdig, alsmede andere geneesmiddelen in gedroogde bloedvlek monsters.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Tacrolimus U.S. Pharmacopeial Convention 1642802
    D2,13C-Tacrolimus Toronto Research Chemicals Inc. F370002
    Red blood cells University of Colorado Hospital W20091305500 V
    Plasma University of Colorado Hospital W2017130556300Q
    Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9% Sigma-Aldrich 439126-4 L
    Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UV Thermo Fisher Scientific A955-4
    Isopropanol 99.9%, HPLC Fisher Scientific BP2632-4
    Methanol Optima LC/MS Thermo Fisher Scientific A452-4
    Water Optima LC/MS, UHPLC-UV Thermo Fisher Scientific W6-4
    Formic acid Thermo Fisher Scientific A118P-500
    Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
    Zinc sulfate Thermo Fisher Scientific Z68-500
    0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008649
    1.5 ml Eppendorf tube Thermo Fisher Scientific 02-682-550
    10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008651
    10 μl pipet tips with filter, sterile Neptune BT 10XLS3
    100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008653
    100 μl pipet tips with filter, sterile Neptune BT 100
    1,000 μl pipet tips with filter, sterile Multimax 2940
    2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008650
    2 ml Eppendorf tube Thermo Fisher Scientific 02-681-258
    20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008652
    20 μl pipet tips with filter, sterile GeneMate P-1237-20
    200 μl pipet tips with filter Multimax 2938T
    200 μl pipet tips with filter, sterile Multimax 2936J
    50 ml Falcon tube BD Falcon 352070
    300 μl inserts for HPLC vials Phenomenex ARO-9973-13
    Balance PR2002 Mettler Toledo 1117050723
    Balances AX205 Delta Range Mettler Toledo 1119343379
    Bullet Blender Homogenizer Next Advance BBX24
    Centrifuge Biofuge Fresco Heraeus 290395
    Disposable Wipes PDI Q55172
    Glass v ials, 4 ml Thermo Fisher Scientific 14-955-334
    Glass vials, 20 ml Thermo Fisher Scientific B7800-20
    Gloves, nitrile Titan Brand Gloves 44-100S
    HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clear Phenomenex ARO- 9921-13
    Lids for HPLC vials Phenomenex ARO- 8952-13-B
    Needle, 18 G 1.5 Precision Glide 305196
    Rack for Eppendorf tubes Thermo Fisher Scientific 03-448-11
    Rack for HPLC Vials Thermo Fisher Scientific 05-541-29
    Steel beads 0.9 – 2 mm Next Advance SSB14B
    Storage boxes for freezers / refrigerators Thermo Fisher Scientific 03-395-464
    Standard multi-tube vortexer VWR Scientific Products 658816-115
    Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK GE Whatman  2016-05
    Autosampler CTC PAL  PAL.HTCABIx1
    Binary pump, Agilent 1260 Infinity Agilent Technologies 1260 G1312B
    Binary pump, Agilent 1290 Infinity Agilent Technologies 1290 G4220A
    Micro vacuum degasser, Agilent 1260 Agilent Technologies 1260 G13798
    Column oven,  Agilent 1290 with 2 position  Agilent Technologies 1290 G1216C
    Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve Agilent Technologies 1290 G1316C
    HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm Phenomenex 820950-926
    HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm Phenomenex 993967-906
    Tandem Mass Spectrometer
    API5000 MS/MS with TurboIonspray source AB Sciex 4364257
    Mass spectrometry software AB Sciex Analyst 1.5.1

    References

    1. Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19, (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
    2. Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40, (9), 1249-1255 (1987).
    3. Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2, (8670), 1000-1004 (1989).
    4. Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344, (8920), 423-428 (1994).
    5. A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331, (17), 1110-1115 (1994).
    6. Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64, (3), 436-443 (1997).
    7. Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group. Transplantation. 15, (7), 977-983 (1997).
    8. Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14, ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
    9. Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54, (6), 925-975 (1997).
    10. Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357, (6380), 695-697 (1992).
    11. Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23, (10), 563-585 (2013).
    12. Annual Data Report. Department of Health and Human Services, Health Resources and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, Division of Transplantation. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov/data/annualreport.asp (2014).
    13. Draft Guidance on Tacrolimus. Food and Drug Administration, Office of Generic Drugs. Available from: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM181006.pdf (2012).
    14. Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41, (11), 813-851 (2002).
    15. Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. ebb 4th Edition, Lipincott, Wiliams, and Wilkins. =Baltimore. 529-562 (2005).
    16. Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24, (1), 59-67 (2002).
    17. Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18, (4), 362-367 (1996).
    18. Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17, (6), 606-614 (1995).
    19. Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31, (5), 309-316 (1998).
    20. Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313, (1-2), 241-253 (2001).
    21. Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11, (6), 1122-1131 (2000).
    22. Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62, (5), 599-606 (1996).
    23. Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10, (6), 712-720 (2006).
    24. Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28, (1), 96-104 (2014).
    25. Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44, (1), 14-20 (2011).
    26. Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31, (3), 327-336 (2009).
    27. Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5, (17), 2187-2208 (2013).
    28. Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3, (7), 779-786 (2011).
    29. Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115, (Oct 15), 47-54 (2013).
    30. Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51, (Pt 1), 106-109 (2014).
    31. Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926, ((May 1)), 54-61 (2013).
    32. Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421, ((Jun 5)), 152-156 (2013).
    33. Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27, (3), 327-334 (2013).
    34. Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884, ((Feb 1)), 102-107 (2012).
    35. Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9, (6), 729-733 (2005).
    36. Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46, (Pt 2), 144-145 (2009).
    37. Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20, (2), 221-225 (2006).
    38. Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24, (6), 757-767 (2002).
    39. Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83, (2), 237-238 (2007).
    40. Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50, (4), 664-670 (2009).
    41. Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21, (2), 140-145 (2008).
    42. Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44, (3), 658-664 (2007).
    43. Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877, (14-15), 1595-1598 (2009).
    44. Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
    45. Hannon, H. W., et al. Blood collection on filter paper for neonatal screening programs, approved standard LA4-A5. Clinical Laboratory and Standards Institute. Available from: http://www.clsi.org (2007).
    46. Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773, (1), 47-52 (2002).
    47. Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400, (1-2), 103-106 (2009).
    48. Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748, (1), 41-53 (2000).
    49. Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877, (29), 3506-3514 (2009).
    50. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131, (5), S1631-S1636 (2001).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter