精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

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Summary

ここで説明すると、嚢胞性線維症における欠陥があるこの塩素チャネル、のための活動を維持して精製野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成するための迅速かつ効果的な手続きである。 CFTRによって媒介され、再構成プロテオリポソー​​ムからヨウ化物流出は、チャネル活性の研究や小分子の効果を可能にする。

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Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).

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Abstract

嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)の輸送体のATP結合カセット(ABC)スーパーファミリーのユニークな流路形成部材である。 CFTRのリン酸化およびヌクレオチド依存性クロライドチャネル活性は、しばしば全細胞系および切除した膜パッチの単一チャネルとして研究されている。多くの嚢胞性線維症の原因となる変異はこの活性を変化させることが示されている。精製プロトコールの少数が公開されているが、チャネルの活性を保持する高速再構成方法及び精製系人口チャネル活性を研究するための適切な方法は、欠けている。ここで迅速な方法は、調整されたハロゲン化チャネルとしての活性を保持して定義された脂質組成物のプロテオリポソー​​ムに精製および全長CFTRタンパク質の機能的再構成のために記載されている。一緒にチャンネル活性の新規のフラックスベースのアッセイと、この再構成方法は、適したシステムである野生型CFTRと病気の原因となる変異体F508del-とG551D-CFTRの人口チャネル特性を研究。具体的には、本方法は、リン酸化、ヌクレオチドおよびそのようなCFTRチャネル活性における増強および阻害剤としての小分子の直接的な効果の研究において有用性を有する。方法はまた、アニオン性基材用の他の膜チャネル/トランスポーターの研究に適している。

Introduction

肺、腸、膵臓および汗腺などの組織における上皮細胞の頂端膜を横切る塩化物輸送は、主に嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)、ATP-とABCのリン酸化調節性メンバー(ATP-によって媒介される1で概説膜タンパク質のカセット)Cサブファミリー()を結合。 ABCCサブファミリーの他のメンバーと同様に、CFTRは、単一で、適度なATPアーゼ活性を有し、そのヌクレオチド結合ドメイン(NBDは)の界面に形成された2つのヌクレオチド結合部位にATPが結合する大規模なマルチスパニング膜内在性タンパク質であるサイト。しかし、他のABCCサブファミリーメンバーとは異なり、CFTRは、固有の規制のClチャネルとしてではなく、アクティブな溶質輸送体として発展してきた。

morbiにつながるCFTR原因嚢胞性線維症、肺、消化管、膵臓および生殖器官を含む複数の器官に影響を与える疾患の変異、若年成人におけるdityと死亡。肺疾患は、典型的には、嚢胞性線維症、早期死亡を占めており、ほとんどの場合、誘導気道の表面上皮におけるCFTR機能の喪失によって引き起こされる。繊毛気道上皮の頂端面上に流体層を変更するために表面上皮を横切って水の動き- CFTR塩素イオンチャネル活性の欠如は、両方のClの減少を引き起こす。これは、繊毛呼吸上皮細胞、気道の外に効果的に明確な病原体の能力を損なう粘性の気道表面液が得られる。結果として、ほとんどのCF患者は、肺感染症や炎症による肺損傷の再発発作に苦しむ。

予想されるように、正常なCFTRタンパク質の作用メカニズムの研究は、主に、チャネルゲーティング活動の詳細な電気生理学的研究に焦点を当てた。シングルチャネルの研究では、PKA-依存性Clとして直接そのCFTR機能を示している- ATP規制ゲート2を有しいるチャンネル。詳細な電気生理学的研究は、単一のCFTRチャネル1,3上の大量の情報を提供する、しかし研究されており、任意の特定の単一チャネルの特性はCFTRチャネルの全人口、したがって、単一チャネルを反映しているかどうかの懸念があるかもしれ結果は常に巨視的人口を研究するための方法と一緒に考慮されるべきである。精製されたCFTRの人口チャネル活性の直接アッセイは、疾患を引き起こす突然変異と関連する分子の欠陥への洞察を提供し、化学モジュレーター修復変異CFTRタンパク質の発見を駆動する可能性がある。現在までに、嚢胞性線維症4を引き起こすと考えCFTRにおける1900の異なる変異を超えるがある。北米と欧州で患者の約90%の少なくとも一つの対立遺伝子に見られる主要な突然変異、F508del-CFTRは、誤った折り畳みタンパク質につながるND小胞体5における保持。 F508del-CFTRはまた、不良チャネル活性6-9を含む他の結果を持っています。細胞表面からのCFTRの結果として存在しないことは、重篤な疾患と関連している。 G551D-CFTR、あまり一般的変異は、正しくまだ折り畳まれた細胞表面6における塩素イオンチャネルとして機能不全であることが考えられている。小分子補正器及び増強剤の開発は、それぞれ、細胞表面に存在フォールディングおよび/またはそのような細胞表面へF508del-CFTRのような変異体のトラフィッキング、および増強の補正や、G551Dような変異のチャンネル活性を増加させるという目標を有する。補正器VX-809およびVX-661は、(まだ患者での使用が承認されていませんが、増強Kalydeco(ivacaftor、VX-770)は、少なくとも1つのG551Dを持つすべての12 CF患者におけるHR> 6歳150ミリグラムで使用されているG178R、S549N、S549R、G551S、G1244E、S1251N、S1255Pの1の患者のためのより最近-CFTR突然変異、及びとG1349D。 Kalydeco安全かつCF疾患10の臨床的指標の改善をもたらすの両方が、しかし、この小分子の作用機序は十分に患者に使用するためのFDA承認の際に理解している。

CFTRの精製方法の一握りが完了するまでにかなりの時間を必要とする多くは、2,11-18、以前に記載されている。最近の刊行物19には、ユニークな精製および再構成の方法は、S fは 9細胞発現系において過剰発現CFTRについて記載し、定義された脂質系において、この精製されたタンパク質は、CFTRの集団CFTRハロゲンチャネル活性アッセイを開発するために使用された分子。アッセイは、CFTR機能上のリン酸化、ヌクレオチドおよび阻害剤の既知の効果を再現。システムは、重量(野生型)、F508del-及びG551D-CFTRに増強VX-770 / Kalydecoの効果を調べるために使用し、それを最初にするために示された薬物が母集団の観点からCFTRおよびヌクレオチドおよび小分子を有する突然変異体の相互作用の研究にこれらの方法の有用性および適用可能性を実証し、ATP非依存的に、チャネル活性を増強するためにCFTRタンパク質と直接相互作用時間タンパク質約臨床的に関連する質問に答える。方法はまた、他の増強剤分子およびそれらの誘導体20、ならびにタンパク質21の活性に対する小分子の補正の効果を研究するために使用されている。

流出アッセイは、以前に、電極、放射性トレーサー、およびフルオロフォア22,23を用いて、全細胞アッセイは、イオン選択性電極24を有する膜小胞を含むCFTR突然変異体の活性およびその活性に対するCFTR調節性化合物の効果を調査するために多くの研究で使用されている、放射性トレーサー25を用いて再構成CFTRを精製した。しかし目精製された再構成されたCFTRを研究するためのイオン選択電極の電子の使用が最初に最近19報告された。現在の方法の応用は、再構成および緑膿菌 、共通CF病原体における2つの膜タンパク質の機能的特徴付けのために使用されてきた。ヨウ化物流出測定と結合して精製AlgE外膜タンパク質の再構成は、このトランス26を介してアニオン性アルギン酸塩分泌のためのモデルをサポートするために使用された。再構成およびヨウ化物流出測定は、モデルは、このタンパク質27によって細菌の内膜を横切る脂質結合オリゴ糖転位のためのH +依存性アンチポートメカニズムを示唆して提案することが許可され精製された例えば、wzxタンパク質に適用した。どちらの場合も、ヨウ化物は、一つは天然基質のために期待するかもしれないよりも低いスループットではあるが、アニオン性基板の代わりとして使用された。この方法は、cと他のタンパク質への適応のために適切であり得るアニオン性基板のためationic輸送又は伝導経路。

ここで迅速な精製手順は、CFTRタンパク質と定義された脂質のプロテオリポソー​​ムへの再構成のために記載されている。迅速な再構成手順は容易に精製において使用される界面活性剤の種類は、ここで使用される方法による除去に適しているか、再構成手順の前に適切な界面活性剤に交換することができれば、他の方法によって精製CFTRでの使用のために調整することができる。精製された再構成CFTRタンパク質のチャンネル活性を測定するためのヨウ化物流出方法について詳細に説明すると、この方法から得ることができるいくつかの典型的な結果を示す。

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Protocol

CFTRの1.精製

注:このプロトコルで使用される機器や材料のリストについては、材料および装置の表を参照してください。詳細なプロトコルは、ヒトの重量-CFTRおよびS fは 、9バキュロウイルス発現系17,28における変異体の過剰発現が存在する。 CFTRを過剰発現し、このプロトコルに従ってS fの 9細胞のペレットを作成。

  1. 粗膜準備
    1. 新鮮を取得するか、標準的な細胞培養方法によって増殖、過剰発現C末端His 10 -タグでwildtype-、F508del-、またはG551D-CFTRタンパク質の細胞を500mlの培養液から凍結S fは 9細胞ペレットを解凍し、として以前に17,28に説明。細胞ペレットを、約5mlの容量と約5gの湿重量を有するであろう。
    2. 再懸 ​​濁S fを確保し、4℃で、プロテアーゼインヒビターカクテルを含むリン酸緩衝生理食塩水20mlを(PBS)pH7.4の(1錠あたり50ミリリットル)中の9個の細胞、サンプルでは、​​視覚的に均質表示され、細胞のない塊が残っていない。
    3. 継代ごとに2分間10,000psiで(好ましくは15,000〜20,000 PSI)の最小値に達し、高圧細胞破壊(材料および装置の表)を使用して、細胞を溶解する。溶解中に4℃でサンプルを保管してください。
      1. その後すぐに細胞破壊でサンプルをリロード溶解期間の後に氷上でサンプルを収集する。溶解手順を3回繰り返します。 10%未満では無傷のまま確実にするために顕微鏡下で調べる。
        注:など、ガラスビーズ等の細胞を溶解する他の方法は、厳密しかしながら、ユーザが適切なこのような代替方法を見つけることができ、このシステムのために検討されていない。
    4. 20分間2000×gで高速遠心機で4℃で遠心細胞溶解材料。上清を収集し、ペレットを処分する。 ultracenテーブルトップで125000×gで4℃で1時間20チューブと遠心分離機サンプル間で上清を分割trifuge。
    5. 削除し、使用するまで2ヶ月未満のために-80℃で、同じチューブ内のペレット、及び店舗ペレットを乱さないように注意しながら、上清を捨て、または氷上に保持し、すぐに精製を続ける。
  2. CFTRの可溶化
    1. 1-4新鮮または凍結のS F 9粗膜ペレットを入手し、バッファ1の1ミリリットルで、各再懸濁(2%FOS -choline、完全なレシピのために、表1を参照)、氷上で4℃で、25 G針と1を使用して溶液になるまでmlシリンジに見える細胞膜塊なし目で均一である。複数のペレットが可溶化されている場所を、ステップ1.3.2でサンプルをプールする、並列して以下の単一のペレットのための指示に従って各サンプルを処理するために続ける。
    2. fosの -choline 14界面活性剤を欠いている(プロテアーゼ阻害剤が10倍以上のコンセントであり、緩衝液2 1ml中の1ミニプロテアーゼ阻害剤錠剤( 表1を参照して、10mMのイミダゾール)を溶解(プロテアーゼ阻害剤は、この時点でその推奨希釈である)、この時点でその推奨希釈よりも、定格)と再懸濁し、粗膜ペレットに100μlを添加する。反転によって5回5分ごとに混合しながら45〜60分間氷上で設定してください。
    3. 遠心分離機は、125000×gで4℃で25分間テーブルトップ超遠心機で粗膜ペレットを再懸濁した。可溶化されたCFTRが含まれている上清を保持し、ペレットを捨てる。
  3. 列結合、リン酸化及び溶出
    1. ニッケルNTA(ニトリロ三酢酸)アガローススラリーまたはバッファ2の1ミリリットルと同等の樹脂400μlの洗浄(10 mMイミダゾールを、 表1を参照)洗剤を欠いている、溶媒を除去し、4℃でバッファする。さらに2回繰り返して洗浄。
    2. (10 mMイミダゾール; 表1を参照)バッファ2との合計10mlに可溶化されたCFTR、残りのプロテアーゼ阻害剤(900μl)をニッケル樹脂(400μlのスラリーからの)を組み合わせワットHICHは、いかなる追加の洗剤を欠いている。 fosの -choline 14濃度を効果的に、この段階で(w / v)の0.2%に希釈する。複数のチューブが存在する場合、可溶化されたCFTR、プロテアーゼ阻害剤、ニッケルNTA樹脂を0.2%含有する全てのサンプルをプール(重量/ v)のfosの -choline-14この時点で。穏やかに振盪しながら4℃で60分間インキュベートする。
    3. 小さ ​​なスクリーニングカラム( 表1)または同等の空の列ダウンCFTR-プロテアーゼ阻害剤-ニッケルNTAソリューションを渡します。
    4. 緩衝液3の最初のペレットあたり4mlで、カラムに保持されたニッケルNTA樹脂、洗う(10 mMイミダゾール+ DDMを、 表1参照)fosの -choline 14を欠いているが、1 mMのDDM(ドデシルマルトシド界面活性剤)を含有し、 4℃で。 DDM洗剤の添加は大幅にこの緩衝液のpHを変更しません。
    5. cAMP依存性プロテインキナーゼA触媒サブユニット(2,500 UはP、MgATPを25μlの(5mMの最終濃度)を添加することによりPKA-MgATPを溶液を調製KA)緩衝液3の475μlのには(10 mMイミダゾールDDM +; 表1を参照)カラム。キャップまたはパラフィルムで、カラムの底端部を密封し、使用される各初期ペレットのためのPKA-MgATPを溶液500μlを添加することにより、タンパク質をリン酸化する。
    6. PKAは、ニッケルNTA樹脂の表面全体に接触していることを確実にするために、2分毎の1mlピペッターを用いて樹脂を穏やかに混合し、再懸濁して20分間室温(20℃)でインキュベートする。
    7. キャップを外し、カラムからのPKA / MgATPをソリューションを溶出。緩衝液3 2mlでカラムを洗浄(10mMイミダゾールDDM +; 表1を参照)、4℃で。
    8. できるように、カラム緩衝液4mlを添加することにより、4℃で、( 表1参照50mMイミダゾール+ DDM)緩衝液4 mlのこの数を4洗浄カラムで実験に用いたペレットの数を掛けそれをカラムに次の4ミリリットルのアリコートを追加を通して、すぐに流れる。
    9. 表1を参照)、および単一の管で精製されたCFTRを含む全体の溶出液を収集します。
    10. 10ミリリットルのバッファ6(75mMの合計で、材料および装置、または他の同様の装置の表に記載されているような遠心分離フィルター装置(100,000分子量カットオフ)を使用して、イミダゾールおよび低分子量の分解生成物を除去するために、タンパク質サンプルを濃縮KI + DDM、2000×gで4℃ために遠心分離することにより、 表1を参照こと);(例えば非ヨウ化物流出実験用バッファ7、25 mMのHEPES + DDMとして1mMのDDMを含む任意の表1)または他のバッファを参照サンプルまで、約20分で200μlに集中する。 10ミリリットルに試料を希釈し、濃縮工程を繰り返します。
      注:私たちの経験では(未発表)、イミダゾールかなりINHICFTRのATPアーゼ活性をビット、サンプルが機能的測定のために使用される場合、少なくとも二倍希釈及び濃縮することにより、この工程で除去されるべきである。
    11. 濃厚精製されたCFTRを収集します。 1〜2日以内に使用するまでのDDM緩衝液の存在下で4℃で保管してくださいまたは再構成ステップにすぐに続ける。我々の経験では、我々は減少した活性を観察するように、精製したタンパク質を凍結しないでください。

CFTRの2の再構成

  1. 脂質製剤
    注:1(w / w)の卵PC:POPC CFTRが正常卵PC、POPC、2に再構成された(1:1 w / w)の混合物、またはPEの混合物:PS:PC:エルゴステロール、5:2 :2:1(w / w)である。
    1. ヨウ化物流出実験、乾燥卵PCの5 mgのためにパイレックスまたは他の頑丈な(非ホウケイで室温で20分間、アルゴンガス気流下(25 mg / mlのストックを200μl、材料および装置の表を参照してください) )ガラス管。
    2. 280nmでの吸光度を用いて、ELISAssayまたはその他の方法は、精製されたCFTRタンパク質試料の濃度を推定する。十分なシグナルを生成するために3000(w / w)である:1の脂質比:300-1野生型CFTRとヨウ流出実験のために、タンパク質を使用する。流出活性を検出するために、1200(W / W):200-1:約1の脂質比:G551D-とF508del-CFTRの場合は、タンパク質を使用しています。
    3. それぞれの特定のシステムのための脂質比:タンパク質を最適化します。必要な精製タンパク質の量を計算します。最終容量1mlを行う必要1mMのDDMと緩衝液の体積を計算する、 すなわち 、1ミリリットル- (必要なタンパク質溶液の体積)=バッファーの量。
      1. 乾燥した脂質に1mMのDDMで所望の緩衝系の計算されたボリュームを追加します(が、この時点ではCFTRタンパク質を追加しない)とパラフィルムでガラス管をカバーしています。ヨウ化物流出の実験のために、バッファ6に脂質を再懸濁(75 mMのKI + DDMを、 表1を参照)。バッファ8に再懸濁他の実験(25 mMのHEPES + DDMについては、を参照してください。表1)または1mMのDDMを含む他の所望の内部バッファ。
      2. DDM緩衝液中の脂質の懸濁を助けるために、室温で2分間ボルテックス。交互に、ボルテックスする前に1~2分間37℃に試料を加熱する。
    4. 全く脂質フィルムがチューブの側面に見えなくなるまで1ミリリットルの注射器と25 G針を用いて室温で繰り返し脂質を一時停止します。微細気泡を生成し、ヨウ化物及び脂質の酸化を支援するソリューションに空気を注入することは避けてください。
    5. 超音波処理パラフィルム中の浮遊脂質は氷を含む浴超音波処理器で20秒のバーストのためのチューブをカバーし、その後、1分間氷にすぐに移す。 3回繰り返します。
      注:激しい超音波処理は、酸化による黄ヨウソリューションをオンにします。そのため、過度の超音波処理を避ける。色の変化のためのサンプルを監視します。色の変化が認められる場合には、サンプルを破棄し、再度準備する。原因のいくつかの酸化色の変化ヨウ化物は、同じ条件下で、脂質の酸化をもたらすであろう。溶液を超音波処理する前に、アルゴンガスをチューブから空気を変位させる脂質及びヨウ化物の酸化を防ぐことができます。強烈な超音波処理は、質の悪い、またはサンプルの損失が生じる傷ガラス管を破ることができる。
    6. 最終容量1mlを達成するために超音波処理した脂質試料に、ステップ2.1.3において算出精製CFTRのボリュームを追加する。 25 G針と1mlシリンジで10回再懸濁によって脂質と洗剤液でタンパク質を混ぜる。
    7. 5回の5分ごとに混合するためにチューブをかき混ぜながら30分間氷上で脂質とタンパク質サンプルを設定する。
  2. 洗剤結合カラム調製
    1. 1ミリリットルボリュームの容量を持つ単一の使用市販の洗剤結合スピンカラムを(材料および機器の表を参照)を入手し、カラムが流れ始めるために下のタブを破る。
    2. ストレージbを除去するために2000×gで2分間、カラムを遠心ufferは、このバッファを捨てる。
    3. バッファ7 5mlの追加カラム(75mMのKIを、 表1を参照)、次いで、洗浄緩衝液を溶出させ4分間200×gで遠心する。保存バッファーのすべての痕跡を削除するには、この手順を3回の洗浄の合計のために2回以上繰り返します。すべてのフロースルーを捨てます。
      注:列を洗浄するために使用されるバッファがDDMや他の洗剤が含まれていないことが重要です。カラムは、洗浄剤のための有限結合能を有し、かつ界面活性剤を含有する緩衝液を使用した場合、カラムは、タンパク質 - 脂質 - 界面活性剤の試料から洗浄剤を除去するのに効果がない。
    4. 注意深くカラム樹脂の上部に脂質 - 界面活性剤 - タンパク質試料の全てを1mlアリコートし、室温で2分間、カラムの最上部に試料をインキュベートする。
    5. 遠心2000×gで4分間、室温でサンプルと新しい1.5または2ミリリットル微量遠心管またはガラス管に濁ったプロテオリポソー​​ムの試料を収集し、サムを配置する氷上でPLE。
    6. 列の先頭にバッファ7(洗剤なし)(75 mMのKI、 表1)または他の緩衝液200μlを添加することにより、列の残りのプロテオリポソームを収集し、2分間の遠心分離工程を繰り返します。
    7. それが曇って見える場合テオサンプルに第二溶出液を追加します。
    8. 一晩4℃でサンプルを保存したりヨウ化物流出測定のためにすぐに使用しています。

精製された、再構成されたCFTR 3.ヨウ流出測定

  1. proteoliposomal膜を横切るヨウ化物勾配の生成
    1. バッファ9のプレ膨潤セファデックスG50ビーズ(約5gの乾燥ビーズを50ミリリットル液中)、又は所望の外部バッファ室温で少なくとも2時間または4において、(75mMのK-Gluのグルタミン酸カリウムは、 表1を参照) Cで一晩°。
    2. バッファ9に飽和4デックスG50カラムの準備や他の(75 mMのK-Gluのを、 表1を参照)カラムのフル少なくとも¾に樹脂をロードすることによって小さなスクリーニング列のバッファ。
    3. 樹脂から余分な緩衝液を除去するために2000×gで4分間遠心します。遠心分離工程の最後にカラムに充填水和した樹脂の約2.25ミリリットルがあるはずです。
      注:樹脂は、軽く水和さが、液体に浸されていないと、その後の短時間のスピンは、バッファの大幅なボリュームを溶出しないでくださいする必要があります。これは、カラム樹脂はどちらもあまりにも濡れず乾燥しすぎていると、ユーザーが最も成功した緩衝液交換条件に慣れるために、列を実験する必要があるかもしれないプロテオサンプルの成功溶出非常に重要です。
    4. 慎重に2000×gで4分間、各列及び遠心分離機のトップにプロテオサンプルの125〜150μlを添加する。
    5. プールテオリポソー​​ムは、ヨウ化物流出または他の実験ですぐに使用するために一緒に溶出液。
      注:各カラムから溶出されたボリュームは大きくすべきである150μlの試料がやや曇ってますが、元のサンプルよりも小さく曇りでなければなりません。大きな容量またはクリア溶出液カラムが十分に乾燥していない、またはあまり、それぞれ乾燥させた、成功したヨウ化物の流出実験をもたらさないことを示唆している。
  2. ヨウ化物流出アッセイ
    1. 広範囲に脱イオン水(材料および装置の表)のヨウ選択微小電極を洗浄した後、バッファ10に実験前に20分間インキュベートする(15μMKI、 表1を参照)。脱イオン水で十分に再び電極を洗ってください。
    2. 96ウェルプレートの1ウェルにバッファ9に薬剤を150μl(20μMのアッセイにおいて、10μMの最終濃度を製造するための典型的な濃度)を追加します(75 mMのK-Gluの、 表1を参照)またはバッファ9の車両小さなノミの攪拌棒を備えた。
      1. 現在の気泡がないことを確認してください。迷光を除去するためにピペットチップを使用して泡。薬液が使用されている場合、(v / v)の(典型的には0.1から0.2パーセント(v / v)で)ウェルの最終DMSO濃度は1%未満であることを保証する。
    3. バッファ9セクション3.1で作成した再構成CFTRタンパク質150μlの追加プレートのウェルに300μlの総体積を生成するために、薬剤または緩衝液をウェルに(75mMのK-Gluでは、 表1を参照)。
    4. 撹拌プレート上の96ウェルプレートを配置し、130rpmで(または約1/4最高速度の中程度の速度で)撹拌する。
    5. 先端がウェルの底に触れていないか、または撹拌棒に見舞われているようなサンプルで慎重にウェルにヨウ選択電極の先端を挿入します。確実に別個の場合、参照電極は、ウェル内の溶液と接触していること。
    6. 電極とのインターフェース自家製または商用コンピュータプログラムを使用してレコード·レーシング(詳細については、材料および装置の表を参照)。ローパスフィルタを介して信号をフィルタリングして、2 [Hz]のサンプリングレートを使用する。
    7. サンプルが記録しながら、安定した平らな、またはフラットベースラインの近くを生産する5分間平衡化することを許可する。
    8. 3μlのMgATPを(KOHでのdH 2 O中で調製し、pHを7に調整した100mMのストックを、1mMの最終濃度)を追加したサンプルには、タンパク質を活性化する。 〜5分が新たな安定したベースラインに到達することを許可する。常に外部緩衝液のpHの変化を避けるために、使用前にニュートラルに100 mMのMgATPをストックのpHを調整する。
    9. CFTRを通じてヨウ化物選択性コンダクタンスによって生じた電位差の変化をシャントするサンプルに、株式をバリノマイシンの3μL(20 nMの最終濃度2μM)を追加します。少なくとも5分間によりCFTR媒介ヨウ化物流出活性に減少勾配(MVの減少)を記録。
    10. テオリポソー​​ム内腔におけるヨウ化物のトラップが十分であったことを確認するために、サンプルに10パーセントの3μL(v / v)のトリトンX-100を追加します。 Significantと即時ヨウリリースは十分なヨウトラッピング3.2.9で決定傾きの変化ではなく、CFTR媒介活動を制限する要因ではなかったような小胞の中に閉じ込められていることを示しています。
    11. これらの試薬のすべてのトレースは、次の試料の汚染を回避するために除去されていることを確認するために薬剤またはトリトンX-100を含む試料を処理した後、脱イオン水で徹底的に電極および撹拌バーを洗う。
    12. (K-Gluのバッファ、 表1を参照)バッファ9にナノモル範囲にマイクロモル中の希釈KI濃度のシリーズを準備します。 0から調製した最高濃度に各濃度の電極のmVの応答を記録します。プローブ応答(MV)は、モルヨウ化物濃度の対数に対してプロットされた標準曲線を構築します。リリースヨウ化物の濃度に流出実験中にプローブのmVのレスポンスを変換するために標準曲線を使用してください。
      注:キャリブレーションCURを準備ユーザーはプローブの変更のどのように迅速に応答のを確認してくださいになるまで、週単位でVEの。時間の経過に応答し、プローブの感度が変動する可能性があります。プローブが古くなると、レスポンスが低下します。これは部分的に可能性プローブ​​表面への分子の付着を制限する、定期的に内部ソリューションを変更し、使用後に水でのプローブ先端の十分に洗浄することによって排除されてもよい。
    13. MgATPを添加する前の最後の30秒間各テオサンプルの時間プロットの濃度対の線の平均勾配を決定し、バリノマイシンを添加した後が、トリトンX-100を添加した。そのサンプルのCFTR媒介ヨウ化物流出活性を決定するために、バリノマイシンからベースラインスロープを減算する。

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Representative Results

この書かれた刊行物、精製および再CFTRタンパク質の調節されたチャネル活性を測定するための方法が記載される。 図1aは、精製、再構成およびヨウ化物流出手順のためのワークフローを示している。ヨウ化物フラックスによる再構成およびチャンネル活性測定のための方法は、関連するビデオにさらに詳細に示されている。

プロテオへのCFTRの精製と再構成

CFTRは、機能的重量または変異CFTR cDNAの2を含む組換えバキュロウイルスを使用して9個fは Sにおいて高レベルで発現させることができる。哺乳動物発現系ではないが、CFTRは、高レベルの発現を確実にするためにS fは 9細胞をバキュロウイルス系を用いて発現させた。 CFTRの生産は、全細胞タンパク質17,28の1%にもなり得る。 9-バキュロウイルス系fの Sタンパク質は、グリコシル化、コアとなるという利点を有するこのシステムの品質管理機構がCFTRおよび変異体は、細胞表面上に生成することができるように比較的寛容である。 10ヒスチジンタグは、ニッケルNTAに対するこのタグの親和性によって精製を可能にするためにカルボキシ末端に操作した。 C末端タグは切り捨てCFTRタンパク質および利回りATPアーゼにおける機能CFTRタンパク質、シングルチャネルおよびヨウ化物流出実験17,19,24,28,29の同時精製を防ぐことができます。しかしここで説明する精製プロトコルは、同様にN末端タグ付きCFTRに適しているべきである。

以前は、CFTRタンパク質が効果的に室温で15 NaPFO(pentadecafluoro -オクタン酸ナトリウム)を用いて、9形質膜調製物fを Sから抽出することができることが示されている。しかし、4℃、適切に折り畳まれたタンパク質を維持に資する温度で沈殿さNaPFOの感受性とPFOを除去するのに必要な長い透析は、RAPに従順ではなかったCFTR機能のその後のアッセイにおいてタンパク質の活性を最大にすることを目的のid精製および再構成方法。ドデシルβ-D-マルトシド(DDM)、3を含む洗浄剤(のパネルの評価- [(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ] -1-プロパンスルホネート(CHAPS)、fosの -choline 12及びfosの -choline 14があることを示したfosの14を-choline。(データは示さず)。したがってfosの -choline 14洗剤抽出ステップS fは 9膜からヒトCFTR-Hisの10を可溶化に最も効果的であり、DDMは、界面活性剤溶液中でCFTRのATPase活性を維持するのに有効であったことタンパク質の活性を維持するために界面活性剤をDDMために交換し、続いて行われる。

(;銀染色図2)の精製および濃縮に続いて、タンパク質画分は、その主成分として〜150 kDaのバンドが含まれているDDM洗剤で得られる。この分子量は、S <において発現されたヒトCFTRに対応em>の9cells fおよびそれが哺乳動物細胞においてCFTRの複雑なグリコシル化特性の種類を欠いてSDS-PAGEにより分析した。 150kDaの種はSDS-PAGE分析および銀染色後に約90%純粋であると思われる。 M3A7抗CFTR抗体を用いたウエスタンブロッティングNBD2に対して向けられ、このマウスモノクローナル抗体は、150 kDaバンド(;ブロット図2)と反応することを確認する。特定の研究において、低分子量成分の微量は、〜60〜80kDaの(データは示していない)でゲル上で可視マイナーなバンドとして存在する。 M3A7抗CFTR抗体は、60及び80 kDaのバンドと反応するが、他の非CFTRタンパク質とは反応しない(データは示さず)。これは、低分子量成分は、それらのC末端Hisタグを介してCFTRと共精製CFTRの分解産物であることを示唆している。精製は、プロテアーゼ阻害剤の存在下で行われ、これらの成分は、精製手順iの前の細胞に存在すると思われるSが行わ。手順の濃縮工程は、実質的に全ての汚染低分子量の断片を除去する。 CFTRは、この時点で再構成することができる、または他の精製法からのタンパク質は、再構成プロトコルで使用することができる。

規制されたリポソームのフラックスベースのアッセイは、陰イオン選択性チャネルを精製し、再構成されたCFTR分子の集団の機能的再構成を報告

精製されたCFTRのかなりの割合は、上記の方法を使用して調整された塩素イオンチャネルとして再構成されたかどうかを決定するために、proteoliposomalハロゲンフラックスアッセイは、( 図1Bに概略的に示される)再構成されたCFTR分子の集団の活性を報告する開発された。最悪の場合、再構成されたCFTR分子の大部分は、ミスフォールドされた場合、これらの分子は、コンダクタンスを与えることに失敗し、陽イオンと陰イオンとを区別することができないおよび/またはゲートがPKAリン酸化とヌクレオチドによって規制を欠くであろう。リーらは、膜タンパク質30のパーセント機能的再構成の推定を可能にする方法を公開している。

空のリポソーム(CFTRを欠く)、またはプロテオリポソー​​ム(再構成されたCFTRベアリング)はKI(75 mM)をロードされると、余分なリポソームヨウ化物は、ゲルろ過カラムを通してリポソームを渡すことによって、グルタミン酸カリウム(75 mM)のと交換。 KIは、プロテオリポソームは、ヨウ化流出のために外向きのグラデーションを作成することを含むウェルK-Gluの(グルタミン酸カリウム)に追加されたロードされ、ヨウ敏感な微小電極24を使用して、時間をかけてリポソーム外ヨウ化物の増加として監視されている。 mVのシグナルの減少で負に帯電したヨウ化物の流出の結果(信号はより負になる)。経時的に放出ヨウ化物の濃度をプロットすると、傾きがex中のヨウ化物の増加を示す( 図3のように)反転される時間をかけてternalソリューション。

K-Gluのは、CFTRタンパク質を通過しないアニオンの一例として使用される条件下で、細孔のかなりのブロッキングを引き起こすようには見えない、非透過性対イオンとして選択し、ヨウ選択的に干渉を起こさない電極。アッセイは、それがこれらの基準を満たしていることを提供し、他の陰イオンの周りに最適化することができる。 75 mMのアニオン濃度は、経験的に記載された条件下でのアッセイで測定するための良好な捕捉及び十分なシグナルが得られた濃度として選択した。 (;制御トレースを図3)CFTR-再構成されたのに対し、ヨウ化物負荷プロテオリポソームは、ヨウの添加後外液中に放出媒介し、小胞は洗剤で透過処理されるまで、本質的に、機能的に再構成されたCFTRを欠いているヨウ化物負荷リポソームからのヨウリリースはありませんCFTRチャネルとバリノマイシンを開くためのMgATP(1 mM)を(20 nM)の膜電位の開発防ぐために( 図3Aを 、タンパク質のトレースを参照してください。1の脂質質量比:3000()w / w)である。

バリノマイシンは、本システムでは、空のリポソームの完全性を乱すしなかった最高濃度として経験的に選択し、その濃度勾配および20nMの濃度まで、具体的には膜を横切るカリウムを往復イオノフォアである。これは、各特定のシステムのために最適化する必要がある。バリノマイシンを添加することなく、迅速にプラトーに達し、数nMでの略称ヨウ放出がある(データは示さず)。これらの条件が知られているが、そうでなければ、最大( 図3Aのように)CFTRアニオンチャネル活性を活性化するために、それは有意な応答の欠如は、CFTRのアニオン選択細孔を通してヨウ伝導により媒介リポソーム内の正電荷の瞬間的な増加を反映していると思われる、すぐに制限continuバリノマイシンが含まれていないのOUヨウ化物流出。このバリノマイシン媒介応答は、再構成されたCFTRのアニオン選択性をサポートする、ヨウ化物流出が原因で電荷蓄積の以前の実験で制限されていたことを確認する。 CFTRは、この選択性を欠いていた場合は、カリウムとヨウ化の両方が、それによってフラックスを開始するためにバリノマイシンの必要性を抑止するプロテオから流出さすることができただろう。

これらの初期の時点で測定されたヨウ化物濃度は、経験的に用いられるヨウ検知電極に対して最適な感度範囲内に収まるように選択した。他のヨウ化物電極の使用は、これらの要因の最適化を必要とし得る。プラトーに達した後に、トリトンX-100は、プロテオリポソー​​ムを透過し、残りの捕捉されたヨウ化物を放出するために添加される。 (バリノマイシン添加後1分の間と2を得た)初期ヨウ測定とは異なり、これらのエンドポイントでの測定値は、電極カリの直線範囲にない校正曲線は、(データ示さず)、それによってCFTRタンパク質はアッセイにおけるリポソームの総数、またはそのパーセント機能的再構成のヨウ化物流出を相対的に媒介することが可能であるから、リポソームの画分の正確な評価を妨げる。

ヨウ流れの速度は、CFTRタンパク質分子の数、開確率、各CFTRチャネルの単位コンダクタンスを反映している。したがって、ヨウ化物流出の速度は、各CFTR分子の数とオープン確率に依存する必要があります。予測は、リポソームあたりCFTR分子の数を増やすことによって、このシステムで試験した。 300-1:3000(w / w)の( 図3A)脂質に対する活性化(リン酸化とMgATPを処理)CFTRタンパク質の比が1の範囲の比で変化させた。プロテオリポソー​​ム中に存在する再構成されたCFTRより多くの量が、流出の大きな割合を予測tを支持する、(添加バリノマイシン後に1〜2分の間に測定された)帽子の流出速度は、各リポソームにおけるCFTR分子の数に依存する。流出速度は、特定のタンパク質を用いて得られた:脂質比は、従って、この方法の厳しさを強調し、実験日及びタンパク質精製の間に再現可能である。

ヨウ化物流出の速度は、この再構成システムにおけるCFTRチャネルの開口確率に関係するように思われる。 PKAによるリン酸化は、(32によるレビュー)CFTRの活性化31に必要とされるように、開確率が低い外因性PKA処理によってリン酸化されていないCFTRを含む小胞のヨウ化物流出率の低さがあることが予想される。 PKA処理されているプロテオでは、オープン確率は流出のはるかに大きいと予想率で、その結果、はるかに高くなります。実際には、このシステムでの1mMのMgATPの存在下でPKA処理CFTRのため、ヨウ化物流出の速度はvalinomycの添加後2分に一から測定で約4 MgATPをにかけCFTRタンパク質の割合ではなく、PKA( 図3B)倍される。これらの知見は、流出率は開確率をチャネルに関連する仮説を支持している。実際には、このような電気化学的駆動力の​​時間的変化のような他の要因が観察された流出活性に影響を与えることを考える可能性を開くために、直接、このアッセイで活性を比較することは困難である。読者は、このアッセイは、詳細なシングルチャネル活性の録音のための代替品ではないことを警告している。

興味深いことに、通常はCFTR( 図3B、C)を欠くリポソームから流出よりもかなり大きいのMgATPの存在下で、「非リン酸化」タンパク質によるヨウ化物流出率が低いが観察される。この低い率が33を精製する前にS F 9細胞発現系におけるCFTRの基底リン酸化を反映している可能性がある。他の発現systeから精製CFTRmsが基底リン酸化の異なるレベル、したがって異なる残存活性を有していてもよい。

しかしF508del-とG551D-CFTRに対するS Fからこの迅速な精製プロトコルの利回りWT-CFTRほぼ均一で9細胞、方法がより良い濃縮手順として記載されている。いくつかの夾雑バンドはCFTR抗体と反応性であり、細胞破壊の前に存在するように思われるCFTR分解産物を反映多くはSDS-PAGE 19を介して観察される。再構成およびヨウ化物フラックスの方法は、臨床的に関連する変異体のこれらの濃縮されたサンプルに適している。 (約1:1の脂質質量比:600タンパク質)およびG551D-CFTR(タンパク質:約1の脂質比:300)、図3(d)に示すように、重要なヨウ化物流出はF508del-両方について測定する。両方の変異体は、重量-CFTR(1:脂質質量比:タンパク質1200)より低い絶対的活性を有するが、それは、直接定量としてサンプルを比較することは困難であるCFTRの分解生成物で汚染された変異体のために正確にすることはできません。しかしF508del-CFTRおよびG551D両方が、これらの方法によって精製し、再構成および排出の測定を行った小分子増強に予想通り( 図4)に対応し、より厳密なPFOの精製方法19によって精製されたタンパク質に類似したチャネル機能を示す。

精製された再構成CFTRのチャネル活性は、小分子阻害剤および増強することによって調節することができる

-172 34 inhは CFTR単一チャネルコンダクタンスの測定35においてCFTR塩化物チャネルの開口確率を阻害し、他の研究22,36においてCFTR活性を阻害することが示された最も具体的なCFTR阻害剤である。 図3(c)に示すように、加算をバリノマイシン後流出の速度が大幅にCFTR inhは前処置によって低減される UB> -172。したがって、精製され、再構成されたCFTR分子の集団のチャネル活性を、このアッセイは、-172 inhは阻害性リガンドCFTRモジュレーターとしての活性を報告するのに有効である。

アッセイは、同様に、小分子増強処置の効果の検討に感受性の高い適用可能である。 図4に示すように、試験したすべての3 CFTR遺伝子型が大幅などのアクティブな小分子増強により増強されるKalydeco / VX-770またはVRT-532( 図4C、G551Dについて示さ)、非アクティブなアナログは、ヨウ化物流出に影響を与えませんしながら、 CFTRの活性(F508del-CFTRについて示さ; 図4B)。アッセイは、増強剤濃度依存性の検査、及び増強媒介CFTR活性に対するATPおよびリン酸化の役割にも適用可能である。

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図1:この文書に記載されている仕事のためのアッセイの設計およびワークフロー(A)ワークフロー(B)ヨウ流出実験の模式図。。パネルBの修正版は、もともとバイオロジカルケミストリー誌に掲載されました。 Eckford、PDW。李、C; Ramjeesingh、M。ベア、CE嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)増強因子VX-770(Ivacaftor)はリン酸化依存が、ATPに依存しない方法で変異型CFTRの不良チャンネルの門を開きます。 2012; 287:36639〜36649。 ©生化学·分子生物学のためのアメリカの社会。

図2
図2:CFTR迅速な精製手順利回りはWT-CFTRタンパク質を精製したシルバーをSDS-PAGEゲルを染色し、西過剰発現の(彼の)10タグ付きバージョンを9細胞F Sから分離されたDDM洗剤で精製ヒトWT-CFTRタンパク質のためのM3A7 CFTR抗体を用いたERNブロット(1μgのゲルとブロットのために0.1μgの、それぞれ)、タンパク質。重量-CFTR(> 90%純粋)は、複雑なグリコシル化を欠くこのタンパク質の適切な150 kDaの、検出される。この研究は、もともとバイオロジカル·ケミストリー誌に掲載されました。 Eckford、PDW。李、C; Ramjeesingh、M。ベア、CE嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)増強因子VX-770(Ivacaftor)はリン酸化依存が、ATPに依存しない方法で変異型CFTRの不良チャンネルの門を開きます。 2012; 287:36639〜36649。 ©生化学·分子生物学のためのアメリカの社会。

図3
図3:Iodide流出アッセイレポートを精製し、再構成されたCFTRタンパク質をチャネル活性を調節。 (A)精製およびリン酸化重量-CFTRタンパク質で再構成された:脂質1の比率:300(w / w)の、1:1200(w / w)の1:3000の(重量/重量)の小胞の内腔からヨウ化物流出を媒介する1mMのMgATPをし、20 nMのバリノマイシンを添加した後の時間をかけてバルク風呂。 (w / v)のトリトンX-100は、実験の終了時に小胞の内腔にヨウ閉じ込められテオリポソームのリリースを透過するため、0.1%を添加。(B)再構成された重量-CFTRタンパク質の初期ヨウ化物流出の時間経過していなかった予めリン酸化(C)初期ヨウ化物流出速度は、機能的なCFTRタンパク質に観察された活性の依存性を実証する。タンパク質のPKAリン酸化は、-172(20μM)INH CTTR、CFTR阻害剤の添加により阻害される重要なチャネル活性のために必要とされる。データは平均値±SEMである。 *はp <0.05、***はp <0.0001(D)複数の遺伝子型が重量、F508del-と対照に対するG551D-CFTRを含むヨウ化物流出アッセイにおける規制CFTR信号を生成。データは平均値±SEMである。 *はp <0.05。 *** P <0.0004対コントロール。この研究(パネルA、C、Dの中のデータの一部)は、もともとバイオロジカル·ケミストリー誌に掲載されました。 Eckford、PDW。李、C; Ramjeesingh、M。ベア、CE嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)増強因子VX-770(Ivacaftor)はリン酸化依存が、ATPに依存しない方法で変異型CFTRの不良チャンネルの門を開きます。 2012; 287:36639〜36649。 ©生化学·分子生物学のためのアメリカの社会。

図4
図4:小分子によるCFTRのリン酸化依存性増強は、使用して問い合わせることができます重量、F508del-とG551D-CFTRのためのヨウ化物流出系。 (a)はWT-CFTRはPKAリン酸化状態では、増強VX-770(10μM)と大幅に増強される。データが大幅にヨウ化物流出を増強SEM、* P <0.01対+ PKA-VX-770±手段。(b)の VX-770(10μM)ではなく、不活性類似体、V-09から1188(10μM)であり、リン酸化されたF508del-CFTRの活性を有する。データは、平均±SEMであり、n = 3 *** P <0.001対-Vx-770コントロール。10μMのVRT-532またはVX-770によるG551D-CFTRの(c)に増強。データは、平均±SEMであり、n = 5、** P <0.001、*** P <0.0001対-Vx-770コントロール。この研究(パネルAC)は、もともとバイオロジカル·ケミストリー誌に掲載されました。 Eckford、PDW。李、C; Ramjeesingh、M。ベア、CE嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)増強因子VX-770(Ivacaftor)はリン酸化依存ではなく、AT変異CFTRの不良チャンネルの門を開きますPに依存しない方法。 2012; 287:36639〜36649。 ©生化学·分子生物学のためのアメリカの社会。

R> IGHT "> 7.4
バッファ 名前 コンテンツ pHは 使用してpHを調整する
バッファ1 2%FOS -choline 10mMイミダゾール中の2%(w / v)のfosの -choline 14洗剤、25mMのHEPES 7.4 イミダゾール/ HEPES
バッファ2 10mMイミダゾール 10mMイミダゾール、25mMのHEPES(洗剤無し) 7.4 イミダゾール/ HEPES
緩衝液3 10 mMイミダゾール+ DDM 10mMイミダゾール、25mMのHEPES、1mMのドデシルβ-D-マルトシド 7.4 イミダゾール/ HEPES
緩衝液4 50 mMイミダゾール+ DDM 50mMのイミダゾール、25mMのHEPES、1mMのドデシルβ-D-マルトシド 7.4 イミダゾール/ HEPES
バッファ5 600 mMイミダゾール+ DDM 600 mMイミダゾール、25 mMのHEPES、1mMのドデシルβ-D-マルトシド 7.4 イミダゾール/ HEPES
バッファ6 75 mMのKI + DDM 75 mMのKI、20 mMのMOPS、1 mMのドデシルβ-D-マルトシド 7.4 KOH
バッファ7 75 mMのKI 75 mMのKI、20 mMのMOPS 7.4 KOH
バッファ8 25mMのHEPES + DDM 25mMのHEPES、25mMのNaClを、1 mMのドデシルβ-D-マルトシド 7.4 のHCl / NaOHを
バッファ9 75 mMのK-Gluの 75 mMのK-グルタミン酸、20mMのMOPS KOH /グルタミン酸
バッファ10 15 mMのKI 15 mMのKI、20 mMのMOPS 7.4 KOH

表1:バッファの表。

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Discussion

細胞の過剰発現システムの様々な、完全長の、機能的なCFTRの単離のための精製プロトコルの数が限られている。それはWT-CFTRまたはATPアーゼ、平面二重層内の単一チャネル測定を含むチャネル機能の直接測定を含むアッセイにおいて、高機能である適度な量のF508del-とG551D-CFTRの高濃縮の迅速な精製を可能にするように、ここで説明する方法は有利である小分子19-21の研究に関連性の高いシステムとCFTR人口チャネル機能の実証された措置。精製方法は、迅速かつ効果的な再構成プロトコルに統合され、他の方法よりしかし、精製されたタンパク質は、精製洗剤も同様除去に適しているという条件で、同様にこの再構成プロトコルに結合することができる。

EXCから、複雑で骨の折れる単一チャンネルの実験とは対照的にised膜パッチは、ここに記載される方法は、CFTRチャネル機能の堅牢なまだ直接的な評価を可能にし、独自にこの指標は、CFTRチャネルではなく、一つまたは少数の分子の大きな集団の機能を報告します。膜パッチを含む技術とは異なり、この方法は、結合された精製手順の有効性に応じて、関連タンパク質の近くまたは完全な非存在下でのチャネル上の小分子モジュレーターの効果の直接評価を可能にする。

プロトコル内の重要なステップ

陰イオンフラックスアッセイのためのCFTRの機能的再構成におけるいくつかの重要なステップがありますが、議定書で示されているノートのように、タンパク質の最適化:CFTRの再構成中の脂質の比率が鍵となります。このような最適化は、各CFTR遺伝子型に必要です。

技術の変更およびトラブルシューティング

ベースラインmVのRES記載のように調製したサンプルとヨウ化物流出アッセイの間に、ここで使用したプローブのためのponseは通常、-20 mVの-50程度である。この範囲からの著しい逸脱は、サンプルに問題がある可能性が示唆された。異なるメーカーから販売されている他のプローブは、ここに提供されたガイドラインと異なる場合があります。安定なベースラインが達成できない場合、残留洗剤または非アクティブ、変性、低品質のタンパク質は、ヨウする小胞を透過性にすることができる。

MgATPをの存在下でリン酸化されたCFTRを含むリポソームから依存ヨウ化物流出をバリノマイシン速度の有意な変化を検出に失敗すると、調査する必要がありそのすべてがいくつかの問題を、反映している可能性がある。これらの問題は、次のとおりです。質の悪い、部分的に変性CFTRまたは不純なCFTRを。再構成時の洗剤の不完全な除去;非最適なタンパク質:プロテオ中の脂質比。または不十分なバリノマイシンは、不完全な電荷散逸をレンダリングする、追加しました。

私odide流出アッセイは、アッセイの間に、事前にリン酸化CFTRタンパク質(プロトコールに記載されている)、またはリン酸化CFTRにを使用するための柔軟性を提供しています。再構成されたタンパク質は、精製手順の間にリン酸化されなかった場合、サンプルは、MgATPを持つPKAを添加することによって、ステップ3.2.7におけるヨウ化物流出実験の間にリン酸化することができる。この場合、ベースラインは、タンパク質が十分にバリノマイシンを添加した機能を測定する前にPKA酵素によってリン酸化されたことを確認するために、少なくとも5分間記録されていることを確認する。同様の結果がいずれかの方法により得られる。

プロトコルの間、モジュレータ分子は、MgATPその後バリノマイシンを添加することによって活性を測定する前に、5分間のCFTRタンパク質と相互作用させる。ほとんどのCFTR変調器は非常に親油性であるとして、それはCFTRタンパク質と一緒にお風呂と平衡協会のほかの間で時間がかかることがあります。アッセイは、目なしで進めることができません電子バリノマイシンを加え、したがってない情報は、このようにしてアッセイを実施することによって失われる。まだ初期の速度段階時に、ユーザは、タンパク質と小分子との相互作用の前に遅れ時間があるかもしれないことを懸念していない状況では、アッセイは、バリノマイシンを添加した後、変調器の急性添加することによって実施することができる測定。

技術の限界

前述のように、精製され再構成され、完全長CFTR分子の集団によって調整されたチャネル活動のこのproteoliposomalフラックスベースのアッセイは、直接活性を修飾リガンドを問い合わせるためのユニークな方法を提供する。しかし、この方法は、それがリガンドがCFTRを通じて流動の速度を変更するメカニズムへの洞察を提供していないという点で制限されています。理想的には、精製され、再構成されたCFTRのproteoliposomalフラックスアッセイは、平坦なリップと組み合わせて使用​​されるべきであるシングルチャネル活性のid二重層の研究。この組み合わせは、開放および/ ​​または閉鎖状態、すなわち 、リガンドに結合するタンパク質の状態への洞察を提供するであろう。

既存の方法に関して意義

調節またはシグナル伝達経路または重要なタンパク質-タンパク質の破壊を介して、例えば間接的にチャネル活性を変化させるために、別の細胞成分と相互作用する小分子モジュレーターに対するCFTRチャネルと小分子との直接的相互作用を評価するための方法の欠如は、現在存在する相互作用。ヨウ化物流出法は、CFTRのチャンネル活性を調節する任意の小分子のタンパク質との直接相互作用を実証する。測定値の低スループット様式にもかかわらず、小分子増強及び補正器とCFTRの直接的な相互作用を研究するためのこれらのユニークな方法でかなりの値が残っている。多くの小規模moleculこれは現在のCF研究の主要な推進力であるように、電子変調器は、学術グループと臨床的にCF患者を治療するための製薬業界の両方によって開発中である。これは、ここに記載される方法は、これらの分子の最も有望なの作用機構の開発と検証を補助することが予想される。

技術の将来の応用

ここで用いられる方法はまた、目的の他のタンパク質に適応するために非常に適している。実際に記載された方法の改変は、2つのP.を研究するために使用された緑膿菌の膜タンパク質は、これらの方法の有用性と汎用性を実証し、膜26,27を横切るアニオン性基材の移動に関与。追加の陰イオンチャネルおよびトランスポーターの研究におけるその使用は、将来予想される。

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Disclosures

著者は、ここに記載される精製方法の開発中に博士Mohabir Ramjeesinghの助言を認める。これらの研究は、ヘルスリサーチ(CIHR)および嚢胞性線維症カナダ(CFC)のカナダの研究所からのCEBに営業補助金によってサポートされていました。 PDWEはCIHRとCFCを通じてフェローシップ賞によって部分的にサポートされていました。著者は、嚢胞性線維症財団ピュー(CFFT)による補正、増強博士R·ブリッジズ(医学部のロザリンド大学と科学)から阻害剤化合物および流通の提供を認める。著者はまた、バキュロウイルス系を用いて、重量および変異型CFTRタンパク質を発現するにベイラー細胞培養施設(NIH助成金をP30 CA125123)により優れたサービスを認める。非アクティブなVX-770アナログ、V-09から1188には、バーテックス·ファーマシューティカルズの贈り物だった。

Acknowledgments

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fos-choline 14 detergent Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) F312 Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche (www.roche-applied-science.com) 04 693 132 001 EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack  Roche (www.roche-applied-science.com) 05 892 791 001
Ni-NTA Agarose Qaigen GmbH 1018240
Fisherbrand Screening columns Fisher Healthcare 11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K Millipore (www.millipore.com) UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840051C
POPC Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 850457C
PS, Porcine Brain Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840032C CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 841118C
Ergosterol Sigma (www.sigmaaldrich.com) 45480
Pierce Detergent removal spin column Thermo Scientific 87779 1 ml capacity columns
valinomycin Sigma (www.sigmaaldrich.com) V-0627
VX-770 (ivacaftor) Selleck Chemicals S1144
iodide selective microelectrode Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) LIS-146ICM  
 
 
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
Clampex 8.1 software Axon Instruments (www.axon.com) we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System  Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) LIS-146LICM-XS Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars Big Science Inc (www.stirbars.com) SBM-0502-CMB choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine GE Health Care (www.gelifesciences.com) 17-0042-01
Sonicator Laboratory Supplies Co, Inc. G112SP1G Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable

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References

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