Funktionel Opløsning og kanalaktivitet Målinger af renset Vildtype og Mutant CFTR Protein

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Beskrevet her er en hurtig og effektiv procedure for funktionel rekonstitution af oprenset vildtype og mutant CFTR-protein, som bevarer aktivitet for denne chloridkanal, som er defekt i cystisk fibrose. Iodid efflux fra rekonstitueret proteoliposomer medieret af CFTR tillader studier af kanalaktivitet og virkningerne af små molekyler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cystisk fibrose transmembrane Konduktans regulator (CFTR) er en unik kanaldannende medlem af ATP Binding Cassette (ABC) superfamilien af ​​transportører. Phosphoryleringen og nukleotid afhængig klorid kanal aktivitet af CFTR er ofte blevet undersøgt i hele cellesystemer og som enkelte kanaler i udskårne membran patches. Mange cystisk fibrose-mutationer er blevet vist at ændre denne aktivitet. Mens et lille antal oprensningsprotokoller er blevet offentliggjort, har en hurtig rekonstitution metode, der bevarer kanalaktivitet og en egnet fremgangsmåde til at studere befolkning kanalaktivitet i et oprenset system, har manglet. Her hurtige fremgangsmåder er beskrevet til oprensning og funktionel rekonstitution af CFTR-proteinet i fuld længde i proteoliposomer med defineret lipidsammensætning, der bevarer aktivitet som et reguleret halogenid kanal. Denne opløsning metode sammen med en ny flux-baserede assay af kanal aktivitet er et egnet system tilstudere befolkningen kanal egenskaber vildtype CFTR og sygdomsfremkaldende mutanter F508del- og G551D-CFTR. Specifikt fremgangsmåden har anvendelighed i at studere de direkte virkninger af phosphorylering, nukleotider og små molekyler, såsom forstærkere og inhibitorer på CFTR kanalaktivitet. Metoderne er også modtagelig for studiet af andre membran kanaler / transportapparater til anioniske substrater.

Introduction

Chloride transport over den apikale membraner af epitelceller i sådanne væv, som lunge, tarm, bugspytkirtel og svedkirtler medieres primært af cystisk fibrose transmembrane konduktionsregulatorkanaler (CFTR), en ATP- og phosphorylering reguleret medlem af ABC (ATP- Binding Cassette) C underfamilie af membranproteiner (revideret i 1). Ligesom andre medlemmer af ABCC underfamilien, CFTR er en stor, multi-spænder integreret membranprotein, som binder ATP ved to nukleotid-bindingssteder dannet ved grænsefladen af ​​dets nucleotid-bindende domæner (NBDs), hvor det har beskedne ATPase aktivitet ved en enkelt site. I modsætning til andre ABCC underfamilie- medlemmer, CFTR udviklet som et enestående reguleret Cl kanal snarere end som en aktiv solut transporter.

Mutationer i CFTR årsag cystisk fibrose, en sygdom, der påvirker flere organer, herunder lungerne, mave-tarmkanalen, pancreas og forplantningsorganer, hvilket fører til Morbidity og dødelighed hos unge voksne. Lungesygdomme typisk tegner sig for tidlig mortalitet i cystisk fibrose og i de fleste tilfælde er forårsaget af tab af CFTR-funktion på overfladen epitel af de ledende luftveje. Manglen på CFTR chloridkanal aktivitet forårsager en reduktion i både Cl - og vand bevægelse hen over overfladen epitel at ændre det fluide lag på den apikale overflade af cilierede respiratorisk epitel. Dette resulterer i en viskøs luftvej overflade væske, der svækker evnen af ​​cilierede respiratoriske epitelceller til effektivt klare patogener ud af luftvejene. Som følge heraf er de fleste CF-patienter lider af tilbagevendende anfald af lungeinfektion og lungeskade som følge af inflammation.

Som forventet, undersøgelser af virkningsmekanismen af ​​den normale CFTR-proteinet primært fokuseret på detaljerede elektrofysiologiske studier af dets kanal gating aktivitet. Enkelt kanal har vist direkte at CFTR fungerer som en PKA-afhængig Cl- Kanal, der besidder en ATP reguleret gate 2. Detaljerede elektrofysiologiske undersøgelser giver en hel del oplysninger om enkelte CFTR-kanaler 1,3, men der kan være bekymring for, om de særlige kendetegn ved en bestemt enkelt kanal, der er blevet undersøgt, er reflekterende af hele befolkningen i CFTR-kanaler og derfor enkelt kanal Resultaterne bør altid overvejes sammen med metoder til at studere den makroskopiske befolkning. Direkte assay af befolkningen kanalaktivitet af renset CFTR har potentialet til at give indsigt i den molekylære defekt forbundet med sygdomsfremkaldende mutationer og at køre opdagelse af kemiske modulatorer som reparation mutant CFTR proteiner. Til dato er der overstiger 1.900 forskellige mutationer i CFTR menes at forårsage cystisk fibrose 4. Den største mutation, F508del-CFTR, findes på mindst en allel i ca. 90% af patienterne i Nordamerika og Europa fører til protein misfoldning enND tilbageholdelse i det endoplasmatiske reticulum 5. F508del-CFTR har også andre konsekvenser, herunder defekte kanal aktivitet 6-9. Den resulterende fravær af CFTR fra celleoverfladen er forbundet med svær sygdom. G551D-CFTR, en mindre almindelig mutation, menes at være foldet korrekt endnu er dysfunktionel som et chlorid kanal på celleoverfladen 6. Udviklingen af ​​små molekyler korrektorer og potentiatorer har som mål at korrigere foldning og / eller handel med mutanter som F508del-CFTR til celleoverfladen, og forstærkende eller øge kanalaktivitet af mutationer som G551D når til stede på celleoverfladen, henholdsvis . Mens korrektorer VX-809 og VX-661 (endnu ikke er godkendt til brug hos patienter, den potentiator Kalydeco (ivacaftor, VX-770) bliver brugt på 150 mg hver 12. time i CF-patienter> 6 år med mindst et G551D -CFTR mutation, og for nylig for patienter med en af ​​G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pog G1349D. Kalydeco er både sikker og resulterer i forbedring af de kliniske foranstaltninger CF sygdom 10 men virkningsmekanismen af denne lille molekyle dårligt forstået på tidspunktet for FDA godkendelse til brug i patienter.

En håndfuld CFTR rensningsmetoder er blevet beskrevet tidligere 2,11-18, hvoraf mange kræver længere tid at gennemføre. I en nylig publikation 19, var en enestående hurtig oprensning og rekonstitution beskrevne metode for CFTR overudtrykt i S f 9 celleekspressionssystem, og det oprensede protein i definerede lipidsystemer blev anvendt til at udvikle en CFTR halogenid kanalaktivitet assay for en population af CFTR molekyler. Assayet rekapitulerer de kendte virkninger af phosphorylering, nukleotider og inhibitorer på CFTR-funktion. Systemet blev anvendt til at forespørge virkningerne af potentiator VX-770 / Kalydeco på Wt- (vildtype), F508del- og G551D-CFTR og det blev vist for den førstetid at lægemidlet interagerer direkte med CFTR-proteinet at forstærke dens kanalaktivitet i en ATP-uafhængig måde, hvilket viser anvendeligheden og anvendeligheden af ​​disse metoder til studiet af interaktionen af ​​CFTR og mutanter med nukleotider og små molekyler fra en population perspektiv besvare klinisk relevante spørgsmål om proteinet. Metoderne er også blevet anvendt til at undersøge andre potentiator molekyler og deres derivater 20, samt virkningerne af et lille molekyle corrector på aktiviteten af proteinet 21.

Efflux assays er blevet anvendt i mange undersøgelser, der tidligere for at undersøge aktiviteten af CFTR mutanter og virkningerne af CFTR-modulerende forbindelser på dets aktivitet, herunder hel celleassays ved hjælp af elektroder, radioaktive sporstoffer og fluoroforer 22,23, membranvesikler med ionselektive elektroder 24 og oprenset rekonstitueret CFTR med radioaktive sporstoffer 25. Men the brug af ionselektive elektroder at studere renset rekonstitueret CFTR blev først rapporteret for nylig 19. En tilpasning af den nuværende metode er blevet anvendt til rekonstitution og funktionel karakterisering af to membranproteiner i Pseudomonas aeruginosa, en fælles CF patogen. Rekonstituering af oprenset alge ydre membranprotein kombineret med iodid efflux målinger blev anvendt til at understøtte en model for anionisk alginat sekretion gennem denne transportør 26. Opløsning og iodid efflux målinger blev anvendt på det oprensede Wzx protein, som tillod en model, der skal foreslås, antyder en H + -afhængig antiport mekanisme til lipid-bundet oligosaccharid translokation på tværs af bakterielle indre membran af dette protein 27. I begge tilfælde iodid blev anvendt som et surrogat for den anioniske substrat, omend ved lavere kapacitet, end man kunne forvente for et nativt substrat. Fremgangsmåden kan være egnet til tilpasning til andre proteiner med Cationic transport- eller ledningsforstyrrelser veje for anioniske substrater.

Her er en hurtig oprensning procedure er beskrevet for CFTR-proteinet og dets rekonstituering i proteoliposomer med defineret lipid. Den hurtige rekonstituering procedure kan let skræddersyes til brug med CFTR renset ved andre metoder, forudsat at den type vaskemiddel, der anvendes i oprensningen er modtagelig for fjernelse af de metoder, der anvendes her, eller kan veksles til et passende rengøringsmiddel før rekonstituering procedure. Den iodid efflux metode til måling af kanal aktivitet af oprenset og rekonstitueret CFTR-proteinet er beskrevet i detaljer, og nogle typiske resultater, der kan opnås fra denne fremgangsmåde præsenteres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Oprensning af CFTR

BEMÆRK: Se venligst Tabel over materialer og udstyr til en liste af udstyr og materialer, der anvendes i denne protokol. En detaljeret protokol eksisterer for overekspression af human Wt-CFTR og mutanter i S f 9-baculovirusekspressionssystemet 17,28. Overudtrykke CFTR og forberede pellets af S f 9 celler ifølge denne protokol.

  1. Råt membran
    1. Opnå en frisk eller tø en frossen S f 9 cellepellet fra en 500 ml kultur af celler over-udtrykker wildtype-, F508del- eller G551D-CFTR-protein med en C-terminal His 10 -tagget, dyrkes ved standard cellekultur metoder som beskrevet tidligere 17,28. Cellepellets vil have et volumen på ca. 5 ml og en våd vægt på ca. 5 g.
    2. Resuspender S f 9 celler i 20 ml phosphatbufret saltvand (PBS) pH 7,4 med protease inhibitor cocktail (1 tablet per 50 ml) ved 4 ° C, sikrerprøve vises visuelt homogen og ingen klumper af celler tilbage.
    3. Lyse celler ved anvendelse af et højt tryk celle disruptor (tabel af materialer og udstyr) og nåede et minimum på 10.000 psi (fortrinsvis 15.000-20.000 psi) i 2 minutter per passage. Hold prøven ved 4 ° C under lysis.
      1. Saml prøven i et rør på is efter lysis periode derefter straks genindlæse prøven i cellen disruptor. Gentag lyseprocedure 3 gange. Undersøg under et mikroskop for at sikre, mindre end 10% forbliver intakt.
        BEMÆRK: andre metoder til at lysere celler, såsom glasperler, etc. ikke er strengt undersøgt for dette system, men en bruger kan finde en sådan alternativ metode er egnet.
    4. Centrifuge cellelyse materiale ved 4 ° C i en højhastigheds-centrifuge ved 2.000 xg i 20 min. Saml supernatanten og bortskaffe pillen. Fordel supernatanten blandt 20 rør og centrifuger prøverne i 1 time ved 4 ° C ved 125.000 xg i en bordplade ultracentrifuge.
    5. Fjern og kassér supernatanten, og pas på ikke at forstyrre pellet, og gemme pellets i de samme rør ved -80 ° C i mindre end 2 måneder før brug, eller at opbevare is og fortsætte med oprensningen samme.
  2. CFTR solubilization
    1. Opnå 1-4 friske eller frosne s f 9 rå membranpellets og resuspender hver i 1 ml buffer 1 (2% FOS -choline; se tabel 1 for komplet opskrift) ved 4 ° C på is under anvendelse af en 25 G kanyle og 1 ml sprøjte, indtil opløsningen er homogen ved øjet uden synlige cellemembran klumper. Hvis mere end én pille er at være opløst, fortsætte med at behandle hver prøve pr vejledningen for en enkelt pille under parallelt, pooling af prøverne ved trin 1.3.2.
    2. Opløs 1 mini protease inhibitor tablet i 1 ml puffer 2 (10 mM imidazol; se tabel 1), som mangler fos -choline 14 detergent (proteasehæmmere er 10x mere concentbedømt end deres anbefalede fortynding på dette tidspunkt), og der tilsættes 100 pi til resuspenderet rå membranpellet (proteasehæmmere er på deres anbefalede fortynding på dette tidspunkt). Sæt på is i 45-60 min med blanding ved inversion 5 gange hver 5 min.
    3. Centrifuge resuspenderet rå membranpellet i en bordplade ultracentrifuge i 25 minutter ved 125.000 xg og 4 ° C. Behold supernatanten, som indeholder opløst CFTR og kassér pillen.
  3. Kolonne binding, phosphorylering og eluering
    1. Vask 400 pi nikkel-NTA (nitrilotrieddikesyre) agarose opslæmning eller tilsvarende harpiks med 1 ml buffer 2 (10 mM imidazol; se tabel 1), som mangler detergent, til fjernelse af opløsningsmiddel og buffer ved 4 ° C. Gentag vask to gange mere.
    2. Kombiner solubiliseret CFTR, resterende proteaseinhibitor (900 pi) og nikkel harpiks (fra 400 pi opslæmning) til i alt 10 ml med puffer 2 (10 mM imidazol; se tabel 1) which mangler tilsat rengøringsmiddel. FOS -choline 14 koncentration effektivt fortyndes til 0,2% (w / v) på dette trin. Hvis der er flere rør, samle alle prøver indeholdende solubiliseret CFTR, proteaseinhibitorer, nikkel-NTA-harpiks og 0,2% (w / v) fos -choline-14 ved dette punkt. Inkuber i 60 minutter ved 4 ° C med forsigtig rystning.
    3. Pass CFTR-proteaseinhibitor-nikkel NTA opløsning ned en lille screening kolonne (tabel 1) eller en tilsvarende tom kolonne.
    4. Vask nikkel NTA resin, som tilbageholdes i kolonnen med 4 ml pr indledende pellet buffer 3 (10 mM imidazol + DDM; se tabel 1), som mangler fos -choline 14, men indeholder 1 mM DDM (dodecylmaltosid detergent), ved 4 ° C. Tilsætning af DDM vaskemiddel ikke væsentligt ændrer pH i denne buffer.
    5. Forbered PKA-MgATP opløsning ved tilsætning af 25 pi (5 mM, endelig koncentration) af MgATP, 2.500 U af cAMP-afhængig proteinkinase A, katalytisk underenhed (PKA) til 475 pi buffer 3 (10 mM imidazol + DDM, se tabel 1) til kolonnen. Phosphorylere protein ved forsegling den nederste ende af søjlen med en hætte eller Parafilm, og tilsætning af 500 pi af PKA-MgATP løsning for hvert oprindelige pellet anvendes.
    6. Inkuber ved stuetemperatur (20 ° C) i 20 minutter med forsigtig blanding og resuspension af harpiksen under anvendelse af en 1 ml pipette hver 2 min for at sikre, at PKA er kommet i kontakt med hele overfladen af ​​nikkel NTA resin.
    7. Tag låget af og eluering af PKA / MgATP løsning fra kolonnen. Vask søjlen med 2 ml puffer 3 (10 mM imidazol + DDM, se tabel 1) ved 4 ° C.
    8. Gange antallet af pellets, der anvendes i forsøget med 4. Vask søjlen med denne række ml puffer 4 (50 mM imidazol + DDM, se tabel 1) ved 4 ° C, ved tilsætning af 4 ml buffer til søjlen, så det til at flyde igennem og straks tilføje den næste 4 ml alikvot til kolonnen.
    9. tabel 1) ved 4 ° C pr indledende pellet anvendes gennem søjlen, 1 ml ad gangen uden pause for at tillade kolonnen at tørre, og indsamle hele Eluatet indeholdende oprenset CFTR i et enkelt rør.
    10. Koncentrer proteinprøve at fjerne imidazol og nedbrydningsprodukter med lav molekylvægt, der ved hjælp af en centrifuge filterindretning (100.000 molekylvægt cut-off), såsom beskrevet i tabel af materialer og udstyr eller lignende anordning, i alt 10 ml Buffer 6 (75 mM KI + DDM; se tabel 1) eller en anden buffer af valg indeholdende 1 mM DDM (såsom Buffer 7 for ikke-iodid efflux eksperimenter, 25 mM HEPES + DDM; se tabel 1), ved centrifugering ved 2.000 xg og 4 ° C for omkring 20 min indtil prøven koncentrater til 200 pi. Fortynd prøve til 10 ml og gentage koncentrationen trin.
      BEMÆRK: Det er vores erfaring (ikke offentliggjort), imidazol betydeligt inhibit ATPase aktivitet af CFTR og bør fjernes på dette trin ved fortynding og koncentration mindst to gange, hvis prøven skal anvendes til funktionelle målinger.
    11. Saml koncentreret renset CFTR. Hold ved 4 ° C i nærvær af DDM buffer indtil anvendelse inden for 1-2 dage eller fortsætte umiddelbart til rekonstituering trin. Må ikke nedfryses det oprensede protein, som i vores erfaring, vi observerer reduceret aktivitet.

2. Opløsning af CFTR

  1. Lipid forberedelse
    BEMÆRK: CFTR er blevet rekonstitueret i Egg PC, POPC, 2: 1 (w / w) ægge-PC: POPC (1: 1 w / w) blanding, eller en blanding af PE: PS: PC: ergosterol, 5: 2 : 2: 1 (w / w).
    1. For iodid efflux eksperimenter, tør 5 mg Egg PC (200 pi 25 mg / ml lager, se tabel af materialer og udstyr) under en strøm af argongas i 20 minutter ved stuetemperatur i en Pyrex eller anden robust (ikke-borsilicat ) glasrør.
    2. Brug absorbans ved 280 nm, en ELISA enssay eller anden metode, estimere koncentrationen af ​​det rensede CFTR-protein prøve. For iodid efflux eksperimenter med vildtype CFTR bruge et protein: lipid forhold på 1: 300 til 1: 3.000 (vægt / vægt) for at fremstille et tilstrækkeligt signal. For G551D- og F508del-CFTR, bruge et protein: lipid forhold på ca. 1: 200 til 1: 1.200 (w / w) for at opdage udstrømning aktivitet.
    3. Optimer protein: lipid ratio for hvert enkelt system. Beregn mængden af ​​oprenset protein nødvendig. Beregn mængden af buffer med 1 mM DDM forpligtet til at foretage en endelig volumen på 1 ml, dvs. 1 ml - (volumen af proteinopløsning påkrævet) = volumen af buffer.
      1. Tilføj den beregnede mængde af det ønskede puffersystem med 1 mM DDM til den tørrede lipid (men ikke tilføjer CFTR-proteinet på dette tidspunkt), og dækker glasrør med Parafilm. For iodid efflux eksperimenter resuspender lipider i Buffer 6 (75 mM KI + DDM, se tabel 1). For andre eksperimenter opblande i Buffer 8 (25 mM HEPES + DDM, seTabel 1) eller en anden ønsket interne buffer indeholdende 1 mM DDM.
      2. Vortex i 2 minutter ved stuetemperatur for at hjælpe til suspension af lipid i DDM buffer. Alternativt opvarmes prøven til 37 ° C i 1-2 minutter før omhvirvling.
    4. Suspender lipid gentagne gange ved stuetemperatur med en 1 ml sprøjte og 25 G nål, indtil der ikke lipid film er synlig på siderne af røret. Undgå at injicere luft ind i den løsning, som ville producere fine bobler og støtte i oxidation af iodid og lipider.
    5. Soniker suspenderet lipid i Parafilm dækket rør til en 20 sek burst i en bad-sonikator indeholdende is og derefter overføre straks is i 1 min. Gentag 3 gange.
      BEMÆRK: Intens lydbehandling vender iodid løsninger gul på grund af oxidation. Derfor undgå overdreven lydbehandling. Overvåg prøven for farveskift. Hvis en farveændring bemærkes, prøven kasseres og forberede igen. Ændringen i farve på grund af oxidation af nogle afiodidet vil resultere i oxidation af lipiderne under de samme betingelser. Forskyde luft fra røret med argongas før sonikering af opløsningen vil hjælpe med at forhindre oxidation af lipider og iodid. Intens lydbehandling kan bryde dårlig kvalitet eller ridsede glasrør med deraf følgende tab af prøven.
    6. Tilsæt mængden af ​​oprenset CFTR beregnet i trin 2.1.3 til sonikeret lipid prøven til et opnå et slutvolumen på 1 ml. Bland proteinet med lipid- og rengøringsmiddel ved resuspension 10 gange med en 25 G kanyle og 1 ml sprøjte.
    7. Indstil lipid og protein prøven på is i 30 minutter med omhvirvling af røret for at blande 5 gange hver 5 min.
  2. Vaskemiddel-bindende forberedelse kolonne
    1. Anskaf en engangsbrug kommerciel detergent-bindende spinkolonne (se tabel af materialer og udstyr) med en 1 ml volumen kapacitet og bryde fanen bund for at starte søjlen flyder.
    2. Centrifugeres søjlen i 2 minutter ved 2.000 xg for at fjerne opbevaring Buffer, og kassér denne buffer.
    3. Tilsæt 5 ml buffer 7 (75 mM KI, se tabel 1) til søjlen, og derefter centrifugeres ved 200 xg i 4 min til eluering af vaskepuffer. Gentag dette trin 2 gange mere for i alt 3 vaske for at fjerne alle spor af lagerbuffer. Kassér alle gennemstrømning.
      BEMÆRK: Det er afgørende, at bufferen anvendt til at vaske kolonnen ikke indeholder DDM eller andet rengøringsmiddel. Søjlen har en begrænset bindingskapacitet for vaskemiddel, og hvis en buffer indeholdende detergent bruges, vil søjlen være ineffektiv ved fjernelse af detergent fra protein-lipid-detergent prøve.
    4. Udportionerer omhyggeligt alle 1 ml af lipid-detergent-proteinprøve på toppen af ​​kolonnen harpiks og inkuberes prøven på toppen af ​​søjlen i 2 minutter ved stuetemperatur.
    5. Centrifugeres prøven ved stuetemperatur i 4 minutter ved 2.000 xg og indsamle den uklare proteoliposom prøve i et rent 1,5 eller 2 ml mikrofugerør eller et glasrør og placere sample på is.
    6. Saml resterende proteoliposomer i søjlen ved tilsætning af 200 pi buffer 7 (75 mM KI, tabel 1) eller en anden buffer (uden detergent) til toppen af søjlen og gentag centrifugeringen for 2 min.
    7. Tilsæt andet eluat til proteoliposom prøve, hvis det ser uklar.
    8. Opbevar prøven ved 4 ° C natten over eller brug straks for iodid efflux målinger.

3. Iodid udstrømning Målinger for renset, Rekonstitueret CFTR

  1. Generering af et iodid gradient over proteoliposomal membran
    1. Pre-dønning Sephadex G50 perler i Buffer 9 (75 mM K-Glu, kalium glutamat, se tabel 1), (ca. 5 g tør perler i 50 ml buffer) eller ønskede eksterne buffer ved stuetemperatur i mindst 2 timer eller ved 4 ° C natten over.
    2. Forbered 4 Sephadex G50 kolonner mættet i Buffer 9 (75 mM K-Glu, se tabel 1) eller andenbuffer i små screening kolonner ved at indlæse harpiks til mindst ¾ fuld i kolonnen.
    3. Centrifugeres i 4 minutter ved 2.000 xg for at fjerne overskydende buffer fra harpiksen. Der skal være ca. 2,25 ml pakket hydreret harpiks i søjlen ved enden af ​​centrifugering.
      BEMÆRK: Resin bør let hydreret, men ikke nedsænket i væske og en efterfølgende kort tur bør ikke elueres betydelige mængder buffer. Det er afgørende for en vellykket eluering af proteoliposom prøve at kolonnen harpiks er hverken for våd eller for tør, og brugeren kan være nødvendigt at eksperimentere med kolonnerne for at blive fortrolig med de mest succesfulde bufferudskiftning forhold.
    4. Tilsættes forsigtigt 125-150 pi proteoliposom prøve til toppen af ​​hver kolonne og centrifugeres i 4 minutter ved 2.000 x g.
    5. Pool proteoliposom Eluater sammen til øjeblikkelig brug i iodid efflux eller andre eksperimenter.
      BEMÆRK: Den eluerede volumen fra hver kolonne skal være nogenlunde150 pi og prøven skal være noget uklar, men mindre uklar end den oprindelige prøve. Større mængder eller klare eluater tyder på, at kolonnerne ikke er blevet tørret tilstrækkeligt, eller er blevet tørret for meget, henholdsvis og vil ikke resultere i en succesfuld iodid efflux eksperiment.
  2. Iodid efflux assay
    1. Vask en iodid selektiv micro elektrode (tabel af materialer og udstyr) i udstrakt grad med de-ioniseret vand, og derefter inkuberes i 20 min før forsøget i Buffer 10 (15 uM KI, se tabel 1). Vask elektroden igen grundigt med afioniseret vand.
    2. Tilsæt 150 pi af lægemiddel (20 uM typiske koncentration for at frembringe en slutkoncentration på 10 uM i assay) i Buffer 9 (75 mM K-Glu, se tabel 1) eller vehikel i puffer 9 til en brønd i en plade med 96 brønde med en lille loppe omrørerstang.
      1. Sørg for, at der ikke er nogen bobler til stede. Brug en pipettespids til at fjerne omstrejfendebobler. Hvis der anvendes en lægemiddelopløsning, at den endelige DMSO-koncentration i brønden er mindre end 1% (v / v) (typisk 0,1-0,2% (v / v)).
    3. Tilsæt 150 pi rekonstitueret CFTR-protein, der blev produceret i afsnit 3.1 i Buffer 9 (75 mM K-Glu, se tabel 1) til brønden med lægemiddel eller buffer, til frembringelse af et samlet volumen på 300 pi i brønden af pladen.
    4. Placer 96-brønds plade på en omrøringsplade og der omrøres ved 130 rpm (eller ved en moderat hastighed på ca. ¼ af den maksimale hastighed).
    5. Sæt spidsen af ​​iodidet selektiv elektrode forsigtigt ned i brønden med prøven, således at spidsen ikke rører bunden af ​​brønden eller rammes af omrører. Kontroller, at referenceelektroden, hvis separat, er også i kontakt med opløsningen i brønden.
    6. Optag tracings hjælp af en hjemmelavet eller kommercielt computerprogram, grænseflader med elektroden (se tabel af materialer og udstyr for detaljer).Brug en samplinghastighed på 2 Hz, med filtrering af signalet gennem et lavpasfilter.
    7. Lad prøven henstår i 5 min for at fremstille en stabil flad, eller i nærheden flad baseline under optagelse.
    8. Tilsæt 3 pi MgATP (100 mM stamopløsning fremstillet i dH2O og justeret til pH 7 med KOH; 1 mM slutkoncentration) til prøven for at aktivere protein. Tillad ~ 5 min for at nå en ny stabil baseline. Juster altid pH af 100 mM MgATP lager til neutral før brug for at undgå ændringer i pH i den eksterne buffer.
    9. Tilsæt 3 pi valinomycin lager (2 uM; 20 nM slutkoncentration) til prøven til aktivering ændringer i potentielle forskel genereret af iodid-selektive konduktans gennem CFTR. Optag faldende hældning (fald i mV) på grund af CFTR-medieret iodid efflux aktivitet i mindst 5 min.
    10. For at sikre, at indfangning af iodid i proteoliposom lumen var tilstrækkelig, tilsættes 3 pi 10% (v / v) Triton X-100 til prøven. Significant og umiddelbar iodid frigivelse indikerer, at tilstrækkelig iodid er fanget i vesiklerne, således at fange ikke var den begrænsende faktor for ændringer i hældning bestemt i 3.2.9 men snarere CFTR-medieret aktivitet.
    11. Vask elektroden og omrører grundigt med afioniseret vand efter behandling af prøverne med lægemiddel eller med Triton X-100 for at sikre alle spor af disse reagenser er blevet fjernet for at undgå kontaminering af den næste prøve.
    12. Fremstilles en serie af fortyndede KI koncentrationer i det mikromolære til nanomolære område i Buffer 9 (K-Glu-buffer, se tabel 1). Optag mV reaktion af elektroden til hver koncentration fra 0 til den højeste koncentration fremstillet. Der tegnes en standardkurve, hvor sonden respons (mV) er afbildet vs. log af den molære iodid koncentration. Brug standardkurven til at konvertere mV reaktion af sonden under efflux eksperiment koncentration af iodid frigives.
      BEMÆRK: Forbered en kalibrering CURve på en ugentlig basis, indtil en bruger er sikker på, hvor hurtigt respons af sonden ændringer. Der vil være et skred i respons og følsomhed af sonden over tid. Som probe aldre, vil reaktion nedbrydes. Dette kan delvis ophæves ved at ændre de interne løsninger periodisk og omfattende vask af sondens spids i vand efter brug, hvilket sandsynligvis grænser vedhæftning af molekyler til proben overflade.
    13. Bestem den gennemsnitlige hældning af koncentrationen versus tid plot for hver proteoliposom prøve for de sidste 30 sek før tilsætning af MgATP, og efter tilsætning af valinomycin men før tilsætning af Triton X-100. Træk den baseline hældning fra valinomycin at bestemme CFTR-medierede iodid efflux aktivitet for at prøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beskrevet i denne skriftlige publikation er metoder til at rense, rekonstituering og måle reguleret kanal aktivitet CFTR-proteinet. Figur 1A viser arbejdsgangen til rensning, rekonstituering og iodid efflux procedurer. Metoder til opløsning og kanal aktivitetsmålinger ved iodid flux er også vist nærmere i den tilhørende video.

Oprensning og rekonstituering af CFTR i proteoliposomer

CFTR kan funktionelt udtrykkes ved høje niveauer i S f 9 celler under anvendelse af rekombinant baculovirus indeholdende Wt eller mutant CFTR cDNA 2. Mens ikke et mammalt ekspressionssystem, blev CFTR udtrykkes under anvendelse af baculovirus-system S f 9 celler for at sikre et højt niveau af ekspression. CFTR produktion kan være så høj som 1% af det totale celleprotein 17,28. S f 9- baculovirussystem har den fordel, at proteinet er kernen glycosyleret ogkvalitetskontrol maskiner i dette system er relativt eftergivende, således at CFTR og mutanter kan frembringes på celleoverfladen. En ti histidinmærke blev manipuleret på carboxyterminalen at tillade oprensning på grund af affiniteten af ​​dette mærke for nikkel-NTA. Den C-terminale tag med til at forhindre co-oprensning af trunkerede CFTR proteiner og udbytter funktionelle CFTR-protein i ATPase, enkelt kanal og iodid efflux eksperimenter 17,19,24,28,29. Men oprensningsprotokollen beskrevet her bør være egnet til N-terminalt mærkede CFTR samt.

Tidligere er det blevet vist, at CFTR-protein effektivt kan ekstraheres fra S f 9 plasma membranpræparater under anvendelse NaPFO (natrium pentadecafluoro-octanoat) ved stuetemperatur 15. Imidlertid er følsomheden af ​​NaPFO udfælde ved 4 ° C, en temperatur, der bidrager til at bevare korrekt foldet protein, og den langvarige dialyse kræves for at fjerne PFO ikke var modtagelig for rapid rensning og rekonstituering metoder bestemt til at maksimere aktivitet af proteinet i efterfølgende assays af CFTR-funktion. En vurdering af et panel af detergenter (herunder dodecyl-β-D-maltosid (DDM), 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS), fos -choline 12 og FOS -choline 14 viste, at FOS -choline 14 var mest effektiv solubilisering human CFTR-His 10 fra S f 9 membraner, og at DDM var effektiv til at holde ATPase aktivitet af CFTR i detergentopløsning (data ikke vist). Således kan en fos -choline 14 detergentekstraktion trin udføres, efterfulgt af udveksling til DDM detergent for at opretholde aktiviteten af ​​proteinet.

Efter oprensning og koncentration, er et protein fraktion opnået i DDM detergent, der indeholder en ~ 150 kDa båndet som sin hovedkomponent (figur 2; sølvfarve). Denne molekylvægt svarer til human CFTR udtrykkes i S <em> f 9cells og analyseret ved SDS-PAGE, hvor det mangler de typer af kompleks glycosylering karakteristisk for CFTR i pattedyrceller. De 150 kDa arter synes at være ca. 90% rent efter SDS-PAGE-analyse og sølvfarvning. Western blotting ved anvendelse af M3A7 anti-CFTR-antistof bekræfter, at denne mus monoklonale rettet mod NBD2 reagerer med 150 kDa-båndet (figur 2; blot). I visse undersøgelser spormængder af bestanddele med lavere molekylvægt er til stede som mindre bånd synlige på gelen, ved ~ 60 og ~ 80 kDa (data ikke vist). Den M3A7 anti-CFTR-antistof reagerer med de 60 og 80 kDa bånd, men reagerer ikke med andre ikke-CFTR-proteiner (data ikke vist). Dette antyder, at de lavere molekylvægt komponenter er CFTR nedbrydningsprodukter co-oprenset med CFTR via deres C-terminale His-tag. Oprensningen sker i nærvær af proteaseinhibitorer, og det fremgår, at disse komponenter er til stede i cellerne før oprensning procedure Is udføres. Koncentrationen trin i proceduren fjerner næsten alle de kontaminerende fragmenter med lavere molekylvægt. CFTR kan rekonstitueres på dette tidspunkt, eller protein fra en anden oprensning procedure kan anvendes i rekonstituering protokollen.

En liposomal flux assay rapporterer den funktionelle rekonstituering af en population af oprensede og rekonstituerede CFTR molekyler som reguleret, anionselektive kanaler

For at afgøre, om en væsentlig del af renset CFTR blev opløst som et reguleret klorid kanal med de ovennævnte metoder blev en proteoliposomal halogenid flux assay udviklet som rapporterer aktiviteten af en population af rekonstituerede CFTR molekyler (vist skematisk i figur 1B). Hvis der i værste fald, at størstedelen af ​​de rekonstituerede CFTR molekyler misfoldet, disse molekyler vil undlade at give en ledningsevne, undlader at skelne mellem kationer og anionerog / eller porten vil mangle regulering af PKA phosphorylering og nukleotider. Lee et al. Har offentliggjort metoder, der tillader beregning af procent funktionel rekonstitution af et membranprotein 30.

Tomme liposomer (mangler CFTR) eller proteoliposomer (forsynet rekonstitueret CFTR) er fyldt med KI (75 mM) og ekstra liposomal iodid udveksles med kalium glutamat (75 mM) ved at passere liposomer gennem en gelfiltreringssøjle. KI indlæst proteoliposomer sættes til en brønd indeholdende K-Glu (kaliumglutamat) at skabe en passiv gradient for iodid og efflux overvåges som stigninger i extraliposomalt iodid over tid ved hjælp af et iodid følsom mikroelektrode 24. Udstrømningen af ​​negativt ladede iodid resulterer i et fald i mV signal (signal bliver mere negativ). Når koncentrationen af iodid frigives over tid afbildes hældningen omvendt (som i figur 3) til at vise en stigning i iodid i exintern opløsning over tid.

K-Glu blev valgt som impermeabel modion da det er et eksempel på en anion, som ikke passerer gennem CFTR-proteinet, synes ikke at forårsage betydelig blokering af pore under de anvendte betingelser, og ikke forårsager interferens med iodid selektive elektrode. Et assay kan optimeres omkring en anden anion, forudsat at det opfylder disse kriterier. Halvfjerds-fem mM anion koncentrationer blev udvalgt empirisk som koncentrationer, der gav god fældefangst og tilstrækkelige signaler til måling i analysen under de beskrevne betingelser. Der vil ikke være væsentlige ingen iodid frigivelse fra iodid liposomer mangler funktionelt rekonstitueret CFTR indtil vesiklerne er permeable med detergent (figur 3; kontrol spor), hvorimod CFTR-rekonstitueret, iodid-loaded proteoliposomer mægle iodid udledning i den ydre opløsning efter tilsætning af MgATP (1 mM) for at åbne CFTR-kanal og valinomycin(20 nM) for at forhindre udviklingen af en membran potentiale (figur 3A, se spor for protein: lipid masseforhold på 1: 3.000 (vægt / vægt)).

Valinomycin er en ionophor, der shuttles kalium specifikt over membranen, ned dets koncentrationsgradient, og koncentrationen af ​​20 nM blev valgt empirisk som den højeste koncentration, som ikke forstyrrer integriteten af ​​tom liposom i det foreliggende system. Dette kan skal optimeres for hvert enkelt system. Uden tilsætning af valinomycin, der er en forkortet iodid frigivelse af et par nM, der hurtigt når et plateau (data ikke vist). Selv om disse forhold er kendt for ellers maksimalt aktivere anion kanalaktivitet af CFTR (som i figur 3A), fremgår det, at manglen på et signifikant respons afspejler den øjeblikkelige stigning i intraliposomal positiv ladning medieret af iodid ledning gennem anionselektive pore af CFTR umiddelbart begrænsende continuskellige iodid efflux hvor valinomycin ikke er inkluderet. Denne valinomycin-medieret reaktion bekræfter, at iodid efflux var begrænset i de tidligere forsøg på grund af afgift ophobning, støtte anion selektivitet rekonstitueret CFTR. Hvis CFTR manglede denne selektivitet, vil både kalium og iodid har kunnet udstrømning fra proteoliposomer derved ophævelse af behovet for valinomycin at indlede flux.

Iodidet koncentrationer målt på disse indledende tidspunkter var empirisk valgt at falde inden for det optimale følsomhedsområde for iodid sensing elektrode anvendes. Anvendelse af andre iodid elektroder kan kræve optimering af disse faktorer. Efter at have nået et plateau, tilsættes Triton X-100 til permeabilisere de proteoliposomer og slip resterende fanget iodid. I modsætning til de oprindelige iodid målinger (opnået mellem 1 og 2 minutter efter valinomycin tilsætning), aflæsninger ved disse effektmål ikke er i det lineære område af elektrode calibrering kurve (data ikke vist), hvilket forhindrer en nøjagtig evaluering af den del af liposomer fra hvilken CFTR-protein er i stand til at mediere iodid efflux forhold til det samlede antal af liposomer i assayet, eller procent funktionel rekonstitution.

Hastigheden af ​​iodid flux afspejler antallet af CFTR proteinmolekyler den åbne sandsynlighed og ensartet ledningsevne af hvert CFTR kanal. Derfor bør satserne for iodid efflux være afhængig af antallet og åben sandsynlighed for hver CFTR molekyle. Forudsigelsen blev testet i dette system ved at øge antallet af CFTR-molekyler pr liposom. Forholdet mellem aktiveret (phosphoryleret og MgATP behandlet) CFTR-protein og lipid blev varieret, med de forhold, der spænder fra 1: 300-1: 3000 (w / w) (figur 3A). Jo større mængden af ​​rekonstitueret CFTR stede i proteoliposomer, jo større hastigheden af ​​efflux (målt mellem 1-2 minutter efter valinomycin tilsætning), støtte forudsigelse that efflux satser er afhængig af antallet af CFTR-molekyler i hver liposom. Den efflux, der opnås ved hjælp af specifikt protein: lipid forhold er reproducerbare mellem eksperimentelle dage og proteinafgrøder oprensninger, hvilket understreger den stramning af denne metode.

Satsen for iodid efflux synes at forholde sig til den åbne sandsynlighed for CFTR-kanalen i denne rekonstitueret system. Som kræves phosphorylering af PKA for CFTR aktivering 31 (og gennemgang af 32), forventes det, at der vil være en lav iodid efflux i vesikler indeholdende CFTR, der ikke er phosphoryleret med eksogen PKA behandling, hvor det åbne sandsynlighed er lav . I proteoliposomer, der er blevet PKA behandlet, vil den åbne sandsynlighed være meget højere, hvilket resulterer i en meget større forventet hastighed af udstrømning. I praksis, for PKA-behandlede CFTR i nærvær af 1 mM MgATP i dette system, hastigheden af ​​iodid efflux målt fra et til to minutter efter tilsætning af valinomyci er cirka fire gange den sats på CFTR-protein underkastet MgATP men ikke PKA (figur 3B). Disse resultater understøtter den hypotese, at efflux sats vedrører kanalisere åben sandsynlighed. I praksis kan det være vanskeligt at sammenligne aktiviteten i dette assay direkte at åbne sandsynlighed da andre faktorer som tidsafhængige ændringer i den elektrokemiske drivkraft vil påvirke den observerede efflux aktivitet. Læseren advares om, at dette assay er ikke en erstatning for detaljerede enkelt kanalaktivitet optagelser.

Interessant er der typisk observeres en lav iodid efflux af "ikke-phosphoryleret" protein i nærvær af MgATP som er betydeligt større end udstrømningen fra liposomer mangler CFTR (figur 3B, C). Denne lave sats kan afspejle basal phosphorylering af CFTR i S f 9 celleekspressionssystem før oprensning 33. CFTR oprenset fra andre udtryk systeMS kan have forskellige niveauer af basal phosphorylering og derfor forskellig restaktivitet.

Denne hurtige oprensningsprotokol udbytter Wt-CFTR fra S f 9 celler på nær homogenitet, men for F508del- og G551D-CFTR er fremgangsmåden bedre beskrives som en procedure berigelse. Nogle kontaminerende bånd observeret via SDS-PAGE 19, hvoraf mange afspejler CFTR nedbrydningsprodukter, der er reaktive for CFTR-antistoffer og synes at være til stede, før cellesprængning. Rekonstituering og iodid flux metoder er egnede til disse berigede prøver af klinisk relevante mutanter. Som vist i figur 3D, er betydelig iodid efflux målt for både F508del- (protein: lipid masseforhold på ca. 1: 600) og G551D-CFTR (protein: lipid forhold på ca. 1: 300). Mens begge mutanter har lavere absolut aktivitet end Wt-CFTR (protein: lipid masseforhold på 1: 1.200), er det vanskeligt at sammenligne prøverne direkte kvantificeringkan ikke være så nøjagtig for mutanter, der er forurenet med CFTR nedbrydningsprodukter. Men både F508del-CFTR og G551D oprenset ved disse metoder, rekonstitueret og underkastet efflux målinger reagerer som forventet på små molekyler potentiatorer (Figur 4) og viser lignende kanal funktion til protein renses ved strengere PFO oprensningsmetode 19.

Kanalen aktivitet af oprenset og rekonstitueret CFTR kan moduleres ved småmolekylære inhibitorer og potentiatorer

CFTR inh -172 34 er den mest specifikke CFTR inhibitor til rådighed, der har vist sig at hæmme den åbne sandsynlighed af CFTR chloridkanaler i enkelt kanal ledningsfunktion 35 og til at inhibere CFTR aktivitet i andre undersøgelser 22,36. Som vist i figur 3C, er hastigheden af efflux efter valinomycin tilsætning væsentligt reduceret ved forbehandling med CFTR inh ub> -172. Derfor dette assay af kanalaktivitet af en population af oprensede og rekonstituerede CFTR molekyler er effektiv rapportering aktivitet modulatorer såsom inhiberende ligand CFTR inh -172.

Assayet er følsomt og meget anvendelig til undersøgelse af virkningerne af små molekyle potentiator behandling samt. Som vist i figur 4, er alle tre CFTR testede genotyper betydeligt forstærket af aktive små molekyler potentiatorer såsom Kalydeco / VX-770 eller VRT-532 (figur 4C; vist for G551D), mens en inaktiv analog ikke har nogen virkning på iodid efflux aktivitet af CFTR (vist for F508del-CFTR; figur 4B). Analysen kan anvendes til undersøgelsen af ​​potentiator koncentrationsafhængighed, og den rolle, ATP og phosphorylering på potentiator-medieret CFTR-aktivitet.

27fig1highres.jpg "width =" 700 pixel "/>
Figur 1:. Assay design og workflow (A) Workflow for arbejdet er beskrevet i denne publikation (B) Skematisk repræsentation af iodid efflux eksperiment.. En modificeret udgave af panel B blev oprindeligt offentliggjort i The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; og Bear, CE cystisk fibrose transmembrane konduktionsregulatorkanaler (CFTR) potentiator VX-770 (Ivacaftor) Åbner den defekte Channel Gate af mutant CFTR i en phosphoryleringsafhængige men ATP-uafhængig måde. 2012; 287: 36639-36649. © The American Society for Biokemi og Molekylær Biologi.

Figur 2
Figur 2:. CFTR hurtig oprensning fremgangsmåde giver oprenset Wt-CFTR-protein Sølvfarvet SDS-PAGE-gel og Western blot ved hjælp af M3A7 CFTR-antistof til oprenset humant Wt-CFTR-protein i DDM detergent (1 ug og 0,1 ug til gelen og blottet, henholdsvis), isoleret fra S f 9 celler overudtrykker a (His) 10 tagged version af proteinet. Wt-CFTR (> 90% rent) detekteres ved 150 kDa, passende til dette protein mangler kompleks glycosylering. Denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; og Bear, CE cystisk fibrose transmembrane konduktionsregulatorkanaler (CFTR) potentiator VX-770 (Ivacaftor) Åbner den defekte Channel Gate af mutant CFTR i en phosphoryleringsafhængige men ATP-uafhængig måde. 2012; 287: 36639-36649. © The American Society for Biokemi og Molekylær Biologi.

Figur 3
Figur 3: iodide efflux assay rapporter reguleret kanal aktivitet for den rensede og rekonstituerede CFTR-protein. (A) Oprenset og phosphoryleret Wt-CFTR rekonstitueret ved protein: lipid-forhold på 1: 300 (vægt / vægt), 1: 1.200 (vægt / vægt) og 1: 3.000 (vægt / vægt) medierer iodid efflux fra vesiklen lumen hovedparten bad over tid efter tilsætning af 1 mM MgATP og 20 nM valinomycin. Tilsætning af 0,1% (w / v) Triton X-100 til permeabilisere proteoliposomer udgivelser fanget iodid i vesiklen lumen ved slutningen af eksperimentet. (B) Initial iodid efflux tidsforløb for rekonstitueret Wt-CFTR-protein, som ikke havde været pre-phosphorylerede. (C) indledende iodid efflux satser demonstrere afhængigheden af den observerede aktivitet på funktionel CFTR-protein. PKA phosphorylering af proteinet er påkrævet for signifikant kanalaktivitet, som hæmmes ved tilsætning af CFTR-inhibitor, CTTR inh -172 (20 uM). Data er middel ± SEM; * P <0,05, *** p <0,0001. (D) Flere genotyper producere regulerede CFTR signaler i iodid efflux analysen, herunder Wt-, F508del- og G551D-CFTR versus kontrol. Data er middel ± SEM; * P <0,05; *** P <0,0004 vs. kontrol. Denne forskning (dele af data i paneler A, C og D) blev oprindeligt offentliggjort i The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; og Bear, CE cystisk fibrose transmembrane konduktionsregulatorkanaler (CFTR) potentiator VX-770 (Ivacaftor) Åbner den defekte Channel Gate af mutant CFTR i en phosphoryleringsafhængige men ATP-uafhængig måde. 2012; 287: 36639-36649. © The American Society for Biokemi og Molekylær Biologi.

Figur 4
Figur 4: phosphorylering-afhængige potensering af CFTR af små molekyler kan forespørges ved hjælp afiodid efflux system til Wt-, F508del- og G551D-CFTR. (A) WT-CFTR forstærkes betydeligt ved potentiator VX-770 (10 uM), kun i PKA-phosphoryleret tilstand. Data er middel ± SEM, * p <0,01 vs. + PKA-VX-770. (B) VX-770 (10 uM), men ikke en inaktiv analog, v-09-1188 (10 uM), potenserer iodidet efflux signifikant aktivitet af phosphoryleret F508del-CFTR. Data er middel ± SEM, n = 3, *** p <0,001 vs. -VX-770 (c) Potentiering af G551D-CFTR ved 10 uM VRT-532 eller VX-770 kontrol.. Data er middel ± SEM, n = 5, ** p <0,001, *** p <0,0001 vs. -VX-770 kontrol. Denne forskning (paneler ac) blev oprindeligt offentliggjort i The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; og Bear, CE cystisk fibrose transmembrane konduktionsregulatorkanaler (CFTR) potentiator VX-770 (Ivacaftor) Åbner den defekte Channel Gate af mutant CFTR i en phosphoryleringsafhængige men ATP-uafhængig måde. 2012; 287: 36639-36649. © The American Society for Biokemi og Molekylær Biologi.

r> ight "> 7.4
Buffer Navn Indhold pH Indstil pH ved anvendelse af
Buffer 1 2% FOS -choline 2% (w / v) fos -choline 14 detergent i 10 mM imidazol, 25 mM HEPES 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 2 10 mM imidazol 10 mM imidazol, 25 mM HEPES (ingen detergent) 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 3 10 mM imidazol + DDM 10 mM imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM dodecyl-β-D-maltosid 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 4 50 mM imidazol + DDM 50 mM imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM dodecyl-β-D-maltosid 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 5 600 mM imidazol + DDM 600 mM imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM dodecyl-β-D-maltosid 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 6 75 mM KI + DDM 75 mM KI, 20 mM MOPS, 1 mM dodecyl-β-D-maltosid 7.4 KOH
Buffer 7 75 mM KI 75 mM KI, 20 mM MOPS 7.4 KOH
Buffer 8 25 mM HEPES + DDM 25 mM HEPES, 25 mM NaCl, 1 mM dodecyl-β-D-maltosid 7.4 HCI / NaOH
Buffer 9 75 mM K-Glu 75 mM K-glutamat, 20 mM MOPS KOH / Glutaminsyre
Buffer 10 15 mM KI 15 mM KI, 20 mM MOPS 7.4 KOH

Tabel 1: Tabel over buffere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der har været et begrænset antal oprensningsprotokoller for fuld længde, funktionel CFTR isolation fra en række cellulære overekspression systemer. Den her beskrevne metode er fordelagtig, da det giver mulighed for hurtig oprensning af Wt-CFTR eller høj berigelse af F508del- og G551D-CFTR i moderate mængder, er yderst funktionel i analyser, herunder ATPase og direkte målinger af kanal-funktion, herunder enkelt kanal målinger i plane dobbeltlag systemer og demonstreret foranstaltninger af CFTR befolkning kanal funktion, der er yderst relevante for studiet af små molekyler 19-21. Oprensningsmetoden er integreret i en hurtig og effektiv rekonstituering protokol, kan dog oprenset protein fra andre metoder kobles til denne rekonstituering protokol samt, forudsat at oprensningen detergent er modtagelig for fjernelse tilsvarende.

I modsætning til komplicerede og omhyggelige enkelt kanal eksperimenter fra excserede membranlapper fremgangsmåderne beskrevet her tillader en robust og enkel vurdering af CFTR-kanal funktion, og entydigt denne foranstaltning rapporterer funktionen af ​​en større population af CFTR kanaler snarere end en eller nogle få molekyler. I modsætning til teknikker, der involverer membranlapper denne metode giver mulighed for direkte vurdering af virkningerne af små molekyler modulatorer på kanalen i nærheden af ​​eller fuldstændigt fravær af associerede proteiner, afhængigt af effektiviteten af ​​det koblede oprensningsprocedure.

Kritiske trin i protokollen

Selv om der er flere kritiske trin i funktionel genetablering af CFTR for anion flux assay, som angivet noter i protokollen, optimering af proteinet: lipid-forhold i CFTR rekonstitution er nøglen. En sådan optimering er nødvendig for hver CFTR genotype.

Ændringer og fejlfinding af teknikken

De baseline mV response for sonden her anvendt under iodid efflux assay med prøver fremstillet som beskrevet er typisk -20 til -50 mV. Væsentlige afvigelser fra dette interval tyder der kan være problemer med prøven. Andre sonder, der sælges af forskellige producenter kan afvige fra de retningslinjer her. Hvis der ikke kan opnås en stabil basislinje, kan resterende rengøringsmiddel eller inaktive, denatureret, dårlig kvalitet protein permeabiliserende vesiklerne til iodid.

