Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Medicine

LC-MS / MS kullanarak Kurutulmuş Kan Spotlar Immünosupresan Tacrolimus Niceleme

1, 1, 1, 1, 2, 3, 4, 1

1iC42 Clinical Research and Development, University of Colorado, Anschutz Medical Campus, 2Division of Clinical Pharmacology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Food and Drug Administration (FDA), Center of Drug Evaluation Research - Office of Generic Drugs, 4Transplant Clinical Research, University of Cincinnati

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    Enter your email to receive a free trial:

    Welcome!

    Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!


    By clicking "Submit", you agree to our policies.

    Admit it, you like to watch.

     

    Summary

    Cite this Article

    Shokati, T., Bodenberger, N., Gadpaille, H., Schniedewind, B., Vinks, A. A., Jiang, W., et al. Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS. J. Vis. Exp. (105), e52424, doi:10.3791/52424 (2015).

    Abstract

    Kalsineurin inhibitörü takrolimus ABD'de solid organ naklinden sonra en immunosupresif tedavi protokollerinin temel taşıdır. Takrolimus dar bir terapötik indeks ilaçtır ve gibi tedavi amaçlı ilaç izleme ve tam kan çukur konsantrasyonları dayalı doz ayarlaması gerektirir. Ev tedavi ilaç ve bağlılık izlenmesini kolaylaştırmak için, kurutulmuş kan lekeleri koleksiyonu cazip bir kavramdır. Bir parmak sopa sonra hasta evde filtre kağıdı üzerinde bir kan damlası toplar. Kan, kurutuldu sonra, takrolimus, yüksek performanslı sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi kullanılarak ölçülür analiz laboratuvarına gönderilecek (HPLC-MS / MS), basit bir el kitabı, protein çökeltme adımında online kolon ekstraksiyon ile kombinasyon halinde.

    Takrolimus analizi için, 6 mm'lik bir disk kan nokta doymuş merkezi kesilerek çıkarılır. Kan nokta bir kurşun blender a kullanılarak homojenize edilirnd sonra proteinler metanol / 0.2 M ZnSO 4 internal standart D 2, 13 C-takrolimus içeren çöktürülür. Vorteks ve santrifüj edilmesinden sonra, yüzer 100 ul bir online ayırma kolonuna enjekte edilir ve 5 ml / 0.1 formik asit / asetonitril dakika ile yıkandı (7: 3, hacim: hacim) 1 için min. Bundan sonra, sviçleme valfi harekete analitleri analitik kolona geri temizlendi (ve% 0.1 formik asit / asetonitril gradyanı kullanılarak ayrılmıştır) vardır. Takrolimus, tandem kütle spektrometresi kullanılarak pozitif çoklu reaksiyon modu (MRM) ölçülür.

    Deney 1 ila 50 ng / ml ile doğrusaldır. Olarak 20 gün içinde değerlendirilen Inter-tahlil değişkenliği (% 3.6 -6.1%) ve doğruluk (% 91.7 -101,6%) kabul kriterlerini karşılayan. Ortalama çıkarma kurtarma 95.5% 'dir. Carry-over, matris müdahaleler ve matriks etkileri ilgili hiçbir bulunmamaktadır. Takrolimus, oda sıcaklığında ve 1 hafta boyunca 4 ° C de kurutulur, kan lekeleri stabildir. Ayıklanan örneklerotomatik numune alma cihazı, en az 72 saat süre ile 4 ° C'de stabildir.

    Introduction

    Takrolimus makrolid yapısına 8, bir (Şekil 1) güçlü bir immonosuppressant 1-7. 653 g / L, etanol: - cis nedeniyle CN bağların trans izomerizm de ters fazlı yüksek-performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılabilmektedir çözelti 9 iki rotamerden oluşturur (HPLC) Takrolimus alkoller (metanol, lipofilik ve çözünür olan 355 g / L), halojenlenmiş hidrokarbonlar (kloroform: 573 g / L) ve eter. . 0.1 g / L ve su (pH 3: Bu alifatik hidrokarbonların (heksan içinde yavaş yavaş çözülür. Molekülü herhangi bir kromoforu ve UV-emme fazla içermez 9 0.0047 g / L) kalsinörinin önlenmesi ile 192 nm Takrolimus davranır . Etki mekanizması referanslar 10,11 gözden geçirilmiştir. Şu anda Amerika Birleşik Devletleri'nde 12 katı organ nakli hastalarının% 80'inden fazlasında kullanılmaktadır.

    Takrolimusun terapötik indeksi olan considered 13 dar olması. Buna ek olarak, takrolimus dozu ve kan konsantrasyonları arasındaki ilişki zayıf ve farmakokinetik 14,15 değişkendir. Transplant hastalarında takrolimus dozu rehberlik Terapötik ilaç izleme, bu nedenle genel klinik pratikte 16-20 olduğunu. Hedef, bir önceden belirlenmiş terapötik aralıkta takrolimus kan konsantrasyonlarını tutmaktır. Terapötik pencere üzerindeki konsantrasyonlar aşırı bağışıklık bastırma, kanser ve nefrotoksisite, nörotoksisite, hipertansiyon ve diyabet gibi toksisite için riskini arttırdığı da terapötik aralığının altında Takrolimus kan konsantrasyonları, kronik veya akut allo-bağışıklık reaksiyonlarının aktivitesinde artış ile sonuçlanabilir. Takrolimus Yüksek farmakokinetik içi bireysel değişkenlik nakli ve organ hasta sağkalımı 21,22 hem zararlı olabilir. Takrolimus farmakokinetik bireylerarası yüksek değişkenlik esas olarak CYP3A5 polimorfizmleri, içi birey için nedenlerden kaynaklanan ikendeğişkenliği arasında, ancak, ilaç-ilaç, hastalığa ilaç ve besin ile-ilaç etkileşimleri 14,15 bunlarla sınırlı değildir. Ayrıca immünosupressif terapötik ilaç rejimine bağlılık eksikliği katkıda bulunan bir faktör ve greft kaybı 23,24 için önemli bir nedenidir.

    Bu düşünceler sık ​​sık ev terapötik ilaç ve takrolimus tam kan konsantrasyonlarının izlenmesi bağlılık hastalar her zaman istenen terapötik pencere içindeki takrolimus maruziyetini sahip olmasını sağlamak için yararlı olabileceğini düşündürmektedir. Ancak, şu anki klinik uygulama 15 engelleyici lojistik ve daha sık terapötik ilaç izleme maliyeti olarak. Bunun nedenlerinden biri hasta flebotomist çizilmiş gereken venöz kan örneği var görmek olmasıdır. Kurutulmuş kan lekeleri son zamanlarda cazip bir kavram 25-28 olarak ortaya çıkmıştır. Hastayı sopa basit bir parmağı sonra özel bir filtre kağıdı kartında ve kan nokta d sonra bir kan damlası toplarried, bu takrolimus analizi ve hasta şu anda çekici olabilir diğer herhangi bir immünosupresan için merkezi laboratuara gönderilecek edilebilir. Bu, kurutuldu kan lekeleri (kan, tipik olarak 20 ul) 25,29-43 olarak, çok küçük kan hacminde takrolimus ve diğer bağışıklık bastırıcı maddelerin miktar tayini için son derece hassas ve spesifik LC-MS / MS testlerin geliştirilmesi mümkün hale gelmiştir. Diğer bir avantajı gibi kurutulmuş kan lekeleri gibi minimal invaziv, düşük hacimli numune toplama stratejileri büyük ölçüde küçük çocukların 28 terapötik ilaç izleme ve farmakokinetik çalışmaları kolaylaştırmak olduğunu.

    Takrolimus, genellikle venöz EDTA tam kan 15 ölçülür. Nedenleri takrolimus yoğun kan hücrelerine dağıtır ve klinik çalışmalar klinik olayların 15,18 ile plazmada daha kanda takrolimus çukur konsantrasyonları arasında iyi korelasyon bildirmişlerdir vardır. Buna karşılık, ta analizikurutuldu kan lekelerinde crolimus filtre kağıdı matris ile karıştırılır ve kılcal kan dayanır. Bu LC-MS / MS analizi ile takrolimus ve potansiyel etkileşimler çözünürleştirme bakımından zorlukları sunmamaktadır. Burada yüksek akış çevrimiçi kolon numunesi temizlemek usul ve LC-MS / MS analizi ile birlikte bir mermi blender kullanılarak kurutulmuş kan spot homojenizasyon dayalı kurulu ve onaylanmış test sunuyoruz. Bugün itibariyle, bu deney başarılı klinik çalışmalarda bağlılık izlenmesi için beş binden fazla takrolimus kurutulmuş kan nokta örneklerinin ölçümü için kullanılır olmuştur.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Protocol

    Sağlıklı bireylerden de tanımlanan kan örnekleri Colorado Hastanesi University (Aurora, Colorado) satın alındı. Validasyon çalışmalarına yanı sıra kalibratör ve kalite kontrol örneklerinin hazırlanması için de tanımlanan kan bankası örneklerinin kullanılması Colorado Çok kurumsal Değerlendirme Kurulu (COMIRB, Aurora) tarafından "muaf" olarak kabul edildi.

    Kaynaklar ve Çözümleri 1. Hazırlık

    1. Satınalma takrolimus ve iç standart D 2, Malzeme Listesi'nde belirtilen satıcılardan 13C-takrolimus.
      1. Takrolimus için 1 mg / ml'lik bir konsantrasyonda ve D 2 10 ug / ml, 13 C-takrolimusun bir konsantrasyonda saf metanol içinde stok çözelti hazırlayın. Üç bağımsız ağırlıkları dayalı referans malzemelerin stok çözümleri olun. Kısım stok çözeltileri ve mağaza -70 ° C veya altında.
    2. Proteinlerini çökeltmek için çözeltisi hazırlayın(: 3 h: 7 hacim) ve su içinde metanol / 0,2 M ZnSO 4 kullanılarak takrolimus ekstrakte edin. Bu çözüm aynı zamanda, iç standart D 2, 2.5 ng / ml arasında bir konsantrasyonda 13 C-takrolimus ihtiva eder ve boş numune ekstre haricinde tüm örnekler, (1.3.3 bakınız) bir çıkarma işlemi için kullanılmıştır.
      1. Her çıkarma gününde taze bu proteinin yağış çözüm hazırlayın ve 12 saatte çözümün bitiminden ayarlayın.
    3. Kalibrasyon eğrisi ve kalite kontrol (QC) numuneleri hazırlanması
      1. Saf metanol kullanılarak stok çözeltisinin uygun seyreltiler gerçekleştirerek takrolimusun stok çözelti hazırlayın.
      2. , Kalibratörler ve kalite kontrol örnekleri hazırlamak EDTA tam kana uygun şekilde seyreltilmiş stok çözeltisi 20 ul başak için, 20 dakika karıştırıldı ve kısım için hücresel kan bileşenlerine takrolimusun homojen bir dağılım sağlamak için bir su banyosu içinde nazik çalkalama altında 37 ° C'de inkübe 1.5 ml polip içinekonik dipli ropylene tüpler ve geçmeli kapaklar. Organik çözücünün nispi hacmi 5% aşmamaktadır emin olun.
      3. Nokta bir pipet kullanarak filtre kartlarında her dairenin ortasına çivili tam kan 50 ul.
      4. 3 saat boyunca oda sıcaklığında filtre kartları kan lekeleri kurutun.
      5. 1, 2.5, 5, 10, 25 ve 50 ng / ml takrolimus konsantrasyonlarında insan EDTA tam kandaki takrolimus kalibrasyon standartları hazırlayın. Iç standart D 2, 13 C-takrolimusu ("sıfır örnek") içeren protein yağış çözelti ile kalibrasyon standartları gibi çıkarılması için boş bir örneği hazırlayın.
      6. 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml konsantrasyonlarda insan EDTA tam kandaki QC örnekleri hazırlanır. Boş bir örnek hazırlayın. İç standart D 2 ihtiva eden çökeltme ile ekstre edilmiştir QC örneklerinin aksine, 13 C-takrolimus yapar protein çökeltme çözeltisi ile boş bir numunesi alıriç standart D 2, 13 C-takrolimusu ("boş örneği") içermez.
    4. Klinik örneklerin toplanması
      1. 43,44 açıklandığı gibi kurutulmuş kan lekeleri toplayın.

    2. Tacrolimus Ekstraksiyon Kurutulmuş Kan Noktası Örnekleri

    1. Görme kabul edilebilir örnek kalitesini ve hacmini 45 sağlamak için kurutulmuş kan nokta kontrol edin.
    2. 6 mm delik yumruk ile filtre kartındaki kan spot Punch merkezi.
      Not: zımbaların kalitesi tartılarak izlenebilir. Bir delikli doymuş filtre diski 0.09 mg (: 4.83- 5.14 mg, n = 12 aralık) ortalama ± 5.02 mg ağırlığındadır.
    3. Konik alt ve geçmeli kapaklı, 1.5 ml polipropilen tüpler içine yerleştirin diskler.
    4. Her tüpe 20-30 mermi ekleyin.
    5. Her tüpe (2.5 ng / ml dahili standart v: 0,2 M ZnSO 4, 7: 3, hac metanol) bir protein çökeltme çözeltisinin 500 ul ekle. Extr içinBoş numunelerin eylem iç standart olmadan protein yağış çözümü kullanın.
    6. ("10" ayarı, maksimum hızı) 1 dakika için mermi blender Diskleri homojenize.
    7. 10 dakika boyunca ("10" ayarı, maksimum hızı) çoklu tüp vorteks üzerinde oda sıcaklığında örnekleri çalkalayın.
    8. Santrifüj örnekleri 16.000 x g'de 10 dakika süreyle 4 ° C 'de.
    9. 300 ul eki ile donatılmış cam HPLC şişe içine süpernatantlar aktarın. Ön yarık teflon contaları kullanın.
      Not: Çıkarılan numuneler -20 ° C'de ya da altında LC-MS / MS analizi kadar depolanabilir.

    3. LC-MS / MS Analizi

    1. Yük 100 C8 kartuşu ekstraksiyon kolonuna ekstre numunenin süpernatant ul ve 7 ile yıkayın: su içinde% 0.1 formik asit: 3 oranında 5 ml 'lik bir akış hızında asetonitril / dk, 1 dakika boyunca. Sviçleme vana bağlantılar Şekil 2 de gösterilmiştir ve gradyan Tablo 1 'de çekme pompası ile işletilen
    2. Ahiret, analitik kolona öncesi sütundan Analitlerin geri gömme sonuçlanan anahtarlama valfi etkinleştirin.
    3. 65 ° C kolon termostatı ayarlayın.
    4. Tablo 1 'de gösterilen akış oranları ve gradyanı kullanılarak, analitik sütundan analitlerin Zehir.
    5. Turbo elektrosprey iyonizasyon kaynağı üzerinden tandem kütle spektrometresi analitik sütun bağlayın. Tablo 2'ye göre kütle spektrometresi önemli parametreleri ayarlayın.
    6. Birden çok reaksiyon modu (MRM) pozitif iyonları ([M + Na] +) algılar. Ölçümü için, aşağıdaki iyon geçişler kullanın: takrolimus: m / z (kütle / şarj) = 826.6 616.2 ve D2, 13 C-takrolimus →: m / z = 619.2 → 829.6.
      Not: Toplam çalışma süresi 4.6 dakikadır.

    4. sayısallaştırılması

    1. Her bir çalışma için 1.3.5 ve hazırlanan kalibratörler göre bir kalibrasyon eğrisi oluşturmakHer analitik vadede sayılabilir.
      1. Kütle spektrometresi yazılımını kullanarak (Tepe Alanı [analit] / Tepe Alanı [internal standart]) analitin tepki faktörü karşısında, nominal konsantrasyonları çizilerek bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
      2. 1 / X ağırlığı ile bir arada bir ikinci dereceden bir montajı kullanarak kalibratörler monte edin.
    2. Kurumuş kan lekelerinde miktar takrolimus ayıklanır MRM Kromatogramlarda takrolimusu ve iç standart doruklarına entegre. Takrolimus için tepki faktörü (Tepe Alanı [analit] / Tepe Area [internal standart]) hesaplayın ve kütle spektrometresi yazılımını kullanarak kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırın.

    5. Doğrulama Prosedürleri

    1. Algılama (LLOD) alt sınırı ve miktar (LLOQ) alt sınırı.
      1. Algılama (LLOD) alt limit olarak 1: 4 bir zirve-gürültü oranı ile en düşük takrolimus konsantrasyonu düşünün. Olarak kantitatif (LLOQ) alt limitini tanımlareşit ya da nominal konsantrasyon ve eşit veya daha iyi% 20 hassasiyet (varyans katsayısı) için ±% 20 sapma daha iyi bir hassasiyetle, kalibrasyon eğrisinin en düşük konsantrasyon.
    2. Içi ve günler arası doğruluk ve kesinliklerini.
      1. 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) ve 40 ng / ml (QC4) dört konsantrasyon seviyelerinde doğruluğu ve hassasiyeti test edin.
      2. Insan EDTA tam kan, her doğrulama gününde QC örnekleri hazırlamak filtre kartları, özü kuru ve yukarıda tarif edildiği gibi analiz edin.
      3. QC konsantrasyon seviyesi başına 6 örnekleri ile gün içi doğruluk ve hassasiyet belirleyin.
      4. 20 gün boyunca günler arası doğruluk ve hassasiyet değerlendirin. 4 örneklerin her gün her QC düzeyini ölçün.
      5. Her gün QC örnekleri ile birlikte iki kalibrasyon eğrileri analiz edin.
      6. Nominal konsantrasyon (% konsantrasyon seviyesi başına altı numune, 5.2.2 bakınız) olarak gün içi doğruluğu hesaplayın. Kireçvaryans (% CV) katsayısı olarak ulate hassas.
      7. Kabul Nominal konsantrasyon% 85 ila% 115 sınırlar içine düşerse gün içi doğruluğu kabul edilebilir düşünün. O% 15 CV (varyans katsayısı) eşit veya daha kabul edilebilir ise gün içi hassasiyet düşünün.
      8. 20 doğrulama gün içinde analiz her QC konsantrasyon seviyesi için ortalama olarak günler arası doğruluk ve hassasiyet hesaplayın.
      9. Kabul Nominal konsantrasyon% 85 ila% 115 sınırlar içine düşerse ortalama arası günlük doğruluğu kabul edilebilir düşünün. O% 15 CV (varyans katsayısı) eşit veya daha kabul edilebilir olmadığını arası günlük hassasiyet düşünün.
    3. Matris müdahalelerden dışlama.
      1. Matris sinyalleri neden olabilir etkileşimler dışlanması için, boş kurutulmuş kan lekeleri (8 farklı bireyler, tercihen 4 erkek ve 4 kadın) analiz.
      2. Görme iyon kromatogramlar kontrol edin. Eğer tutma süresi olan tepe değeritakrolimus pencere LLOQ de takrolimusla çivili entegre ve boş örneklerinde takrolimus zirveleri olanlar ile eğrinin altında kalan alanlarını karşılaştırmak, tespit edilir. Boş örneklerinde piklerin alanı LLOQ de takrolimus olanların% 15'ini gerekiyordu değildir.
    4. İyon bastırma / iyon geliştirme.
      1. Ko salınımlı matris bileşenleri nedeniyle iyon bastırma / iyon artışının potansiyel bir girişimi değerlendirmek için 45 anlatıldığı gibi bir post-kolon infüzyon protokolü kullanın.
      2. % 0.1 formik asit içinde çözülmüş 10 mg / ml arasında bir konsantrasyonda, takrolimusu infüze: metanol (30:70, v / v) sütun sonrası 10 ul / dk'lık bir hızda doldurulur.
        1. Analitik kolon ve elektrosprey kütle spektrometresi kaynağı arasında T parçası ile bir şırınga pompası bağlayın.
        2. Takrolimus için MRM geçişleri MS / MS sinyal yoğunluğu Monitör ve iç standart (m / z = 616.2 m / z = 829,6 → 619,2 → 826,6) Extrac enjeksiyonundan sonrated boş örnekleri (n = farklı bireylerden 8 örnek).
          Not: İyon-bastırma-sinyali ve iyon geliştirme bir zirve bir daldırma neden olurken iyon bastırılması / iyon geliştirme yokluğunda analitlerin infüzyon neden olduğu, sürekli sinyal boş matris enjeksiyonu ile etkilenmemelidir.
    5. Devam etmek.
      1. En yüksek kalibratörlerinin sonra boş örnekleri ekstre analiz ederek olası carry-over değerlendirin (50 ng / ml, n = 6).
      2. Görme iyon kromatogramlar kontrol edin. Takrolimusun tutulma süresi penceresi içinde doruklarına tespit edilirse, LLOQ de takrolimusla çivili entegre ve boş örneklerinde takrolimus zirveleri olanlar ile eğrinin altında alanlarını karşılaştırır. Boş örneklerinde piklerin alanı LLOQ de takrolimus olanların% 15'ini gerekiyordu değildir.
    6. Ekstraksiyon kazanımları.
      1. QC sam çıkarıldığı sonra Analitlerin sinyalleri karşılaştırarak geri kazanımlar belirlemeples boş kurutulmuş kan lekeleri olanlar ile dört konsantrasyon seviyeleri (n = konsantrasyon başına 6) de ekstraksiyonu sonrası takrolimusun gelen miktarda çivili.
      2. QCS dört set (: 2, 4, 20, 40 ng / ml konsantrasyon seviyelerini) hazırlayın.
      3. Filtre kağıdı kartları üzerine boş olarak EDTA tam kan 50 ul tespit ve 2 saat süre ile kurutulması "bir geri kazanım test örnekleri" karşılık gelen bir 4 setleri hazırlayın.
      4. Bundan sonra, QC ve boş "Kurtarma test örnekleri" hem makasla filtre kartında tüm kan nokta kesip konik alt ve geçmeli kapaklı bir polipropilen tüp içine sonuçlanan diskleri yerleştirin.
      5. Tüm örnekler ayıklayın.
      6. Cam HPLC şişe içine süpernatantlar (400 ul) aktarın.
      7. 2, 4, 20 ve 40 ng / ml (200, 400, 2000, 4000 ng / ml stok çözeltisi, takrolimus 4 ul konsantrasyonları elde etmek için boş bir "ekstre geri test örnekleri" olarak takrolimus stok solüsyonu ekleyinsüpernatan 400 ul) ile utions.
      8. LC-MS / MS analizinden sonra, QC örneklerinin ve ilgili konsantrasyon "Kurtarma test örnekleri" hem sinyalleri karşılaştırmak (ekstraksiyon / sinyal örnekleri çıkarma x 100 sonra çivili önce kurtarma% = sinyal örnekleri çivili).
    7. Sulandırma bütünlüğü.
      1. Kullanılarak seyreltme bütünlüğü kurmak örnekler, 500, 250 ve 100 ng / ml'de analit ile çivili.
      2. Ekstraksiyon işleminden sonra, protein, bir çökeltme çözeltisi kullanarak örnekleri seyreltik (1:10, n = 3 konsantrasyon düzeyinde başına).
      3. Nominal konsantrasyonlarda sapmaları hesaplayın. % 85 içinde anma kabul edilebilir bir -115% düşüş sonuçları düşünün.
    8. Kararlılıkları.
      1. Dört konsantrasyon seviyelerinde (n = konsantrasyon başına 4), farklı zaman noktalarında ve farklı depolama şartları altında analiz de QC örnekleri kullanarak stabiliteleri araştırılması.
      2. Nominal değerleri ile depolandıktan sonra sonuçları karşılaştırın. R düşünün% 85 içinde anma kabul edilebilir bir -115% düşüş sonuçları · Borçlar.
      3. 4 ° C, -20 ° C de 1 ay ve -80 ° C de 1 ay 1 hafta çevre sıcaklığında 1 hafta Örnek stabilitesini oluşturulması.
      4. Üç döngü üzerinde test donma-çözülme stabilitesi (-20 ° C). 4 ° C'ye ayarlanır termostatlı bir otomatik numune alıcı içinde numuneler yerleştirilerek test ekstre numune ve otomatik numune stabilitesi. 72 saat sonra numune enjekte edilir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Boş numune Örnek iyon kromatogramları, örnek, Şekil 3 'de gösterilmiştir miktar ve bir hasta numunesinin alt limitte çivili.

    Kalibrasyon Eğrileri

    En düşük algılama sınırı ml 0,5 ng / ve kantifikasyonunun alt sınırı 1,0 ng / ml olmuştur. Yüksek konsantrasyonlar normal şartlar altında klinikte ulaşılacak muhtemel olarak Elli ng / ml, en yüksek kalibratör olarak seçildi.

    Kalibrasyon eğrileri, taze insan EDTA tam kan, her doğrulama gün hazırlanabilir filtre kartı üzerinde kurutulur ve ile ekstre edildi, metanol / 0,2 M ZnSO 4 (70:30 v / v) + dahili standartlı (iç standardın nihai konsantrasyon: 2.5 ng / ml ). Günde 1 doğrulama için (n = 6 QC seviyesi kalibratör ve n = 6 için) ve günler 2 - (her QC seviyesi için n = 2 kalibratör ve n = 4), 20 konsantrasyonda 1, 2,5, 5 ile analiz edildi, Kalibrasyon için 10, 25, 50 ng / mlrators. Tipik bir kalibrasyon eğrisi Şekil 4'te gösterilmiştir. Nominal 115% 85'ten% doğrulukları ortalama, (6 sıfır olmayan kalibratörlerin minimum) kalibratörlerin 2/3 için çalışma aralığında kabul edilebilir bulundu. Korelasyon, ortalama katsayısı (r) = 0,999 (n = 40 kalibrasyon eğrileri) idi.

    Doğruluk ve Precisions

    Sonuçlar Tablo 3'te ayrıntılı olarak gösterilmektedir.

    Ekstraksiyon Kurtarma

    Ortalama ekstraksiyon geri kazanımları (2 ng / ml), 92.2 (4 ng / ml), 95.5 (20 ng / ml), 96.2 (40 ng / ml)% 98.2 idi.

    Matrix Girişimler, İyon Bastırma / İyon Geliştirme Testi Kullanarak Sürekli Post-Kolon İnfüzyon ve Carry-over

    Karşılık gelen sekiz farklı bireyler (n = 4 dişi, n = 4 male) alıkonma zamanında gösterdi sinyalleri LLOQ (1 ng / ml)% 15 den az boş numunelerin analizitespit edilen takrolimus zirve belirli kabul edilebilir olduğunu belirten takrolimus zirve. Temsili bir örneği, Şekil 3'te gösterilmiştir. İyon bastırılması / iyon iyileştirme açısından olası müdahaleler sekiz farklı sağlıklı bireylerin boş kurutulmuş kan numuneleri kullanılarak test edilmiştir. Temsili deney, Şekil 5 'de gösterilmiştir. Belirgin iyon bastırılması / iyon geliştirme ilişkin hiçbir endikasyon gözlenmiştir. LLOQ sinyalin% 15 aşan zirveleri ile sonuçlanır Resim ilgili carry-over tespit edildi.

    Sulandırma Bütünlük

    Seyreltme bütünlüğü hedef konsantrasyonları elde etmek için, en yüksek kalibratör (100, 250 ve 500 ng / ml) üzerindeki konsantrasyonlarda hazırlanmış ve ekstraksiyon işleminden sonra, protein çökelti çözeltisi içinde 1:10 seyreltilmiş numunelerinin analiz edilmesi ile araştırılmıştır: 10, 25 ve 50 ng / mi. Ortalama doğrulukları Nominal konsantrasyonlarının% 115% 85 kabul kriterleri dahilinde zorunda kaldı. Tüm seyreltmeler tested kabul kriterlerini (Tablo 4) bir araya geldi.

    Kararlılıkları

    Kurumuş kan lekelerinde takrolimus İstikrar değişen koşullarda saklanan dört seviyeleri (n = 4 / konsantrasyon seviyesi), en QC örnekleri analiz edilerek araştırıldı.

    Ortalama doğrulukları Nominal konsantrasyonlarının% 115% 85 kabul kriterleri dahilinde zorunda kaldı. Sonuçlar Tablo 5 'de ayrıntılı olarak gösterilmektedir. 3 dondurma ve çözme çevriminden sonra -80 ° C 'de depolama 1 ay sonra -20 ° C' de depolama 1 ay sonra 4 ° C de depolama 1 hafta sonra oda sıcaklığında depolama 1 hafta sonra hiçbir kayıp,,,,, ve 4 ° C'de otomatik örnekleyici çıkarılan numunelerin 72 saat sonra aşikar bir hale gelmiştir.

    Ekstraksiyon Pompası Analitik (elüsyon) Pompa
    Su +% 0.1 formik asit Asetonitril Debi [ul / dak] Zaman [dk] Su +% 0.1 formik asit Asetonitril Debi [ul / dak]
    0 70 30 5000 0 13 87 1000
    1 70 30 5000 2 2 98 1200
    1.1 2 98 100 3,5 2 98 1200
    3 2 98 100 3.6 13 87 1000
    3.1 20 80 2000 4.6 13 87 1000
    4 70 30 5000
    4.6 70 30 5000

    Ekstraksiyon için Tablo 1. Gradient Programı ve Analitik HPLC pompalar.

    Parametre Ayar
    Çarpışma gazı (CAD) 10
    Perde gazı (KKO) (psi) 30
    İyon Kaynağı gazı 1 (GS1) (psi) 50
    İyon kaynak gaz 2 (GS2) (psi) 30
    Nebülizör akım (NC) (V) 1
    Sıcaklık (TEM) (° C) 600
    IonSpray Gerilim (IS) (V) 5500
    Arayüz ısıtıcı (ihe) Açık
    Declustering potansiyeli (DP) (V) 136
    Giriş potansiyeli (AP) (V) 10
    Çarpışma enerjisi (CE) (V) 47
    Çarpışma hücresi çıkış potansiyeli (CXP) (V) 16

    Tablo 2. Turbo Elektrosprey Arayüz ve Kütle Spektrometre Parametreleri. Isimlendirme kütle spektrometresi yazılımında kullanılan tekabül (üretici ayrıntılar için, Malzeme Listesi bakınız).

    <td> 106
    Doğrulama Günü QC Seviye [Nominal konsantrasyonu%]
    2 4 20 40
    1.gün 93.0 86.3 88.9 93.4
    101 90.4 95.3 100
    85.6 95.9 99,0 97.5
    88.6 93.6 105 103
    85.0 97.4 97.2 109
    89.1 96.7 100 101
    Gün içi Doğruluk [%] 90.4 93.4 97.6 100.7
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 6.6 4.6 5.5 5.2
    Gün 2 92.8 86.0 103
    91,1 88,8 94.7 87,0
    88.6 90.9 92.8 94.2
    97.2 93.7 94.2 115
    Gün içi Doğruluk [%] 92.4 89.9 96.2 97.9
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 3.9 3.6 4.8 12.2
    3. Gün 97.6 101 98.4 112
    104 85.6 102 110
    99.2 88.4 99.4 105
    96.3 87.2 108 117
    Gün içi Doğruluk [%] 99.3 90.6 102.0 111.0
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 3.4 7.8 4.2 4,5
    4. Gün 95.2 88.6 112 94.5
    105 87.3 93.2 116
    99.8 96.2 103 103
    100 104 97.2 99.4
    Gün içi Doğruluk [%] 100.0 94.0 101,4 103.2
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 4,0 8.2 8.1 8.9
    5. Gün 106 90.4 101 106
    108 89.0 100
    102 101 96.6 128
    105 88,8 105 107
    Gün içi Doğruluk [%] 105.3 92.3 102.2 110.3
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 2.4 6.3 4.2 11.1
    Gün 6 90.9 93.7 119 106
    98,8 88.1 96.4 110
    94.6 96.3 99.1 108
    108 100 102 102
    Gün içi Doğruluk [%] 98.1 94.5 104.1 106.5
    7.5 5.3 9.8 3.2
    7. Gün 85.1 87.5 99.5 95.4
    86.4 85.4 94.7 101
    94.5 87.3 98.9 94.6
    85.5 97.0 101 99.6
    Gün içi Doğruluk [%] 87,9 89.3 98.5 97.7
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 5.1 5.8 2.7 3.2
    8. Gün 86.1 92.5 91.9 102
    87.5 91.5 95.2 88.5
    115 85.6 92.1 102
    85,8 85.9 95.4 108
    Gün içi Doğruluk [%] 93.6 88.9 93.7 100.1
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 15.3 4.1 2.0 8.2
    Gün 9 88.9 91.4 96.9 100
    90.0 89.8 95.0 100
    69.7 85.9 95.8 109
    91.9 87,0 105 101
    Gün içi Doğruluk [%] 85.1 88.5 98.2 102.5
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 12.2 2.9 4.7 4.3
    Gün 10 90.9 91.3 96.2 100
    97.7 89.5 94.4 100
    99.9 109 98.7 96.8
    99.1 90.0 95.7 96.1
    Gün içi Doğruluk [%] 96.9 95.0 96.3 98.2
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 4.2 9.9 1.9 2.1
    Gün 11 92.7 91.9 88.2 104
    96.6 91.2 97.0 110
    109.0 92.8 970,6 102
    98.3 107 93.7 111
    Gün içi Doğruluk [%] 99.2 95.7 94,1 106.8
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 7,0 7.9 4.6 4.1
    Gün 12 87.7 85.5 105 95.3
    112 88.1 101 96.1
    102 89.1 89.7 97.5
    106 92.5 102 104
    Gün içi Doğruluk [%] 101.9 88,8 99.4 98.2
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 10.1 3.3 6.7 4,0
    Gün 13 Başarısız 85,7 93.3 102
    101 105 88.0 93.9
    112 98.0 91.4 102
    104 113 104 101
    Gün içi Doğruluk [%] 105.7 100.4 94.2 99.7
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 5.4 11.5 7.3 3.9
    Gün 14 91.5 89.1 97.4 93.1
    90.4 87.1 93.9 99.8
    89.7 97.0 94.8 106
    97.4 86.8 89.9 Başarısız
    Gün içi Doğruluk [%] 92.3 90.0 94.0 99.6
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 3.8 5.3 3.3 6.5
    Gün 15 92.8 92.8 92.5 95.4
    97.5 96.3 96.2 95.5
    95.5 108 97.3 99.3
    110 109 115 113
    Gün içi Doğruluk [%] 99,0 101.5 100.3 100.8
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 7.7 8.1 10.0 8.3
    Gün 16 93.7 97.8 90.7 112
    90.3 87.1 Başarısız 101
    97.9 88.3 95.5 107
    91.4 85,7 89.3 96.7
    Gün içi Doğruluk [%] 93.3 89.7 91.8 104.2
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 3.6 6.1 3,5 6.4
    Gün 17 88.0 86.0 93.7 103
    89.8 90.8 94.8 93.2
    85.9 91,1 99.7 94.8
    86.7 88.1 95.6 91,7
    Gün içi Doğruluk [%] 87.6 89.0 96,0 95.7
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 1.9 2.7 2.7 5.3
    Gün 18 89.6 85,8 91.0 98.3
    89.6 86.2 88.3 93.6
    Başarısız 86.7 96.8 104
    88.1 85,8 95.2 111
    Gün içi Doğruluk [%] 89.1 86.1 92.8 101.7
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 1.0 0.5 4.2 7.4
    Gün 19 98.0 </ td> 89.7 94.2 102
    88.3 86.0 97.6 102
    91.6 88.1 95.8 97.5
    90.7 90.1 92.8 88.3
    Gün içi Doğruluk [%] 92,2 88.5 95.1 97.5
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 4,5 2.1 2.2 6.6
    Gün 20 93.0 87,0 99.4 101
    97.3 87.6 95.5 91.9
    89.0 88.4 91.2 93.5
    104 90.7 97.7 115
    Gün içi Doğruluk[%] 95.8 88.4 96,0 100.4
    Gün içi Tutarsızlık [CV%] 6.7 1.8 3.7 10.5

    Inter-Gün Doğruluk ve Tutarsızlık
    Inter-gün Doğruluk 95.2 91,7 97.2 101.6
    Inter-Gün Tutarsızlık 6.1 4,5 3.6 4.2

    Tablo Kalite Kontrol Örneklerinin 3. Sonuçlar üzerinde 20 Gün. Veriler, nominal% 'si olarak sunulmuştur. "Başarısız" olarak listelenen numuneler laboratuvar / enstrüman hataları kayboldu örneklerdir. En cas içindees, hiçbir zirveleri hiç saptandı ya da internal standart pik eksikti.

    Seyreltme 01:10
    Seyreltildikten sonra nominal hedef konsantrasyonu, 50 ng / ml
    98.6
    94.5
    91.4
    Doğruluk [%] 94.8
    Tutarsızlık [CV%] 3.6
    Seyreltme 01:10
    Seyreltildikten sonra nominal hedef konsantrasyonu, 10 ng / ml
    103
    99.5
    101
    Doğruluk [%] 101.2
    Tutarsızlık [CV%] 1.8
    Seyreltme 01:10
    Seyreltildikten sonra nominal hedef konsantrasyonu, 25 ng / ml
    91,7
    98.2
    103
    Doğruluk [%] 97.6
    Tutarsızlık [CV%] 5.7

    Seyreltme Bütünlüğü Testi. Verilerin Tablo 4. Sonuçlar, nominal% 'si olarak sunulmuştur.

    A
    RT'de Kararlılık, 1. Gün
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    91.9 85,8 86.0 102
    86.7 85,7 88.5 102
    86.0 85.9 90.1 103
    89.2 98.0 90.8 112
    Nominal konsantrasyonu% 88.5 88.9 88.9 104.8
    Tutarsızlık [% CV] 2.7 6.1 2.1 4.9
    RT'de İstikrar, 3. Gün
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    88.6 105 101 113
    94,1 100 98.5 103
    100 101 106 109
    99.5 102 102 108
    Nominal konsantrasyonu% 95.6 102.0 101.9 108.3
    Tutarsızlık [% CV] 5.3 2.2 3.1 4.1
    RT'de İstikrar, 7. Gün
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    105 103 91,7 109
    101 107 100 110
    102 108 107 105
    93,8 105 109 111
    Nominal konsantrasyonu% 100.5 105.8 101.9 108.8
    Tutarsızlık [% CV] 4.7 2.2 7.8 2.6
    B
    4 ° C, Gün 1'de Kararlılık
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    101 89.9 95.8 100
    88.9 91.0 94,1 99,0
    96.2 100 102 96.7
    89.5 87.8 95.4 88.6
    Nominal konsantrasyonu% 93.9 92,2 96.8 96.1
    Tutarsızlık [% CV] 5.8 5.4 3,5 5.2
    4 ° C, 3. Gün de stabilitesi
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    87.3 85.2 105 95.3
    Başarısız 87.8 101 96
    101 88,8 89.6 97.5
    106 92,2 102 104
    Nominal konsantrasyonu% 98.1 88.5 99.4 98.2
    Tutarsızlık [% CV] 9.7 2.9 6.8 4,0
    4 ° C, Günlük 7 at İstikrar
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    94.0 98.5 96.1 110
    92.9 96.4 109 109
    91,7 96.3 97.9 115
    94.7 96.9 99.8 113
    Nominal konsantrasyonu% 93.3 97.0 100.7 111.8
    Tutarsızlık[%ÖZGEÇMİŞ] 1.3 1.0 5.7 2.8
    C
    -20 ° C'de, gün 3 Kararlılık
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    87.3 98.7 111 111
    93.5 89.6 108 105
    89.5 91.5 107 112
    88.2 99.1 108 92.4
    Nominal konsantrasyonu% 89.6 94.7 108.5 105.1
    Tutarsızlık [% CV] 2.7 4.9 1.7 9,0
    -20 ° C'de, gün 7 Kararlılık
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    96.5 98.7 102 109
    94.8 94.6 114 106
    95.5 102 98.1 108
    107 99.5 115 105
    Nominal konsantrasyonu% 98.5 98.7 107.3 107
    Tutarsızlık [% CV] 5.7 3.1 8.5 1.8
    </ td>
    -20 ° C, Gün 30 Kararlılık
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    82.3 83.1 90.4 93.2
    87,9 85,8 85.3 97.9
    85,7 88.6 98.3 98.0
    92.0 95.6 110 103
    Nominal konsantrasyonu% 87,0 88.3 96,0 98.0
    Tutarsızlık [% CV] 4.1 5.4 10.8 4,0
    D </ td>
    -80 ° C'de, gün 3 Kararlılık
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    87.5 96.5 96.7 Başarısız
    Başarısız 97.6 98.7 110
    88,8 96.4 106 109
    87.3 101 96.5 109
    Nominal konsantrasyonu% 87,9 97.9 99.5 109.3
    Tutarsızlık [% CV] 0,8 2.2 4,5 0.6
    -80 ° C'de, gün 7 Kararlılık QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    Başarısız 98.0 105 99.8
    97.1 106 104 105
    99.7 102 99.3 102
    101 99.9 109 106
    Nominal konsantrasyonu% 99.3 101.5 104.3 103.2
    Tutarsızlık [% CV] 2.0 3.4 4,0 2.8
    -80 ° C, Gün 30 Kararlılık
    QC seviyesi [ng / ml] 2 20 40
    88.2 85.3 89.6 96.7
    96.2 92.6 85,8 94,1
    83.9 93.7 91.0 105
    95.6 94.0 98.9 102
    Nominal konsantrasyonu% 91.0 91.4 91.3 99.5
    Tutarsızlık [% CV] 6 4.1 5.5 4.9

    E
    Donma çözülme stabilitesi -20 ° C, 1 çevrim
    QC seviyesi [ng / ml] </ td> 2 4 20 40
    92.5 86.2 90.2 94.3
    89.8 90.5 85.4 104
    94.7 88.6 93.4 104
    101 89.2 93.7 96.3
    Nominal konsantrasyonu% 94.5 88.6 90.7 99.7
    Tutarsızlık [% CV] 4.8 1.8 3.9 5.1
    Istikrar çözülme Freeze -20 ° C, 2 kür
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    99.1 97.6 Başarısız 85.3
    93.1 88.1 93.4 92.0
    94.9 91.5 85,8 93.9
    Başarısız 90.5 86.8 85.4
    Nominal konsantrasyonu% 95.7 91.9 88.7 89.2
    Tutarsızlık [% CV] 3.1 4,0 4.1 4,5
    Stabilite çözülme Freeze -20 ° C, 3 döngüleri
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    95.7 Başarısız 86.0 93.3
    95.5 87.4 85.0 91.3
    90.5 89.1 86.0 86.0
    96.9 85,7 90.2 Başarısız
    Nominal konsantrasyonu% 94.7 87.4 86.8 90.2
    Tutarsızlık [% CV] 2.8 1.7 2.3 3.8
    F
    4 ° C, 24 saat ekstre örnek stabilitesi
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    122 112 91.0 104
    93.5 106 91.8 96.1
    111 94.8 98.2 93.5
    98.4 97.6 91.3 89.8
    Nominal konsantrasyonu% 106.2 102.6 93.1 95.9
    Tutarsızlık [% CV] 12.8 7.9 3.4 6
    4 ° C, 48 saat ekstre örnek stabilitesi
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    106 108 93.7 110
    105 98.1 94.6 98.9
    103 98.4 95.0 92.6
    108 93.1 89.7 85.5
    Nominal konsantrasyonu% 105.5 99.4 93.3 96.8
    Tutarsızlık [% CV] 2.1 6.2 2.4 10.4
    4 ° C, 72 saat ekstre örnek stabilitesi
    QC seviyesi [ng / ml] 2 4 20 40
    96.5 112 96.4 104
    101 95.3 103 95.2
    94.2 105 93.5 99.5
    100 96.9 92.6 89.3
    Nominal konsantrasyonu% 97.9 102.3 96.4 97.0
    Tutarsızlık [% CV] 3.1 7.7 4.7 6.3

    Stabilite Testi Tablo 5. Sonuçları. A: 7 gün boyunca oda sıcaklığında kurutulmuş kan lekeleri üzerinde takrolimus kararlılığı, B: buzdolabında kurumuş kan lekeleri (4 ° C) 7 günden fazla, üzerinde takrolimusun İstikrar C: -20 ° C'de kurutulmuş kan lekeleri üzerinde takrolimus İstikrar C üzerinde 1 ay, D: -80 ° C kurutulmuş kan lekeleri üzerinde takrolimus İstikrar üzerinde 1 ay, E: kurutulmuş kan lekeleri üzerinde takrolimus İstikrar üzerinde üç donma-çözülme döngüsünden (-20 ° C), F : 72 saat içinde 4 ° C'de örnek / autosampler istikrar Çıkarılan. Veriler mevcut konsantrasyonda% 'si olarak sunulmuştur. "Başarısız" olarak listelenen numuneler laboratuvar / enstrüman hataları kayboldu örneklerdir. Çoğu durumda hiçbir zirveleri hiç saptandı ya da internal standart pik eksikti.

    figür 1
    Takrolimus. Atom numaralandırma Şekil 1. Yapısı Saf ve Uygulamalı Kimya (IUPAC) terminoloji Uluslararası Birliği izler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 2,
    Anahtarlama Vana 2. Bağlantı Şekil.424fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 3,
    Şekil 3. Temsilci İyon Kromatogramlar. (A) filtre kağıdı üzerine lekeli boş kan numunelerinin Temsilcisi iyon kromatogram (üretici ayrıntılar için, Malzeme Listesi bakınız) ve kurutulur. Ok takrolimus zirve, (B) numuneleri miktar (1 ng / ml), alt sınırında çivili boş kan Örnek iyon kromatogram filtre kağıdı üzerine tespit ve kurutuldu, ve (C) Örnek iyon kromatogram tutulma süresini işaretler filtre kağıdı üzerinde, bir transplant hasta tarafından toplanan numunenin. Bu çukur örnek ve ölçülen takrolimus konsantrasyonu 2,1 ng / ml olmuştur. Bu örnek, evde hasta tarafından toplanan ve bir klinik deneme dir Cincinnati Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi'nde (Cincinnati, OH) tarafından onaylanmıştır. Tüm hastalar uygun yazılı izin verdi. Kütle spektrometresi yazılımı tarafından oluşturulan İyon kromatogramlar orijinal çıktılar vardır (üretici detaylar için, Malzeme Listesini bakınız). Iyon Kromatogramlarda Mavi ve kırmızı çizgiler internal standart D 2, sırasıyla 13 C-takrolimus ve takrolimus, temsil etmektedir. Ana takrolimus ve iç standart piklerinin önünde akıtılarak zirve rotamerler bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 4,
    Şekil 4. Temsilcisi Kalibrasyon Eğrisi. Orijinal bir çıktısı kütle spektrometresi yazılımı tarafından oluşturulan olarak gösterilir.424 / 52424fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 5,
    Şekil 5. Temsilcisi Ion kromatogramı (İyon Bastırma / İyon Geliştirme). Ok takrolimus tepe tutma süresini işaretler bir Potansiyel Matrix Efekti değerlendirin için çıkarılan Boş Kan Örneğinin Post-Kolon Tacrolimus Nakli ve Enjeksiyon sırasında ölçülmüştür. Matris etkisi testi 46 da tarif edilen prosedüre dayanıyordu. Etkisi tespit edildi Hiçbir ilgili matrisi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Anılan olarak, kurutulmuş kan lekeleri dayalı terapötik ilaç ve takrolimus bağlılık izlenmesi kavramı çekici rağmen, genellikle venöz EDTA tam kan örneklerinde takrolimus LC-MS / MS analizi ile ilişkili ötesinde analitik zorluklar vardır. Bunlar arasında, ancak matris Burada kullanılan filtre kart malzemeyi ve düşük kan hacmi (20 ul) pamuk linterleri malzemesi içine batırılmış kapiler tam kan olması, bunlarla sınırlı değildir. Bununla birlikte, merkezi bir laboratuarda yüksek verimlilik analizi, güçlü bir spesifik ve son derece hassas LC-MS / MS deneyi ile kombinasyon halinde matris parazitleri ve matris etkileri göstermezler örnek vermiştir hızlı ve güvenilir bir ekstraksiyon yöntemi gerektirmektedir. Zaten delikli filtre kart çıkarma / LC-MS / MS analizi başarısız olması durumunda yeniden analiz için sol yeterince malzeme genellikle yok gibi tahlilin Güvenilirlik önemlidir.

    FiBu çalışmada kullanılan ltresi kartları bu FDA onaylı sınıf II cihaz olarak, NCCLS rehberlik LA4-A5 44 ile uyumlu olan ve CE işaretli Avrupa'da bulunan seçildi (üretici ayrıntılar için, Malzeme Listesi bakınız). Tamamen doldurulmuş ise, Whatman 903 filtre kartında tek daire tutan ≈50 kanda 46 ul. Ancak, tek tek hastalar tarafından toplanan kan damlası boyutu değişebilir ve uygun örnekleme tekniği eğitimi esastır 46 olduğunu.

    Kan nokta numunesi kuru bir zımba-out açılan ilk önemli adım homojenizasyon olduğunu. Bizim deneyime dayalı, bir mermi blender kullanımı daha verimli ve sonikasyon olarak ekstraksiyon verimini artırmak için kullanılan diğer yöntemlere göre daha tekrarlanabilir. Mermi blender kullanımı sürekli% 90'ın üzerinde çıkarma geri kazanımları elde etmek için gerekli oldu. Ekstraksiyon prosedürü güvenilirliği için, tüm santrifüjler temperat emin olmak için de önemli olduğunuure kontrollü (4 ° C) ve vorteks adım daha değişken ve daha düşük ekstraksiyon kurtarma sonuçlandı daha kısa 10 dakika, değildi. Buna ek olarak, bu takrolimus geri protein çökeltme çözeltisi doğru bileşime çok hassas olarak metanol / ZnSO 4 oranında değişmemesidir önemlidir.

    Bir sonraki zorluk matris etkileşimler ve etkilere neden olabilir malzemelerin ideal yoksun temiz bir özü elde etmektir. Bu durumda, sık sık EDTA kan örneklerinden takrolimusun çıkarılması için kullanılan basit bir tek-aşamalı bir protein çökeltme adımı uygun bir seçenek olarak kabul edilmemiştir. Protein (izotop etiketli dahili standart ilave) ZnSO 4 kullanılarak çökeltme, vorteks ve santrifüj sonrasında süpernatanlar 2B HPLC sistemi içine ve çevrimiçi ekstraksiyon kolonu üzerine enjekte edildi. Basit 6-port kullanılarak geleneksel ön sütun kartuşları 5 ml / dak yüksek akımlarını kullanarak Çevrimiçi sütun çıkarmatakrolimus analizi için anahtarlama valfı 47 daha önce tarif edilmiştir. Bu, takrolimus ve iç standart ekstraksiyon kolonunun ön konsantre edildi ve temizleme adımı sırasında sütun üzerinde göç yoktu bu yüzden mobil faz seçilmiştir. Mevcut protokolde kullanılan çevrimiçi çıkarma olumsuz HPLC analizi etkilemeden nispeten büyük örnek hacimlerinin enjeksiyonu da dahil olmak üzere birçok avantajı vardı. Ekstraksiyon sütununun üstünde analitleri zenginleştirilmesi sonra geri sifon ("odaklama zirve") özellikle düşük takrolimus konsantrasyonlarda numuneler için yazılım algoritması tarafından daha güvenilir entegrasyon için izin keskin zirveleri sonuçlandı. 48 Online temizleme aşaması remove only vermedi Potansiyel matris bileşikleri müdahale değil, aynı zamanda numune de tuzlu. Yüksek hacimli, yüksek verimli bir LC-MS / MS analizleri için önemli bir sorun, fakat en az açıklanan artan LC-MS / MS sistemine duyarlılık kademeli kaybıBüyük partilerin analizi sırasında elektrosprey kaynak kirlenmesi. Anlamlı matriks etkileri (iyon bastırma / iyon geliştirme) gözlenmiştir. Potansiyel matris etkileri olumsuz etkisi kombinasyonu ile / azaltılmış kaçınılması aşağıdaki: 16.000 xg, yüksek akışlı çevrimiçi çıkarma, olası müdahalelerden erken çıkan takrolimusun net kromatografik ayırma protein çöktürme sonra metanol / ZnSO 4, santrifüj kullanılarak etkili protein yağış analitik kolon ve bunun yerine böyle askomisinin olarak yapısal olarak ilişkili içsel standartların iç standart olarak izotop işaretli takrolimus kullanımı.

    Kantifikasyonunun alt sınırı 1 ng / ml, ve şu an genellikle EDTA kan örnekleri takrolimusun terapötik ilaç izlenmesi için kullanılan çoğu bağışıklık daha böylece daha düşük olmuştur. Nicelikleme Bu alt sınır, hatta sözde düşük kalsineurin inhibitörü uzun vadeli immunosuppres için yeterlidirsive bakım protokolleri.

    Kurutuldu kanlar takrolimusu ölçmek için daha önce tarif edilen LC-MS / MS deneyler ile karşılaştırıldığında 29-34,36,39,41,42, bu deney, stoktaki noktalar ya da daha düşük miktar sınırı, ekstraksiyon iyileşme, doğruluk açısından performanslarını aşan ve hassas gibi genellikle sağlıklı bireylerden kan örneklerinde dayalı doğrulama sırasında kabul edilebilir sonuçlar elde tek adımlı bir protein yağış usul ve ultra kısa kromatografi süreleri gibi potansiyel riskli kavramları kaçınarak. Ancak, transplantasyon hastaları kan kompozisyonunu etkiler ve kimin çok sayıda ilaç almak hastalarındaki son derece karmaşık bir grubuz. Bu neredeyse imkansız doğrulama sırasında bireysel hastaların bulunması ve tek uygun bir strateji bu tür olası müdahalelerden riskini en aza indirir bir şekilde tahlil kurmak için olabilecek tüm potansiyel müdahaleleri hariç yapar. Kurutulmuş kan spots kan viskozitesi üzerindeki hematokrit etkisi ve dolayısıyla filtre kağıdı 49 uygulanan kan difüzyon özellikleri olarak zorlukları var. Bu tür etkiler zaten klinik makul sınırlar içinde 29,32 hematokritleri ve takrolimus konsantrasyonlarında kurumuş kan lekelerinde takrolimus analizini etkilemediği tarif edilmiş olarak bu burada tekrar test edilmemiştir. Yüksek sıcaklıklarda kurutulur kan lekelerinde takrolimusun da stabilite ve zaten kurutulmuş bulunan kan lekelerinde diğerleri ve takrolimus ile incelenmiştir kurutuldu kan sevk için önemli olan, hatta 60 ° C 32, 37 ° C de 5 gün süre ile istikrarlı ve bulunmuştur Özellikle yaz aylarında değil, sıcaklık kontrollü koşullar altında noktalar.

    Mermi blender homojenizasyon kombinasyonuna dayanan bu tahlil, yüksek akışlı çevrimiçi kolon temizleme ve LC-MS / MS analizi diğer imm miktarının biyoanalitik testlerinin geliştirilmesi için bir platform stratejisi sağlayabilirTek başına ya da aynı anda, hem de kuru kan örneklerinde başka ilaçların unosuppressants.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Tacrolimus U.S. Pharmacopeial Convention 1642802
    D2,13C-Tacrolimus Toronto Research Chemicals Inc. F370002
    Red blood cells University of Colorado Hospital W20091305500 V
    Plasma University of Colorado Hospital W2017130556300Q
    Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9% Sigma-Aldrich 439126-4 L
    Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UV Thermo Fisher Scientific A955-4
    Isopropanol 99.9%, HPLC Fisher Scientific BP2632-4
    Methanol Optima LC/MS Thermo Fisher Scientific A452-4
    Water Optima LC/MS, UHPLC-UV Thermo Fisher Scientific W6-4
    Formic acid Thermo Fisher Scientific A118P-500
    Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
    Zinc sulfate Thermo Fisher Scientific Z68-500
    0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008649
    1.5 ml Eppendorf tube Thermo Fisher Scientific 02-682-550
    10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008651
    10 μl pipet tips with filter, sterile Neptune BT 10XLS3
    100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008653
    100 μl pipet tips with filter, sterile Neptune BT 100
    1,000 μl pipet tips with filter, sterile Multimax 2940
    2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008650
    2 ml Eppendorf tube Thermo Fisher Scientific 02-681-258
    20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008652
    20 μl pipet tips with filter, sterile GeneMate P-1237-20
    200 μl pipet tips with filter Multimax 2938T
    200 μl pipet tips with filter, sterile Multimax 2936J
    50 ml Falcon tube BD Falcon 352070
    300 μl inserts for HPLC vials Phenomenex ARO-9973-13
    Balance PR2002 Mettler Toledo 1117050723
    Balances AX205 Delta Range Mettler Toledo 1119343379
    Bullet Blender Homogenizer Next Advance BBX24
    Centrifuge Biofuge Fresco Heraeus 290395
    Disposable Wipes PDI Q55172
    Glass v ials, 4 ml Thermo Fisher Scientific 14-955-334
    Glass vials, 20 ml Thermo Fisher Scientific B7800-20
    Gloves, nitrile Titan Brand Gloves 44-100S
    HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clear Phenomenex ARO- 9921-13
    Lids for HPLC vials Phenomenex ARO- 8952-13-B
    Needle, 18 G 1.5 Precision Glide 305196
    Rack for Eppendorf tubes Thermo Fisher Scientific 03-448-11
    Rack for HPLC Vials Thermo Fisher Scientific 05-541-29
    Steel beads 0.9 – 2 mm Next Advance SSB14B
    Storage boxes for freezers / refrigerators Thermo Fisher Scientific 03-395-464
    Standard multi-tube vortexer VWR Scientific Products 658816-115
    Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK GE Whatman  2016-05
    Autosampler CTC PAL  PAL.HTCABIx1
    Binary pump, Agilent 1260 Infinity Agilent Technologies 1260 G1312B
    Binary pump, Agilent 1290 Infinity Agilent Technologies 1290 G4220A
    Micro vacuum degasser, Agilent 1260 Agilent Technologies 1260 G13798
    Column oven,  Agilent 1290 with 2 position  Agilent Technologies 1290 G1216C
    Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve Agilent Technologies 1290 G1316C
    HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm Phenomenex 820950-926
    HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm Phenomenex 993967-906
    Tandem Mass Spectrometer
    API5000 MS/MS with TurboIonspray source AB Sciex 4364257
    Mass spectrometry software AB Sciex Analyst 1.5.1

    References

    1. Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19, (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
    2. Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40, (9), 1249-1255 (1987).
    3. Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2, (8670), 1000-1004 (1989).
    4. Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344, (8920), 423-428 (1994).
    5. A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331, (17), 1110-1115 (1994).
    6. Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64, (3), 436-443 (1997).
    7. Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group. Transplantation. 15, (7), 977-983 (1997).
    8. Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14, ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
    9. Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54, (6), 925-975 (1997).
    10. Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357, (6380), 695-697 (1992).
    11. Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23, (10), 563-585 (2013).
    12. Annual Data Report. Department of Health and Human Services, Health Resources and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, Division of Transplantation. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov/data/annualreport.asp (2014).
    13. Draft Guidance on Tacrolimus. Food and Drug Administration, Office of Generic Drugs. Available from: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM181006.pdf (2012).
    14. Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41, (11), 813-851 (2002).
    15. Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. ebb 4th Edition, Lipincott, Wiliams, and Wilkins. =Baltimore. 529-562 (2005).
    16. Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24, (1), 59-67 (2002).
    17. Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18, (4), 362-367 (1996).
    18. Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17, (6), 606-614 (1995).
    19. Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31, (5), 309-316 (1998).
    20. Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313, (1-2), 241-253 (2001).
    21. Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11, (6), 1122-1131 (2000).
    22. Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62, (5), 599-606 (1996).
    23. Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10, (6), 712-720 (2006).
    24. Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28, (1), 96-104 (2014).
    25. Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44, (1), 14-20 (2011).
    26. Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31, (3), 327-336 (2009).
    27. Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5, (17), 2187-2208 (2013).
    28. Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3, (7), 779-786 (2011).
    29. Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115, (Oct 15), 47-54 (2013).
    30. Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51, (Pt 1), 106-109 (2014).
    31. Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926, ((May 1)), 54-61 (2013).
    32. Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421, ((Jun 5)), 152-156 (2013).
    33. Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27, (3), 327-334 (2013).
    34. Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884, ((Feb 1)), 102-107 (2012).
    35. Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9, (6), 729-733 (2005).
    36. Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46, (Pt 2), 144-145 (2009).
    37. Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20, (2), 221-225 (2006).
    38. Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24, (6), 757-767 (2002).
    39. Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83, (2), 237-238 (2007).
    40. Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50, (4), 664-670 (2009).
    41. Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21, (2), 140-145 (2008).
    42. Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44, (3), 658-664 (2007).
    43. Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877, (14-15), 1595-1598 (2009).
    44. Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
    45. Hannon, H. W., et al. Blood collection on filter paper for neonatal screening programs, approved standard LA4-A5. Clinical Laboratory and Standards Institute. Available from: http://www.clsi.org (2007).
    46. Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773, (1), 47-52 (2002).
    47. Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400, (1-2), 103-106 (2009).
    48. Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748, (1), 41-53 (2000).
    49. Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877, (29), 3506-3514 (2009).
    50. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131, (5), S1631-S1636 (2001).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter