纯化野生型和突变CFTR蛋白的功能重建和通道活性测定

Biology

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Summary

这里描述的是一种快速,有效的方法为纯化的野生型和突变型CFTR蛋白的功能性重组,可以保留活动而此氯离子通道,这是有缺陷的囊性纤维化。从由CFTR介导的重组蛋白脂质体碘流出允许通道活性的研究和小分子的影响。

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Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).

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Abstract

囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)是ATP的一个独特的通道形成构件结合转运盒(ABC)家族。 CFTR的磷酸化和核苷酸依赖的氯离子通道活性已经常研究整个细胞系统和单频道切除膜补丁。许多囊性纤维化致病突变已显示出改变该活动。而少数的纯化方案已经发表,即保留通道活性的快速重建的方法和一种合适的方法来研究人口通道活性的纯化的系统已缺乏。这里迅速的方法描述用于纯化和全长CFTR蛋白的功能重建成保留活性调节的卤化物信道定义的脂质组合物的蛋白脂质体。这个重构方法与通道活性的新颖的磁通为基础的检测一起是一个合适的系统,用于研究的野生型CFTR的人口信道特性和致病突变F508del-和G551D-CFTR。具体地,该方法在研究磷酸,核苷酸和小分子如上CFTR通道活性增强剂和抑制剂的直接影响实用。该方法也适合于其他的膜通道/转运对阴离子基底的研究。

Introduction

跨越上皮细胞在这样的组织如肺,肠,胰腺和汗腺的顶膜的氯离子转运主要由囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR),一个ATP-和磷酸化调节的部件的基础知识(A​​TP-介导的结合膜蛋白的录像带)C亚科(1回顾)。像ABCC亚科的其他成​​员,CFTR是一个大的,多生成树整合膜蛋白,其在形成在其核苷酸结合结构域(NBDS),在那里它具有适度的ATP酶活性,在一个单一的接口两个核苷酸结合位点结合的ATP站点。然而,与其他ABCC亚家族成员,CFTR已演变为一种独特的监管氯通道而不是作为一个活跃的溶质转运。

CFTR突变导致囊性纤维化,这种疾病影响多个器官包括肺,胃肠道,胰腺和生殖道,导致morbidity和死亡率在青壮年。肺部疾病通常占在囊性纤维化早期死亡率和在大多数情况下是由CFTR功能上的传导气道表面上皮的损失。 CFTR氯离子通道活性的缺乏导致在两个氯的减少-横跨表面上皮和水的运动来修改流体层上的纤毛呼吸上皮的顶端表面。这导致粘稠的气道表面液体,可以削弱纤毛呼吸道上皮细胞的能力,以有效地清除病原体从气道。其结果是,大部分的CF患者患有肺部感染和肺损伤引起炎症的反复发作。

正如预期的那样,正常的CFTR蛋白的作用机制研究主要集中在其通道门控活动的详细的电生理研究。单信道研究表明直接说CFTR用作PKA依赖性Cl-它拥有一个ATP调节的2号门通道。详细的电生理学研究提供了大量的关于单个CFTR通道1,3的信息,但是可能有关心是否已被研究的任何特定单个信道的特性是反射性CFTR通道的全部人口,因此单信道的结果应始终与方法来研究宏观的人口考虑沿。纯化CFTR的人口通道活性的直接检测有可能提供洞察与致病突变相关的分子缺陷,并带动化工发现其调制器修复突变CFTR蛋白。迄今为止,有超过在CFTR 1900不同的突变被认为造成囊性纤维化4。主要的突变,F508del-CFTR,发现至少一个等位基因的患者,在北美和欧洲的约90%会导致蛋白质错误折叠一第二保留于内质网5。 F508del-CFTR也有其他后果,包括有缺陷的通道活性6-9。从细胞表面所得到的不存在的CFTR的与严重的疾病有关。 G551D-CFTR,一个不太常见的突变,被认为是正确折叠但是不正常如在细胞表面6一氯离子通道。小分子校正和增效剂的发展具有校正的折叠和/或贩卖的突变体,如F508del-CFTR到细胞表面的,和增效或增加突变的通道活性如G551D在细胞表面上存在时,目标分别。而校正的VX-809和VX-661(尚未批准使用的患者,所述增效剂Kalydeco(ivacaftor; VX-770)正在使用,在150毫克每12小时在CF患者> 6年与至少一个G551D -CFTR突变,以及最近的患者G178R,S549N,S549R,G551S,G1244E,S1251N,S1255P之一和G1349D。 Kalydeco是既安全又导致改善的疾病的CF 10的临床措施,这种小分子的作用却是知之甚少在FDA批准用于在患者使用时的机制。

少数CFTR纯化方法先前已被描述2,11-18,其中许多需要相当长的时间才能完成。在最近的出版物19,一个独特的快速纯化和重组方法被用于过度表达的CFTR中的S F 9细胞表达系统描述的,并且在所定义的脂质系统本纯化的蛋白被用来建立一个CFTR卤化物通道活性测定为CFTR的人口分子。该测定概括的磷酸,核苷酸和抑制剂对CFTR功能的已知作用。该系统被用来询问增强剂的效果的VX-770 / Kalydeco上重量(野生型),F508del-和G551D-CFTR和它表明用于第一时间,该药物直接交互的CFTR蛋白,以使可能在一个ATP无关的方式其信道活动,从总体角度来证明这些方法的实用性和适用性CFTR与核苷酸和小分子的突变体的相互作用的研究回答关于蛋白质临床相关的问题。该方法也被用来研究其它增强剂分子和它们的衍生物20中 ,以及对蛋白质21的活性的小分子校正的效果。

流出测定法已被用于在许多研究中预先调查的CFTR突变体的活性和CFTR-调节化合物在其活性的影响,包括使用的电极,放射性示踪剂和荧光团22,23的全细胞测定法,膜囊,用离子选择性电极24和纯化重组CFTR与放射性示踪剂25。然而THE使用的离子选择性电极,研究纯化重组CFTR首次最近19日报道。当前方法的改编已用于重建和绿脓杆菌 ,一个共同的CF病原体2的膜蛋白的功能特性。加之碘化流出测量纯化ALGE外膜蛋白的重组被用来通过此传送机构26,以支持一个模型阴离子藻分泌。重构和碘化流出测量施加到纯化WZX蛋白,其允许被提出了一个模型,通过该蛋白27表明一个H +依赖性反向转运机制为跨细菌内膜的脂质连接寡糖的易位。在这两种情况下,碘化用作替代物的阴离子基底,尽管在较低的吞吐量比人们所预料要天然底物。该方法可以适用于适应其它蛋白质与Cationic运输或传导途径阴离子基底。

这里一个快速纯化过程被描述为CFTR蛋白和其重组到所定义的脂质脂蛋白体。迅速重建过程可以很容易地定制用于与CFTR通过其他方法纯化的使用,其前提是在纯化中使用的洗涤剂的种类是适合于除去由这里所使用的方法,也可以用于重建过程之前合适的去污剂交换。碘化物流出方法纯化和重组CFTR蛋白的通道活性的测定进行详细说明,并可以从该方法得到的一些典型结果。

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Protocol

1.净化CFTR的

注意:请参见表材料和设备的设备和材料在这个协议中使用的列表。存在重量的人,CFTR的过度表达和突变体在S F 9杆状病毒表达系统17,28的详细协议。过度CFTR并准备了S F 9细胞根据此协议的颗粒。

  1. 粗膜制备
    1. 获取新的或从500毫升培养细胞过表达wildtype-,F508del-或G551D-CFTR蛋白的C末端His 10 -tag的解冻冷冻S F 9细胞沉淀,用标准的细胞培养方法进行培养,如前面描述的17,28。细胞小球将具有体积的约5 ml和大约5克湿重。
    2. 重悬S F 9细胞在20ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4的具有蛋白酶抑制剂混合物(1片每50毫升)中,在4℃下,确保了样品显示出目视均匀的并且没有团块的细胞的存在。
    3. 使用高压细胞破碎(表材料和设备的),对于每通道2分钟达到最小10,000磅(优选15,000-20,000 psi)的裂解细胞。保持样品在4℃裂解过程中。
      1. 收集在裂解期间之后冰管中的样品,然后立即重新加载在细胞破碎样品。重复裂解过程3次。在显微镜下检查,以确保不超过10%保持不变。
        注:其他的方法来裂解细胞,如玻璃珠等没有被严格地检查该系统中,然而,用户可能会发现这样的替代方法合适。
    4. 在4℃离心细胞裂解材料在高速离心机在2000×g离心20分钟。收集上清和处置的颗粒。划分上清液中20管和离心样品1小时,在4℃以125000×g离心以表格顶部ultracentrifuge。
    5. 取出并弃去上清液,小心不要打扰颗粒,并在同一管店颗粒在-80℃下不到2个月,直至使用,或保留在冰上继续立即与净化。
  2. CFTR溶
    1. 获得1-4新鲜或冷冻S F 9粗膜颗粒和在1ml的缓冲液1的悬浮每个(2%FOS -choline; 见表1为完整配方)在4℃下在冰上,使用将25g针头和1毫升注射器,直到该溶液均匀肉眼不可见的细胞膜团块。其中,一个以上的小球被溶解,继续在平行于对待每说明书各样品为单个丸下面,汇集的样品在步骤1.3.2。
    2. 溶解1小蛋白酶抑制剂片剂在1ml缓冲液2中(10mM咪唑; 见表1)它缺乏fos的 -choline 14洗涤剂(蛋白酶抑制剂是10倍以上concent额定比在这一点上他们推荐的稀释),并添加100微升的悬浮粗膜颗粒(蛋白酶抑制剂是他们推荐的稀释在这一点)。与由倒置混合5次,每次5分钟,置冰上45-60分钟。
    3. 离心机以125000×g离心,4℃悬浮粗膜沉淀在台式超速离心机25分钟。保留上清液,其含有溶解的CFTR弃沉淀。
  3. 列绑定,磷酸化和洗脱
    1. 洗400μl的镍NTA(次氮基三乙酸)琼脂糖浆或等效树脂用1毫升缓冲液2中(10 mM咪唑; 见表1)它缺乏洗涤剂,以除去溶剂和缓冲液,在4℃。重复洗两次。
    2. 结合溶解的CFTR,其余的蛋白酶抑制剂(900微升)和镍树脂(400微升浆料)至总体积为10ml的缓冲液2(10mM咪唑; 见表1)瓦特HICH没有任何添加的洗涤剂。 (重量/体积)在此步骤中,FOS -choline 14浓度被有效地稀释到0.2%。如果有多个管,汇集所有样品含溶解的CFTR,蛋白酶抑制剂,镍NTA树脂和0.2%(重量/体积)FOS -choline-14在这一点上。孵育在4℃下60分钟,轻轻摇动。
    3. 通过CFTR的蛋白酶抑制剂-镍NTA溶液向下一个小的筛选柱( 表1)或等效的空柱。
    4. 洗镍NTA树脂,其被保留在柱中,用缓冲液每3的初始沉淀4毫升(10mM咪唑+ DDM; 见表1)它缺乏fos的 -choline 14,但含有1mM的DDM(十二烷基麦芽糖苷清洁剂),在4℃下。此外DDM洗涤剂不显著改变这种缓冲液的pH。
    5. 制备PKA-MgATP溶液中加入25微升(5毫米,最终浓度)MgATP的,2500的cAMP依赖性蛋白激酶A,催化亚基U(PKA),以475微升的缓冲液3(10mM咪唑+ DDM; 见表1)到柱上。通过密封用盖或封口膜柱的底端,并加入500微升PKA-MgATP溶液为每个使用的初始沉淀磷酸蛋白。
    6. 在室温下孵育(20℃)下进行20分钟,温和混合,并使用1毫升吸移管,每2分钟的树脂的再悬浮,以确保PKA已经与镍NTA树脂的整个表面接触。
    7. 取下盖和从柱上洗脱的PKA / MgATP溶液。用2ml缓冲液3中洗涤柱(10mM咪唑+ DDM; 见表1),在4℃。
    8. 乘用在实验中通过4.洗涤所述柱,用毫升缓冲液4的这个数目颗粒的数目(50mM咪唑+ DDM; 见表1),在4℃,通过加入4毫升缓冲液的柱,使它流经并立即加入在接下来的4毫升一份到柱上。
    9. 见表1)以每通过该柱用1毫升的时间初始沉淀4℃没有暂停,以允许柱干燥,和收集含纯化,CFTR在单管整个洗脱液。
    10. 浓缩蛋白样品用离心机过滤装置(100,000分子量截止),如在表材料和设备或其它类似设备的描述以去除咪唑和低分子量的降解产物,在总共为10ml缓冲液6(75毫KI + DDM; 见表1)或含有1mM DDM选择的其他缓冲液(如缓冲器7,用于非碘化流出试验中,25毫米的HEPES + DDM; 见表1),通过离心,在2000×g离心和4℃下进行约20分钟,直到样品浓缩至200微升。稀释样品至10ml并重复浓缩步骤。
      注:根据我们的经验(未发表),咪唑显著INHI位的CFTR的ATP酶活性,并应在此步骤通过稀释和浓度的至少两倍去除如果样品将用于功能性的测量。
    11. 收集集中净化CFTR。保持在4℃下在DDM缓冲液存在,直到使用在1-2天内或立即继续到重构步骤。不要冷冻纯化的蛋白质,在我们的经验,我们观察到减少活动。

2.重组CFTR的

  1. 脂质准备
    注:CFTR已成功重组到蛋的PC,POPC,2:1(重量/重量)鸡蛋PC:POPC(1:1 W / W)混合物,或PE的混合物:PS:PC:麦角甾醇,5:2 :2:1(W / W)。
    1. 对于碘化流出实验,干燥5毫克蛋的PC(200微升25毫克/毫升的库存,参见表材料和设备的)在氩气气流,在室温下20分钟,在一个派热克斯玻璃或其他坚固的(非硼硅)玻璃管中​​。
    2. 使用280nm处的吸光度,将ELISA一个SSAY或其他方法,估计纯化的CFTR蛋白样品的浓度。对于碘化流出实验的野生型CFTR的,可以使用的蛋白质的1脂质比:300-1:3000(W / W),以产生一个足够的信号。对于G551D-和F508del-CFTR,使用蛋白质:200-1:约1脂质比1200(W / W),以检测流出活性。
    3. 优化蛋白质:脂质的比例为每一个特定的系统。计算所需的纯化的蛋白的体积。计算缓冲器用1mM DDM体积,使1毫升, 1 ml的终体积所需- =缓冲液体积(所需蛋白质溶液体积)。
      1. 用1mM DDM添加所需的缓冲系统的计算量,以干燥后的脂质(但不添加此时CFTR蛋白)和盖用Parafilm玻璃管。对于碘化流出实验,重悬在缓冲液6脂质(75毫KI + DDM; 见表1)。对于其他的实验中悬浮缓冲区8英寸(25毫米HEPES + DDM,请参阅表1)或含有1mM DDM另一个所需的内部缓冲器。
      2. 涡旋,在室温下2分钟,以帮助在悬浮液中的DDM缓冲器的脂质。或者,加热样品至37℃涡流前1-2分钟。
    4. 反复暂停所述脂质在室温下用1ml注射器和25g针,直到没有脂质膜是在管的两侧可见。避免将空气注入将产生细小气泡并有助于碘化物和脂质的氧化溶液中。
    5. 超声处理在封口膜悬浮脂质覆盖管,用于在含水浴超声冰一个20秒的突发,然后立即转移到冰上1分钟。重复3次。
      注:强烈的超声变成碘解决因氧化发黄。因此避免过度超声。监测样品的颜色变化。如果颜色变化指出,丢弃样品并再次准备。在颜色由于一些氧化所述变化碘化物将导致在相同条件下的脂质的氧化。取代从用氩气管中的空气进行超声处理的溶液中之前,将有助于防止脂质和碘的氧化。强烈超声处理可以打破质量差或导致样品损失划伤玻璃试管中。
    6. 添加在步骤2.1.3计算到超声处理脂质样品到一个纯化的CFTR的量达到1毫升的最终体积。通过再悬浮混合与脂质和洗涤剂溶液中的蛋白质的10倍与地下25针和1ml注射器。
    7. 在冰上30分钟,以管的旋流设置脂类和蛋白质样品混合5次,每次5分钟。
  2. 洗涤剂结合柱的准备
    1. 获得在单次使用商业洗涤剂结合旋转柱(见表材料和设备的)与1毫升体积容量并打破底部标签以启动柱流出。
    2. 离心2分钟列在2000×g离心以除去存储器Buffer,并丢弃该缓冲区。
    3. 加入5 ml缓冲液7(75mM的KI, 见表1)的柱中,然后离心200×g离心4分钟,以洗脱所述洗涤缓冲液。重复此步骤2次以上,总共3次洗涤,以除去所述存储缓冲器的所有痕迹。丢弃所有流量通过。
      注意:用于洗涤塔的缓冲区不包含DDM或任何其它的洗涤剂,这一点至关重要。列具有用于洗涤剂有限结合能力并且如果使用含有洗涤剂的缓冲液,该列将是无效的,在从蛋白质 - 类脂的洗涤剂样品中除去洗涤剂。
    4. 仔细分装所有将1ml脂质洗涤剂蛋白样品上柱树脂的顶部和孵育样品在塔的顶部,在室温下2分钟。
    5. 离心样品,在室温下搅拌4分钟,在2000×g离心,并收集在一个干净的1.5或2 ml离心管混浊脂蛋白体样品或玻璃管,并放置在SAMPLE冰上。
    6. 通过加入200μl的缓冲液7(75mM的KI, 表1)或其他缓冲液(无去污剂)与塔的顶部收集在塔其余脂蛋白体,并重复离心步骤,持续2分钟。
    7. 添加第二洗脱液的脂蛋白体样品,如果它看起来浑浊。
    8. 存储所述样品在4℃下过夜或立即用于碘化物流出测量。

3.碘外排的测量纯化,冲调CFTR

  1. 整个proteoliposomal膜碘梯度代
    1. 预溶胀的Sephadex G50珠粒在缓冲液9(75mM的K-谷氨酸;谷氨酸钾, 见表1),(在50ml缓冲液约5克干燥的珠子),或所需的外部缓冲在室温下至少2小时或在4 °过夜。
    2. 准备在缓冲液9的饱和4的Sephadex G50柱(75毫米的K-谷氨酸, 见表1)或其他缓冲区小筛查列加载树脂至少¾全在列。
    3. 离心4分钟,在2000×g离心来从树脂去除多余的缓冲区。应该有大约2.25毫升在所述离心步骤的所述端部的柱填充水合树脂。
      注:树脂应该轻易的水分,但不能浸泡在液体和随后的简短旋不应洗脱显著体积的缓冲液中。这是对脂蛋白体样本列树脂既不是太湿也不能太干,用户可根据需要进行实验的列,以熟悉最成功的缓冲区交换条件成功洗脱关键。
    4. 小心在2000×g下125-150微升脂蛋白体的样品添加到每个柱和离心机的顶部为4分钟。
    5. 游泳池脂蛋白体洗脱液一起在碘外排或其他实验立即使用。
      注意:从每个柱洗脱的体积应大致150微升和样品应该有点浑浊,但比原来的样品少雪。较大体积或明确洗脱液表明列没有被充分干燥,或已被干燥的太多,分别和不会导致一个成功的碘化物流出实验。
  2. 碘外排法
    1. 洗碘化物选择性微电极(表材料和设备的)广泛地与去离子水,然后在实验缓冲液10之前孵育20分钟(15μMKI, 见表1)。用去离子水再广泛冲洗电极。
    2. 添加150微升的药物(20μM的典型浓度以产生10μM的在测定中的最终浓度)在缓冲液9(75mM的K-谷氨酸, 见表1)的96孔板的或车辆在缓冲液9到一个阱与小跳蚤搅拌棒。
      1. 确保没有泡沫存在。用枪头消除杂散气泡。如果正在使用的药液,保证在阱中的最终DMSO浓度为小于1%(体积/体积)(通常0.1-0.2%(体积/体积))。
    3. 添加150微升被制作在部分3.1的缓冲液9重构CFTR蛋白(75毫K -谷氨酸, 见表1)至很好地与药物或缓冲液中,以产生在所述板的孔中加入300微升的总体积。
    4. 放置在96孔板上的搅拌盘和搅拌在130转(或近似最大速度的四分之一在中速)。
    5. 插入碘化物选择性电极的尖端仔细地进入井与样品使得该尖端不接触孔的底部或被击中的搅拌棒。确保参考电极,如果分开,也与在孔中的溶液接触。
    6. 使用与电极接口自制或商业计算机程序的记录轨迹(见表材料和设备的详细信息)。通过低通滤波器使用2 Hz的采样率,与信号的滤波。
    7. 允许该样品平衡5分钟,以产生一个稳定的平面,或接近平面的基线录制时。
    8. 加入3微升MgATP(100毫制备的dh 2 O和调节至pH 7,用KOH的库存; 1mM的终浓度)与样品以激活蛋白。让〜5分钟,以达到一个新的稳定的基线。随时调整的100mM MgATP股票的pH至中性后再使用,以避免改变在外部缓冲液的pH。
    9. 加入3微升缬氨霉素存量(2μM; 20nM的终浓度)与样品分流的变化,通过CFTR由碘化物选择性电导产生的电势差。记录的下降斜率(减少以mV)由于CFTR介导的碘化流出活性为至少5分钟。
    10. 以确保碘化物在脂蛋白体腔的捕集充足,加10%的3微升(体积/体积)的Triton X-100的样品。 SignificanT和即时碘的释放表示有充足的碘已经被困在这样诱捕不是在3.2.9确定的变化斜率而是CFTR介导活动的限制因素的囊泡。
    11. 治疗用药物或用Triton X-100的样品后,用去离子水彻底清洗电极和搅拌棒,以确保这些试剂的所有痕迹已被删除,以避免下一个样品的污染。
    12. 制备一系列稀释的碘化钾浓度以微摩尔至纳摩尔范围的缓冲液9(K -谷氨酸缓冲液, 见表1)。记录电极的每个浓度的毫伏响应从0到制备的最高浓度。建立标准曲线,其中所述探测响应(毫伏)绘制对lo​​g摩尔碘化物浓度的。使用标准曲线来转换流出实验碘化物浓度释放期间探头的毫伏响应。
      注:准备校准CUR已经每周直到用户是肯定的速度有多快的探测器的变化的响应。会有在探针随时间的响应和灵敏度漂移。作为探针的年龄,响应会降低。这可通过周期性地改变内部溶液和探针尖端的水充分洗涤后使用,这有可能限制分子与探针表面的粘附部分地废止。
    13. 确定的浓度对时间曲线图用于加成MgATP的之前的最后30秒每脂蛋白体样品的直线的平均斜率,和加法缬氨霉素后但加成的Triton X-100的之前。减去基线斜率从缬氨霉素,以确定为该样本的CFTR介导的碘化物流出活性。

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Representative Results

描述这个写入出版物中一些方法来纯化,重建并测量CFTR蛋白的调节的通道活性。 图1A示出的工作流程的纯化,重组和碘化流出程序。方法用于重建和通道活性的测量通过碘化通量也列于进一步的细节,在相关联的视频。

净化CFTR和重建成脂蛋白

CFTR可以功能性以高水平表达于S F使用含有WT或突变体的CFTR基因2重组杆状病毒9细胞。而不是一个哺乳动物表达系统中,CFTR是使用杆状病毒系统在S F 9细胞,以确保表达的高水平表达。 CFTR产量可高达总细胞蛋白17,28的1%。的S F 9-杆状病毒系统具有的优点是该蛋白是糖基化的核心和在这个系统中的质量控制机械是相对宽松,使得CFTR和突变体可以在细胞表面上进行制造。这是十组氨酸标签被设计到羧基末端,使净化凭借这个标签的镍NTA的亲和力。 C-末端标签有助于防止共纯化截短的CFTR蛋白和产量官能CFTR蛋白在ATP酶,单信道和碘化流出实验17,19,24,28,29的。但是这里所描述的纯化方案应该适合N-末端标记的CFTR为好。

此前,它已显示CFTR蛋白可以有效地从使用NaPFO(钠pentadecafluoro辛酸)在室温下15 S F 9质膜制剂萃取。然而,NaPFO的易感性沉淀,在4℃的温度有利于保持正确折叠的蛋白质,并以除去PFO所需的冗长的透析是不适于说唱ID纯化和重组方法旨在最大限度地提高在CFTR功能的后续分析的蛋白质的活性。洗涤剂(包括十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM),3的面板的评价- [(3-胆酰胺丙基)二甲氨基] -1-丙烷(CHAPS), 果寡糖 -choline 12和fos的 -choline 14,表明fos的 -choline 14是最有效的从S F 9膜增人力的CFTR-他10中 ,并且DDM是有效地维持CFTR的ATP酶活性的洗涤剂溶液(数据未示出)。因此,一个fos的 -choline 14洗涤剂提取步骤被执行,随后交换DDM洗涤剂维持该蛋白质的活性。

(;银染图2)以下的纯化和浓缩,以DDM洗涤剂包含〜150 kDa的带为主要成分而获得的蛋白质级分。该分子量对应于表示S中<人类的CFTR青霉> F 9cells并通过SDS-PAGE,在那里它缺乏的CFTR在哺乳动物细胞中复杂的糖基化特征的类型进行分析。的150 kDa的物种似乎是大约90%的纯以下SDS-PAGE分析和银染色。使用M3A7抗CFTR抗体的Western印迹证实了该小鼠单克隆针对NBD2反应与150 kDa的条带( 图2;印迹)。在某些研究中,低分子量组分的痕量存在作为在凝胶上可见轻微的带,在〜60和〜80 kDa的(数据未示出)。在M3A7抗CFTR抗体与60和80 kDa的条带,但不与其他非CFTR蛋白反应(数据未示出)。这表明,在较低分子量组分的CFTR降解产物共同纯化通过其C-末端His标签与CFTR。净化工作是在蛋白酶抑制剂的存在下,看来,这些部件是存在于细胞中的纯化步骤之前我s执行。该过程的浓度步骤除去几乎所有的污染性低分子量的片段。 CFTR可以在此时被复原,或者从另一个纯化步骤蛋白可以在重建协议被使用。

的脂质体通量分析的基础报告和纯化重组CFTR分子群的功能重建的监管,阴离子选择性渠道

为了确定是否进行纯化,CFTR的显著比例使用上述方法重组为一个稳压氯通道,一个proteoliposomal卤化物通量测定法开发用于报告重构的CFTR分子( 图1B中示意性地示出)的人口的活性。如果,在最坏的情况下,多数重组CFTR分子被错误折叠,这些分子将不能赋予电导,失败的阳离子和阴离子之间进行区分和/或门就会缺乏监管PKA磷酸化和核苷酸。 Lee 等人发表的方法,使估计的膜蛋白30的百分之官能重构的。

通过凝胶过滤柱通过脂质体的空脂质体(缺乏CFTR)或蛋白脂质体(轴承重构CFTR)装载有碘化钾(75毫摩尔)和额外的脂质体碘交换谷氨酸钾(75毫摩尔)。碘化钾加载脂蛋白体被添加到一个孔含有的K-谷氨酸(谷氨酸钾)来创建一个向外梯度为碘和流出,使用碘化物敏感的微电极24监视作为增加extraliposomal碘随时间。的带负电的碘化物导致在毫伏信号减小流出(信号变得更负)。当碘的释放随时间的浓度作图,斜率反转( 如图3),以显示在所述前增加碘化ternal解决方案随着时间的推移。

的K-谷氨酸被选为透性抗衡离子,因为它是一种不通过CFTR蛋白的阴离子的一个实例中,不会出现造成使用的条件下的细孔的显著阻塞,且不会引起干扰碘化物选择性电极。的测定可以围绕另一个阴离子被优化,只要它符合这些标准。七十五个毫阴离子浓度选定为凭经验浓度,在所述的条件下测定,得到良好的捕集和足够的信号进行测量。会有基本上从碘化加载脂质体缺乏功能性重组的CFTR没有碘化物释放直至囊泡透用洗涤剂( 图3;控制迹线),而CFTR-重构,碘化物加载脂蛋白体介导的碘化物加入后释放到外部溶液MgATP(1毫米),打开通道CFTR和缬氨霉素(20纳米),以防止一个膜电位的发展( 图3A;见微量蛋白质:1脂质量比:3000(W / W))。

缬氨霉素是穿梭钾具体地说穿过膜,向下其浓度梯度为20纳米的浓度根据经验被选为其中未在本系统中扰动的空脂质体的完整性的最高浓度的离子载体。这可能需要针对每个特定系统进行优化。不加入缬氨霉素,有几纳米即很快达到平稳的缩写碘化物释放(数据未示出)。虽然这些条件是已知的,否则最大激活的CFTR的阴离子通道的活性(如在图3A),它似乎缺乏显著响应反映通过CFTR的阴离子选择孔隙由碘化传导介导的瞬时增加脂质体内正电荷,立即限制continuOU中碘外排,其中霉素不包括在内。此缬氨霉素介导的应答确认碘化流出物中由于电荷累积以前的实验的限制,支承重构CFTR的阴离子选择性。如果CFTR缺乏这种选择性,两者钾和碘化就已经能够从脂蛋白由此消除需要缬氨霉素发起通量外排。

在这些初始时间点测得的碘浓度凭经验选择落在最佳感光度范围所采用的碘传感电极中。使用其他碘化物电极可能需要对这些因素进行优化。达到平台后,加入Triton X-100加入到通透的脂蛋白体,并释放任何残留的陷入碘化物。不像初始碘化物测量(缬氨霉素加成后1至2分钟获得的),读数在这些端点不在电极卡利的线性范围bration曲线(数据未显示),从而排除了脂质体的级分从该CFTR蛋白能够介导的外排相对于脂质体在测定中的总数,或它的百分官能重构碘化物的准确评估。

碘化物熔剂的速率反映CFTR蛋白分子的数目,开放概率以及每个CFTR通道的单通道电导。因此,碘化流出的速率应该依赖于数目和每个分子的CFTR的开放概率。该预测是通过增加每个脂质体的CFTR的分子数在本系统中进行测试。活化(磷酸化和MgATP处理)CFTR蛋白与脂质的比例是变化的,具有范围为1的比例:300-1:3000(W / W)( 图3A)。重构的CFTR中存在的脂蛋白体量越大,流出的速率更高(1-2分钟之间测量缬氨霉素加成后),支持该预测吨帽子流出率是依赖于CFTR分子中的每个脂质体的数量。使用特定的蛋白质的流出率得到:类脂比是可重复的实验日和蛋白质纯化之间,从而突出了该方法的严谨性。

碘化流出的速度似乎涉及CFTR通道的开放概率在该重新构成的系统中。作为磷酸化的PKA需要CFTR活化31(和审查32),预计将有碘化流出的含有囊泡的CFTR低速率尚未磷酸外源性PKA的治疗,其中所述开放概率是低。在已处理PKA脂蛋白,开放概率会高得多,导致外排一个更大的预期速度。在实践中,在1mM的MgATP在该系统中存在对PKA处理的CFTR,碘化流出的速率从一个测量到两分钟加入valinomyc的后在大致4倍CFTR蛋白的速率经受MgATP但不是PKA( 图3B)。这些发现支持了流出率与通道开放概率的假设。在实践中可能难以在该测定中进行比较的活性直接打开鉴于其它因素,如在电化学驱动力依赖于时间的变化将影响所观察到的流出活性概率。读者警告说,这个实验是不能代替详细的单通道活动记录。

有趣的是,所观察到的典型的碘化流出的通过“未磷酸化的”蛋白以低速率在​​MgATP的存在是显著大于从脂质体缺乏的CFTR( 图3B,C)的外排。这种低利率可能反映CFTR的基础磷酸化之前的S F 9细胞表达系统净身33。 CFTR从其他的表达纯化SYSTEMS可以具有不同水平的基磷酸化并因此不同的残留活性。

这种快速纯化方案收率将Wt-CFTR的从S F 9细胞在接近同质性,但是对于F508del-和G551D-CFTR中,该方法是更好地描述为一个浓缩步骤。一些污染频带通过SDS-PAGE电泳19,其中有许多反映出是反应性的,以CFTR抗体和似乎是细胞破坏之前本CFTR的降解产物观察到。重构和碘化通量方法适合于临床相关突变这些富集的样品。 如图3D,显著碘化流出被测量为F508del-(蛋白:约1脂质量比:600)和G551D-CFTR(蛋白:约1脂质比:300)。虽然这两个突变体具有较低的绝对活性地比Wt-CFTR(蛋白质:1脂质量比:1,200),则难以直接比较样品作为定量不能准确对被污染的CFTR降解产物的突变体。但是既F508del-CFTR和G551D通过这些方法进行纯化,重组,并进行流出测量响应预期到小分子增效剂( 图4),并且显示出类似的信道的功能的蛋白的更严格的PFO纯化方法19纯化。

纯化的和重组的CFTR的通道活性可通过小分子抑制剂和增强剂进行调制

CFTR INH -172 34是最具体的CFTR抑制剂可用已显示出抑制的CFTR氯通道的单通道电导测量35的开放概率和抑制CFTR活性的其他研究22,36。 如图3C所示 ,流出缬氨霉素加成后的速率由预处理CFTR INH显著降低 UB> -172。因此,该测定纯化的和重组的CFTR分子群体的通道活性是有效的调节剂的报告活动,如抑制性配体的CFTR INH -172。

该法是敏感和高度适用于检查小分子增效剂治疗效果为好。 如图4,所有三种测试的CFTR基因型是由活性小分子增效剂显著增效如Kalydeco / VX-770或VRT-532( 图4C;示为G551D),而惰性类似物具有对碘化流出没有任何影响CFTR活性(示为F508del-CFTR的; 图4B)。该法适用于增效剂浓度依赖性的检查,ATP对增强剂介导CFTR活动中的作用和磷酸化。

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图1:试验的设计和工作流程(一)工作流程本出版物中所描述的工作(B)的碘外排实验示意图。 B组的修改版本最初发表于生物化学杂志。埃克福德,PDW;李,C; Ramjeesingh,男;和熊,CE囊性纤维化跨膜电导调节器(CFTR)增效剂VX-770(Ivacaftor)打开CFTR突变的缺陷通道门的磷酸化依赖,但ATP无关的方式。 2012; 287:36639-36649。 ©美国社会为生物化学与分子生物学。

图2
图2:在CFTR快速纯化过程的产量纯化重量-CFTR蛋白银染色的SDS-PAGE胶,西使用M3A7 CFTR抗体纯化的人重量-CFTR蛋白DDM洗涤剂(1微克和0.1微克的凝胶和印迹,分别),分离出S F 9细胞过表达(HIS)10 -tagged版ERN印迹的蛋白质。重量-CFTR的(> 90%纯)被检测到,在150 kDa的,适合于该蛋白缺乏复杂糖基化。这项研究最初发表于生物化学杂志。埃克福德,PDW;李,C; Ramjeesingh,男;和熊,CE囊性纤维化跨膜电导调节器(CFTR)增效剂VX-770(Ivacaftor)打开CFTR突变的缺陷通道门的磷酸化依赖,但ATP无关的方式。 2012; 287:36639-36649。 ©美国社会为生物化学与分子生物学。

图3
图3:我odide流出分析报告调节通道活性的纯化和重组CFTR蛋白。 (A)的纯化的和磷酸化将Wt-CFTR重构在蛋白质:脂质的比例为1:300(W / W),1:1200(W / W)和1:3000(w / w的)介导碘化流出从囊泡管腔散装浴随时间加入1mM MgATP并且20nm缬氨霉素后。加入0.1%(重量/体积)的Triton X-100透化,以在实验结束时捕获碘化物在囊泡管腔的蛋白脂质体释放。(B)的初始碘化物流出时间过程重构将Wt-CFTR蛋白尚未被预磷酸化。(℃)初始碘化物流出率表明所观察到的活动对功能CFTR蛋白的依赖。是必需的蛋白质的PKA磷酸为显著通道活性,这是通过加入CFTR抑制剂抑制,CTTR INH -172(20μM)。数据是平均值±SEM; * P <0.05,*** P <0.0001(D)多基因型产生的碘外排法规范的CFTR信号,包括重量,F508del-和G551D-CFTR与控制。数据是平均值±SEM; * P <0.05; *** P <0.0004与控制。这项研究(中板A,C和D的数据部分)最初发表于生物化学杂志。埃克福德,PDW;李,C; Ramjeesingh,男;和熊,CE囊性纤维化跨膜电导调节器(CFTR)增效剂VX-770(Ivacaftor)打开CFTR突变的缺陷通道门的磷酸化依赖,但ATP无关的方式。 2012; 287:36639-36649。 ©美国社会为生物化学与分子生物学。

图4
图4:CFTR的由小分子的磷酸化依赖性增强作用可以通过使用被询问碘外排系统的重量,F508del-和G551D-CFTR。 (一)将Wt-CFTR是显著由增效剂VX-770(10μM)增效,仅在PKA磷酸化状态。数据是平均值±SEM,* P <0.01相对于+ PKA-VX-770。(二)的VX-770(10μM),而不是一个无活性类似物,V-09-1188(10μM),显著会加强其碘化物流出磷酸化F508del-CFTR的活性。数据是平均值±SEM,n = 3时,*** P <0.001相对于-vx-770控制。G551D-CFTR(三)程增强由10μM的VRT-532或VX-770。数据是平均值±SEM,N = 5,** P <0.001,*** P <0.0001与-vx-770控制。这项研究(板AC)最初发表于生物化学杂志。埃克福德,PDW;李,C; Ramjeesingh,男;和熊,CE囊性纤维化跨膜电导调节器(CFTR)增效剂VX-770(Ivacaftor)打开CFTR突变的缺陷通道门的磷酸化依赖,但ATP-独立的方式。 2012; 287:36639-36649。 ©美国社会为生物化学与分子生物学。

R> 飞行“> 7.4
缓冲 名字 内容 pH值 通过调节pH
缓冲区1 2%FOS -choline 2%(重量/体积)FOS -choline 14洗涤剂在10mM咪唑,25mM的HEPES 7.4 咪唑/ HEPES
缓冲区2 10mM咪唑 10 mM咪唑,25毫米的HEPES(无洗涤剂) 7.4 咪唑/ HEPES
缓冲区3 10mM咪唑+ DDM 10mM咪唑,25mM的HEPES,1mM的十二烷基β-D-麦芽糖苷 7.4 咪唑/ HEPES
缓冲区4 50 mM咪唑+ DDM 50mM咪唑,25mM的HEPES,1mM的十二烷基β-D-麦芽糖苷 7.4 咪唑/ HEPES
缓冲区5 600 mM咪唑+ DDM 600 mM咪唑,25毫米的HEPES,1mM的十二烷基β-D-麦芽糖苷 7.4 咪唑/ HEPES
缓冲区6 75 mM的KI + DDM 75mM的碘化钾,20毫MOPS,1mM的十二烷基β-D-麦芽糖苷 7.4 KOH
缓冲区7 75 mM的KI 75mM的碘化钾,20毫MOPS 7.4 KOH
缓冲器8 25毫米的HEPES + DDM 25mM的HEPES,25mM的氯化钠,1mM的十二烷基β-D-麦芽糖苷 7.4 盐酸/氢氧化钠
缓冲区9 75毫米K-谷氨酸 75mM的K-谷氨酸,20mM的MOPS KOH /谷氨酸
缓冲区10 15 mM的KI 15mM的碘化钾,20毫MOPS 7.4 KOH

表1:表缓冲器。

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Discussion

已经出现了纯化流程为全长,功能性CFTR隔离数量有限,从各种细胞过表达系统。此处所描述的方法是有利的,因为它允许将Wt-CFTR或F508del-和G551D-CFTR的中等量的高富集的快速纯化即高功能的测定中,包括ATP酶和通道功能的直接测量,包括在平面双层单信道测量系统和人口CFTR通道功能表现的措施是高度相关的小分子19-21的研究。纯化方法被集成到一个快速有效的重建协议,从其他的方法但是纯化的蛋白质,可被耦合到该重建协议,以及,提供了纯化的洗涤剂是适合于去除类似。

而不是从EXC复杂而艰苦的单通道实验ISED膜补丁,这里所描述的方法允许的CFTR通道功能的强大且简单的评估,并唯一这一措施报告的CFTR通道,而不是一个或几个分子的一个较大的人口的功能。不同于涉及膜修补技术,这种方法允许在不久的或完全不存在相关的蛋白质,这取决于耦合纯化过程的有效性的信道上的小分子调节剂的影响,直接评估。

在协议中的关键步骤

虽然也有在CFTR的阴离子磁通测定功能重建几个关键步骤,因为该协议中表示票据,该蛋白质的优化:在CFTR重组脂质比是关键。这种优化需要对每个CFTR基因型。

该技术的改进和故障诊断

基准毫伏RESponse用于制备所述样品的碘外流测定期间这里使用的探针通常是-20至-50毫伏。在此范围内显著偏差表明可能有问题的样本。由不同制造商出售其他探头可能与这里提供的准则。如果稳定的基线不能达到,残留洗涤剂或不活动的,变性,质量差的蛋白质可被透化的囊泡为碘化物。

故障检测缬氨霉素从含有磷酸的CFTR中MgATP的存在下脂质体依赖性碘化流出可能反映若干问题,所有这些应调查的速率的显著变化。这些问题包括:质量差,部分变性CFTR或不纯的CFTR;重建过程中完全去除洗涤剂;非最佳蛋白:在脂蛋白脂质比;或者霉素不足添加,使电荷耗散不完整的。

在我odide流出测定法提供了在试验过程中使用的预磷酸化的CFTR蛋白(如在协议中所述),或磷酸化的CFTR的灵活性。如果重组蛋白的纯化过程中没有被磷酸化,样品可以碘化物流出实验步骤3.2.7期间被磷酸化,通过加入PKA与MgATP。在这种情况下,确保该基准线被记录为至少5分钟,以确保该蛋白质已被充分受PKA酶测量功能并加入缬氨霉素的前磷酸化。类似的结果通过任一方法获得。

在协议中,调制器分子被允许活性通过加入MgATP,然后缬氨霉素在测量前用CFTR蛋白相互作用5分钟。由于大部分的CFTR调节剂是非常亲脂性,它可能需要除了与CFTR蛋白的浴和平衡缔合之间的时间。该法不能在没有日Ë加成缬氨霉素,因而没有信息通过以这种方式进行测定丢失。在用户不关注的是,可能存在的小分子与蛋白质的相互作用之前的滞后时间的情况下,该测定可以由急性加成调制器的加成缬氨霉素进行,同时仍然在初始速率相测量。

该技术的局限性

如前所述,这proteoliposomal磁通基于受管制通道活性的测定由纯化的和重组全长CFTR分子群体提供用于询问的配体直接修改活性的独特方法。然而,该方法是在其不提​​供的洞察,通过该配位体通过CFTR的改变通量率的机制的限制。理想的是,纯化的和重组的CFTR的proteoliposomal通量测定法应与平面边缘结合使用单通道活动的ID双层研究。这种组合将提供的洞察,其结合配体的蛋白质的状态, 在打开和/或关闭状态。

相对于现有方法的意义

目前缺乏用于评估小分子的直接相互作用与CFTR通道与与另一个细胞成分相互作用,以间接地改变信道的活动, 例如 ,小分子调节剂,通过调节或信号传导途径的重要蛋白质-蛋白质或中断方法相互作用。碘外排方法演示与任何的小分子调节CFTR的通道活性的蛋白质直接互动。尽管测量的低通量方式,仍然在这种独特的方法用于研究的CFTR的小分子增效剂和校正的直接相互作用相当大的价值。许多小moleculË调制器正在开发由学术团体和制药业临床治疗CF患者,因为这是目前CF研究的主要推力。可以预料的是,这里所描述的方法将在最有希望的这些分子的作用机制的开发和验证帮助。

该技术的未来应用

此处所用的方法也非常适合于适应于所关注的其它蛋白质。确的描述的方法的修改被用于研究2 P.假单胞菌膜蛋白牵连阴离子基底的穿过膜26,27的移动,这表明了这些方法的实用性和通用性。它们在附加的阴离子通道和转运研究使用预计在未来。

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Disclosures

作者承认这里所述的纯化方法,开发过程中Mohabir Ramjeesingh医生的意见。这些研究是由运营赠款从健康研究(CIHR)和囊性纤维化加拿大(CFC)的加拿大学院CEB支持。 PDWE是通过在CIHR和CFC奖学金奖励部分支持。作者承认由囊性纤维化基金会治疗(CFFT)提供校正,增强剂和R·布里奇斯博士(医学罗莎琳德大学版)抑制剂化合物和分布。作者还通过贝勒细胞培养基金(NIH资助P30 CA125123)使用杆状病毒表达系统的重量和突变CFTR蛋白承认出色的服务。无效VX-770模拟,V-09-1188,是Vertex制药公司的礼物。

Acknowledgments

作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fos-choline 14 detergent Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) F312 Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche (www.roche-applied-science.com) 04 693 132 001 EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack  Roche (www.roche-applied-science.com) 05 892 791 001
Ni-NTA Agarose Qaigen GmbH 1018240
Fisherbrand Screening columns Fisher Healthcare 11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K Millipore (www.millipore.com) UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840051C
POPC Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 850457C
PS, Porcine Brain Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840032C CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 841118C
Ergosterol Sigma (www.sigmaaldrich.com) 45480
Pierce Detergent removal spin column Thermo Scientific 87779 1 ml capacity columns
valinomycin Sigma (www.sigmaaldrich.com) V-0627
VX-770 (ivacaftor) Selleck Chemicals S1144
iodide selective microelectrode Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) LIS-146ICM  
 
 
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
Clampex 8.1 software Axon Instruments (www.axon.com) we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System  Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) LIS-146LICM-XS Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars Big Science Inc (www.stirbars.com) SBM-0502-CMB choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine GE Health Care (www.gelifesciences.com) 17-0042-01
Sonicator Laboratory Supplies Co, Inc. G112SP1G Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable

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