Manglende opdage en væsentlig ændring i antallet af valinomycin afhængig iodid efflux fra liposomer indeholdende phosphoryleret CFTR i nærværelse af MgATP kan afspejle en række spørgsmål, som alle bør undersøges. Disse spørgsmål omfatter: dårlig kvalitet, delvist denatureret CFTR eller uren CFTR; ufuldstændig fjernelse af detergent under rekonstituering; ikke-optimal protein: lipid-forhold i proteoliposomer; eller utilstrækkelig valinomycin tilføjede, rendering afgift dissipation ufuldstændig.

Den iodide efflux assays giver fleksibilitet til at anvende præ-phosphoryleret CFTR-proteinet (som beskrevet i protokollen), eller phosphoryleret CFTR under assayet. Hvis det rekonstituerede proteinet ikke blev phosphoryleret under oprensningen procedure, kan prøven phosphoryleret under iodid efflux eksperimentet på trin 3.2.7, ved tilsætning af PKA med MgATP. I dette tilfælde sikre, at baseline registreres i mindst 5 min for at sikre, at proteinet er blevet tilstrækkeligt phosphoryleret af PKA enzym før måling funktion med tilsætning af valinomycin. Lignende resultater opnås ved enten metoden.

Under den protokol, er modulatoren molekyle lov til at interagere med CFTR-proteinet i 5 minutter før måling af aktivitet ved tilsætning af MgATP og derefter Valinomycin. Da de fleste CFTR modulatorer er meget lipofile, kan det tage tid mellem tilføjelse til bad og ligevægt samarbejde med CFTR-proteinet. Analysen kan ikke fortsætte uden the tilsætning af valinomycin, og dermed ingen oplysninger går tabt ved at udføre analysen på denne måde. I situationer, hvor brugeren ikke er bekymret for, at der kan være en latenstid før interaktion af den lille molekyle med proteinet, kan analysen udføres af akut tilsætning af modulator efter tilsætning af valinomycin, mens stadig i den oprindelige sats fase målingen.

Begrænsninger af teknikken

Som tidligere nævnt, dette proteoliposomal flux assay af regulerede kanal aktivitet ved en population af oprensede og som rekonstitueres i fuld længde CFTR molekyler giver en unik metode til at afhøre ligander, direkte modificerer aktiviteten. Imidlertid er metoden begrænset, at det ikke giver indsigt i den mekanisme, gennem hvilken ligander ændre hastigheden af ​​flux gennem CFTR. Ideelt set bør proteoliposomal flux assay af oprenset og rekonstitueret CFTR anvendes i kombination med plane læbeid dobbeltlag studier af enkelt kanal aktivitet. Denne kombination ville give indsigt i tilstanden af protein, der binder liganderne, dvs. åbne og / eller lukkede tilstand.

Betydning i forhold til eksisterende metoder

Der er i øjeblikket mangel på metoder til vurdering af direkte interaktion af små molekyler med CFTR-kanal versus små molekyler modulatorer, der interagerer med en anden cellulære komponent til indirekte ændre kanal aktivitet, fx via en modulerende eller signalvejen eller afbrydelse af vigtige protein-protein interaktioner. Den iodid efflux metode demonstrerer direkte interaktion med proteinet ifølge et hvilket som helst lille molekyle, som modulerer kanalaktivitet af CFTR. På trods af den lille produktion måde af målingerne, er der stadig en betydelig værdi i disse unikke metoder til at studere den direkte interaktion af CFTR med små molekyler potentiatorer og korrektorer. Mange små molecule modulatorer er under udvikling af både faglige grupper og den farmaceutiske industri til at behandle CF-patienter klinisk, da dette er den hovedsigte aktuelle CF forskning. Det forventes, at de metoder, der er beskrevet her, vil hjælpe til udvikling og validering af virkningsmekanismen af ​​de mest lovende af disse molekyler.

Fremtidige anvendelser af teknikken

De her benyttede metoder er også meget modtagelig for tilpasning til andre proteiner af interesse. Faktisk en modifikation af de beskrevne metoder blev anvendt til at studere to P. aeruginosa membranproteiner impliceret i bevægelsen af anioniske substrater over membranen 26,27, hvilket viser nytten og alsidighed af disse metoder. Forventes deres anvendelse i studiet af yderligere anion kanaler og transportere i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne anerkender råd fra Dr. Mohabir Ramjeesingh under udviklingen af ​​rensningsmetoder er beskrevet her. Disse undersøgelser blev støttet af driftstilskud til CEB fra de canadiske Institutes of Health Research (CIHR) og cystisk fibrose Canada (CFC). PDWE blev delvist understøttet af Fellowship awards gennem CIHR og CFC. Forfatterne anerkender levering af korrektion, potentiator og inhibitorforbindelser fra Dr. R. Bridges (Rosalind University of Medicine and Science) og distribution af cystisk fibrose Foundation Therapeutics (CFFT). Forfatterne også anerkende enestående service fra Baylor Cell Culture Facility (NIH tilskud P30 CA125123) udtrykke Wt og mutant CFTR-protein ved hjælp baculovirussystemet. Den inaktive VX-770 analog, v-09-1188, var en gave af Vertex Pharmaceuticals.

Acknowledgments

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fos-choline 14 detergent Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) F312 Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche (www.roche-applied-science.com) 04 693 132 001 EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack  Roche (www.roche-applied-science.com) 05 892 791 001
Ni-NTA Agarose Qaigen GmbH 1018240
Fisherbrand Screening columns Fisher Healthcare 11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K Millipore (www.millipore.com) UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840051C
POPC Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 850457C
PS, Porcine Brain Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840032C CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 841118C
Ergosterol Sigma (www.sigmaaldrich.com) 45480
Pierce Detergent removal spin column Thermo Scientific 87779 1 ml capacity columns
valinomycin Sigma (www.sigmaaldrich.com) V-0627
VX-770 (ivacaftor) Selleck Chemicals S1144
iodide selective microelectrode Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) LIS-146ICM  
 
 
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
Clampex 8.1 software Axon Instruments (www.axon.com) we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System  Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) LIS-146LICM-XS Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars Big Science Inc (www.stirbars.com) SBM-0502-CMB choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine GE Health Care (www.gelifesciences.com) 17-0042-01
Sonicator Laboratory Supplies Co, Inc. G112SP1G Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50, (1), 233-248 (2011).
  2. Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68, (4), 809-818 (1992).
  3. Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
  4. Genetic Analysis Consortium. http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
  5. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245, (4922), 1073-1080 (1989).
  6. Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2, (8), 1253-1261 (1993).
  7. Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148, (1-2), 164-274 (2012).
  8. Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148, (1-2), 150-163 (2012).
  9. Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419, (1-2), 41-60 (2012).
  10. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365, (18), 1663-1672 (2011).
  11. Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270, (28), 17033-17043 (1995).
  12. Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
  13. Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267, (36), 26142-26149 (1992).
  14. Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4, (2), 95-100 (1993).
  15. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327, (1), 17-21 (1997).
  16. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, (37), 39051-39057 (2004).
  17. Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
  18. Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
  19. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, (44), 36639-36649 (2012).
  20. Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54, (24), 8693-8701 (2011).
  21. Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21, (5), 666-678 (2014).
  22. Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78, (3), 411-418 (2010).
  23. Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8, (2), 153-171 (2009).
  24. Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418, (1), 185-190 (2009).
  25. Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3, (2), 119-121 (2004).
  26. Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (32), 13083-13088 (2011).
  27. Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4, (5), e00678-e00613 (2013).
  28. Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. Academic Press. 337-357 (2010).
  29. Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75, (6), 1430-1438 (2009).
  30. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387, (5), 1055-1060 (2009).
  31. Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268, (15), 11304-11311 (1993).
  32. Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
  33. Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271, (45), 28463-28468 (1996).
  34. Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110, (11), 1651-1658 (2002).
  35. Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136, (6), 659-671 (2010).
  36. Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89, (4), 417-425 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics