מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

שתואר כאן הוא הליך מהיר ויעיל לכינון מחדש פונקציונלי של מטוהר wild-type וחלבון CFTR מוטציה המשמרת את פעילות לערוץ כלוריד הזה, שהוא פגום בסיסטיק פיברוזיס. זרימת יודיד מproteoliposomes מחדש בתיווכו של CFTR מאפשרת לימודים של פעילות ערוץ ואת ההשפעות של מולקולות קטנות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות הרגולטור (CFTR) הוא חבר יוצרי ערוץ ייחודי של ATP כריכת קלטת superfamily (ABC) של מובילים. פעילות ערוץ זירחון וכלוריד התלוי נוקלאוטיד של CFTR נחקרה לעתים קרובות במערכות תא כולו וכערוצים בודדים בתיקוני קרום נכרתו. מוטציות הגורם לסיסטיק פיברוזיס רבים הוכחו לשנות פעילות זו. בעוד מספר קטן של פרוטוקולי טיהור פורסמו, שיטה מהירה לשיקום שומרת פעילות ערוץ ושיטה מתאימה ללימוד פעילות ערוץ אוכלוסייה במערכת מטוהרת היו חסרה. שיטות כאן מהירות מתוארות לטיהור וכינון מחדש תפקודי של חלבון CFTR באורך המלא לproteoliposomes של הרכב שומנים בדם מוגדר ששומר על פעילות כערוץ הליד מוסדר. שיטה זו הכינון מחדש יחד עם assay מבוסס שטף רומן של פעילות ערוץ היא מערכת מתאימה ללומד את מאפייני אוכלוסייה של ערוץ CFTR סוג בר ומוטציות הגורמות למחל F508del- וG551D-CFTR. באופן ספציפי, יש לו את השיטה שירות בלימוד ההשפעות הישירות של זירחון, נוקלאוטידים ומולקולות קטנות כגון potentiators ומעכבים על פעילות ערוץ CFTR. השיטות גם נתונים למחקר של ערוצים / מובילי קרום אחרים למצעי anionic.

Introduction

תחבורת כלוריד פני ממברנות הפסגה של תאי האפיתל ברקמות כגון בלוטות ריאות, מעי, הלבלב וזיעה מתווכת בעיקר על ידי סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות הרגולטור (CFTR), ATP- וחבר-מוסדר זירחון של ABC (ATP- כריכת subfamily הקלטת) C של חלבונים בממברנה (הנסקרת ב 1). כמו חברים אחרים של תת-משפחת Abcc, CFTR הוא חלבון גדול, רב-פורש נפרד קרום שקושר ATP בשני אתרי קישור נוקלאוטיד נוצרו בממשק של תחומים מחייב נוקלאוטיד (NBDs), בם יש לי פעילות ATPase צנועה באחת אתר. עם זאת, בניגוד לחברים תת-משפחת Abcc אחרים, CFTR התפתח כערוץ Cl מוסדר ייחודי ולא כטרנספורטר המומס פעיל.

מוטציות בגורם CFTR סיסטיק פיברוזיס, מחלה הפוגעת באיברים רבים, כולל ריאות, מערכת עיכול, לבלב ואיברי רבייה, שמובילות לmorbidity ותמותה במבוגרים צעירים. מחלת ריאות בדרך כלל חשבונות לתמותה מוקדמת בסיסטיק פיברוזיס וברוב המקרים נגרמת על ידי אובדן תפקוד CFTR על האפיתל של דרכי הנשימה ביצוע המשטח. חוסר בפעילות ערוץ כלוריד CFTR גורם להפחתה בשני Cl - ותנועת מים על פני האפיתל פני השטח כדי לשנות את שכבת הנוזל על משטח הפסגה של אפיתל הנשימה ריסי. התוצאה היא נוזל צמיג שטח בדרכי נשימה שפוגע ביכולת של תאי אפיתל נשימה ריסי ליעילות פתוגנים מדרך הנשימה ברורים. כתוצאה מכך, רוב חולי CF סובלים מהתקפים חוזרים ונשנים של דלקת ריאות ונזק ריאות בשל דלקת.

כצפוי, מחקרים של מנגנון פעולה של חלבון CFTR הנורמלי התמקדו בעיקר במחקרי אלקטרו מפורטים של פעילות gating הערוץ שלה. מחקרי ערוץ אחד הראו כי פונקציות ישירות CFTR כPKA-תלוי Cl- ערוץ שבו בעל שער מוסדר ATP 2. מחקרי אלקטרו מפורטים לספק מידע רב על ערוצי CFTR יחידים 1,3, אולם ייתכנו דאגה באשר לשאלה האם המאפיינים של כל ערוץ אחד מסוים שנחקר הוא שיקוף של כל אוכלוסיית ערוצי CFTR ולכן ערוץ אחד תוצאות תמיד צריכים לשקול יחד עם שיטות ללמוד האוכלוסייה מקרוסקופית. assay הישיר של פעילות ערוץ האוכלוסייה של CFTR מטוהר יש הפוטנציאל לספק תובנה הפגם המולקולרי הקשורים למוטציות הגורמות למחלות ולנהוג גילוי מאפננים כימיים שתיקון חלבוני CFTR המוטציה. נכון להיום, יש עודף של 1,900 מוטציות שונות בCFTR חשבו לגרום סיסטיק פיברוזיס 4. המוטציה הגדולה, F508del-CFTR, הנמצאת באלל אחד לפחות בכ -90% מהחולים בצפון אמריקה ובאירופה מובילה לחלבון misfoldingשמירת nd בreticulum endoplasmic 5. F508del-CFTR יש גם השלכות אחרות, הכולל את פעילות ערוץ פגום 6-9. היעדרות כתוצאה של CFTR מתא השטח מזוהה עם מחלה קשה. G551D-CFTR, מוטציה נפוצה פחות, הוא חשב להיות מקופל עדיין כראוי הוא לא מתפקד כערוץ כלוריד על פני תא 6. הפיתוח של מתקן מולקולה קטן וpotentiators יש את המטרה של תיקון מתקפל ו / או סחר של מוטציות כגון F508del-CFTR לשטח פני התא, וpotentiating או הגדלת פעילות הערוץ של מוטציות כגון G551D כאשר קיים על פני התא, בהתאמה . בעוד מתקן VX-809 וVX-661 (עדיין לא אושר לשימוש בחולים, potentiator Kalydeco (ivacaftor; VX-770) נמצא בשימוש ב 150 מ"ג כל 12 שעות בחולי CF> 6 שנים עם לפחות אחד G551D מוטציה -CFTR, ולאחרונה בחולים עם אחד מG178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255PוG1349D. Kalydeco הוא גם בטוח וגם תוצאות בשיפור אמצעים קליניים של המחלה CF 10, אולם מנגנון פעולה של מולקולה קטנה זה הבין היטב בעת אישור ה- FDA לשימוש בחולים.

קומץ של שיטות טיהור CFTR תוארו בעבר 2,11-18, שרבים מהם דורשים אורך ניכר של זמן כדי להשלים. בפרסום האחרון 19, שיטת טיהור והכינון מחדש מהירה ייחודית תוארה לCFTR ביטוי יתר במערכת הביטוי 9 תא f S, וחלבון מטוהר זה במערכות שומנים מוגדרות שימש לפיתוח assay פעילות ערוץ הליד CFTR לאוכלוסייה של CFTR מולקולות. Assay משחזר את ההשפעות הידועות של זירחון, נוקלאוטידים ומעכבים על תפקוד CFTR. המערכת הייתה בשימוש כדי לחקור את ההשפעות של potentiator VX-770 / Kalydeco על Wt- (wild-type), F508del- וG551D-CFTR וזה הוצגו בראשוןזמן שתרופת אינטראקציה ישירות עם חלבון CFTR להגברת פעילות הערוץ שלה באופן ATP-עצמאי, הממחישה את התועלת ותחולתה של שיטות אלה לחקר האינטראקציה של CFTR ומוטציות עם נוקלאוטידים ומולקולות קטנות מנקודת מבט אוכלוסייה ל לענות על שאלות רלוונטיות מבחינה קלינית על החלבון. השיטות יש גם שימשו ללמוד מולקולות אחרות potentiator ונגזרותיהם 20, כמו גם את ההשפעות של מתקן מולקולה קטן בפעילות של החלבון 21.

מבחני בזרימת היו בשימוש במחקרים רבים בעבר כדי לחקור את הפעילות של מוטציות CFTR ואת ההשפעות של תרכובות CFTR-modulatory על פעילותה, ובכלל זה מבחני תא כולו באמצעות אלקטרודות, קליעים נותבים רדיואקטיבי וfluorophores 22,23, שלפוחית ​​עם קרום אלקטרודות סלקטיבית יון 24 , וטהר CFTR מחדש עם קליעים נותבים רדיואקטיבי 25. עם זאת thשימוש בדואר של אלקטרודות סלקטיבית היון ללמוד מטוהר CFTR מחדש דווח לראשונה לאחרונה 19. הסתגלות של השיטה הנוכחית הייתה בשימוש כבר הכינון מחדש ואפיון פונקציונלי של שני חלבוני קרום בPseudomonas aeruginosa, הפתוגן CF נפוץ. הכינון מחדש חלבון מטוהר alge חיצוני קרום יחד עם מדידות זרימת יודיד שלהם המשמשים לתמיכת מודל להפרשת אלגינט anionic דרך טרנספורטר זה 26. כינונה מחדש ומדידות זרימת יודיד יושמו חלבון Wzx המטוהר, שאיפשר מודל להצעה שמציעה H + מנגנון antiport + תלוי לטרנסלוקציה oligosaccharide צמוד שומנים על פני הקרום הפנימי החיידקים על ידי חלבון זה 27. בשני המקרים יודיד שימש כתחליף למצע anionic, אם כי בתפוקה נמוכה יותר מכפי שאפשר לצפות למצע ילידים. השיטה עשויה להיות מתאימה להסתגלות לחלבונים אחרים עם גמסלולי תחבורה או הולכה ationic מצעי anionic.

כאן תהליך טיהור מהיר מתואר לחלבון CFTR והרכבתה מחדש לproteoliposomes של שומנים בדם מוגדרים. הליך הכינון מחדש המהיר יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם CFTR מטוהר על ידי שיטות אחרות, ובלבד שהסוג של חומר ניקוי בטיהור ניתן להסרה בשיטות המשמשות כאן או ניתן להחליף אבקת כביסה מתאימה לפני הליך הכינון מחדש. שיטת זרימת יודיד למדידת פעילות ערוץ חלבון CFTR המטוהר והמשוחזר של מתוארת בפירוט וכמה תוצאות טיפוסיות שניתן להשיג משיטה זו מוצגות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. טיהור של CFTR

הערה: נא ראה טבלה של חומרים וציוד לרשימה של ציוד וחומרים המשמשת בפרוטוקול זה. פרוטוקול מפורט קיים לביטוי יתר של האדם WT-CFTR ומוטציות בf S מערכת ביטוי 9-baculovirus 17,28. ביטוי יתר CFTR ולהכין כדורים של f S 9 תאים על פי פרוטוקול זה.

  1. הכנת קרום גולמי
    1. להשיג טרי או להפשיר תא גלולה קפוא S f 9 מתרבות 500 מיליליטר של תאי חלבון wildtype-, F508del-, או G551D-CFTR עימו 10 -tag C-המסוף להביע מעל, גדל בשיטות תרבית תאים סטנדרטיים, כפי שתואר לעיל 17,28. כדורי תא יהיו בהיקף של כ 5 מיליליטר ומשקל רטוב של כ 5 גרם.
    2. f S Resuspend 9 תאים ב 20 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS) pH 7.4 עם מעכבי פרוטאז קוקטייל (1 לוח לכל 50 מיליליטר) בשעה 4 ° C, על מנת להבטיחמדגם מופיע חזותי הומוגנית וללא גושים של תאים נשארים.
    3. תאי Lyse באמצעות משבש תא לחץ גבוה (טבלה של חומרים וציוד), והגיע למינימום של 10,000 psi (רצוי 15,000-20,000 psi) עבור 2 דקות למעבר. שמור את המדגם על 4 מעלות צלזיוס במהלך תמוגה.
      1. לאסוף את הדגימה בצינור על קרח לאחר תקופת תמוגה לאחר מכן טען המדגם במשבש התא באופן מיידי. הליך תמוגה חזור 3 פעמים. בדוק תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח פחות מ -10% יישארו ללא שינוי.
        הערה: תאי שיטות אחרות לlyse, כגון חרוזי זכוכית, וכו 'כאמורים לא נבדקו בקפדנות למערכת זו, עם זאת, משתמש עשוי למצוא שיטה חלופית כמתאימה.
    4. חומר צנטריפוגה תמוגה תא על 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה במהירות גבוהה XG ב 2000 עבור 20 דקות. לאסוף את supernatant ולהשליך את הכדור. מחלקים את supernatant בין 20 צינורות וצנטריפוגה הדגימות עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס ב125,000 XG בראש טבלת ultracentrifuge.
    5. להסיר ולסלק supernatant, נזהר שלא להפריע את הכדור, וכדורי חנות באותו הצינורות ב -80 המעלות צלזיוס למשך פחות מ -2 חודשים עד לשימוש, או לשמור על קרח ולהמשיך בטיהור באופן מיידי.
  2. solubilization CFTR
    1. להשיג 1-4 9 כדורי קרום גולמי f S טריים או קפוא וresuspend כל 1 מיליליטר של הצפת 1 (FOS 2% -choline; ראה טבלה 1 למתכון מלא) בשעה 4 ° C על קרח, באמצעות מחט 25 G ו 1 מזרק מיליליטר עד הפתרון הוא הומוגנית לפי העין ללא גושי קרום תא גלויים. איפה גלולה יותר מפעם אחת הוא להיות solubilized, תמשיך לטפל בכל דגימה להוראות לגלולה אחת מתחת במקביל, איגום הדגימות בשלב 1.3.2.
    2. לפזר לוח מעכב פרוטאז מיני 1 ב 1 מיליליטר של הצפת 2 (imidazole 10 מ"מ; ראה טבלה 1) שאין בו חומר הניקוי 14 -choline Fos (מעכבי פרוטאז הם 10x concent יותרדירוג מאשר הדילול מומלץ בשלב זה) ולהוסיף לגלולת הקרום הגולמי resuspended 100 μl (מעכבי פרוטאז הם בדילול מומלץ בשלב זה). קבע על קרח במשך 45-60 דקות עם ערבוב על ידי היפוך 5 פעמים כל 5 דקות.
    3. צנטריפוגה resuspended גלולה קרום גולמי בultracentrifuge בראש טבלה במשך 25 דקות ב 125,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס. שמור את supernatant, אשר מכיל CFTR solubilized וזורקים את הכדור.
  3. טור מחייב, זירחון וelution
    1. שטוף 400 μl של ניקל-נ.ת.ע slurry (חומצת nitrilotriacetic) agarose או שרף שווה ערך עם 1 מיליליטר של הצפת 2 (imidazole 10 מ"מ; ראה טבלה 1) שאין בו חומרי ניקוי, כדי להסיר ממס וחיץ על 4 מעלות צלזיוס. חזור על לשטוף פעמיים נוספות.
    2. לשלב CFTR solubilized, מעכב פרוטאז שנותר (900 μl) ושרף ניקל (מ -400 slurry μl) לסך של 10 מיליליטר עם הצפת 2 (10 imidazole מ"מ; ראה טבלה 1) which חסר כל חומר ניקוי הוסיף. הריכוז 14 -choline פוס מדולל ביעילות ל -0.2% (w / v) בשלב זה. אם יש צינורות מרובים, בריכה כל הדגימות המכילות CFTR solubilized, מעכבי פרוטאז, שרף ניקל-נת"ע ו -0.2% (w / v) -choline-14 Fos בשלב זה. דגירה של 60 דקות ב 4 ° C עם רעד עדין.
    3. לעבור פתרון נת"ע המעכב-ניקל CFTR-פרוטאז את טור קטן הקרנה (טבלה 1) או עמודה ריקה שווה ערך.
    4. לשטוף את שרף נת"ע ניקל, אשר נשמרת בעמודה, עם 4 מיליליטר לגלולה ראשונית של הצפת 3 (imidazole 10 מ"מ + DDM; ראה טבלה 1) שאין בו Fos -choline 14 אך מכילה 1 מ"מ DDM (חומר ניקוי maltoside dodecyl), ב 4 מעלות צלזיוס. תוספת של חומר ניקוי DDM אינה משנה באופן משמעותי את ה- pH של חיץ זה.
    5. הכן פתרון PKA-MgATP על ידי הוספת 25 μl (5 מ"מ, ריכוז סופי) של MgATP, 2500 U של cAMP-dependent kinase החלבון, מקטע קטליטי (PKA) 475 μl של הצפת 3 (10 מ"מ imidazole + DDM; ראה טבלה 1) לעמודה. Phosphorylate חלבון על ידי איטום הקצה התחתון של העמודה עם כובע או Parafilm, והוספת 500 μl של פתרון PKA-MgATP לכל גלולה ראשונית בשימוש.
    6. דגירה בטמפרטורת חדר (C ° 20) במשך 20 דקות עם ערבוב וresuspension של השרף באמצעות pipettor 1 מיליליטר כל 2 דקות עדינים על מנת להבטיח שPKA בא במגע עם פני השטח של שרף נת"ע ניקל.
    7. הסר את המכסה וelute פתרון PKA / MgATP מהעמודה. לשטוף את העמודה עם 2 מיליליטר של חיץ 3 (10 מ"מ imidazole + DDM; ראה טבלה 1) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
    8. להכפיל את מספר כדורים ששמשו בניסוי על ידי 4. לשטוף את העמודה עם מספר כזה של 4 מיליליטר של הצפת (imidazole 50 מ"מ + DDM; ראה טבלה 1) על 4 מעלות צלזיוס, על ידי הוספת 4 מיליליטר של חיץ לעמודה, המאפשר לה לזרום דרך ומייד הוסיף aliquot 4 מיליליטר ליד העמודה.
    9. טבלה 1) 1 מיליליטר של הצפת 5 על 4 מעלות צלזיוס לגלולה ראשונית המשמשת דרך העמודה, 1 מיליליטר בכל פעם בלי הפסקה כדי לאפשר לטור לייבוש, ו לאסוף את כל eluate מכיל CFTR מטוהר בצינור אחד.
    10. להתרכז מדגם חלבון כדי להסיר מוצרי imidazole והשפלה משקל מולקולרי נמוכה באמצעות מכשיר סינון צנטריפוגה (חתוך 100,000 משקל מולקולרי) כאמור בטבלה של חומרים וציוד או מכשיר דומה אחר, בסכום כולל של 10 מיליליטר הצפת 6 (75 מ"מ KI + DDM; ראה טבלה 1) או חיץ אחר של בחירה המכילה 1 מ"מ DDM (כגון 7 הצפת לניסויים בזרימת בלתי יודיד, 25 מ"מ HEPES + DDM; ראה טבלה 1), על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 ו- 4 מעלות צלזיוס במשך כ -20 דקות עד המדגם מתרכזת 200 μl. לדלל מדגם 10 מ"ל ולחזור על שלב הריכוז.
      הערה: מניסיוננו (לא פורסם), imidazole inhi באופן משמעותירסיסים את פעילות ATPase של CFTR, ויש להסיר בשלב זה על ידי דילול וריכוז לפחות פעמיים אם המדגם ישמש למדידות פונקציונליות.
    11. לאסוף CFTR מטוהר מרוכז. שמור על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות של חיץ DDM עד לשימוש בתוך 1-2 ימים או להמשיך באופן מיידי לצעד הכינון מחדש. אין להקפיא חלבון המטוהר, כמו בניסיון שלנו אנו רואים את פעילותו המצומצמת.

2. כינונה מחדש של CFTR

  1. הכנת שומנים בדם
    הערה: CFTR כבר מחדש בהצלחה לביצה PC, POPC, 2: 1 (w / w) PC ביצה: POPC (1: 1 w / w) תערובת, או תערובת של PE: PS: PC: ergosterol, 5: 2 : 2: 1 (w / w).
    1. בניסויים יודיד בזרימת, מ"ג היבש 5 של ביצת PC (200 μl של 25 מ"ג / מיליליטר מניות, ראה טבלה של חומרים וציוד) תחת זרם של גז ארגון במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בפיירקס או יציב אחרים (לא ורוסיליקט ) שפופרת זכוכית.
    2. באמצעות הספיגה ב 280 ננומטר, ELISAssay או שיטה אחרת, להעריך את הריכוז של מדגם חלבון CFTR המטוהר. לניסויים בזרימת יודיד עם CFTR wildtype, להשתמש חלבון: יחס שומנים של 1: 300-1: 3000 (w / w) כדי לייצר אות מספיק. לG551D- וF508del-CFTR, להשתמש חלבון: יחס שומנים של כ 1: 200-1: 1,200 (w / w) כדי לזהות פעילות בזרימת.
    3. לייעל את החלבון: יחס שומנים למערכת מסוימת כל אחד. חשב את הנפח של חלבון מטוהר הנדרש. חשב את הנפח של חיץ עם 1 מ"מ DDM הנדרש כדי להפוך את נפח סופי של 1 מיליליטר, כלומר, 1 מיליליטר - (נפח של פתרון חלבון הנדרש) = נפח של חיץ.
      1. הוסף את הנפח המחושב של מערכת החיץ הרצויה עם 1 מ"מ DDM לשומנים בדם המיובש (אך לא להוסיף את חלבון CFTR בשלב זה) ולכסות את שפופרת הזכוכית עם Parafilm. לניסויים בזרימת יודיד, resuspend שומנים במאגר 6 (75 מ"מ KI + DDM; ראה טבלה 1). בניסויים אחרים resuspend במאגר 8 (25 מ"מ HEPES + DDM, לראותטבלת 1) או אחר חיץ פנימי רצוי המכיל 1 מ"מ DDM.
      2. מערבולת למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר כדי לסייע בהשעיה של השומנים בדם במאגר DDM. לחלופין, לחמם את המדגם ל -37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 דקות לפני vortexing.
    4. להשעות את השומנים בדם שוב ושוב בטמפרטורת חדר עם מזרק 1 מיליליטר ומחט 25 G עד שלא סרט שומנים גלוי על הצדדים של הצינור. הימנע מהזרקת אוויר לתוך הפתרון שמייצר בועות עדינות ולסייע בחמצון של יודיד ושומנים.
    5. Sonicate השומנים התלויים בParafilm מכוסה צינור לפרץ 20 שניות בקרח sonicator אמבטיה המכיל, ולאחר מכן להעביר מייד לקרח 1 דקות. חזור 3 פעמים.
      הערה: sonication אינטנסיבי הופכת פתרונות יודיד צהובים עקב חמצון. לכן להימנע sonication מוגזם. לפקח על המדגם לשינויי צבע. אם שינוי צבע יצוין, לבטל את המדגם ולהכין שוב. השינוי בצבע עקב חמצון של חלק מיודיד יביא חמצון של השומנים באותם תנאים. עקירת האוויר מהצינור עם גז ארגון לפני sonicating הפתרון תסייע למנוע חמצון של שומנים ויודיד. sonication האינטנסיבי יכול לשבור באיכות ירודה או צינורות זכוכית שרוטים ותוצאה הוא אובדן של המדגם.
    6. הוסף את הנפח של CFTR מטוהר מחושב בשלב 2.1.3 למדגם השומנים sonicated להשגת נפח סופי של 1 מיליליטר. מערבבים את החלבון עם פתרון השומנים וחומרי ניקוי על ידי resuspension 10 פעמים עם מזרק מחט 25 G ומ"ל 1.
    7. מדגם שומנים וחלבונים שנקבע על קרח למשך 30 דקות עם מתערבל של צינור לערבב 5 פעמים כל 5 דקות.
  2. הכנת טור מחייב חומר ניקוי
    1. השג טור ליחד מסחרי מחייב חומר ניקוי ספין (ראה טבלה של חומרים וציוד) עם קיבולת נפח 1 מ"ל ולשבור את הכרטיסייה התחתונה כדי להתחיל את הטור זורם.
    2. צנטריפוגה העמודה במשך 2 דקות XG ב 2000 כדי להסיר את האחסון בuffer, וזורקי החיץ הזה.
    3. הוסף 5 מיליליטר של חיץ 7 (75 מ"מ KI, ראה טבלה 1) לעמודה ואז צנטריפוגות ב XG 200 למשך 4 דקות לelute החיץ לשטוף. חזור על פעולה זו 2 פעמים יותר עבור הסכום כולל של 3 שוטף כדי להסיר כל העקבות של חיץ האחסון. מחק את כל הזרימה דרך.
      הערה: זה קריטי, כי המאגר משמש כדי לשטוף את העמודה אינו מכיל DDM או כל חומר ניקוי אחר. יש עמודת קיבולת מחייבת סופית לחומרי ניקוי ואם מאגר המכיל חומר ניקוי משמש, הטור לא יהיה יעיל בהסרת חומר הניקוי ממדגם החלבון-שומני חומר הניקוי.
    4. aliquot בעיון את כל 1 מיליליטר של מדגם שומני חומר ניקוי החלבון על החלק העליון של שרף טור דגירה מדגם בחלק העליון של העמודה במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר.
    5. צנטריפוגה המדגם בטמפרטורת חדר למשך 4 דקות XG ב 2000 ולאסוף את מדגם מעונן proteoliposome בצינור microfuge נקי של 1.5 או 2 מיליליטר או שפופרת זכוכית ולמקם את סםPLE על קרח.
    6. לאסוף proteoliposomes שנותר בעמודה על ידי הוספת 200 μl של הצפת 7 (75 מ"מ KI, טבלת 1) או חיץ אחר (ללא חומר ניקוי) לחלק העליון של העמודה ולחזור על שלב צנטריפוגה למשך 2 דקות.
    7. הוסף את eluate השני למדגם proteoliposome אם זה נראה מעונן.
    8. חנות המדגם ב 4 ° C למשך הלילה או להשתמש באופן מיידי למדידות זרימת יודיד.

3. מדידות יודיד בזרימת לCFTR מזוקק, כששב ל

  1. דור של שיפוע יודיד על פני קרום proteoliposomal
    1. חרוזים טרום להתנפח Sephadex G50 במאגר 9 (75 מ"מ K-Glu; גלוטמט אשלגן, ראו טבלה 1), (חרוזים כ 5 גרם יבשים ב 50 מיליליטר חיץ) או חיץ חיצוני רצוי בטמפרטורת חדר למשך לפחות שעה 2 או 4 ° C למשך הלילה.
    2. הכן 4 עמודות Sephadex G50 רוויות במאגר 9 (75 מ"מ K-Glu, ראה טבלה 1) או אחרתחיץ בטורי הקרנה קטנים על ידי טעינת שרף לפחות ¾ מלא בעמודה.
    3. צנטריפוגה למשך 4 דקות XG ב 2000 כדי להסיר חיץ עודף מהשרף. לא צריך להיות כ 2.25 מיליליטר של שרף hydrated ארוז בטור בסוף צעד צנטריפוגה.
      הערה: שרף צריך להיות התייבשות קלה אך לא שקוע בנוזל וספין קצר לאחר מכן לא צריך elute היקפים משמעותיים של מאגר. זה קריטי לelution המוצלחת של מדגם proteoliposome ששרף הטור הוא לא רטוב מדי ולא יבש מדי והמשתמש עשוי להזדקק להתנסות עם העמודות כדי להכיר את תנאי חילופי חיץ המוצלחים ביותר.
    4. בזהירות להוסיף 125-150 μl של proteoliposome מדגם לחלק העליון של כל עמודה ו צנטריפוגות במשך 4 דקות ב2,000 g x.
    5. proteoliposome הבריכה eluates יחד לשימוש מיידי בזרימת יודיד או ניסויים אחרים.
      הערה: נפח eluted מכל עמודה צריך להיות בערך150 μl והמדגם צריך להיות קצת מעונן, אבל פחות מעונן מהמדגם המקורי. נפחים גדולים יותר או eluates ברור מצביעים על כך שהטורים לא היו מיובשים מספיק, או שהתייבשו יותר מדי, בהתאמה, ולא יגרמו לניסוי בזרימת יודיד מוצלח.
  2. assay הזרימה יודיד
    1. לשטוף אלקטרודה יודיד סלקטיבית מיקרו (טבלה של חומרים וציוד) בהרחבה במי דה המיונן, ואז דגירה במשך 20 דקות לפני הניסוי במאגר 10 (15 מיקרומטר KI, ראה טבלה 1). שטוף את האלקטרודה שוב בהרחבה במי דה המיונן.
    2. להוסיף 150 μl של תרופה (ריכוז טיפוסי 20 מיקרומטר לייצר ריכוז סופי של 10 מיקרומטר בassay) במאגר 9 (75 מ"מ K-Glu, ראה טבלה 1) או רכב ב9 הצפת ולאחת מצלחת 96-היטב עם בר ומערבב פשפשים קטן.
      1. ודא שאין בועות בהווה. השתמש קצה פיפטה כדי להסיר תועהבועות. אם נעשה שימוש בפתרון תרופתי, להבטיח כי ריכוז DMSO הסופי בבאר הוא פחות מ -1% (V / V) (בדרך כלל 0.1-0.2% (V / V)).
    3. להוסיף 150 μl חלבון CFTR מחדש שהופק בסעיף 3.1 במאגר של 9 (75 מ"מ K-Glu, ראה טבלה 1) להיטב עם תרופה או חיץ, כדי לייצר בנפח כולל של 300 μl בבאר של הצלחת.
    4. מניחים את צלחת 96-היטב על צלחת ומערבבים ומערבבים ב 130 סל"ד (או במהירות בינונית של כ ¼ של המהירות המרבית).
    5. הכנס את קצה האלקטרודה סלקטיבית יודיד בזהירות לתוך הבאר עם המדגם כזה הקצה לא נוגע בתחתית הבאר או מפגיעת בר והמערבב. ודא שאלקטרודה ההתייחסות, אם נפרד, גם היא במגע עם הפתרון בבאר.
    6. העתקי שיא באמצעות תוכנת מחשב תוצרת בית או מסחרי ממשקים עם אלקטרודה (ראו טבלה של חומרים וציוד לפרטים נוספים).השתמש בקצב דגימה של 2 הרץ, עם סינון של האות דרך מסנן מעביר נמוך.
    7. לאפשר את המדגם כדי לאזן במשך 5 דקות כדי לייצר בסיס שטוח יציב שטוח, או בסמוך בעת ההקלטה.
    8. הוסף 3 μl MgATP (100 מניות מ"מ מוכנות ב DH 2 O ומותאמים pH 7 עם KOH; 1 מ"מ ריכוז סופי) לדוגמא, כדי להפעיל את החלבון. לאפשר ~ 5 דקות כדי להגיע לבסיס יציב חדש. תמיד להתאים את ה- pH של מניית מ"מ MgATP 100 לניטראליים לפני השימוש כדי להימנע משינויים ב- pH של החיץ החיצוני.
    9. הוסף 3 μl של valinomycin מניות (2 מיקרומטר; 20 ננומטר ריכוז סופי) לדוגמה כדי לדחוק שינויים בפרש פוטנציאל שנוצר על ידי מוליכות יודיד סלקטיבי דרך CFTR. רשום את מדרון הירידה (ירידה בmV) עקב פעילות בזרימת יודיד בתיווך CFTR במשך 5 דקות לפחות.
    10. כדי להבטיח שהלכידה של יודיד בלומן proteoliposome הייתה מספיק, להוסיף 3 μl של 10% (v / v) טריטון X-100 לדוגמא. משמעותיתt ושחרור יודיד מיידי מצביעים על כך שיודיד מספיק כבר לכוד בשלפוחית ​​כך שההשמנה לא הייתה הגורם המגביל לשינויים במדרון שנקבעו ב3.2.9 אלא הפעילות בתיווך CFTR.
    11. שטוף את בר אלקטרודה ומערבבים היטב במים דה המיונן לאחר הטיפול של דגימות עם תרופה או עם Triton X-100 כדי להבטיח את כל העקבות של חומרים כימיים אלה הוסרו כדי למנוע זיהום של המדגם הבא.
    12. הכן סדרה של ריכוזי KI לדלל במייקרו למגוון של ננו-מולר במאגר 9 (חיץ K-Glu, ראה טבלה 1). רשום את תגובת mV של האלקטרודה לכל ריכוז שבין 0 ל הריכוז הגבוה ביותר שהוכן. בניית עקומה סטנדרטית שבו תגובת הבדיקה (mV) היא להתוות לעומת יומן של ריכוז יודיד טוחנת. השתמש בעקומה סטנדרטית להמיר את תגובת mV של החללית במהלך ניסוי הזרימה לריכוז של יודיד שוחרר.
      הערה: הכן נוכ כיולve על בסיס שבועי עד משתמש הוא בטוח באיזו מהירות התגובה של שינויי הבדיקה. יהיה להיסחף בתגובה והרגישות של הבדיקה לאורך זמן. כפי גילאי הבדיקה, התגובה תהיה לבזות. זה עשוי להיות מבוטל באופן חלקי על ידי שינוי הפנימי הפתרונות מעת לעת ושטיפה נרחבת של הבדיקה הקצה במים לאחר שימוש, שדבקות סביר גבולות של מולקולות על פני השטח הבדיקה.
    13. לקבוע את השיפוע הממוצע של הקו של הריכוז לעומת עלילת זמן עבור כל דגימת proteoliposome במשך 30 שניות האחרונות לפני תוספת של MgATP, ולאחר תוספת של valinomycin אבל לפני תוספת של Triton X-100. הפחת את מדרון הבסיס מvalinomycin כדי לקבוע את הפעילות בזרימת יודיד בתיווך CFTR למדגם ש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מתוארים בפרסום בכתב זה הם שיטות לטיהור, מחדש ולמדוד את פעילות ערוץ מוסדרת של חלבון CFTR. איור 1 א מציג את זרימת העבודה לטיהור, הכינון מחדש ונהלים בזרימת יודיד. שיטות למדידת הכינון מחדש ופעילות ערוץ על-ידי שטף יודיד גם מוצגות בפירוט נוסף בווידאו קשור.

טיהור וכינון מחדש של CFTR לproteoliposomes

CFTR יכול לבוא לידי ביטוי מבחינה תפקודית ברמות גבוהות בf S 9 תאים באמצעות baculovirus רקומביננטי המכיל Wt או CFTR המוטציה cDNA 2. אמנם לא מערכת יונקים ביטוי, CFTR בא לידי הביטוי באמצעות מערכת baculovirus בf S 9 תאים כדי להבטיח רמה גבוהה של ביטוי. ייצור CFTR יכול להיות גבוה ככל 1% מכלל 17,28 חלבון תאי. S f מערכת baculovirus 9- יש את היתרון שהחלבון הוא ליבת glycosylated ומכונות בקרת איכות במערכת זו היא יחסית מתירנית כך שCFTR ומוטציות יכולים להיות מיוצרים על פני התא. תג עשרה היסטידין תוכנן על התחנה הסופית carboxy לאפשר טיהור מכוח הזיקה של תג זה לניקל-נת"ע. תג C-המסוף מסייע במניעת שיתוף טיהור של חלבוני CFTR מקוצצים ותשואות חלבון CFTR פונקציונלי בATPase, ערוץ יחיד וניסויים בזרימת יודיד 17,19,24,28,29. עם זאת פרוטוקול הטיהור המתואר כאן צריך להיות מתאים לCFTR N-סופני מתויגים גם כן.

בעבר, זה כבר הראה כי חלבון CFTR ניתן להפיק ביעילות מהכנות קרום f S פלזמה 9 באמצעות NaPFO (נתרן pentadecafluoro-octanoate) בטמפרטורת חדר 15. עם זאת, הרגישות של NaPFO כדי לזרז על 4 מעלות צלזיוס, טמפרטורה תורמת לשמירה על חלבון מקופל כראוי, והדיאליזה הממושכת נדרשה להסיר PFO לא היו נוח לראפשיטות טיהור id וכינון מחדש נועדו למקסם את פעילותו של החלבון במבחנים הבאים של פונקצית CFTR. הערכה של פנל של חומרי ניקוי (כולל dodecyl-β-D-maltoside (DDM), 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (בחורים), Fos -choline 12 וFos -choline 14, הראתה ש Fos -choline 14 היה יעיל ביותר בsolubilizing CFTR-אדם 10 מ -9 קרומי f S, וDDM שהיה יעיל בשמירה על פעילות ATPase של CFTR בתמיסת סבון (מידע לא מוצג). כך צעד החילוץ 14 אבקת הכביסה -choline Fos מבוצע, ואחרי חילופי לDDM חומר ניקוי כדי לשמור על פעילותו של החלבון.

בעקבות טיהור וריכוז, חלק חלבון מתקבל בחומרי ניקוי המכיל DDM להקת kDa ~ 150 כמרכיב העיקרי שלה (איור 2; כסף כתם). משקל מולקולרי זה מתאים לCFTR האנושי בא לידי ביטוי בS <em> 9cells f ונותח על ידי SDS-PAGE, שבו היא חסרה את הסוגים אופייניים glycosylation המורכבת של CFTR בתאי יונקים. 150 מיני kDa נראה כ 90% טהורים הבאה ניתוח SDS-PAGE וצביעת כסף. מערבי סופג באמצעות הנוגדן אנטי CFTR M3A7 מאשר כי חד שבטי עכבר זה מכוון נגד NBD2 מגיב עם להקת 150 kDa (איור 2; כתם). במחקרים מסוימים, כמויות זעירות של רכיבי משקל מולקולריים נמוכים נמצאות כלהקות שוליות גלויות על ג'ל, ב ~ 60 ו~ 80 kDa (מידע לא מוצג). הנוגדן אנטי CFTR M3A7 מגיב עם 60 ו -80 להקות kDa, אבל לא מגיב עם חלבונים לא-CFTR אחרים (מידע לא מוצג). הדבר מצביע על כך רכיבי משקל מולקולרי הנמוכים הם עם CFTR באמצעות תג C-המסוף שלו מטוהר מוצרים במשותף השפלה CFTR. הטיהור נעשה בנוכחות מעכבי פרוטאז ונראה כי רכיבים אלה נמצאים בתאים לפני i הליך הטיהורים שבוצע. צעד הריכוז של ההליך מסיר כמעט את כל שברי משקל המולקולריים הנמוכים זיהום. CFTR ניתן מחדש בשלב זה, או חלבון מהליך טיהור אחרת ניתן להשתמש בפרוטוקול הכינון מחדש.

Assay מבוסס שטף liposomal מדווח הכינון מחדש התפקודי של אוכלוסייה של מולקולות CFTR מטוהרים ומחדש כמוסדר, ערוצים סלקטיבית אניון

על מנת לקבוע אם חלק משמעותי מCFTR מטוהר הוקם מחדש כערוץ כלוריד מוסדר באמצעות השיטות לעיל, assay שטף הליד proteoliposomal פותח אשר מדווח על הפעילות של אוכלוסייה של מולקולות מחדש CFTR (מוצגים באופן סכמטי באיור 1). אם, במקרה הגרוע ביותר, רוב מולקולות CFTR מחדש הם misfolded, מולקולות אלה ייכשלו להעניק מוליכות, לא מצליח להבחין בין קטיונים ואניוניו / או השער יחסר ויסות בזירחון PKA ונוקלאוטידים. אל לי ואח. פרסמו שיטות המאפשרות הערכה של הכינון מחדש פונקציונלי אחוזים מחלבון קרום 30.

ליפוזומים ריקים (חסר CFTR) או proteoliposomes (נושאות CFTR מחדש) נטענים עם KI (75 מ"מ) ויודיד במיוחד liposomal החליף עם גלוטמט אשלגן (75 מ"מ) על ידי העברה ליפוזומים דרך עמודה סינון ג'ל. KI טעון proteoliposomes מתווספים K-Glu (גלוטמט אשלגן) המכיל גם ליצור שיפוע כלפי חוץ ליודיד וזרימה מנוטרת עם עלייה ביודיד extraliposomal לאורך זמן באמצעות microelectrode רגיש יודיד 24. בזרימת של תוצאות יודיד טעונות שלילי בירידה באות mV (האות הופכת שלילית יותר). כאשר הריכוז של יודיד שוחרר לאורך הזמן הוא להתוות, המדרון הוא הפוך (כמו באיור 3) להראות עלייה ביודיד באקספתרונן פנימי לאורך זמן.

K-Glu נבחר כcounterion impermeant כפי שהוא דוגמא אחת של אניון שאינו עובר דרך חלבון CFTR, אינו מופיע כדי לגרום לחסימה משמעותית של נקבובית בתנאי שימוש, ואינו גורם להפרעות בסלקטיבית יודיד אלקטרודה. Assay יכול להיות מותאם סביב אניון אחר, ובלבד שהוא עומד בקריטריונים אלה. שבעים וחמישה ריכוזי אניון מ"מ נבחרו באופן אמפירי כריכוזים שנתנו לכידה טובה ואותות מספיק למדידה בassay בתנאים שתוארו. יהיה למעשה אין שחרור יודיד מיפוזומים טעון יודיד חסרי CFTR מחדש תפקודי עד השלפוחית ​​permeabilized עם חומר ניקוי (איור 3; עקבות שליטה), ואילו CFTR מחדש-, proteoliposomes טעון יודיד לתווך יודיד לשחרר לפתרון החיצוני לאחר תוספת של MgATP (1 מ"מ) כדי לפתוח את ערוץ CFTR וvalinomycin(20 ננומטר) כדי למנוע ההתפתחות של פוטנציאל הממברנה (איור 3 א; לראות עקבות לחלבון: יחס שומנים המוני של 1: 3000 (w / w)).

Valinomycin הוא ionophore שהסעות אשלגן במיוחד על פני הקרום, במורד מפל הריכוזים שלה ואת הריכוז של 20 ננומטר נבחר באופן אמפירי כריכוז הגבוה ביותר שלא להפריע שלמות liposome הריק במערכת הנוכחית. זה עשוי צריך להיות מותאם למערכת מסוימת כל אחד. ללא תוספת של valinomycin, יש שחרור יודיד מקוצר של כמה ננומטר שמגיעים לרמה מהירות (מידע לא מוצג). למרות שידועים בתנאים אלה כדי להפעיל אחרת מקסימאלי פעילות ערוץ אניון של CFTR (כמו באיור 3 א), נראה כי חוסר תגובה משמעותית משקף עלייה מיידית במטען חיובי intraliposomal מתווכת על ידי ההולכה יודיד הדרך הנקבובית סלקטיבית אניון של CFTR , Continu הגבלה מיידזרימת יודיד יחידות ארגונית בי valinomycin אינו כלולה. תגובה בתיווך valinomycin זו מאשרת שזרימת יודיד הייתה מוגבלת בניסויים הקודמים בגלל הצטברות מטען, תמיכה בסלקטיביות אניון של CFTR מחדש. אם CFTR חסר סלקטיביות זו, שניהם אשלגן יודיד והיה מסוגל זרימה מproteoliposomes כך יבטל את הצורך בvalinomycin ליזום שטף.

ריכוזי יודיד נמדדו בנקודות זמן אלה ראשוניים היו אמפירי בחרו ליפול בטווח הרגישות האופטימלי לאלקטרודה חישת יודיד המועסק. שימוש באלקטרודות יודיד אחרים עשויות לדרוש אופטימיזציה של גורמים אלה. לאחר שהגיע לרמה, Triton X-100 מתווסף permeabilize proteoliposomes ולשחרר את כל יודיד לכודים שנותר. בניגוד למדידות הראשוניות יודיד (שהושגו בין 1 ל -2 דקות אחרי תוספת valinomycin), הקריאה בנקודתי קצה אלה אינן בטווח ליניארי של קאלי אלקטרודהעקומת bration (מידע לא מוצג), ובכך מונעת הערכה מדויקת של כל החלק של יפוזומים שממנו החלבון CFTR מסוגל תיווך יודיד זרימה ביחס למספר הכולל של יפוזומים בassay, או הכינון מחדש הפונקציונלי אחוזים.

שיעור שטף יודיד משקף את מספר מולקולות חלבון CFTR, הסתברות הפתוחה ומוליכות אחידים של כל ערוץ CFTR. לפיכך, שיעורי זרימת יודיד צריכים להיות תלויים במספר ובהסתברות הפתוחה של כל מולקולת CFTR. התחזית נבדקה במערכת זו על ידי הגדלת מספר מולקולות CFTR ליפוזום. יחס חלבון CFTR מופעל (פוספורילציה וMgATP טופל) לשומנים בדם של היה מגוון, עם היחסים הנעים בין 1: 300-1: 3000 (w / w) (איור 3 א). גדל ההיקף של CFTR מחדש נוכח בproteoliposomes, גדל שיעור הזרימה (נמדד בין 1-2 דקות לאחר valinomycin בנוסף), התומך בt התחזיתשיעורי זרימת כובע תלויים במספר מולקולות CFTR בכל liposome. השיעור בזרימת שהושג באמצעות חלבון מסוים: יחסי שומנים ולייצר בין ימים הניסיוניים וpurifications חלבון, ובכך מדגיש את ההקפדה של שיטה זו.

שיעור בזרימת יודיד מופיע להתייחס להסתברות הפתוחה של ערוץ CFTR במערכת מחדש זה. כזירחון על ידי PKA נדרש להפעלת CFTR 31 (ובדיקה על ידי 32), הוא צפוי שלא יהיה שיעור נמוך של זרימת יודיד בשלפוחית ​​המכילה CFTR שלא phosphorylated על ידי טיפול PKA אקסוגניים, שבו ההסתברות הפתוחה היא נמוכה . בproteoliposomes שטופל PKA, ההסתברות הפתוחה תהיה הרבה יותר גבוהה, וכתוצאה מכך שיעור צפוי הרבה יותר גדול של זרימה. בפועל, שלטופל PKA CFTR בנוכחות 1 מ"מ MgATP במערכת זו, שיעור זרימת יודיד נמדד מאחד לשתי דקות לאחר תוספת של valinomycבהוא כ פי ארבעה השיעור של חלבון CFTR נתון MgATP אבל לא PKA (איור 3). ממצאים אלה תומכים בהשערה כי שיעור הזרימה מתייחס לערוץ הסתברות פתוחה. בפועל זה עלול להיות קשה כדי להשוות פעילות בassay זה ישירות כדי לפתוח הסתברות נתונה כי גורמים אחרים, כגון שינויים תלויים זמן בכוח המניע אלקטרוכימיים ישפיעו על הפעילות בזרימת הנצפית. הקורא הזהיר כי assay זה אינו מהווה תחליף להקלטות פעילות ערוץ אחד מפורטות.

מעניין, יש הוא ציין בדרך כלל שיעור נמוך של זרימת יודיד על ידי חלבון "unphosphorylated" בנוכחות MgATP שהוא גדול באופן משמעותי מזרימה מיפוזומים חסרי CFTR (איור 3 ב, ג). שיעור נמוך זה עשוי לשקף זירחון בסיס של CFTR בf S מערכת ביטוי 9 תא לפני טיהור 33. CFTR מטוהר מתוכנה לביטוי אחרתms יכול להיות רמות שונות של זירחון הבסיסי ופעילות שיורית שונה לכן.

תשואות זה מהיר פרוטוקול טיהור WT-CFTR מf S 9 תאים בהומוגניות קרובה, אולם לF508del- וG551D-CFTR, השיטה טובה יותר כפי שתוארו הליך העשרה. כמה להקות מזהמות הם נצפו באמצעות SDS-PAGE 19, שרבים מהם משקפים מוצרים פגומים CFTR שמגיבים לנוגדני CFTR ומופיעים להיות נוכח לפני ההפרעה תא. שיטות הכינון מחדש ושטף יודיד מתאימות לדגימות מועשרים אלה של מוטציות רלוונטיות מבחינה קלינית. כפי שניתן לראות באיור 3D, זרימת יודיד משמעותית נמדדת בשני F508del- (חלבון: שומנים יחס המוני של כ 1: 600) וG551D-CFTR (חלבון: יחס שומנים של כ 1: 300). בעוד שני מוטציות פעילות מוחלטת נמוך מWT-CFTR (חלבון: יחס בין מסת שומן של 1: 1200), שקשה להשוות את הדגימות באופן ישיר כquantitationלא יכול להיות מדויק כמו למוטציות שהם מזוהמים עם מוצרים פגומים CFTR. עם זאת הן F508del-CFTR וG551D מטוהרים על ידי שיטות אלה, מחדש ונתונים למדידות זרימה להגיב כצפויות potentiators מולקולה הקטנה (איור 4), ולהראות פונקצית ערוץ דומה לחלבון מטוהר בשיטת טיהור PFO הקפדני יותר 19.

פעילות הערוץ של CFTR המטוהר ומחדש יכולה להיות מווסתת על ידי מעכבי מולקולה קטנים וpotentiators

CFTR Inh -172 34 הוא מעכב CFTR הספציפי ביותר זמין שהוכח לעכב את ההסתברות הפתוחה של ערוצי כלוריד CFTR במדידות מוליכות ערוץ אחד 35 ולעכב פעילות CFTR במחקרים אחרים 22,36. כפי שניתן לראות באיור 3 ג, שיעור הזרימה לאחר valinomycin בנוסף מצטמצם משמעותי על ידי טיפול מקדים בInh CFTR UB> -172. לפיכך, assay זה של פעילות הערוץ של אוכלוסייה של מולקולות CFTR מטוהרים ומחדש הוא יעיל בפעילות דיווח של מאפננים כגון CFTR יגנד המעכב Inh -172.

Assay הוא רגיש וישים ביותר לבחינת ההשפעות של טיפול potentiator המולקולה קטן גם כן. כפי שניתן לראות באיור 4, כל שלושת גנוטיפים CFTR נבדקו הם potentiated באופן משמעותי על ידי potentiators מולקולה הקטנה הפעיל כגון Kalydeco / VX-770 או VRT-532 (איור 4C; מוצגים לG551D), בעוד אנלוגי לא פעיל אין כל השפעה על זרימת יודיד פעילות של CFTR (מוצג לF508del-CFTR; איור 4). Assay ישים לבדיקה של תלות ריכוז potentiator, ותפקידה של ATP וזירחון על פעילות CFTR בתיווך potentiator.

"= רוחב" 700px 27fig1highres.jpg "/>
איור 1: זרימת עבודה עיצוב ועבודת Assay (A) לעבודה המתוארת בפרסום זה ייצוג סכמטי של הניסוי בזרימת יודיד (B)... גרסה שונה של לוח ב 'פורסמה במקור בכתב עת Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; ודוב, CE סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות רגולטור (CFTR) Potentiator VX-770 (Ivacaftor) פותח את ערוץ השער פגום של Mutant CFTR באופן זירחון תלוי אך ATP-עצמאי. 2012; 287: 36,639-36,649. © האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית.

איור 2
איור 2:. חלבון כסף WT-CFTR תשואות הליך טיהור מהירה CFTR המטוהרים מוכתם ג'ל SDS-PAGE ומערבכתם ארן באמצעות נוגדן M3A7 CFTR לחלבון מטוהר אדם WT-CFTR בחומר ניקוי DDM (1 מיקרוגרם ו -0.1 מיקרוגרם לג'ל והכתם, בהתאמה), 9 תאים מבודדים מf S 10 -tagged גרסה של (שלו) להביע מעל החלבון. WT-CFTR (> 90% טהורים) הוא זוהה על 150 kDa, מתאים לחלבון זה חסר glycosylation המורכבת. מחקר זה פורסם במקור בכתב עת Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; ודוב, CE סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות רגולטור (CFTR) Potentiator VX-770 (Ivacaftor) פותח את ערוץ השער פגום של Mutant CFTR באופן זירחון תלוי אך ATP-עצמאי. 2012; 287: 36,639-36,649. © האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית.

איור 3
איור 3: iדיווחי assay זרימת odide מוסדרים פעילות ערוץ לחלבון CFTR המטוהר ומחדש. () WT-CFTR מזוקק וphosphorylated מחדש בחלבון: יחסי שומנים של 1: 300 (w / w), 1: 1,200 (w / w) ו -1: 3000 (w / w) מתווך בזרימת יודיד מלומן השלפוחית ​​ל האמבטיה בתפזורת לאורך זמן לאחר תוספת של 1 מ"מ MgATP ו -20 ננומטר valinomycin. התוספת של 0.1% (w / v) טריטון X-100 לpermeabilize משחרר proteoliposomes לכוד יודיד בלומן השלפוחית ​​בסוף הניסוי. כמובן ראשוני יודיד בזרימת זמן לחלבון CFTR WT-מחדש (ב) שלא הייתה . (ג) שיעורי זרימה מראש phosphorylated ראשוניים יודיד להדגים את התלות של הפעילות שנצפתה בחלבון CFTR פונקציונלי. זירחון PKA של החלבון דרוש לפעילות ערוץ משמעותית, המעוכבת על ידי התוספת של מעכב CFTR, CTTR Inh -172 (20 מיקרומטר). הנתונים הם ממוצעי ± SEM; * P <0.05, *** p <0.0001. גנוטיפים מרובים (D) לייצר אותות מוסדרים CFTR בassay זרימת יודיד, כוללים Wt-, F508del- וG551D-CFTR לעומת שליטה. הנתונים הם ממוצעי ± SEM; * P <0.05; *** P <0.0004 שליטה לעומת. מחקר זה (מנות של נתונים בלוחות, C ו- D) יצאה לאור במקור בכתב עת Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; ודוב, CE סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות רגולטור (CFTR) Potentiator VX-770 (Ivacaftor) פותח את ערוץ השער פגום של Mutant CFTR באופן זירחון תלוי אך ATP-עצמאי. 2012; 287: 36,639-36,649. © האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית.

איור 4
איור 4: הגברת זירחון תלוי של CFTR על ידי מולקולות קטנות יכולה להיחקר באמצעותמערכת הזרימה יודיד לWt-, F508del- וG551D-CFTR. (א) WT-CFTR הוא potentiated באופן משמעותי על ידי potentiator (מיקרומטר 10) VX-770, רק במדינה PKA-פוספורילציה. הנתונים הם ממוצעי ± SEM, * p <0.01 לעומת + PKA-VX-770. (ב) VX-770 (10 מיקרומטר) אך לא אנלוגי פעיל, V-09-1188 (10 מיקרומטר), מגביר את זרימת יודיד באופן משמעותי פעילות של F508del-CFTR פוספורילציה. הנתונים הם ממוצעי ± SEM, n = 3, *** p <0.001 לעומת -VX-770 שליטה. הגברה (ג) לG551D-CFTR על ידי 10 מיקרומטר VRT-532 או VX-770. הנתונים הם ממוצעי ± SEM, n = 5, ** p <0.001, *** p <0.0001 לעומת -VX-770 שליטה. מחקר זה (ac פנלים) פורסם במקור בכתב עת Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; ודוב, CE סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות רגולטור (CFTR) Potentiator VX-770 (Ivacaftor) פותח את ערוץ השער פגום של Mutant CFTR בזירחון תלוי אך ATP-עצמאי אופן. 2012; 287: 36,639-36,649. © האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית.

r> ight "> 7.4
חיץ שם תוכן pH התאם את ה- pH באמצעות
מאגר 1 2% Fos -choline 2% (w / v) חומר ניקוי -choline Fos 14 בimidazole 10 מ"מ, 25 מ"מ HEPES 7.4 Imidazole / HEPES
מאגר 2 10 מ"מ imidazole 10 imidazole מ"מ, 25 מ"מ HEPES (לא חומר ניקוי) 7.4 Imidazole / HEPES
מאגר 3 10 מ"מ + imidazole DDM 10 imidazole מ"מ, 25 מ"מ HEPES, dodecyl-β-D-maltoside 1 מ"מ 7.4 Imidazole / HEPES
מאגר 4 50 מ"מ + imidazole DDM 50 imidazole מ"מ, 25 מ"מ HEPES, dodecyl-β-D-maltoside 1 מ"מ 7.4 Imidazole / HEPES
מאגר 5 600 מ"מ imidazole + DDM 600 מ"מ imidazole, 25 מ"מ HEPES, dodecyl-β-D-maltoside 1 מ"מ 7.4 Imidazole / HEPES
מאגר 6 75 מ"מ KI + DDM 75 מ"מ KI, מגבי 20 מ"מ, 1 מ"מ dodecyl-β-D-maltoside 7.4 KOH
מאגר 7 75 מ"מ KI 75 מ"מ KI, 20 מ"מ מגבים 7.4 KOH
מאגר 8 25 מ"מ HEPES + DDM 25 מ"מ HEPES, 25 מ"מ NaCl, dodecyl-β-D-maltoside 1 מ"מ 7.4 HCl / NaOH
מאגר 9 75 מ"מ K-Glu 75 מ"מ K-גלוטמט, 20 מ"מ מגבים KOH / חומצה גלוטמית
מאגר 10 15 מ"מ KI 15 מ"מ KI, 20 מ"מ מגבים 7.4 KOH

טבלת 1: טבלה של חוצצים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יש כבר מספר מוגבל של פרוטוקולי טיהור לאורך מלא, בידוד CFTR פונקציונלי, ממגוון רחב של מערכות ביטוי יתר סלולריות. השיטה המתוארת כאן היא יתרון שכן היא מאפשרת טיהור מהירה של WT-CFTR או גבוהה העשרת F508del- וG551D-CFTR בכמויות מתונות שהיא מאוד פונקציונלי במבחנים כוללים ATPase ומדידות ישירות של פונקצית ערוץ, כוללים מדידות ערוץ אחד בbilayer מישוריים מערכות ואמצעים מוכחים של פונקצית ערוץ אוכלוסיית CFTR שרלוונטיים מאוד למחקר של מולקולות קטנות 19-21. שיטת הטיהור משתלבת פרוטוקול הכינון מחדש מהיר ויעיל, חלבון עם זאת מטוהר משיטות אחרות, ניתן מצמידים את פרוטוקול הכינון מחדש זה גם כן, ובלבד שחומר הניקוי לטיהור ניתן להסרה באופן דומה.

בניגוד לניסויי ערוץ אחד מסובכים ומדקדקים מEXCתיקוני קרום ised, השיטות שתוארו כאן לאפשר הערכה חזקה עדיין פשוטה של ​​פונקצית ערוץ CFTR, וייחודית מדד זה מדווח הפונקציה של אוכלוסייה גדולה יותר של ערוצי CFTR ולא אחד או כמה מולקולות. שלא כמו בשיטות הכוללות תיקוני קרום, שיטה זו מאפשרת הערכה ישירה של ההשפעות של מאפנני מולקולה קטנים בערוץ בהיעדר הקרוב או מלא של חלבונים הקשורים, בהתאם ליעילותו של תהליך הטיהור בשילוב.

צעדים קריטיים בפרוטוקול

למרות שיש כמה שלבים קריטיים בכינון מחדש פונקציונלי של CFTR לassay שטף אניון, כפי שמציין שצוין בפרוטוקול, אופטימיזציה של החלבון: יחס שומנים בכינון מחדש CFTR הוא מפתח. אופטימיזציה כאמור נדרש לכל גנוטיפ CFTR.

שינויים ופתרון בעיות של הטכניקה

מיל mV הבסיסponse לבדיקה משמשת כאן בassay זרימת יודיד עם דגימות מוכנות כפי שתואר הוא בדרך כלל -20 עד -50 mV. סטיות משמעותיות מהטווח הזה מציעות ייתכן שתהיינה בעיות עם המדגם. בדיקות אחרות הנמכרות על ידי יצרנים שונים עשויות להיות שונות מההנחיות הניתנות כאן. אם לא ניתן להשיג בסיס יציב, חומר ניקוי שיורית או חלבון פעיל, מפוגל, באיכות ירודה עשוי להיות permeabilizing שלפוחית ​​ליודיד.

כישלון לזהות שינוי משמעותי בשיעור של valinomycin זרימת יודיד תלויה מיפוזומים המכילים CFTR phosphorylated בנוכחות MgATP עשוי לשקף כמה בעיות, שכולן יש לחקור. נושאים אלה כוללים: איכות ירודה, CFTR מפוגל באופן חלקי או CFTR הטמא; ההסרה חלקית של חומר ניקוי בכינון מחדש; חלבון שאינו אופטימלי: יחס שומנים בproteoliposomes; או valinomycin מספיק הוסיף, טיוח פיזור תשלום חלקי.

Iמבחני בזרימת odide מציעים את הגמישות להשתמש חלבון CFTR מראש פוספורילציה (כפי שמתואר בפרוטוקול), או לCFTR phosphorylated במהלך assay. אם החלבון מחדש לא phosphorylated במהלך הליך הטיהור, המדגם ניתן phosphorylated במהלך ניסוי זרימת יודיד בשלב 3.2.7, על ידי תוספת של PKA עם MgATP. במקרה זה להבטיח כי הבסיס נרשם לפחות 5 דקות כדי להבטיח שהחלבון כבר phosphorylated מספיק על ידי אנזים PKA לפני מדידת פונקציה עם תוספת של valinomycin. תוצאות דומות מתקבלות על ידי שני שיטות.

במהלך הפרוטוקול, מולקולת המאפנן מותרת לקיים אינטראקציה עם חלבון CFTR במשך 5 דקות לפני המדידה של פעילות על ידי תוספת של MgATP ולאחר מכן Valinomycin. כמו רוב מאפנני CFTR מאוד lipophilic, זה עלול לקחת זמן בין בנוסף לעמותת האמבטיה ושיווי משקל עם חלבון CFTR. Assay לא יכול להמשיך ללא הבנוסף דואר של valinomycin, ולכן אין מידע הולכים לאיבוד על ידי ביצוע assay באופן זה. במצבים בהם המשתמש הוא לא מודאג כי ייתכן שיש זמן השהיה לפני האינטראקציה של המולקולה הקטנה עם החלבון, assay יכול להתבצע על ידי התוספת החריפה של מאפנן לאחר התוספת של valinomycin, ועדיין בשלב הראשוני של השיעור המדידה.

מגבלות של הטכניקה

כאמור, assay זה שטף proteoliposomal מבוסס של פעילות ערוץ מוסדרת על ידי אוכלוסייה של מולקולות CFTR באורך מלא מטוהרים ומחדש מספק שיטה ייחודית לחקירת ligands שישירות לשנות פעילות. עם זאת, השיטה היא מוגבלת בכך שהוא אינו מספק תובנה לגבי המנגנון שדרכו ligands לשנות את שיעור השטף דרך CFTR. באופן אידיאלי, assay proteoliposomal שטף של CFTR המטוהר ומחדש יש להשתמש בשילוב עם שפה מישורייםמחקרי bilayer id פעילות ערוץ אחד. שילוב זה יספק תובנה למצב של החלבון שקושר את ligands, כלומר הפתוח ו / או המדינה הסגורה.

משמעות ביחס לשיטות קיימות

אין כרגע חוסר שיטות להערכת האינטראקציה הישירה של מולקולות קטנות עם ערוץ CFTR לעומת מאפנני מולקולה קטנים הפועלים באינטראקציה עם עוד מרכיב תאי לשנות פעילות ערוץ, למשל בעקיפין, באמצעות ויסות או מסלול איתות או שיבוש של חלבונים חשובים אינטראקציות. שיטת זרימת יודיד מדגימה אינטראקציה ישירה עם החלבון של כל מולקולה קטנה המווסתת את פעילות הערוץ של CFTR. למרות אופן התפוקה הנמוך של המדידות, נותר ערך רב בשיטות הייחודיות אלה ללימוד האינטראקציה הישירה של CFTR עם potentiators מולקולה קטנה ומתקן. molecul קטן רבמאפנני דואר נמצאים בפיתוח על ידי שני קבוצות אקדמיות ותעשיית התרופות לטיפול בחולי CF קליני, כמו זה הדחף העיקרי של מחקר הנוכחי CF. זה צפוי כי השיטות שתוארו כאן יסייעו בפיתוח והאימות של מנגנון פעולה של המבטיח ביותר של מולקולות אלה.

יישומים עתידיים של הטכניקה

השיטות המועסקות כאן גם נוחות מאוד לאימוצו לחלבונים אחרים בעלי עניין. ואכן שינוי של השיטות שתוארו הועסק ללמוד שני פ חלבוני קרום aeruginosa מעורבים בתנועה של מצעי anionic על פני הקרום 26,27, מדגימים את השירות ואת הרב-גונית של שיטות אלה. השימוש בם במחקר של ערוצי אניון נוספים ומובילים צפוי בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מודים לעצתו של ד"ר Mohabir Ramjeesingh במהלך פיתוח של שיטות הטיהור שתוארו כאן. מחקרים אלה נתמכו על ידי מענקים תפעוליים לCEB מהמכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) וציסטיק פיברוזיס קנדה (CFC). PDWE נתמך בחלקו על ידי פרסים מלגה דרך CIHR וCFC. המחברים מודים מתן המתקן, potentiator ותרכובות מעכב מד"ר ר 'גשרים (אוניברסיטת רוזלינד של רפואה ומדע) והפצה על ידי Therapeutics האיגוד סיסטיק פיברוזיס (CFFT). המחברים גם להכיר בשירות יוצא מן הכלל על ידי המתקן ביילור תרבית תאים (CA125123 P30 מענק NIH) בביטוי WT וחלבון CFTR מוטציה שימוש במערכת baculovirus. אנלוגי VX-770 לא פעיל, V-09-1188, היה מתנה של תרופות ורטקס.

Acknowledgments

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fos-choline 14 detergent Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) F312 Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche (www.roche-applied-science.com) 04 693 132 001 EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack  Roche (www.roche-applied-science.com) 05 892 791 001
Ni-NTA Agarose Qaigen GmbH 1018240
Fisherbrand Screening columns Fisher Healthcare 11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K Millipore (www.millipore.com) UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840051C
POPC Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 850457C
PS, Porcine Brain Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840032C CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 841118C
Ergosterol Sigma (www.sigmaaldrich.com) 45480
Pierce Detergent removal spin column Thermo Scientific 87779 1 ml capacity columns
valinomycin Sigma (www.sigmaaldrich.com) V-0627
VX-770 (ivacaftor) Selleck Chemicals S1144
iodide selective microelectrode Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) LIS-146ICM  
 
 
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
Clampex 8.1 software Axon Instruments (www.axon.com) we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System  Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) LIS-146LICM-XS Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars Big Science Inc (www.stirbars.com) SBM-0502-CMB choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine GE Health Care (www.gelifesciences.com) 17-0042-01
Sonicator Laboratory Supplies Co, Inc. G112SP1G Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50, (1), 233-248 (2011).
  2. Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68, (4), 809-818 (1992).
  3. Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
  4. Genetic Analysis Consortium. http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
  5. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245, (4922), 1073-1080 (1989).
  6. Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2, (8), 1253-1261 (1993).
  7. Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148, (1-2), 164-274 (2012).
  8. Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148, (1-2), 150-163 (2012).
  9. Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419, (1-2), 41-60 (2012).
  10. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365, (18), 1663-1672 (2011).
  11. Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270, (28), 17033-17043 (1995).
  12. Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
  13. Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267, (36), 26142-26149 (1992).
  14. Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4, (2), 95-100 (1993).
  15. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327, (1), 17-21 (1997).
  16. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, (37), 39051-39057 (2004).
  17. Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
  18. Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
  19. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, (44), 36639-36649 (2012).
  20. Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54, (24), 8693-8701 (2011).
  21. Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21, (5), 666-678 (2014).
  22. Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78, (3), 411-418 (2010).
  23. Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8, (2), 153-171 (2009).
  24. Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418, (1), 185-190 (2009).
  25. Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3, (2), 119-121 (2004).
  26. Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (32), 13083-13088 (2011).
  27. Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4, (5), e00678-e00613 (2013).
  28. Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. Academic Press. 337-357 (2010).
  29. Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75, (6), 1430-1438 (2009).
  30. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387, (5), 1055-1060 (2009).
  31. Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268, (15), 11304-11311 (1993).
  32. Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
  33. Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271, (45), 28463-28468 (1996).
  34. Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110, (11), 1651-1658 (2002).
  35. Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136, (6), 659-671 (2010).
  36. Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89, (4), 417-425 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics