Cardioplegic गिरफ्तारी के साथ मायोकार्डियल बहतरीन एसोसिएटेड की Murine पृथक दिल मॉडल

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Cordeiro, B., Clements, R. Murine Isolated Heart Model of Myocardial Stunning Associated with Cardioplegic Arrest. J. Vis. Exp. (102), e52433, doi:10.3791/52433 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

निम्नलिखित प्रोटोकॉल बिगड़ा हृदय समारोह या दौरे तेजस्वी निम्नलिखित उदारवादी इस्कीमिक अपमान का मूल्यांकन करने के लिए काम का नहीं है। तकनीक cardioplegic गिरफ्तारी और कार्डियोपल्मोनरी बाईपास, बंद पंप सीएबीजी, प्रत्यारोपण, एनजाइना, संक्षिप्त ischemia, आदि के साथ हृदय शल्य चिकित्सा सहित कई नैदानिक ​​प्रासंगिक घटना के साथ जुड़े इस्कीमिक चोट मॉडलिंग के लिए उपयोगी है। प्रोटोकॉल दौरे सिकुड़ा समारोह की माप पर ध्यान केंद्रित कर कृंतक दिलों में hypothermic hyperkalemic cardioplegic गिरफ्तारी और reperfusion की मॉडल करने के लिए एक सामान्य विधि प्रस्तुत करता है। संक्षेप में, एक माउस दिल, langendorff मोड में perfused है एक intraventricular गुब्बारे के साथ instrumented, और आधारभूत हृदय कार्यात्मक मापदंडों दर्ज हैं। स्थिरीकरण के बाद, दिल डायस्टोलिक गिरफ्तारी आरंभ करने के लिए एक cardioprotective hypothermic हृदय का पक्षाघात समाधान के अर्क जानकारी देने के लिए तो विषय है। हृदय का पक्षाघात 2 घंटे से अधिक रहकर वितरित किया जाता है। दिल तो reperfused और warme हैnormothermic तापमान और मायोकार्डियल समारोह की वसूली करने के लिए डी नजर रखी है। कृन्तकों में सकल दौरे ऊतक के नुकसान से मुक्त विश्वसनीय उदास हृदय सिकुड़ा समारोह में इस प्रोटोकॉल के परिणामों का प्रयोग करें।

Introduction

तेजस्वी myocardial ischemia या cardioprotection 1,2,3,4,5 साथ इस्कीमिक अपमान की लंबी अवधि का एक संक्षिप्त अवधि के बाद पर्याप्त मात्रा में रक्त प्रवाह की बहाली के बावजूद प्रतिवर्ती कम सिकुड़ा गतिविधि के रूप में परिभाषित किया गया है। प्रस्तुत विधि विशेष रूप से सिकुड़ा समारोह में प्रतिवर्ती दोष में परिणाम कर सकते हैं जो नैदानिक ​​प्रासंगिक इस्कीमिक अपमान मॉडल का उपयोग किया जाता है (यानी, कार्डियक सर्जरी cardioplegic गिरफ्तारी, ischemia, एनजाइना, आदि का संक्षिप्त अवधि के उपयोग के साथ जुड़े इस्कीमिक अपमान)। गंभीर ischemia के अध्ययन (रोधगलन, परिगलन) के विपरीत इस प्रोटोकॉल ऊतक चोट, remodeling, और कोशिका मृत्यु के बिना दौरे कार्यात्मक वसूली और cardioprotection मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया था। कागज के बहुमत हाइपोथर्मिया और रुक-रुक कर हृदय का पक्षाघात वितरण का उपयोग कर एक कार्डियक सर्जरी करने के लिए इसी तरह के तत्वों के साथ एक मानक cardioplegic गिरफ्तारी प्रोटोकॉल पर चर्चा।

मायोकार्डियल protकार्डियक सर्जरी के बहुमत के दौरान ection हृदय का पक्षाघात और कार्डियोपल्मोनरी बाईपास पर निर्भर करता है। हृदय का पक्षाघात (सीपी) समाधान और रणनीतियों (रक्त, crystalloid, ठंड, गर्म आदि) व्यापक रूप से भिन्न हालांकि सबसे आम तत्व, 1) hyperkalemia और / या जिससे दौरे संकुचन से उत्पन्न ऊर्जा के उपयोग को सीमित करने, पाद लंबा में दिल की गिरफ्तारी के लिए अन्य रणनीतियों रहे हैं और 2) हाइपोथर्मिया चयापचय धीमी और गिरफ्तार कर लिया, जबकि एटीपी और अन्य ऊर्जा भंडार बनाए रखने में मदद करने के लिए। वर्तमान हृदय का पक्षाघात समाधान अन्यथा घातक साबित होता है कि इस्कीमिक अपमान के खिलाफ दिल को सुरक्षा प्रदान करते हैं। हालांकि, शल्य इस्कीमिक अपमान दौरान cardioprotective रणनीतियों सही नहीं हैं, और उसके एवज में हल्के इस्कीमिक चोट पर्याप्त रक्त प्रवाह के बावजूद प्रतिवर्ती हृदय सिकुड़ा रोग में परिणाम कर सकते हैं (तेजस्वी दौरे), एसिडोसिस, cardiomyocyte क्षति, और कम कोरोनरी छिड़काव और vasospasm सहित संवहनी प्रभाव।

इस प्रोटोकॉल अलग हैसंक्षिप्त ischemia या cardioplegic गिरफ्तारी के साथ जुड़े इस्कीमिक अपमान निम्नलिखित बिगड़ा हृदय समारोह में परिणाम कर सकते हैं जो रोधगलन और यह मामूली इस्कीमिक अपमान का मूल्यांकन करता है कि में गंभीर ischemia के मूल्यांकन के मानक अलग दिल ischemia के मॉडल से। (- 8 Langendorff छिड़काव तकनीक और मैं पर समीक्षा के लिए / आर पढ़ाई 6 देखें)। सामान्य दिशा निर्देशों और माउस पृथक perfused दिल के साथ जुड़े प्रयोगात्मक मापदंडों का गहन विश्लेषण के लिए सदरलैंड ई टी अल देखना। 2003 यहाँ प्रस्तुत तकनीक मज़बूती माउस दिलों में आश्चर्यजनक प्रेरित करने के लिए आवश्यक उपकरण, अभिकर्मकों, कदम, रणनीतियों और सुझावों का विवरण 9। छोटा बदलाव चूहों के लिए तकनीक को लागू करने के लिए आवश्यक हैं।

संक्षेप में पृथक माउस दिलों Langendorff एक hyperkalemic hypotherm की डिलीवरी के माध्यम से ठंड संरक्षित हृदय की गिरफ्तारी के द्वारा, शारीरिक क्रेब्स-Henseleit बफर (KHB) के साथ लगभग 30 मिनट के लिए perfused पीछा कर रहे हैंआईसी हृदय का पक्षाघात समाधान। गिरफ्तारी के बाद हृदय कार्यात्मक वसूली rewarming और KHB के साथ दिल की reperfusion के दौरान नजर रखी है। हृदय सिकुड़ा समारोह की वसूली की डिग्री में परिवर्तन cardioprotective एजेंटों और विभिन्न cardioprotection रणनीतियों का आकलन करने के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: सभी प्रक्रियाओं उम्र संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति और देखभाल और प्रयोगशाला पशु 10 के उपयोग के लिए राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद गाइड के अनुसार सभी जानवरों और प्रक्रियाओं के द्वारा अनुमोदित किया गया।

सर्किट निगरानी 1. गुब्बारा निर्माण और बाएं निलय दबाव

  1. एक हलचल पट्टी के साथ एक बीकर में। मिलर एट अल के अनुसार 11 एल.वी. गुब्बारे का निर्माण एक गर्म थाली पर 9.5 आसुत जल से मिली, प्रकाश कॉर्न सिरप के 14.2 मिलीग्राम और सुक्रोज का 33.8 ग्राम, और गर्मी मिश्रण, चीनी भंग कर रहा है जब तक मिश्रण । यह लगभग 150 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है जब तक हीटिंग समाधान जारी रखें।
    नोट: कई तरीकों कंडोम सुझाव और चिपटना फिल्म निर्माण 9,12 के संशोधन सहित एल.वी. गुब्बारे का निर्माण करने के लिए मौजूद हैं। हम फिर भी फिल्म चिपटना गुब्बारे का एक फायदा उपयुक्त frequen के लिए पिछले लक्षण वर्णन भी शामिल है, उपरोक्त विधि रिसाव से मुक्त गुब्बारे का निर्माण करने के लिए अपेक्षाकृत आसान हो पाते हैंCY-प्रतिक्रिया रिश्तों 9।
  2. लंबाई में टुकड़ों में लगभग 5 सेमी ड्राई स्पेगेटी किस्में तोड़ और चीनी समाधान में लगभग 1 सेमी गहरी प्रत्येक टुकड़ा के एक तरफ डुबकी और धीरे-धीरे हटा दें।
  3. एक polystyrene फोम ब्लॉक में पास्ता कतरा की सूखी अंत प्लेस और चीनी का मिश्रण नीचे भरी और एक अश्रु आकार ढालना रूपों इसलिए निलंबित। ढालना और मज़बूत बनाता है तो एक desiccator में हे / एन छोड़ दें।
  4. अगले दिन, सिलिकॉन फैलाव जेल में नए नए साँचे डुबकी। 2 घंटे के लिए या सूखी जब तक ए.ए. 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में वापस polystyrene फोम ब्लॉक और जगह में पास्ता किस्में रखें। एक बार तो और अधिक सिलिकॉन की दो परतों लागू कर रहे हैं इस चरण को दोहराएँ।
  5. एक बार सूखा, कई घंटे के लिए पानी में जगह मोल्ड से गुब्बारे को हटाने में सहायता करते हैं। 0.02% सोडियम azide समाधान में स्टोर गुब्बारे।
  6. एक कुंद टिप बनाने के लिए एक सुई काटने और सुई में डिग्री रखकर एक स्वनिर्धारित गुब्बारा प्रवेशनी का उत्पादन करने के लिए सेट एक 23 जी रक्त संग्रह का प्रयोग करें।
  7. ट्रांस एक दबाव टयूबिंग कनेक्टducer और ट्यूबिंग और प्रवेशनी रखते हुए पानी के साथ फ्लश सिस्टम को पूरी तरह प्रवेश करने से हवा को रोकने के लिए जलमग्न। प्रवेशनी पर पानी से भर दिया गया है कि एक गुब्बारा प्लेस और प्रवेशनी पर टाई करने के लिए 2-0 रेशम टांके का उपयोग करें। दबाव बनाए रखने की क्षमता से टेस्ट गुब्बारे (कम से कम 1 घंटे के लिए ~ 100 एमएमएचजी)

पृथक दिल छिड़काव प्रणाली की 2. तैयारी

  1. प्रारंभ में, धोने और प्रणाली गर्म है। Langendorff तंत्र से जुड़ा किया गया है कि एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्म पानी से स्नान फैलानेवाला पर बारी, और आसुत जल से बफर जलाशय को भरने के। तंत्र में बह ट्यूबिंग और प्रणाली से बाहर निकलवाने के लिए पंप चालू करने के लिए एक नया ग्लास फाइबर फिल्टर कनेक्ट करें। प्रस्तुत करने का समय के दौरान, एक तापमान जांच का उपयोग Langendorff ब्लॉक से निष्कासित पानी के तापमान पर नजर रखने कि पानी के स्नान सही रूप में सेट किया गया है सुनिश्चित करने के लिए। इसके अलावा, एक प्रशीतित फैलानेवाला पंप पर बारी और दिल की cardioplegic गिरफ्तारी के दौरान उपयोग किया जाएगा जो 20 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है।
  2. मैंएन इस बीच निम्न समाधानों को तैयार। 1 हृदय का पक्षाघात समाधान के एल (110 मिमी NaCl, 16 मिमी KCl, 16 मिमी 2 MgCl, 1.5 मिमी 2 CaCl, 10 मिमी 3 NaHCO) और फिल्टर तैयार करें। इसके अलावा, KHB (118 मिमी NaCl, 4.8 मिमी KCl, 1.2 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 1.7 मिमी MgSO 4, 2 मिमी ना-पाइरूवेट, 6 मिमी डेक्सट्रोज, के एल 2 को तैयार 24.9 मिमी 3 NaHCO (पूर्व वातित सीओ 2 के साथ) , 1.4 मिमी 2 CaCl (पिछले) जोड़ा। एक बार जब कीप fritted एक 5 माइक्रोन ग्लास का उपयोग कर एक कुप्पी में छान कर अवक्षेप को हटा दें। बर्फ पर एक छोटी सी डिश में कुछ सर्जरी और अलगाव के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा, जगह भंग कर दिया।
  3. का उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ perfusate (KHB) आक्सीजन के साथ मिलना। KHB साथ छिड़कना Langendorff प्रणाली सिस्टम से किसी भी शेष पानी निकालने और जलाशय बफर करने के लिए। चूहों के लिए, ~ 2.0 मिलीग्राम / मिनट के लिए प्रारंभिक पंप की गति निर्धारित किया है। छिड़काव प्रवेशनी के पास 2-0 और 4-0 से रेशम टांके रखें। ट्यूबिंग और तंत्र बुद्धि भर रहे हैं जब तक पंप चलाने के लिएएच perfusate और बुलबुला strup सुनिश्चित perfusate से भर जाता है।
    नोट: यह अत्यधिक की सिफारिश की है छिड़काव और स्थिर समारोह की लंबी अवधि के लिए दिल में थक्के फार्म सकता है कि किसी भी अवक्षेप इकट्ठा करने के लिए छिड़काव सर्किट में एक लाइन में ग्लास फाइबर फिल्टर (~ 1 माइक्रोन) स्थापित करने के लिए

3. माउस सर्जरी

3.1) माउस संज्ञाहरण और हैंडलिंग

  1. 80 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 5 मिलीग्राम / मिलीलीटर xylazine मिश्रण की संवेदनाहारी खुराक के साथ सिरिंज तैयार है, और 0.2 मिलीलीटर मात्रा को लाने के लिए बाँझ 0.9% खारा जोड़ें। हेपरिन आईपी (1,000 यू / एमएल समाधान के 50 μl) इंजेक्षन।
  2. परिवहन कंटेनर (~ 10-20 मिनट) में वापस माउस प्लेस और हेपरिन प्रभाव लेता है के रूप में यह चेतना खोने के लिए प्रतीक्षा करें। समय-समय पर दर्द पलटा नजर रखने के लिए एक पैर की अंगुली चुटकी करते हैं।

3.2) दिल को दूर

  1. माउस को पूरी तरह से बेहोश है और पैर की अंगुली चुटकी का जवाब पिन या 25 जी का उपयोग कर एक उपयुक्त ऑपरेटिंग मेज पर इसे सुरक्षित नहीं करता है एक बार हाथ पैरों के माध्यम से सिरिंज सुझाव। दिल को बेनकाब करने के लिए एक thoracotomy प्रदर्शन करते हैं। बस उरोस्थि के नीचे एक छोटा सा छेद में कटौती और डायाफ्राम से बचने के माउस के पक्ष में कटौती का विस्तार।
  2. जल्दी डायाफ्राम में कटौती और फिर तेजी से रिब पिंजरे के पक्षों को काट दिया। वक्ष गुहा का पर्दाफाश करने के लिए एक क्लैम खोल की तरह रिब पिंजरे वापस फ्लिप। धीरे, दिल की पकड़ लेने के नीचे कैंची जगह है और दिल को हटा दें।
    नोट: यह यह वक्ष गुहा में अवगत कराया और फेफड़ों गैर कार्यात्मक कर रहे हैं जल्दी से एक बार दिल को दूर करने के लिए आवश्यक है।

3.3) दिल साफ

  1. पकवान युक्त बर्फ के ठंडे KHB में दिल प्लेस और संलग्न फेफड़े के ऊतकों के किसी भी बड़े टुकड़ों बंद ट्रिम। दिल लेने और महाधमनी का पता लगाने के लिए संदंश का प्रयोग करें। धीरे दिल निचोड़ और इस महाधमनी के खुले अंत होना चाहिए, के रूप में प्रकट होता है कि किसी भी रक्त के लिए देखो। महाधमनी के खुले अंत तक दिल धारण करने के लिए ठीक टिप चिमटी का प्रयोग करें।
ई "> 4। गुब्बारा, हार्ट बढ़ते छिड़काव शुरू, और रखने

4.1) बढ़ते और हृदय Cannulating

  1. Langendorff तंत्र को दिल का परिवहन करने से पहले, छिड़काव दबाव कम है कि यह सुनिश्चित करने पंप (~ 20 एमएमएचजी) पर बारी। बस प्रवेशनी के तहत महाधमनी से दिल पकड़ो। ठीक टिप चिमटी का एक और सेट का प्रयोग, ध्यान महाधमनी खुला और प्रवेशनी पर दिल स्लाइड। चिमटी से एक सेट के साथ यह जगह में पकड़ और फिर अस्थायी रूप से प्रवेशनी के लिए यह सुरक्षित करने के लिए एक नरम धार क्लिप का उपयोग करें।
    नोट: जल्दी छिड़काव प्रवेशनी दिल बढ़ते एक अच्छी तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है। अनुभव के साथ, दिल बढ़ते जब तक वक्ष गुहा खोलने से प्रक्रियाओं के बीच 1 और 2 मिनट के लिए ले जाना चाहिए।
  2. सीधे क्लिप नीचे प्रवेशनी को 4-0 रेशम सीवन सुरक्षित महाधमनी का उपयोग करते हुए, टाई और के रूप में छिड़काव आरंभ करें। कस जब महाधमनी से बंधे नहीं मिलता इसलिए टाई, धातु महाधमनी प्रवेशनी के आसपास भी है सुनिश्चित करेंगांठ। एक टाई मजबूती से रखा गया है, एक बार क्लिप को हटा दें।
  3. महाधमनी बंद आ रहा हो सकता है कि किसी भी पोत शाखाओं के नीचे बंद टाई करने के लिए सुनिश्चित कर रही है प्रवेशनी को सुरक्षित रूप से महाधमनी दृढ़ करने के लिए अतिरिक्त रेशम टांके का उपयोग करें। ये अक्सर perfusate लीक या महाधमनी से बाहर शूटिंग के द्वारा देखा जा सकता है।
    नोट: छिड़काव के प्रारंभिक चरणों के दौरान रक्त को हृदय से धोने की जानी चाहिए और पूरे दिल एक नरम गुलाबी रंग दिखाई देनी चाहिए। बाहर साफ नहीं है कि अंधेरे discolorations नहीं किया जाना चाहिए कारण हवा एम्बोली या थक्के और दिल को इस्कीमिक क्षेत्रों की संभावना का संकेत मिलता है।

4.2) की स्थापना छिड़काव और LVP मापन

  1. धीरे धीरे छिड़काव दबाव बढ़ाने के लिए और छिड़काव दबाव 70 एमएमएचजी तक पहुँच जाता है जब तक पंप की गति बढ़ा सकते हैं।
    नोट: माउस छिड़काव के लिए मानक छिड़काव के दबाव 70-90 एमएमएचजी हो सकता है, लेकिन एक प्रयोग के भीतर पशु को पशु से स्थिर रखा जाना चाहिए।
  2. शेष ऊतक (फेफड़ों को साफ करें, थायराइड आदि) है कि अभी भी दिल से जुड़ा जा सकता है। बाएं वेंट्रिकल में एक खोलने बनाने के लिए छोड़ दिया अटरिया नाश करने के लिए कैंची का प्रयोग करें।
  3. धारक पर गुब्बारा प्लेस और खंडन करना। सीधे बाएं वेंट्रिकल में खोलने पर, महाधमनी प्रवेशनी के पास गुब्बारा प्रवेशनी स्थिति। महाधमनी आंसू नहीं करता इसलिए जगह में दिल धारण करते समय सावधानी बाएं वेंट्रिकल में नीचे की ओर गुब्बारा डालें।
  4. यह जगह में है एक बार धीरे-धीरे LVEDP तक पहुँच जाता है जब तक ~ 8 एमएमएचजी गुब्बारा फुलाना शुरू करते हैं। यह प्रवाह के तापमान के उपाय तो दिल के नीचे के खिलाफ तापमान जांच रखें।

4.3) बेसल मापन

  1. एक पानी की जैकेट छिड़काव कक्ष में दिल सील। इस समय के दौरान लगातार KHB के साथ दिल छिड़कना है, और तापमान में वृद्धि जारी है कि सुनिश्चित करते हैं। तापमान की निगरानी और यह लगभग ~ 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है जब तक उसके अनुसार पानी के स्नान को समायोजित।
    नोट: निगरानी temperatतापमान दिल से दिल के लिए अलग-अलग हो सकते हैं कोरोनरी प्रवाह के रूप में और बाद में छिड़काव के प्रारंभिक चरणों में ure महत्वपूर्ण है। प्रवाह perfusate की तापमान दिल के शीर्ष पर रखा एक तापमान जांच के माध्यम से वांछित दौरे तापमान के लिए नजर रखी है। इसके अलावा, अन्य Langendorff छिड़काव प्रोटोकॉल की तुलना में दिल का छिड़काव या गिरफ्तारी के दौरान सी.पी. या KHB में डूबे हुए नहीं है, यह मुख्य रूप से जल्दी से तापमान को समायोजित करने के साथ ही प्रसार के बिना कुशल सी.पी. डिलीवरी प्रदान करने के लिए किया जाता है।
  2. लगातार छिड़काव दबाव, बाएं निलय दबाव (LVP गुब्बारे से जुड़ा दबाव transducer), तापमान, और electrophysiological मानकों (ईकेजी, ताकि सुसज्जित अगर एमएपी) सहित उपयुक्त सेंसर से जुड़ी एक डाटा अधिग्रहण प्रणाली का उपयोग करते हुए कार्यात्मक माप रिकॉर्ड करने के लिए शुरू करो (लगाव हो जाएगा निर्माताओं के अनुसार और व्यक्तिगत सेंसरों और डाटा अधिग्रहण प्रणाली) के लिए विशिष्ट। प्रवाह KHB कम से कम 15 के लिए ~ 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है एक बार न्यूनतम और हृदय कार्यात्मक मापदंडों स्थिर रहे हैं, आधारभूत मापन के लिए समय का ध्यान रखें।
    नोट: समावेशन / बहिष्कार मापदंड हर दिल को लागू कर रहे हैं। बेस लाइन पर 60 एमएमएचजी <का एक LVDP विश्लेषण से हटा दिया जाना चाहिए कि एक दिल को इंगित करता है। इसके अलावा, आधार रेखा पर छिड़काव दबाव बनाए रखने के लिए कोरोनरी प्रवाह> 4.5 मिलीग्राम / मिनट, या अक्षमता की संभावना एक लीक या फटे महाधमनी इंगित करता है। इसके अलावा हृदय समारोह में (यानी, अत्यंत अतालता LVeDP, बढ़ती) नेत्रहीन पुष्टि की जा सकती है, जो स्पष्ट इस्कीमिक क्षेत्रों (यानी, थक्का) या प्रदर्शनी ischemia के जुड़े कटौती है कि किसी भी दिलों विश्लेषण से हटा रहे हैं।
  3. 1 मिनट के लिए एक स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर में कोरोनरी प्रवाह के संग्रह के माध्यम से कोरोनरी प्रवाह को मापने। चैम्बर बंद और तापमान की अनुमति है और आधारभूत मूल्यों पर लौटने के लिए कार्य करते हैं। वैकल्पिक रूप से दबाव राहत सर्किट के बाद रखा एक प्रवाह जांच के माध्यम से छिड़काव लाइन में लगातार कोरोनरी प्रवाह को मापने।
"> 5। शुरुआत Cardioplegic गिरफ्तार

  1. एक और जलाशय में ठंड हृदय का पक्षाघात बफर के 100 मिलीलीटर प्लेस और। हृदय का पक्षाघात जलाशय को KHB जलाशय प्रवेशनी हस्तांतरण।
  2. गर्म पानी से स्नान पानी की जैकेट आवास और छिड़काव वार्मिंग सर्किट को अलग करें और त्वरित डिस्कनेक्ट टयूबिंग का उपयोग प्रशीतित फैलानेवाला से कनेक्ट। दिल और perfusate की तेजी से तापमान में परिवर्तन की अनुमति के लिए अलग हीटिंग और कूलिंग circulators का प्रयोग करें।
  3. स्विच के दौरान ट्यूबिंग में पेश किया जाता है कि हवा के बुलबुले का पालन करें, और यह पृथक दिल के पास पहुंचता है एक बार हृदय का पक्षाघात के लिए समय शुरू करते हैं। 2 मिनट के लिए हृदय का पक्षाघात उद्धार। प्रारंभिक खुराक के बाद पंप बंद करो। पाद लंबा में दिल को गिरफ्तार करने और वांछित सी.पी. तापमान के करीब होने के लिए सुनिश्चित करें।
    ध्यान दें: एक पर्याप्त बुलबुला जाल दिल में हवा एम्बोली से बचने के लिए आवश्यक है। वैकल्पिक रूप से एक पानी निकलने की टोंटी से बंद कर दोनों जलाशयों के लिए एक वितरण प्रणाली को आसानी से निर्माण किया जा सकता है, फिर भी हम पालन लगता हैजलाशयों के बीच प्रवेशनी स्वैपिंग जब शुरू की है कि छोटे हवाई बुलबुले, प्रयोगों के बीच संभावित विभिन्न पंप की गति को देखते हुए समय सी.पी. वितरण का एक आसान तरीका आईएनजी (कारण माउस / चूहा, छिड़काव दबाव, फिल्टर प्रतिरोध, आदि के लिए यानी,।)
  4. ~ 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए हृदय का पक्षाघात में दिल रखें। एक और खुराक प्रशासित किया जाता है ताकि सी.पी. दौरान हर आधे घंटे 1 मिनट के लिए पीठ पर पंप बदल जाते हैं।
    नोट: ऊतक के नेक्रोसिस बिना सी.पी. दिल के कार्यात्मक हानि में हर 30 मिनट के परिणामों की विरामी खुराक। सीपी (यानी,> 45 मिनट) की खुराक के बीच लंबी अवधि के गल जाना और इस्कीमिक contracture में परिणाम कर सकते हैं और असुरक्षित ischemia के साथ जुड़े परिगलित चोट की एक मॉडल के लिए अधिक उपयुक्त होगा।

6. reperfusion

  1. सीपी के अंत में, ऑक्सीजन KHB वापस करने के लिए जलाशय प्रवेशनी हस्तांतरण। हीटिंग फैलानेवाला तापमान नियंत्रण सर्किट कनेक्ट और पंप बारीपर reperfusion के शुरू करने के लिए। हृदय का पक्षाघात बाहर washes इस बिंदु पर, तापमान वृद्धि का निरीक्षण और दिल reperfusion के 2-4 मिनट के बाद फिर से धड़क रहा शुरू होता है। दिल से शुरू होता है जब दिल की धड़कन धीमी और अक्सर अतालता है।
    नोट: आमतौर पर अक्सर शुद्ध ischemia के मॉडल में विशेषता है, जो डायस्टोलिक LVP (यानी, ≤10 एमएमएचजी वृद्धि) में एक बड़ी वृद्धि नहीं है। Arrhythmias reperfusion में अच्छी तरह से बच सकते हैं और कभी-कभी दिल defibrillated करने की आवश्यकता होगी। यह दिल का आधार है और शीर्ष पर रखा उच्च voltages (~ 10-50 वी) और इलेक्ट्रोड के लिए एक उत्तेजक सेट के उपयोग से प्राप्त किया जा सकता है।
  2. दिल 30 मिनट के लिए reperfuse करने की अनुमति दें, और इस समय अवधि के दौरान आवश्यक के रूप में कोरोनरी प्रवाह माप लेते हैं। 30-60 सेकंड के लिए एक स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर के साथ प्रवाह को इकट्ठा करके कोरोनरी प्रवाह को मापने।

7. ऊतक एकत्रित

  1. गुब्बारा खंडन करना और बाएं वेंट्रिकल से हटा दें। बंद दिल ले लोप्रवेशनी और यह वजन। प्रारंभिक प्रयोगों में, दिल की कम से कम एक अनुप्रस्थ टुकड़ा लिया और टीटीसी दिल किसी भी परिगलित चोट से मुक्त है कि यह सुनिश्चित करने के लिए नेक्रोसिस का मूल्यांकन करने के दाग होना चाहिए।
  2. आदि शेष या पूरे दिल माइक्रोस्कोपी अध्ययन, गीला / सूखी वजन, के लिए दिल स्लाइस लीजिए तेजी से तरल नाइट्रोजन में रखकर जमे हुए किया जाना चाहिए। एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर जमे हुए दिल।
    नोट: उच्च ऊर्जा फॉस्फेट यौगिकों (यानी, एटीपी, creatine फॉस्फेट) की माप के लिए, दिल तुरंत जमे हुए किया जाना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 1 एक माउस के प्रयोग से विशिष्ट परिणाम प्रस्तुत करता है। LVP (लाल रेखा), डी पी / डीटी (ग्रीन लाइन), और तापमान (बैंगनी लाइन) continusouly ~ 3 घंटा से अधिक दर्ज किया गया। पत्र एक संकेत मिलता है - आधारभूत माप, बी, सी, डी, ई - reperfusion की, जी की शुरुआत है, एच, मैं, जम्मू - - reperfusion के दौरान cornary प्रवाह की माप के हृदय का पक्षाघात समाधान, एफ का वितरण। ध्यान दें, उदास LVDP और आधारभूत की तुलना में reperfusion पर डी पी / डीटी। चित्रा 1 बी एक से अधिक दर्ज ~ 2 सेकंड से डेटा शामिल हैं। ध्यान दें, LVP में कमी और एक करने के लिए इसी तरह के डीटी डी पी /, LVEDP में मानव संसाधन और मामूली वृद्धि में मामूली कटौती। आमतौर पर reperfusion के 30 मिनट के बाद चित्रा 1C में दर्शाया बाएं निलय विकसित दबाव LVDP इसका सबूत के रूप में हृदय समारोह में एक ~ 40% की कमी नहीं है।

चित्र 1
चित्रा 1. प्रतिनिधि परिणामएक पूरे प्रयोग के एस। (ए) रिकॉर्डिंग निलय दबाव (ऊपर), एल.वी. दबाव है, और तापमान के पहले व्युत्पन्न छोड़ दिया है। (बी) लघु अंतराल रिकॉर्डिंग का पता लगाने के विस्तार और कई प्रयोगों के लिए बाएं निलय विकसित दबाव (LVDP) (सी) Quantitation देखने के लिए (एन = 6)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पूर्ववर्ती प्रोटोकॉल विवरण के तरीकों cardioplegic गिरफ्तारी के साथ जुड़े वैश्विक ischemia के लिए दौरे तेजस्वी माध्यमिक मूल्यांकन करने के लिए। हमारे हाथ में इस प्रोटोकॉल हृदय समारोह में एक ~ लगभग 40% की कमी का उत्पादन (LVDP, +/- डी पी / डीटी) 30 मिनट के बाद reperfusion के समय बिंदु पर दिल की दर में कम से कम परिवर्तन के साथ। दिल reperfused और rewarmed है जैसा हृदय समारोह के सभी मापदंडों मिनट 20 और 30 के बीच स्थिर होने से पहले एक बहुत कम दिल की दर के साथ प्रारंभिक समय बिंदुओं पर कम कर रहे हैं। कोरोनरी प्रवाह 30 मिनट reperfusion की निम्न नियंत्रण के स्तर की तुलना में 20-30% कम ~ करने के लिए आम तौर पर बहुत कारण hyperemia करने के लिए जल्दी reperfusion के दौरान वृद्धि हुई है, और फिर गिर जाता है।

यह परिभाषा के द्वारा आश्चर्यजनक दौरे शुद्ध ischemia की विशेषता है जो कोशिका मृत्यु और नेक्रोसिस से मुक्त दिल छोड़ देना चाहिए कि याद रखना महत्वपूर्ण है / एम आई मॉडल (यानी,> 20 मिनट कोई प्रवाह क्षेत्रीय ischemia)। प्रारंभिक अध्ययन ऊतक histol का मूल्यांकन करना चाहिएogy परिगलित चोट की कमी सुनिश्चित करने के लिए। संभव है कि यह पूरी तरह से प्रोटोकॉल की वजह से नियंत्रण में हृदय समारोह में reductons साथ जुड़ा हुआ है, जो पूर्व vivo Langendorff छिड़काव करने के लिए समारोह बरामद प्रदर्शित नहीं होगा इसके अलावा, मायोकार्डियल तेजस्वी हालांकि परिभाषा से लंबे समय तक reperfusion की (दिन के लिए मानव संसाधन) निम्नलिखित सामान्य समारोह में परिणाम चाहिए, यह है समय के साथ perfused दिल। फिर भी एक cardioprotection रणनीति के उपयोग में, / नेक्रोसिस इस प्रोटोकॉल बनाम क्लासिक कोई प्रवाह ischemia के प्रोटोकॉल में चौंकाने वाली प्रमुख अंतर की गंभीरता के सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कोशिका मृत्यु के अभाव में हृदय समारोह की भारी वसूली में है बदलता है इस मामले hyperkalemic हृदय का पक्षाघात किया जा रहा है। Hyperkalemic हृदय का पक्षाघात समाधान डायस्टोलिक हृदय की गिरफ्तारी के कारण द्वारा परिगलित चोट और कोशिका मृत्यु से सुरक्षा प्रदान करते हैं। दिल की डायस्टोलिक गिरफ्तारी ऊर्जा भंडार के संरक्षण को बढ़ावा देता है। इसके अलावा, सबसे चिकित्सकीय इस्तेमाल किया cardioprotection प्रोटोकॉल आगे ली को हाइपोथर्मिया का उपयोगचयापचय की मांग को कम करने से एमआईटी दौरे चोट। ऊपर प्रोटोकॉल के दौरान संग्राहक जा सकता है कि अन्य कारकों अलग हृदय का पक्षाघात के समाधान के योगों (hyperpolarizing योगों, मिलीग्राम ++ + K स्तर, आदि), रणनीतियों (गर्म बनाम ठंड, 'हॉट शॉट', आदि), और विभिन्न दवाओं में शामिल हैं (काइनेज निरोधक, आयन चैनल modulators, cardioprotective एजेंटों, आदि)।

दिल एक अपेक्षाकृत अच्छी तरह से संरक्षित अवस्था में है के बाद से इस मॉडल जरूरी रह गया ischemia के टाइम्स (यानी, अधिक से अधिक से अधिक 2 घंटा) की आवश्यकता है में, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कार्यात्मक दोष पाने के लिए। हम मज़बूती से बहुत कम अवधि (यानी, 30 मिनट) के दौरान दंग रह मायोकार्डियम प्रदर्शित जो बड़े जानवरों (सूअर, मनुष्य) की तुलना में जब कृंतक दिलों विशेष रूप से, इस मॉडल में चोट करने के लिए अपेक्षाकृत प्रतिरोधी रहे हैं कि मिल गया है। हम यह भी रुक-रुक कर प्रसव एक 45-60 मिनट के अंतराल follo के रूप में गंभीर इस्कीमिक नुकसान से दिल की रक्षा करने के लिए आवश्यक है कि मिल गया हैविंग सी.पी. वितरण सकल डायस्टोलिक रोग, इस्कीमिक contracture, और reperfusion पर ऊतक चोट में परिणाम कर सकते हैं। प्रोटोकॉल के अन्य आसानी से अनुकूलनीय घटकों + K पर नहीं निर्भर सी.पी. घटक और हाइपो / normothermic गिरफ्तारी की भूमिका के साथ-साथ विभिन्न गिरफ्तारी रणनीतियों (ना चैनल ब्लॉकर्स, hyperpolarizing एजेंट) 3 से संबंधित जांच में शामिल कर सकते हैं।

नैदानिक ​​हृदय की शल्य चिकित्सा से जुड़े चौंकाने मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है जब इस तकनीक के लिए महत्वपूर्ण सीमाओं के एक नंबर भी शामिल हैं। सबसे पहले, नैदानिक ​​सी.पी. समाधान के सकल बहुमत खून (: 1 सी.पी. अनुपात ~ 4 रक्त) के साथ मिश्रित कर रहे हैं। इस वजह से छिड़काव circuitry के मात्रा के रूप में अच्छी तरह से इलाज किया ट्यूबिंग और फाइबर ओकसिजनेटर के लिए जरूरत के लिए आम तौर पर चूहों में संभव नहीं है। अक्सर बड़े जानवरों के लिए (गिनी सूअरों / खरगोश) दाता जानवरों को भी आवश्यक होगा। इसके अलावा, सभी अलग अंग मॉडल के रूप में, परिधीय कारकों (यानी, सूजन का संकेत है, रक्त पुनः के प्रभावछिड़काव, आदि) को पूरी तरह से नजरअंदाज कर दिया है। फिर भी यह औषधीय additives और विभिन्न cardioprotection रणनीतियों का परीक्षण करने के लिए प्रारंभिक अध्ययन के लिए एक व्यावहारिक, कुशल, और किफायती मॉडल है।

प्रोटोकॉल एक बड़ा गुब्बारा और महाधमनी प्रवेशनी 13,14 के अपवाद के साथ अनिवार्य रूप से चूहे दिलों में एक ही है। इसके अलावा, चूहे दिल तैयारी काफी अधिक प्रवाह दर (12-20 मिलीग्राम / मिनट) की आवश्यकता है। कारण इसका आकार के लिए, चूहे दिल तैयारी प्रदर्शन reproducibly जानने के लिए और करने के लिए काफी आसान है। दौरे तेजस्वी प्रोटोकॉल में जिसके परिणामस्वरूप चोट के अन्य प्रकार का आकलन करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है। प्रतिवर्ती इस्कीमिक चोट का अनुकरण करने के लिए, बस संक्षिप्त अवधि के लिए छिड़काव पंप बंद करो। चूहों में ~ 20 मिनट के वैश्विक ischemia के कोशिका मृत्यु और रोधगलन पर सकल प्रभाव के बिना कम सिकुड़ा समारोह में परिणाम होगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardioplegia Solution (St Thomas II) Symbol / Concentrations (mM)
Sodium Chloride NaCl; 110
Potassium chloride KCl; 16
Calcium Chloride CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride NaCl; 118
Potassium Chloride KCl; 4.8
Magnesium Sulfate MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic) KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate Na pyruvate; 2
Glucose C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters - 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion resevoir (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kloner, R. a, Jennings, R. B. Consequences of Brief Ischemia: Stunning, Preconditioning, and Their Clinical Implications: Part 1. Circulation. 104, (24), 2981-2989 (2001).
  2. Mentzer, R. M. Myocardial protection in heart surgery. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16, (3-4), 290-297 (2011).
  3. Chambers, D. J., Fallouh, H. B. Cardioplegia and cardiac surgery: pharmacological arrest and cardioprotection during global ischemia and reperfusion. Pharmacol Ther. 127, (1), 41-52 (2010).
  4. Bolli, R., Marbán, E. Molecular and cellular mechanisms of myocardial stunning. Physiol Rev. 79, (2), 609-634 (1999).
  5. Kloner, R. a, Bolli, R., Marban, E., Reinlib, L., Braunwald, E. Medical and Cellular Implications of Stunning, Hibernation, and Preconditioning An NHLBI Workshop. Circulation. 97, (18), 1848-1867 (1998).
  6. Mersmann, J., Latsch, K., Habeck, K., Zacharowski, K. Measure for measure-determination of infarct size in murine models of myocardial ischemia and reperfusion: a systematic review. Shock (Augusta, Ga). 35, (5), 449-455 (2011).
  7. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion). J Mol Cell Cardiol. 50, (6), 940-950 (2011).
  8. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55, (2), 113-126 (2007).
  9. Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart characteristics and cautions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, (11), 867-878 (2003).
  10. Guide for the Care and Use of Laboratory AnimalsSource. National Research Council. Available from: http://grants.nih.gov/grants/olaw/Guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
  11. Miller, A., Wright, G. L. Fabrication of Murine Ventricular Balloons for the Langendorff Heart Preparation. J Biotecnol Biomater. 1, (101), 1-4 (2011).
  12. Curtis, M. J. Characterisation, utilisation and clinical relevance of isolated perfused heart models of ischaemia-induced ventricular fibrillation. Cardiovasc Res. 39, (1), 194-215 (1998).
  13. Clements, R. T., Feng, J., Cordeiro, B., Bianchi, C., Sellke, F. W. p38 MAPK-dependent small HSP27 and αB-crystallin phosphorylation in regulation of myocardial function following cardioplegic arrest. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 300, (5), H1669-H1677 (2011).
  14. Clements, R. T., Cordeiro, B., Feng, J., Bianchi, C., Sellke, F. W. Rottlerin increases cardiac contractile performance and coronary perfusion through BKCa++ channel activation after cold cardioplegic arrest in isolated hearts. Circulation. 124, (11 Suppl), S55-S61 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics