JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

ERRATUM NOTICE

Summary

פיתחנו מודל vivo לשעבר רומן ללמוד פעולת הורמון בשד האנושי. היא מבוססת על microstructures הרקמה מבודדת מדגימות רקמת שד ניתוחיות המשמרות מבנה רקמה, אינטראקציות בין תאית, ואיתות אוטוקריני.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sflomos, G., Shamseddin, M., Brisken, C. An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. J. Vis. Exp. (95), e52436, doi:10.3791/52436 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מחקר פעולה של הורמונים בשד האנושי כבר הקשו על ידי היעדר מערכות מודל הולמים. על התרבות במבחנה, תאי אפיתל החלב ראשוניים נוטים לאבד ביטוי קולט הורמון. נרחב שורות תאי סרטן השד חיובי קולט הורמון המשמשות הן רלוונטיות מוגבלות למצב in vivo. כאן אנו מתארים מודל vivo לשעבר ללמוד פעולת הורמון בשד האנושי. דגימות טריות אנושיות רקמת שד מחומר שנזרק כירורגית כגון mammoplasties הפחתה או mammectomies הם מכניים ואנזימים מתעכלים להשיג שברי רקמה המכילים צינוריות ואוניות וסוגים שונים של תאי סטרומה. microstructures הרקמות אלה המשיכו במדיום בסיסי ללא גורמי גדילה לשמר הקשר בין תאיתם, מבנה הרקמה, ולהישאר הורמון מגיב במשך כמה ימים. הם מעובדים בקלות לRNA ומיצוי חלבון, ניתוח היסטולוגית או מאוחסנים בהקפאה בינונית. הקרינהמיון תא פעיל (FACS) ניתן להשתמש כדי להעשיר לאוכלוסיות תאים ספציפיות. פרוטוקול זה מספק גישה פשוטה, סטנדרטית ללימודי translational עם דגימות מורכבות ביותר, מגוונות אנושיות.

Introduction

מידע על נוף מוטאציות בסרטן השד גדל בקצב מהיר. פחות תשומת לב הוקדשה לגורמים מערכתיים המשפיעים על התפתחות סרטן השד. חשיפה להורמוני רבייה יש השפעה משמעותית על התקדמות מחלה 1-3. עם זאת, המנגנונים שבאמצעותם הורמוני רבייה לפגוע בשד האנושי הם הבינו היטב. עבודה עם מודלים של עכברים מהונדסים גנטי גילתה כי הם כרוכים איתות פנימית ואוטוקריני תא באמצעות מספר effectors במורד הזרם 4.

הידע המוגבל על פעולת הורמונים בשד האנושי הוא במידה רבה מיוחס לחוסר מודלים נאותים. רוב העבודה על המנגנונים של קולטן אסטרוגן (ER) וקולטני פרוגסטרון איתות (PR) שבוצעה עם קווי קולט הורמון חיוביים סרטן שד תא, כגון MCF-7 וT47D. אלה נגזרים מיפליטו פלאורלי מחולים עם סרטן השד מתקדם שהיה לי already קיבל טיפולים מרובים 5. רלוונטי הביולוגית של ממצאים במבחנת מודלים פשוטים כל כך של השד האנושי הוא גנים מפוקפקים ויעד שזוהו במודלים אלה במבחנה הם שונים מגני היעד שמזוהים במודלים של בעלי חיים 6. כאשר תאי אפיתל שד אנושי ראשוני בתרבית במבחנה הם נוטים לאבד את ביטוי קולט הורמון ולכן תגובת הורמון 7,8. בעיה זו ניתן circumventd על ידי גישות 3D מתוחכמות באמצעות matrigel. בדרך זו, סי קלארק ועמיתים הצליחו להקים תאי האפיתל שד שנשמרו ביטוי קולט הורמון והראה תגובת שגשוג לפרוגסטרון גירוי 9. ובכל זאת, שתי חשובים בגנים המטרה קולטני פרוגסטרון vivo, Wnt-4 וRANKL, לא נגרם על גירוי פרוגסטרון במערכת זו 9. גישה זו צולמה לאחרונה על עוד עם במבחנה 10. אזהרה היא שיש matrigel פעילויות שהן אצווה תלויות, היא יקר, ודורשת תכנון ניסוי כי הוא מתאים למספרים סלולריים קטנים בלבד.

בהתבסס על הממצא שבER vivo ואיתות יחסי הציבור מתווכים במידה רבה על ידי אינטראקציות אוטוקריני 11, אנחנו טענו שאינטראקציות בין תאית צריכה להישמר. גורם חשוב נוסף שהולך לאיבוד כרקמות הם ניתקו לתאים בודדים לתרבות במבחנה הן האינטראקציות של תאי האפיתל במטריצה ​​תאית; אך אלה הם קריטיים לבידול אפיתל ושיבושם חשוב ביצירת גידולים 12. עם זה בחשבון, הקמנו שיטה לבודד microstructures רקמת שד מחומר שנזרק כירורגית טרי 13. Parenchyma השד, בהיקף של אפיתל שני שכבות עם luminal הפנימי וחיצוני myoepitheliתאי אל, הוא גזורים מרקמת שומן ונתונים לניתוק מכאני והאנזימטית. לאחר הכביסה וצנטריפוגה, שברי צינורות החלב מתקבלים ששומרים אינטראקציות קרובות עם הרבה תאי סטרומה. microstructures רקמות אלה יישאר הורמון תגובה. המודל היה תוקף בדגימות קליניות 13. ככזה, ההליך הנוכחי יכול לעזור ללמוד פעולת הורמון בשד בהקשר ביולוגי ורלוונטי מבחינה קלינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

שיקולים כלליים: לפני הזמן, להגדיר פרוטוקול אתיקה, להכין שאלונים לחולים, ותראו להכשרת כוח האדם הקליני. לפני השימוש בחומר מניתוח מאמופלסטית הפחתה, להשיג אישורים, ולהבטיח את הסכמת מטופל. רקמה עשויה להיות מדבקת וצריכה להיות מטופל בהתאם. פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת האתיקה של ISREC - שוויצרי מכון לחקר הסרטן ניסויי.

1. רקמות שחזור, עיבוד וביו-בנקאי

על מנת להבטיח איכות מדגם אופטימלית ליו-בנקאי, מספר הצעדים מתבצעים בבית החולים לפני הובלה למעבדה.

בבית החולים:

  1. להשיג רקמות שד אנושיות בתנאים סטריליים מדגימות ניתוח מאמופלסטית ההפחתה ודם, במידת צורך. רקמה צריכה להיבדק על ידי פתולוג שידגום להוציא נוכחות של נגעים ממאירים.
  2. הנח את t השדלהוציא מתחת למכסת המנוע על לוח סטרילי ולהכין מספריים, סכין מנתחים כירורגים ומלקחיים שכבר מעוקרים עם מעקר קיטור. הפוך חתך עמוק באתרים של רקמת החלב שונים באמצעות אזמל כדי לפתוח אותו. ברקמת שד אנושית לחפש גדילים לבנים המורכב מצינורות ואוניות, שמוטמעים ברקמת שומן צהובה.
    הערה: היחס של parenchymal הלבן לרקמת השומן הצהובה שונה בקרב נשים; בדרך כלל יש לי נשים צעירות רקמת האפיתל יותר.
  3. בחר חתיכות של חומר לבן ולהחזיק אותם עם מלקחיים, ולאחר מכן להפריד ביניהם בעדינות מרקמת השומן במספריים. להימנע מנטילת כלי דם.
  4. חתיכות שטיפה של רקמות שבנאגרו מלוח פוספט pH (PBS) 7.2 להסיר דם. העברת הרקמה לבקבוקי פלסטיק המכילים 250 מיליליטר בינוני F12 (F12 בינוני של הנשר השתנה Dulbecco) ללא פנול אדום עם 2% פניצילין / סטרפטומיצין (כולל יחידה 5000 / פניצילין מיליליטר ו5,000 g / ml סטרפטומיצין) ו% 1tibiotic / amphotericin B (כולל 10,000 יחידות / מיליליטר פניצילין, 10,000 מיקרוגרם / מיליליטר של סטרפטומיצין, ו -25 מיקרוגרם / מיליליטר של amphotericin B). רקמות חנות במדיום להובלה למעבדה.
  5. הכן חתיכות של 3 - קוטר 5 מ"מ להפקת RNA וחלבון ופלאש להקפיא אותם בcryovials עם איזופנטאן הקר (קרח יבש). העבר אותם לתיבת קרח יבשה לתחבורה למעבדה.
  6. שים חתיכות של 3 - 5 מ"מ לתוך תבנית ולכסות אותו בשכבה של טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) ולאחר מכן למקם את התבנית בתחתית שטוחה קופסא מלאה באיזופנטאן הקר של. לאחר הקפאה מוחלטת להעביר את התבנית לתיבת הקרח היבשה.
  7. תקן 5 חתיכות של 3 - 5 מ"מ קוטר בparaformaldehyde (PFA) 4% ו -5 חתיכות אחרת בפורמלדהיד (FA) 4% ב- ​​PBS בניתוח היסטולוגית RT מאוחר יותר. שני fixatives שונה מומלץ כחלק מהנוגדנים לעבוד טוב יותר עם אחד או האחר של שתיים.

במעבדה:

  1. האםcument את כל המידע על מאמופלסטית ההפחתה, מועד הניתוח והאם הדגימות נגזרים משמאל לעומת שד ימני.
  2. מניחים את הדגימות קפואות ב -80 ° C ולהעביר את הרקמות קבועות לקלטות היסטולוגיה לאחר שעה 2 של קיבעון. ואז לשים אותם גם בPBS או אתנול 70%, לO / אחסון N ב 4 מעלות צלזיוס. ביום שלמחרת, להעביר את קלטות היסטולוגיה למתקני היסטולוגיה להטבעת פרפין.

2. רקמות עיכול והורמוני גירוי

  1. העבר את הבקבוקים המכילים דגימות רקמה לזרימה למינרית בחדר תרבית תאי P2. מניחים חתיכות רקמה על לוח סטרילי הקיצוץ (29 x 19 סנטימטרים). החזק את החומר עם מלקחיים ולגרד את השומן וכלי נותר מparenchyma השד (חלק לבן) עם אזמל. הנח את החומר הלבן בPBS בצלחת תרבות 10 סנטימטרים.
  2. לאחר הסרת החומר השומני מכל החלקים והשלכתם על פי הכלל הבטיחותים של המעבדה, למקם את החלקים הלבנים המכילים את רקמות אפיתל חזרה על קרש החיתוך. באמצעות אזמלים מנוגדים לחתוך את הרקמה וקוצץ אותו לחתיכות בקוטר של עד 2 מ"מ.
  3. הנח את החומר הטחון לתוך צינורות בגודל מתאים: עד 1, 2.5 ו -10 מיליליטר ל5, 15 או 50 מיליליטר צינורות, בהתאמה. בדרך כלל תשואות צינור 5 מיליליטר מספיק חומר לגירויי embedment פרפין והורמון, ותשואות 15 מיליליטר צינור מספיק חומר לסלולרי קרינה המופעל מיון (FACS). צינורות גדולים יותר משמשים להקפאת aliquots.
  4. הכן תערובת עיכול אדון בהיקף של מדיום (DMEM / F12 ללא פנול אדום) עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין / amphotericin B וCollagenase (Clostridiopeptidase מhistolyticum Clostridium). מנת collagenase לפי זמני עיכול.
    1. במשך 12, 24, ו -36 שעות של דגירה, להשתמש בריכוז סופי של collagenase של 1.5 מ"ג / מיליליטר, 1.0 מ"ג / מיליליטר ומ"ג 0.5 / בהתאמה מ"ל. להוסיף תערובת אמן עיכול עד 4 פעמים בנפח של החומר מתעכל כדי להבטיח אוורור נאות ותסיסה.
      הערה: בהתאם לתכנון ניסוי ואת משך הזמן של גירוי הורמונלי, להוסיף הורמונים או במהלך או לאחר התאוששות צעד העיכול ומייקרו האנזימטית.
  5. להוסיף הורמון (ים) בריכוז רצוי כדי לבדוק את הדגימות והרכב לשליטה. לגירוי עם 17-β-אסטרדיול, וpromegestone (R5020) להשתמש ריכוז סופי של 20 ננומטר.
    הערה: R5020 הוא אגוניסט קולטן פרוגסטרון סינטטי, שהוא יציב יותר מפרוגסטרון הטבעי במדיום.
    1. מקום צינורות על מיקסר רולר בתוך חממה ב 37 מעלות צלזיוס ו -40 O סל"ד / N. לפני הצבת הדגימות במיקסר, resuspend אותם היטב כדי להבטיח שכל החומר מפיץ לאורך צינורות צנטריפוגה.
  6. כעיכול לוקח לפחות 12 שעות (O / N), לפעמי גירוי הורמון של שעות פחות מ -12, להוסיף את ההורמונים לאחר ההתאוששות של microstructures (deזנב תחת שלב 3). הוסף את ההורמונים כמו שאתה resuspend microstructures ולמקם את ההשעיה על צלחות מצורפים נמוכות במיוחד. יכולה להיות כל הזמן microstructures רקמות על צלחות נמוכות במיוחד מצורפים לתקופה של עד 7 ימים במדיום גידול-ללא גורם שימור כדאיות כ -70%.
  7. לRNA וניתוח חלבון, לאסוף microstructures רקמה על ידי צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות והקפאת הבזק בצינורות צנטריפוגה.

3. שחזור של Microstructures רקמות

  1. צנטריפוגות הצינור (ים) ב 400 XG במשך 5 דקות. לשאוב השומן מהחלק העליון של צינור צנטריפוגות ולהעביר את supernatant של supernatant המימי שנותר, שהוא מועשר בfibroblasts, לצינור צנטריפוגות חדש וצנטריפוגות ב 1250 XG במשך 5 דקות.
    הערה: ככל שmicrostructures רקמת השד היא מאוד דביקה, את כל הצעדים הבאים resuspend גלולה בעדינות על ידי התססה הצינור. Pipetting אינו מומלץ בשל הסיכון של אובדן חומר. Resuspend את כדורים מועשרים בmicrostructures ובfibroblasts נגזר מsupernatant המימי בPBS, 2% עגל סרום עוברי (FCS). בהמשך לכך ספין שני הצינורות ב1,250 XG במשך 5 דקות ולאחר מכן למחוק את supernatants.
  2. Resuspend את כדורים ב 3 - 5 מיליליטר מאגר תמוגה תאי דם אדום ולהעביר אותם לניקוי צינורות. דגירתם במשך 5 דקות בRT.
  3. הוספת נפח 2x של PBS, 2% FCS ו צנטריפוגות ב1,250 XG במשך 5 דקות. לשטוף את כדורים עם PBS, 2% FCS ו צנטריפוגות ב 1250 XG במשך 5 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים.

4. דוגמאות לcytometry הזרימה

  1. להוסיף 1-2 מיליליטר טריפסין 0.25% לגלולה ולערבב אותו על ידי pipetting מעלה ומטה בעדינות במשך 2 דקות עם pipetman 1,000 μl לנתק תאים.
  2. לעכב פעילות טריפסין ידי הוספת 9 מיליליטר PBS, 2% FCS. צנטריפוגה ב 450 XG במשך 5 דקות ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר PBS, 2% FCS.
  3. מעביר את ההשעיה התא על מסננת תא 40 מיקרומטר מונחת על top של צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר להכין תאים בודדים. אם כמה מיקרוליטר של השעיה תא להישאר בחלק העליון של המסנן, לעזור להם לעבור את הסינון על ידי aspirating מהצד השני של מסננת האחר עם pipet ולהוסיף אותם לmicrostructures המסוננת.
  4. נוגדני תאי חיסון נפרדים, fibroblasts ותאי האנדותל מmicrostructures עם קוקטייל של אנטי-CD45, אנטי-FAP ואנטי-CD31 ולאחר מכן למיין אותם עם FACS, המבוססים על EpCAM פאן-אפיתל סמן CD10 ולהפריד תאי luminal ובסיס בהתאמה 10 .

5. דוגמאות להיסטולוגיה

  1. לאחר שטיפת החומר מתעכל באופן מכאני ואנזימים כפי שתואר לעיל, לתקן כדורים מחומר ראשוני 1.5 מיליליטר ב 1 מיליליטר של 4% PFA PBS ב RT למשך 30 דקות.
  2. צנטריפוגה ב1,250 XG במשך 5 דקות ולשטוף עם 1-2 מיליליטר PBS פעמיים.
  3. צנטריפוגה XG ב 16,000 במשך 10 דקות. במהלך תקופה זו, להכין 1% רב תכליתי agarose בטריס-אצטט-EDTA (טה) חיץ ולחמם את הפתרון במיקרוגל עד הפתרון מגיע לרתיחה.
    1. הסר את הפתרון מתנור המיקרוגל ולערבל את הבקבוק בעדינות לתערובת הפתרון וresuspend כל חלקיקי agarose שנותרו. פתרון agarose מגניב עד 50 ° C ויוצקים 1 מיליליטר בעובש בסיס פרפין בגודל 31 × 23 × 13.5 מ"מ.
  4. בטל supernatant ומניח את כדורים על גבי השכבה המוצקה (1 - 3 מ"מ) של agarose בעזרת מרית עם קצה שטוח. לכסות את כולם עם שכבה נוספת של agarose (40 מעלות צלזיוס).
  5. לאחר agarose המבצרת, בדרך כלל תוך 5 דקות, לשים בלוקים agarose לקלטות היסטולוגיה לembedment פרפין. יחד עם דגימות agarose למקם נייר משרדי לבן בקלטת עם כל המידע על מספר מאמופלסטית ההפחתה, תנאי ניסוי, ותאריך כתוב באותיות קטנות בעיפרון; כתיבת שורות אלה עומדים בכל צעדי הטיפול עוקבות.
  6. שים את הקלטות בPBS O / N, או ב -70% אתנול לאחסון בסוף השבוע, בשעה 4 מעלות צלזיוס. לא שם לב כל הבדל בין שני פתרונות האחסון. לאחר מכן להעביר את קלטות היסטולוגיה למתקני היסטולוגיה להטבעת פרפין.

6. Microstructures הקפאה (עתיד Culturing)

  1. microstructures רקמות הגלולה בהקפאה בינונית בהיקף של FCS עם sulfoxide דימתיל 10% (DMSO) ולהקפיא 1 מיליליטר aliquots בcryovials. מספר cryovials השיג תלוי בכמות של חומר ראשוני המתקבל מהפחתת מאמופלסטית.
  2. להקפיא את cryovials המכיל microstructures רקמות באמצעות מקפיא קצב מבוקר עם התכנית הבאה: 5 דקות מגורים על 4 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה יורד ל-7 ° C עם שיעור של 6 מעלות צלזיוס / min, ומקטין את הטמפרטורה ל -12 מעלות צלזיוס עם שיעור של 6 מעלות צלזיוס / min, 10 דקות מגורים, ומקטין את הטמפרטורה ל -40 מעלות צלזיוס עם שיעור של 6 מעלות צלזיוס / min, ירידה בטמפרטורה ל -80 מעלות צלזיוס עםשיעור C / min 6 מעלות. לאחר מכן להעביר את cryovials למקפיא -80 מעלות צלזיוס.
  3. למחרת, להעביר את cryovials מ-80 ° C למכל חנקן נוזלי לאחסון ארוך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי ללמוד את התפקיד של אסטרוגנים ופרוגסטרון ולהבין טוב יותר את התפקידים המולקולריים שלהם בשד האנושי, אנו אוספים דגימות רקמת שד אנושיות טריות מחולים שעברו mammoplasties הפחתה (איור 1) לאחר קבלת ההסכמה מהדעת שלהם. אנחנו גם לקבל היסטוריה של החולים רפואי ורבייה, כמו גם דגימת דם כדי לקבוע את רמות הפרוגסטרון בסרום בזמן הניתוח. רקמה מmammoplasties ההפחתה הטרי מנותקת באופן מכאני ואנזימים. יש לי microstructures הרקמות וכתוצאה מצינוריות ואוניות אופייניות לרקמת השד ממוצא (איור 2 א). ניתוח immunohistochemical של agarose וmicrostructures רקמות מוטבעים פרפין המוכתם עבור ΔNp63 סמן myoepithelial (איור 2) עולה כי microstructures לשמר את המאפיינים לא רק מורפולוגיות של רקמת השד הרגילה, אלא גם את הפרופיל המולקולרי של celאוכלוסיות l.

כדי להעריך את תגובת ההורמון, טופלו microstructures רקמה או עם promegestone פרוגסטרון הסינתטי אגוניסט קולטן (R5020) או שליטת אתנול. כדי להעשיר לקולטן הורמון תאי luminal החיוביים cytometry הזרימה בוצע על בסיס אפיתל (EpCAM) וסמן myoepithelial (Calla; איור 3 א) לאחר הדלדול לאנדותל, fibroblasts ותאי חיסון עם קוקטייל של CD31 אנטי, אנטי-FAP ואנטי- נוגדני CD45. ניתוח qRT-PCR של EpCAM +, תאי CD10- הופיעו רגולציה של גן מטרת פרוגסטרון Wnt-4 (איור 3) באוכלוסייה מועשרת תא luminal מR5020 נחשף microstructures רקמה.

איור 1
איור 1. דגימת רקמת שד. תצלום של מדגם מאמופלסטית הפחתה טרי גזור. חיצים מצביעיםלגדילים לבנים רקמה המכילים parenchyma השד, כלומר, צינורות החלב ויחידות lobular ductal מסוף. מוטבע בתוך רקמת שומן צהובה בשפע. בעוד הצבע של השומן אינו עולה בקנה אחד בין חולים, חלקם של רקמת שומן, בדרך כלל את החלק הגדול ביותר של רקמת השד במונחים של נפח, משתנה. בר סולם:. 5 מ"מ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. microstructures רקמות. תמונת שדה מוארת של microstructures () בתרבית בצלחת מצורף נמוכה במשך 48 שעות לאחר ניתוק מכאני ועיכול אנזימטי. בר סולם: 40 מיקרומטר (ב) מיקרוסקופ של סעיף היסטולוגית על microstructures רקמה המשובצת בagarose ופרפין לאחר 3 ימים ב.תרבות. הסעיף היה נתון למכתים immunohistochemical לΔNp63 סמן myoepithelial וcounterstained עם hematoxylin. ראשי החץ להצביע לתאים הפנימיים, luminal, חיצים מצביעים על תאי myoepithelial החיוביים ΔNp63. בר סולם:. 40 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. Cytometry זרימת מיון הפרדה וניתוח RNA של microstructures רקמה. הפרדה (א) לאוכלוסיות התאים השונות ממייקרו רקמות שטופלו בR5020 או אתנול על ידי cytometry זרימה. microstructures הרקמה היו מנותקת וimmunodepleted לתאי מערכת חיסון, fibroblasts, ותאי האנדותל עם קוקטייל של אנטי-CD45, אנטי-FAP, ונוגדנים נגד CD31. תאים תויגו עם antiboמת נגד תאי אפיתל הידבקות מולקולה (EpCAM) (HEA-125 שיבוט) להעשרה לאוכלוסיית תא luminal (ירוק) והנפוצה חריף Lymphoblastic לוקמיה Antigen (CD10 / כלה) לתאי myoepithelial (Clone SS2 / 36). כתם פיזור נציג מוצג. גרף בר (B) מראה Wnt-4 רמות ביטוי mRNA היחסית בתת-אוכלוסיית luminal מmicrostructures הרקמה (ענן נקודה ירוק, פנל) מושרה עם אתנול או R5050 למשך 24 שעות. רמות ביטוי mRNA היחסית של גן מטרת פרוגסטרון, Wnt-4 מנורמלות נגד רמות ה- mRNA של phosphoribosyltransferase hypoxanthine-גואנין (HPRT). הנתונים המוצגים מייצגים את הממוצע ± סטיית תקן של triplicates. בידוד RNA וqRT-PCR בוצעו כפי שתוארו לעיל 14. רצפי פריימר: Wnt-4: קדימה 5 '- GTGGCCTTCTCACAGTCGTT-3' ולהפוך 5 '- ACCTCACAGGAGCCTGACAC-3 ", HPRT: קדימה 5 <em> '-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3' ולהפוך 5 '- CCTGACCAAGGAAAGCAAAG-3'. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תרבות vivo לשעבר המתוארת כאן מספקת microstructures רקמת שד המכילה צינורות שלמים ואוניות, יחד עם סוגי תאים אחרים בדרך כלל נמצאים בחזה הנשי האנושי. בעיבוד של רקמת השד האנושית בדרך כלל מתקבלת מmammoplasties ההפחתה, הסרת רקמת שומן, עיכול מכאני והאנזימטית של מטריצת סטרומה, ותמוגה של תאי דם אדומים מעשירה לברי צינור חלב ויחידות lobular ductal מסוף. עיכול עדין האנזימטית בריכוז הנכון, למשך הנכון הוא חיוני כדי להבטיח כי microstructures הרקמות נותרה על כנן, לשמור על סוגים שונים של תאים ובעיקר לשמר המטריצות תאי שלהם. גם יש לשים לב לעיבוד הרקמות במהירות הוסרו פעם אחת מהמטופל. דגימות מטופל להשתנות באופן משמעותי ועיכול מכאני והאנזימטית ייתכן שיהיה צורך ממושך, ו / או אנזים נוסף צריך להוסיף כאשר הרקמה היא גבוהה במיוחד בתוכן קולגן.

למרות microstructures תישאר 90% קיימא עבור עד 6 ימים, יש המודל המגבלות לגירויי הורמון לטווח ארוך. כמו שיש לי סוגי תאים שונים מחצית חיים שונים, הרכב הסלולר עשוי להשתנות עם הזמן. בעוד microstructures הרקמה לשמר חדירת תאי מערכת חיסון, אלה אינם מתחדש כמו הרקמה מוסרת מהמחזור של הגוף. יתר על כן, נדרש צינור מוצק עם השותפים הקליניים המספקים דגימות כירורגית כמו מספר גדול של דגימות צריך להיות מנותח בגלל הווריאציה מטופל השאר. microstructures רקמה אפשר להקפיא לשימוש מאוחר יותר. עם זאת, למה שהקפאת מידה והפשרה להשפיע על כדאיויות תא, אולי באופן דיפרנציאלי לתאים מסוגים שונים, ואיך זה עשוי לשנות את תגובת הורמון, לא מאופיין. תכנון של ניסויים יכול להיות קשה כמו לכל מאמופלסטית כמות microstructures הרקמה שתתקבל קשה לצפות מראש.

"Jove_content"> למיטב ידיעתנו, המודל הנוכחי vivo לשעבר מציג את הדגם הראשון ללמוד פעולת הורמון פיזיולוגית בשד האנושי. בעוד שמערכות תרבות 3D מתוחכמות לתאי האפיתל שד ראשוני פותחו, מערכת זו vivo לשעבר משמרת את מבנה הרקמה והמורכבות הסלולרית שלה על פני כמה ימים. כתוצאה מכך, לא רק את התגובה בתאי המטרה החיוביות קולט הורמון ניתן לנתח אך האירועים במורד הזרם של איתות אוטוקריני בסוגי תאים אחרים הפכו לאישה נוח ללמוד. Microstructures נשמרות בללא בינוני גורם גדילה בכל משך הזמן של הניסויים. לפיכך, אין הפעלה חיצונית של בלבול מפלי איתות. ככזה, microstructures רקמת השד מציעה את האפשרות להתייחס לשאלות בהגדרה המשקפת באופן הדוק יותר את המורכבות הביולוגיות של השד האנושי.

המערכת לשעבר vivo יכול לשמש כדי להעריך את התגובה של brמזרח להורמונים טבעיים וסינטטיים. זה חשוב מאוד לאור שכיחות גוברת של סרטן השד. יתר על כן, תרופות, מולקולות קטנות, פפטידים, גורמי גדילה, וציטוקינים ניתן ליישם וללמוד את ההשפעות שלהם על שגשוג תאים, אפופטוזיס ואיתות.

התיאור מפורט הנוכחי נועד להקל על השימוש בשיטה זו על ידי חוקרים אחרים ועל מנת למזער וריאציה מעבדה השאר. כגישה זו מסתמכת על דגימות חולים, זה הוא בעל חשיבות עליונה לכך ששיטה סטנדרטית משמשת כך תוצאות יכולות להתחיל להשוות בין מעבדות שונות 15 והערכה טובה יותר של השתנות מטופל השאר הופכת לאפשרית. המחברים מעריכים את המשוב וישמחו לשלב את השיפורים לגרסות מתוקנות של פרוטוקול זה. העבודה עם דגימות אנושיות היא מאוד מאתגרת והמחברים מקווים לעורר מחקר translational יותר עם דגימות ביולוגיות מעניינות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לי המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים M. Fiche של בית החולים של האוניברסיטה של ​​לוזאן למתן תמונת מאמופלסטית, מ 'וא' וירט Ayyanan של שוויצרי מכון לחקר הסרטן ניסויי, המרכז הלאומי של יכולת המחקר המולקולרית אונקולוגיה, בית הספר למדעי חיים, אקול פוליטכניק הפדרלי דה לוזאן לקבלת סיוע טכני ור 'קלארק מאוניברסיטת מנצ'סטר להערות ביקורתיות. המחקר שיוביל לתוצאות אלה קיבל תמיכה מSNF3100A0-112090, Oncosuisse 531,817, ותרופות היוזמה המשותפת ההתחייבות החדשנית תחת הסכם מענק לא. 115,188, משאבים אשר מורכבים מתרומה כספית מהתכנית של האיחוד האירופי מסגרת השביעית (FP7 / 2007-2013) ופדרציה האירופית של חברות תעשיות פרמצבטיות ועמותות 'בתרומה נדיבה. כתובת האינטרנט של תרופות חדשניות יוזמה היא http://www.imi.europa.eu/. </ P>

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microlitre Centrifuge Heraeus Biofuge Fresco 75005521
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810 000.327
Cryobox Nalgene   5100-0001
Controlled Rate Freezer EF600 Grant Asymptote  EF600
CO2 incubator Hera Cell Heraeus 51022391
Roller Mixer SRT9D Sturt SRT9D
Histology Cassettes Medizintechnik 81-0021-00
Cell Strainer Falcon 352340
Strile Surgical Blade  Aesculap BB536 
Scalpel Aesculap BB084R
Forceps Aesculap BD047R
Scissors Aesculap BC374R
Paraffin base mold SAKURA 4166
Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix Thermoscientific 6769006
Penicillin/Streptomycin  Life Technologies 15070-063
Antibiotic/Antimycotic Life Technologies 15240-062
DMEM F/12 Life Technologies 11039-021 Prewarm (37 °C)
Collagenase Roche 11 088 793 001 Prewarm (37 °C)
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10270 Can be replaced with Fetal Calf Serum
Cell Blood Lysis Buffer Sigma R7757
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Agarose Invitrogen 16500-500
Formaldehyde Sigma F1635
Paraformaldehyde Roth 335
Isopentane Sigma M32631
Ethanol Merck 1009831000
Cryogenic vials (5.0 ml) VWR, International 479-0820
Ultra low attachment culture dish Corning, NY 14831 3471

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362, (9382), 419-427 (2003).
  2. MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43, (2), 209-221 (1970).
  3. Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. 'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303, (5920), 767-770 (1983).
  4. Brisken, C., O'Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (12), a003178 (2011).
  5. Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57, (15), 3071-3078 (1997).
  6. Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14, (4), 210 (2012).
  7. Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (26), 12378-12382 (1994).
  8. Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39, (11), 1987-1994 (2007).
  9. Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150, (7), 3318-3326 (2009).
  10. Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5, (215), 215le214 (2013).
  11. Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13, (6), 385-396 (2013).
  12. Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28, (1-2), 167-176 (2009).
  13. Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5, (182), 182ra155 (2013).
  14. Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17, (10), 1600-1610 (2010).
  15. Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6, (5), 779-781 (2014).

Erratum

Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 02/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:

Marie Shamseddin

instead of:

Marie Shamsheddin

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics